Souris

Les souris utilisées appartiennent à une souche athymique dépourvue de défenses immunitaires, choisie pour que des cellules cancéreuses humaines prennent sous leur peau. 974 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, un fragment de tumeur humaine est implanté dans leur flanc droit, puis elles reçoivent des injections intraveineuses hebdomadaires pendant deux à six semaines selon la progression de la tumeur, complétées par des gavages et des injections dans l'abdomen. Toutes sont tuées, le porteur indiquant que des animaux porteurs d'une tumeur au flanc ne peuvent pas être inclus dans un autre protocole.

Objectifs

La sénescence est un processus biologique naturel qui intervient en protégeant les cellules contre des stress cellulaires comme le raccourcissement des télomères, les dommages à l’ADN ou encore le stress oxydatif. Durant certains processus naturels, comme par exemple l’embryogénèse, la senescence a un rôle fondamental. Cependant, l’accumulation de ces cellules sénescentes dans l’organisme au cours du temps conduit à l’émergence de pathologies que l’on retrouve majoritairement chez les personnes âgées. Par exemple, les fibroses comme celle du foie, des poumons, des reins ou du coeur, le cancer, les maladies neurodégénératives ou l'arthrose sont des ptahologies directement liées à l’accumulation de ces cellules sénescentes. L'objectif de ce projet est la mise au point de thérapies innovantes capable d'éliminer les cellules senecentes dans les tumeurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de valider l'efficacité de nouveaux composés dans le traitement du cancer. Ces thérapies ciblées permettent d'éliminer spécifiquement les cellules senescentes tumorales responsables des mécanismes de résistance aux drogues et de la formation des métastases. De plus, le ciblage des cellules senescentes cancéreuses permettra de limiter les effets secondaires associés aux traitements classiques comme la chimiothérapie comme par exemple la formation de tissus fibrotique.

Procédures

Les animaux seront greffés en sous-cutané avec des modèles de lignées cellulaire humaines tumorales. Au début du protocole, les souris seront anesthésiés puis des cellules cancéreuses seront implantées sous la peau au niveau du flanc droit. Puis, les animaux se verront injecter différents produits par intraveineuse, une par semaine, durant 2 à 6 semaines consécutives en fonction de la progression des tumeurs.

Impact sur les animaux

Plusieurs éléments peuvent nuire au bien être des animaux et engendrer un stress et une douleur notamment lors des greffes sous cutanées des cellules tumorales, des gavages et lors des injections intraveineuseet intrapéritonéales.

Devenir

Tous les animaux inclus dans le protocole expérimental seront mis à mort soit en fin de procédure. En effet, les animaux présentant une tumeur dans le flanc ne pourront être réutilisés ou inclus dans un autre protocole.

Remplacement

Ce projet a pour but le développement de potentielles thérapies ciblées pour la traitement du cancer. Ces études in vivo font suite à de nombreux résultats in vitro qui nous permettent d'affirmer que nos nouveaux ADC présentent un réel intérêt thérapeutique. Cependant, à ce stade du développement de nos recherches, l'utilisation de modèles complexes, comme des modèles de xénogreffes, est requise pour pouvoir prouver l'efficacité thérapeutique de nos candidats. De plus, pour le développement préclinique de nos ADC, nous devons apporté la preuve d'une efficacité sur des modèles complexes en plus d'étude de pharmacocinétique précise des molécules en développement.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum tout en maintenant la possibilité d'une analyse statistique des résultats. Etand donné que l'originalité de nos ADC, ces expériences n'ont jamais été faites précédemment dans la littérature.

Raffinement

Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin de s'assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance. L'apparition de signes évocateurs de souffrance, de mal-être comme la prostation, un comportement erratique ou une altération de l'état général de la souris permettra rapidement, en fonction de la gravité des observations, de procéder soit à une prise en charge de l'animal (administration d'un antalgique) soit à la mise à mort de l'animal concerné.

Choix des espèces

La souche NMRI nude athymique sera utilisée dans l'étude de modèles de xénogreffes de cellules humaines cancéreuses en greffées en sous-cutanée. Il s'agit d'un modèle immunodéprimé avec une courbe de poids homogène et couramment utilisée dans la littérature associée à la recherche en oncologie. Ce souche permettra l'évaluation de l'effiacité anti-tumorale de nos candidats médicaments dans des modèles de xénogreffes exprimant les cibles d'intérêts thérapeutiques. Les souris NMRI athymique nude seront âgées de 6-7 semaines lors de la greffe sous-cutanée pour garantir une prise tumorale homogène.

Pour valider un substitut de peau fabriqué avec des cellules modifiées afin d'échapper au rejet, 140 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est anesthésié, un morceau de peau du dos lui est retiré et le substitut greffé, pour une chirurgie d'environ quinze minutes. Le porteur indique que l'opération peut provoquer une douleur et une perte de poids pendant trois à quatre jours, et que l'isolement en cage individuelle quatre jours avant l'expérience induit un stress. Toutes sont tuées pour prélever la peau en cours de cicatrisation, les observations visuelles de la plaie ne suffisant pas, selon lui, à conclure sur l'efficacité du substitut.

Objectifs

En raison de sa fonction protectrice, la peau est un organe indispensable à la survie de l’organisme. Lors d’agressions importantes, telles qu’une brûlure du troisième degré, la peau n’est plus capable de cicatriser spontanément et induit un déséquilibre parfois mortel. La prise en charge des victimes de brûlures sévères se base aujourd’hui sur l’utilisation de substituts cutanés préparés avec les cellules du patient. Cependant, la disponibilité limitée de cellules saines du patient et le long procédé de fabrication peut mettre en jeu la vie du patient. Une des solutions envisagée pour pallier au problème de disponibilité de cellules saines et limiter les temps d’attente est d’utiliser les cellules d’une autre personne saine. La contrainte alors rencontrée est le phénomène de rejet. Pour contrer cela, il est possible d’utiliser les propriétés de tolérance immunitaire d’une molécule centrale dans la protection du foetus contre le rejet par le système immunitaire maternel. En se basant sur cette stratégie, nous avons développé une méthode permettant de modifier des cellules de peau de manière à permettre une production contrôlable de cette molécule. L’objectif de ce projet est maintenant de valider la capacité de notre substitut cutané immunotoléré, préparé dans des conditions correspondant aux exigences réglementaires d’un médicament, à reformer une peau fonctionnelle après greffe.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de sélectionner un milieu de culture chimiquement défini répondant aux exigences règlementaires d’un médicament et de valider la capacité du substitut immunotoléré à favoriser d’une bonne prise de greffe, la maturation de la peau et son auto-renouvèlement. Cette étape permettra une avancée significative vers la conception de nouveaux substituts cutanés immunotolérés pouvant servir de bio-pansements lors de greffes de peaux chez l’Homme (ex : grands brulés). En d’autre terme, ce projet a pour objectifs, à court et moyen termes de sélectionner les conditions optimales de culture de substituts cutanés universels pour, à plus long terme, développer le traitement des grands brulés en proposant un accès plus rapide et universel à des greffons tissulaires pour des patients chez qui l’autogreffe est limitée voire même impossible.

Procédures

Les animaux, sous anesthésie générale, seront soumis à l’enlèvement d’un morceau de peau et une greffe d’un substitut cutanée sur le dos pour une durée moyenne de chirurgie de 15 minutes par souris.

Impact sur les animaux

La nécessité d’isoler les animaux le temps de la procédure et la greffe d’un substitut de peau peuvent induire un stress. L’anesthésie peut provoquer chez les animaux une légère baisse d’activité au réveil pendant une ½ journée. La chirurgie peut provoquer une douleur et une légère perte de poids pendant 3 à 4 jours.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux inclus dans l’étude est nécessaire pour prélever la peau en cours de cicatrisation et réaliser les analyses qui viendront compléter les observations visuelles de la plaie et permettre de conclure à l’efficacité du substitut cutanée. .

Remplacement

Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée impliquant des cultures de cellules et des reconstructions de substituts cutanés en 3D, les mécanismes physiopathologiques mis en jeu lors d’une greffe, de sa maturation et des processus de cicatrisation ne peuvent être répliqués en laboratoire. Par exemple, les modèles de cicatrisation ex vivo qui reproduisent plus fidèlement l’environnement structurel et moléculaire de la peau sont eux limités par l’absence de mécanismes de coagulation, d’inflammation et de réponse métabolique. Le remplacement par des modèles in vitro ou ex vivo n’est ainsi pas possible ici car seul un modèle animal permet de rendre compte de la complexité de la réparation tissulaire, notamment des effets physiopathologiques de la possible réponse inflammatoire à la suite d’une xenogreffe, permettant ainsi d’atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, des premières études in vitro de culture cellulaire 2D et 3D ont été effectuées pour valider la non toxicité et la fonctionnalité biologique de la peau greffée préparée dans différents milieux de culture. Des tests statistiques prédictifs du nombre nécessaire d’animaux pour atteindre une différence significative ont été utilisés pour chaque procédure. Des calculs de puissance préalables ont été effectués pour prédéterminer la taille de l'échantillon à l'aide d'un logiciel en accès libre et sur la base d'expériences antérieures avec des modèles de cicatrisation similaires.

Raffinement

Tout le long du projet, les animaux auront un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson. Pour réduire au maximum le stress lié à l’isolement et que ce dernier n’influence pas les résultats de l’étude, les souris seront acclimatées 3 jours à l’environnement de l’animalerie puis hébergées dans des cages séparées 4 jours avant le début de l’expérimentation, en mélangeant une petite poignée de la litière précédente à la nouvelle litière lors du nettoyage des cages. Pour réduire au maximum le stress lié à l’isolement et que ce dernier n’influence pas les résultats de l’étude, les souris seront acclimatées 3 jours à l’environnement de l’animalerie puis hébergées dans des cages séparées 4 jours avant le début de l’expérimentation dans des cages en conditions standard d’animalerie, avec un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson. Le choix de la durée d’adaptation et d’isolement des souris est justifié par l’étude de la réaction immunitaire au greffon. Ainsi, la production de cytokines due au stress pourrait interférer avec notre étude, c’est pourquoi les souris doivent être adaptées à leur environnement afin de ne pas créer de biais supplémentaire. Par ailleurs, la durée d’adaptation a été réduite au maximum afin que la totalité de l’étude dure 21 jours. Le bien-être des animaux sera assuré par l’utilisation de moyens d’enrichissement du milieu de vie des animaux, par une visite quotidienne et un suivi analgésique avant, pendant et après les chirurgies. Une analgésie multimodale sera attribuée aux animaux associant du paracétamol quotidiennement (dans l’eau de boisson) pour une durée minimale de sept jours post-chirurgie (puis en fonction du comportement de l’animal) et un anti douleur en injection, 2 fois par jour pendant les 3 premiers jours après la chirurgie (puis en fonction du comportement de l’animal). Pour pallier l’éventuelle perte de poids, des gelées enrichies sont données aux animaux quotidiennement. Une grille de suivi des animaux est mise en place et des points limites ont été définis afin de réduire la souffrance animale. L’ensemble des effets indésirables sont pris en compte lors d’examens cliniques journaliers des animaux permettant la mise en place de traitements ou le cas échéants la mise à mort des animaux si les points limites sont atteints.

Choix des espèces

Nous avons choisi l’espèce souris car c’est un modèle largement décrit dans la littérature en ce qui concerne l’excision cutanée et l’évaluation de la greffe et la cicatrisation. De plus, la manipulation de cette espèce et de cette technique de chirurgie sont bien maîtrisées au sein du laboratoire. De plus, ce choix vise à standardiser ce modèle de greffe cutanée au sein du consortium expérimental du programme sur différents sites. Les souris seront utilisées au stade du jeune adulte (8 semaines). Un compromis a été effectué pour utiliser des souris à un stade du développement suffisamment avancé pour s’affranchir du cycle de croissance des souris (pouvant entrer en jeu dans les processus de greffe et de cicatrisation) mais suffisamment jeunes pour s’affranchir des processus de vieillissement de la souris.

Sept prélèvements sanguins sur animal vigile, des injections dans l'orbite de l'œil et 72 heures d'isolement dans une cage métabolique de 500 cm2 : 2 184 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles sont soumises à des régimes hypercaloriques ou déficients en méthionine et en choline pour provoquer une maladie du foie, avec des jeûnes de 8 à 16 heures et des tests de tolérance au glucose. L'objectif déclaré est de comprendre comment les plaquettes sanguines régulent l'installation des maladies hépatiques métaboliques, les retombées thérapeutiques restant énoncées au futur. Le résumé annonce "plusieurs injections successives par souris" sans nommer les substances injectées ni en donner le nombre, et qualifie les perturbations du métabolisme hépatique de "non dommageable pour la souris".

Objectifs

Les maladies hépatiques métaboliques sont des conséquences hépatiques du syndrome métabolique. Elles peuvent rester asymptomatiques mais aussi évoluer vers une cirrhose et un cancer du foie avec un taux de survie de 10% sur 5 ans.Les maladies hépatiques métaboliques représentent un problème majeur de santé publique à l’échelon mondial. L'organisation mondiale de la santé les catégorise actuellement comme la cause numéro une des maladies hépatiques dans les pays occidentaux. Même si les maladies métaboliques hépatiques sont étroitement liées à l’obésité et au syndrome métabolique, les causes des maladies métaboliques hépatiques ne sont pas les mêmes chez tous les patients et demeurent actuellement en grande partie non élucidée, ce qui complique la prévention et la prise en charge de ces maladies. Comment les plaquettes sanguines et leur vésicules extra-cellulaires, acteurs clés du maintien de l’intégrité vasculaire, peuvent réguler l’installation des maladies métaboliques hépatiques est une question très intéressante et novatrice et aborde un problème médical important sous un angle à la fois moléculaire et de physiopathologie intégrée. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des plaquettes dans les maladies métaboliques hépatiques et ses conséquences. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie hépatique et aideront à évaluer l’intérêt thérapeutique de cibler les plaquettes pour prévenir les maladies métaboliques du foie.

Procédures

La souris sera soumise à différents régimes alimentaires (hypercalorique et/ou déficients en méthionine ou/et choline) (réalisé dans l'Etablissement Utilisateur (EU) 1/2). La souris sera mise à jeun (8h ou 16h) pour les tests de tolérance (réalisé dans EU 1/2). La souris sera soumise à des procédures avec des injections sur souris vigiles ou anesthésiées (plusieurs injections successives par souris de quelques secondes) (réalisé dans EU 1/2). Sept prélèvements sanguins de 30 secondes sur souris vigile (réalisé dans EU1/2) et une prise de sang terminale sur la souris anesthésiée (d’une durée environ de 2 min) seront réalisées (réalisé dans EU1/2 ou 2/2 en fonction de l’expérimentation réalisée avec le sang et les organes prélevés). Pour l'évaluation du métabolisme in vivo, la souris sera isolée individuellement en cage métabolique d’une surface de 500cm2 sur une durée de 72h (réalisé dans EU 1/2). Pour l'évaluation de la structure et perméabilité des vaisseaux sanguin : une seule injection (injection d'une durée de quelques secondes) sera réalisée sur la souris anesthésiée suivie de la mise à mort de la souris 30 minutes après suite à une anesthésie générale et antalgie locale et une perfusion intra-cardiaque (EU 2/2).

Impact sur les animaux

La mise en régime hyperlipidique de la souris induit : une prise de poids pour la souris et des perturbations du métabolisme hépatique non dommageable pour la souris. Les actions suivantes vont induire un stress modéré et un inconfort des animaux : injections intra-orbitaire et intra-péritonéale (durée : 30 sec), mise en isolation de 72h pour les mesures de calorimétrie indirecte, test de tolérance (induction d’hyerglécemie et d’hypoglycémie et prise de sang) (durée 2h).

Devenir

La souris sera euthanasiée suite à un prélèvement sanguin terminal à la veine cave ou suite à l’isolement dans les cages métaboliques de 72h qui ne permettra pas de réaliser en suivant d’autres mesures métaboliques.

Remplacement

Les effets pléiotropes dans un contexte d’hémostase et thrombose et de maladies métaboliques hépatiques font intervenir des fonctions et types cellulaires multiples dans l’organisme non modélisables à ce jour par des approches in vitro. Le recours à l’expérimentation animale est donc l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiopathologiques dans un contexte intégré.

Réduction

Plusieurs résultats seront obtenus avec un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Nous utiliserons 6 à 8 animaux par groupe en fonction de la procédure (nombre minimum nécessaire déjà défini par des expériences déjà réalisées au laboratoire). Ce nombre a été estimé en fonction des tests statistiques qui seront utilisés. Les paramètres évalués seront analysés par une analyse de variance.

Raffinement

Le suivi des souris sera réalisé 2 fois par jour par les zootechniciens et l’expérimentateur et un calcul de score général sera réalisé. En fonction du score général, une surveillance accrue est nécessaire. De l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage. Du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Des soins/désinfections seront prodigués à la souris. La souris peut être aussi momentanément séparée de ces congénères. Si l'animal atteint le point limite : mise à mort par l’expérimentateur ou par le service de zootechnie. Toutes les procédures invasives utilisent des analgésiques généraux ou locaux. Certains animaux seront transportés à pied selon un tracé bien défini de 5 minutes dans leur cage d’origine placée dans des sacs isotherme de transports à raison de 2 cages par sac de transport. Ceci permet de réduire le stress des animaux car dans l’obscurité et à une température contrôlée. Tout animal faible ou malade ne sera pas transporté et mis à mort avant transport par dislocation cervicale. Les animaux sont ensuite placés dans la salle d’expérimentaion pour une acclimation de 2 h avant l’expérimentation.

Choix des espèces

Nous utilisons des modèles murins car nous disposons de modèles de souris génétiquement modifiées ainsi que d'outils pharmacologiques commercialement disponibles et couramment utilisés pour modifier le compte plaquettaire chez la souris. Les modèles de drosophiles ou de poissons zèbres ne sont pas utilisables dans le contexte de ce projet de recherche car les plaquettes sanguines sont phénotypiquement et mecanistiquement très différentes de celles de l'Homme, ce qui n'est pas le cas chez les rongeurs. Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte, système cardiovasculaire et métabolique mature).

795 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune subissant une chirurgie cérébrale de vingt à trente minutes ou une injection intracérébrale. Deux semaines de tests suivent, trois épreuves de coordination motrice de cinq minutes et une épreuve de motricité et d'anxiété de trente à soixante minutes. Le porteur prévoit que la suppression du transporteur étudié provoque chez les souris des troubles de la mémoire, de l'anxiété et une baisse de la psychomotricité, tout en écrivant qu'aucun effet indésirable majeur n'est attendu. L'objet du projet est de comprendre comment un transporteur de lactate participe à la communication entre neurones, les retombées pour les malades restant énoncées comme une possibilité.

Objectifs

Notre cerveau est fait de cellules appelées neurones, qui communiquent entre elles grâce à des messages chimiques. Ces messages, appelés neurotransmetteurs, sont fabriqués dans une partie du neurone et doivent voyager jusqu’à l’extrémité du neurone pour passer le message au suivant. Pour cela, ils sont transportés le long d’un “fil” appelé axone, grâce à de petits moteurs qui ont besoin d’énergie pour avancer. Nous avons découvert qu’une protéine appelée huntingtine, aide à organiser ce transport en contrôlant les moteurs et en aidant à produire l’énergie nécessaire, à partir du sucre. Cette énergie n’est pas produite par la voie métabolique canonique comme on le pensait, mais directement sur les petites bulles (vésicules) qui transportent les messages. Pendant ce transport, un "déchet" métabolique est fabriqué, et nous avons trouvé qu’il existe un transporteur spécial, qui aide à l'incorporer dans les vésicules avec les neurotransmetteurs. En bloquant ce transporteur, nous avons vu que le transport des messages et la communication entre neurones sont perturbés. Notre projet cherche donc à comprendre comment ce transporteur aide les neurones à bien communiquer.

Bénéfices attendus

Dans notre cerveau, certaines protéines aident les neurones à survivre et à bien fonctionner. Pour que ces protéines arrivent là où elles sont utiles, elles voyagent à l’intérieur des neurones grâce à des petits moteurs et à de l’énergie produite à partir du sucre. Nous avons découvert que l’acide lactique, fabriqué pendant cette production d’énergie, est très important pour que ce transport fonctionne bien et pour que les neurones puissent communiquer entre eux. Notre projet cherche à comprendre comment l’acide lactique circule et aide les neurones, surtout dans les parties du cerveau qui contrôlent le mouvement et la mémoire. Cela pourrait nous aider à mieux comprendre certaines maladies du cerveau et à trouver de nouveaux traitements.

Procédures

Les souris, anesthésiées, seront soumises à une chirurgie du cerveau de 20-30 minutes par souris, ou à une injection de 5 minutes par souris. De plus, des études comportementales, réparties sur une durée de deux semaines, seront effectuées pour évaluer l'effet de la suppression du transporteur sur la coordination motrice (3 tests de 5 minutes) et sur la motricité (globale) et l'anxiété avec un test d'une durée de 30 à 60 minutes.

Impact sur les animaux

Nous pouvons identifier plusieurs nuisances potentiellement attendues sur les animaux lors de l’expérimentation : 1) Un stress léger lors de la manipulation pour les injections et la chirurgie, pendant lesquelles les animaux seront anesthésiés. 2) Un risque de douleur post-opératoire ou post-injection. 3) Suite aux injections, nous pourrions voir apparaître certaines nuisances chez les animaux, qui sont difficilement identifiables à ce stade de l'étude. Nous pensons que cela pourrait provoquer des problèmes de mémoires voire de l'anxiété et une possible diminution de la psychomotricité. 4) Les tests comportementaux réalisés sont susceptibles de générer un stress chez nos animaux.

Devenir

La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux en vue des études biologiques qui permettront de comprendre les mécanismes du traitement.

Remplacement

Le projet analyse des réseaux neuronaux complexes. Il nous est impossible de remplacer le modèle animal vivant par des cultures cellulaires ou des simulations informatiques. Nos résultats sur des cultures de neurones nous ont déjà permis de valider les constructions virales et donc de réduire les nombre d'animaux testés.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique d’estimation de la taille d’échantillon optimale grâce aux variances déterminées dans des études préliminaires de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. Nous prévoyons une analyse du comportement des animaux, suivi d’analyses post-mortem des cerveaux. Puisque nous avons observé que les résultats comportementaux pouvaient varier en fonction du sexe dans le modèle souris, tous les groupes seront composés de 50% d‘animaux mâles et 50% d’animaux femelles afin de pallier de potentielles disparités dans les résultats. Dans l’éventualité où aucune différence significative n’est observée entre mâles et femelles, les animaux des deux sexes seront regroupés au sein d’un même groupe de traitement afin d’augmenter la puissance des tests statistiques.

Raffinement

Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué précédemment, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d’une litière stérile et des matériaux permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. Tous deux seront changés toutes les semaines. Les cages seront équipées d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, changés également toutes les semaines. Le transport des animaux sera effectué en cages occultées avec leurs nids et des croquettes mouillées dans la cage. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. Nous laisserons aux souris au moins une semaine d'acclimatation avant de commencer les expériences. Des points limites suffisamment précoces et adaptés aux procédures expérimentales ainsi que des critères d'arrêt des souffrances sont mis en place. 1) Pour les individus qui vont subir une chirurgie : afin de prévenir toute douleur post-opératoire supplémentaire pouvant affecter la récupération de l’animal, nous injecterons un analgésique avant la procédure chirurgicale, ensuite, toutes les 24 heures si l’animal présente des signes de douleur. Ces chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale volatile en maintenant une température constante, les yeux sont protégés de la dessiccation et un anesthésique local est injecté avant incision. Suite à la chirurgie, les souris sont placées sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. 2) Pour les injections les animaux seront anesthésiés une première fois pour les endormir, et seront ensuite maintenus sous anesthésie volatile pendant la durée de l'injection pour leur éviter du stress. Dans la littérature, aucun signe de douleur lié directement à ce type d'injection n'a pu être observé. Des points limites suffisamment précoces et adaptés ainsi que des critères d'arrêt des souffrances seront mis en place et l’état de santé des animaux sera surveillé régulièrement par des mesures de poids jusqu'a leur mise à mort.

Choix des espèces

Seule la souris permet actuellement de disposer facilement et rapidement, d'un modèle mammifère de maladie génétique par manipulation du génome. L'intérêt général du modèle souris, utilisé comme modèle préclinique, repose essentiellement sur la proximité physiopathologique avec l'espèce humaine (transférabilité des résultats), un élément nécessaire à une recherche translationnelle valide. L'utilisation de ce modèle est indispensable pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Nous utiliserons des animaux de 4 à 36 semaines. En effet, nous visons à étudier le rôle de cette protéine; spécifiquement dans les neurones mais aussi dans un ensemble complexe : un cerveau pleinement développé et mature.

Hébergées seules pendant toute la durée des procédures, les souris reçoivent treize gavages de matière fécale et sont isolées une heure chaque matin pour qu'on récupère leurs crottes. 365 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse du cerveau, de l'intestin et du foie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Il s'agit d'établir si le microbiote intestinal cause la perte de contrôle de la consommation d'alcool, l'anxiété du sevrage et la rechute, et le porteur reconnaît que le gavage peut provoquer une fausse route ou une lésion mécanique. Il annonce une heure de tests comportementaux au total par animal pour évaluer le comportement lié à l'alcool, sans préciser lesquels.

Objectifs

Le rôle causal du microbiote intestinal (MI) dans la maladie alcoolique du foie a été démontré et est actuellement une piste thérapeutique pour améliorer la prise en charge des patients. En revanche, il existe peu de données sur le rôle du MI dans l’addiction à l’alcool. Néanmoins quelques publications et données préliminaires permettent de poser l’hypothèse que le MI a un rôle dans l’addiction à l’alcool. En particulier, des données obtenues par les déposants ont montré qu’il y a un MI spécifique lié à l’addiction chez les souris. Notre objectif est donc de mieux comprendre le rôle de ce MI et statuer sur son rôle causal. L’addiction à l’alcool ou trouble de l’usage de l’alcool est un trouble chronique récidivant qui englobe : (1) une perte de contrôle de la consommation d’alcool, (2) la compulsion, caractérisée par une consommation d'alcool en dépit des conséquences néfastes et au détriment d'autres occupations, (3) la dépendance, caractérisée par le désir irrépressible de boire de l’alcool, (4) les symptômes du sevrage après l'abstinence mimant un syndrome d'anxiété, (5) la rechute après l’abstinence. Dans cette étude, nous allons nous focaliser sur le rôle causal du MI dans la consommation d’alcool (1) l’anxiété liée au sevrage (4) et la rechute (5).

Bénéfices attendus

Cette étude examinera le rôle causal du microbiote intestinal sur différents symptômes de l’addiction à l’alcool, la consommation d’alcool, le syndrome d’anxiété lié au sevrage et la rechute post-abstinence. Les résultats de cette étude permettront de définir le rôle causal du microbiote intestinal dans les différents symptômes liés au mésusage de la consommation d’alcool qui concernent pour ce projet son rôle dans la perte de contrôle vis-à-vis de la consommation d’alcool, l’anxiété qui est liée au manque d’alcool durant la période de sevrage et la rechute. Cela permettra de proposer pour des études ultérieures de moduler le microbiote intestinal, par exemple, par des prébiotiques ou probiotiques pour restreindre ces symptômes.

Procédures

Nous effectuerons des recueils fécaux (3 crottes) sur animal vigil sur toutes les souris. Le matin (9h) les animaux seront isolés durant 1h maximum, pour la récupération des fèces (3 crottes). Les souris sont ensuite remises dans leurs cages initiales. Les souris recevront des gavages récurrents, chaque gavage dure environ 20 secondes (contention comprise), au total 13 gavages seront effectués sur un même animal. Des tests comportementaux seront effectués sur les animaux afin d’évaluer le comportement lié à la consommation d’alcool. Chacun des tests sera réalisé une fois sur chaque animal. L’ensemble des tests comportementaux sera au total de 1 heure maximum pour chaque animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour ces animaux sont modérées dans la mesure où les souris sont hébergées seules durant toutes les procédures. Le gavage pour la transplantation de microbiote fécal sera fait par des chercheurs expérimentés, réduisant le risque d’une fausse route ou de lésion mécanique. Néanmoins, bien que le geste technique soit maitrisé par les expérimentateurs, il peut y avoir exceptionnellement des lésions mécaniques. Les tests comportementaux, bien qu’indolores, entraînent une sortie du cadre familier, ce qui peut provoquer un inconfort passager (anxiété légère, agitation, baisse d’exploration ou d’appétit). Ces nuisances sont transitoires et limitées.

Devenir

Au terme des procédures, les souris seront euthanasiés pour analyse post mortem des cerveaux, intestins, foie et le séquençage du microbiote.

Remplacement

Dans l’état actuel des connaissances modéliser in vitro ou in silico les mécanismes biologiques des troubles de l’usage d’alcool n’est pas possible. Dans le cadre de ce projet, il s’agit d’évaluer une consommation d’alcool dépendante du microbiote intestinal et d’analyser l’état de la barrière digestive dont le système nerveux intestinal et d’analyser l’impact de ce microbiote intestinal sur des dysfonctions d’organes tels que le foie et le cerveau. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire pour étudier les interactions entre ces différents organes, le microbiote intestinal et le comportement lié à l’usage d’alcool.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique, en se basant sur la littérature précédente dans le même domaine. L'élément le plus important pour la réduction est l'utilisation des mêmes animaux est d’étudier de manière séquentielle dans les procédures, le trouble de l’usage à l’alcool, le syndrome d’anxiété lié au sevrage et la rechute après abstinence.

Raffinement

Au cours des semaines une surveillance quotidienne sera entreprise pour veiller au bien-être des animaux (quantité de boisson et de nourriture adéquats). Un suivi du poids des animaux, de la qualité de la fourrure des animaux seront pratiqués de façon hebdomadaire la quantité de boisson ingérée eau et alcool sera mesurée tous les jours. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués tout au long du projet.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car les mécanismes cellulaires développés dans le trouble de l’usage d’alcool sont proches de ceux observés chez l’homme. Cette espèce est largement utilisé dans la littérature comme modèle de consommation d’alcool. L’évaluation pour l’addiction à l’alcool et les tests comportementaux seront effectués sur des souris adultes (à partir de 6 semaines), puisque nous nous intéressons à cette pathologie chez l’adulte.

Enfermées quatre jours dans des cages de 330 cm² sans possibilité de se suspendre, des souris reçoivent des chimiothérapies utilisées contre le cancer du sein, par injections espacées d'une à trois semaines. 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent des tests de force et de fonction musculaire ainsi que des tests d'effort maximal de dix à vingt minutes, avant et après le traitement. Le porteur décrit la réduction de l'espace comme une "altération mineure du bien-être animal" à "faible nuisance physiologique", alors que le projet l'organise pour aggraver la fonte musculaire provoquée par la chimiothérapie.

Objectifs

La chimiothérapie utilisée pour traiter le cancer du sein précoce entraîne de nombreux effets secondaires sur le muscle squelettique, affectant à la fois sa quantité et sa qualité. Les patientes traitées présentent diverses altérations musculaires, comme une atrophie, qui contribuent à la diminution des capacités fonctionnelles. Ces altérations, observées après un traitement par chimiothérapie, varient en fonction de la molécule utilisée. Par ailleurs, la réduction de l’activité physique, fréquemment observée chez les patientes, aggrave probablement ces altérations musculaires. En effet, la diminution des contraintes mécaniques et métaboliques exercées sur les muscles entraîne des effets similaires à ceux induits par la chimiothérapie. L'interaction entre ces deux facteurs reste difficile à dissocier chez la patiente, ce qui justifie l’utilisation d’un modèle animal. À l'inverse, l’exercice, qui augmente les stimuli mécaniques et métaboliques, pourrait prévenir ces altérations, bien que ces bénéfices n’aient été observés que chez des sujets sains avec des preuves scientifiques robustes. Cependant, les effets aigus, chroniques et différés de l'exercice dans le contexte de l'atrophie musculaire induite par la chimiothérapie demeurent largement méconnus. Ce projet a pour objectif d'étudier, dans un modèle murin, l'impact de la modulation de l’activité physique sur l’atrophie musculaire induite par la chimiothérapie. L’étude 1 caractérisera les effets combinés de la réduction de l’activité physique et des chimiothérapies sur les altérations musculaires, tandis que l’étude 2 explorera les effets aigus, chroniques et différés de l’exercice sur ces altérations. MODIFICATION : PLUS PRECISEMENT, LE TURNOVER PROTEIQUE, QUI COMPREND LA SYNTHESE ET LA DEGRADATION PROTEIQUE), SERONT ETUDIES AFIN D’AVOIR DE COMPRENDRE LES MECANISMES QUI REGULENT LA MASSE MUSCULAIRE.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples au niveau fondamental et au niveau de l’application clinique possible. Tout d’abord, la caractérisation de l’interaction entre la réduction du niveau d’activité physique et la chimiothérapie sur les altérations musculaires permettra de proposer un modèle murin plus proche de la réalité clinique. En effet, étant donné que les patientes atteintes d’un cancer du sein ont une réduction de leur niveau d’activité physique après l’administration de chimiothérapie, il est probable que cette réduction, induite dans le modèle murin, exacerbe les effets de la chimiothérapie sur le tissu musculaire. D’autre part, l’étude des effets aigus, chroniques et différés de l’exercice permettra d’un point de vue fondamental de caractériser les voies de signalisation cellulaires sous-jacentes et d’un point de vue clinique d’adapter la prise en charge des patientes. En effet, nous pensons que de manière aigue, l’exercice pourrait prévenir une partie des altérations musculaires. Si nous montrons ces bénéfices, cela aboutira à une preuve de concept et un changement de prise en charge clinique. Il sera alors recommandé de pratiquer de l’exercice juste avant l’administration de chaque dose de chimiothérapie. Enfin, la caractérisation des effets différés de l’exercice et de la chimiothérapie permettra d’indiquer aux patientes si la pratique d’exercice spécifique doit se poursuivre au-delà du traitement.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, nous allons administrer des traitements de chimiothérapies. Pour l'étude avec administration aigu : une injection sur animal vigile, d'une durée de quelques secondes, sera effectuée sur les animaux. Lorsque les chimiothérapies seront administrées par injection de manière chronique, celles-ci seront espacées de 1 à 3 semaines selon le type de molécule administrée. Pour répondre aux questions scientifiques, les souris de l’étude avec administration aigue seront placées dans des cages individuelles, tandis que celles du groupe "réduction d’activité" seront hébergées dans des cages de dimensions réduites (330 cm², sans possibilité de suspension). la durée de ce maintien cage individuelle avec ou non réduction de la surface au sol disponible sera de 4 jours. Deux tests de force et de fonction musculaire seront réalisés, pour une durée inférieure à 5 minutes. Ces tests seront effectués avant et 4 jours après l’administration de la chimiothérapie dans le cadre des expérimentations aiguës, ou avant et après l’ensemble du traitement par chimiothérapie pour les expérimentations chroniques et différées. Dans le cadre des expérimentations chroniques et différées, des tests d’effort maximaux seront réalisés, d’une durée de 10 à 20 minutes, avant et après l’ensemble du traitement par chimiothérapie. MODIFICATION : POUR L’ENSEMBLE DES EXPERIMENTATIONS, UNE INJECTION D'UNE MOLECULE PERMETTANT DE MESURER LES FLUX DE PROTEINES DE 1 A 2 SECONDES SERA REALISEE SUR ANIMAL VIGILE.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, l'administration des chimiothérapies entraîne une douleur légère à modérée au site d'injection, de courte durée MODIFICATION : ET PEUT ENTRAINER DES PERTES DE POIDS. La répétition des injections, bien qu’alternées entre les côtés injectés et espacées d’au minimum 1 semaine, pourrait induire une légère induration locale et un stress modéré lié à la contention, d’intensité croissante avec le nombre de manipulations. Les manipulations répétées pour les séances d’exercice et les évaluations (force, fonction musculaire et vitesse maximale à l'exercice) induisent un stress modéré, de durée variable selon la fréquence des manipulations. Dans l’étude 1, le placement des animaux dans des cages individuelles pendant une courte durée entraîne une altération mineure du bien-être animal, sans impact significatif sur l’anxiété ou les capacités cognitives. Le placement en cage individuelle sera limité à 4 jours, réduisant ainsi son impact potentiel. Pour le groupe de réduction d’activité, le placement dans des cages de dimensions réduites (330 cm² sans possibilité de suspension) entraîne une réduction des opportunités de mouvement, avec une faible nuisance physiologique et une intensité limitée sur le bien-être, en accord avec les études précédentes.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements tissulaires post-mortem nécessaires aux analyses prévues.

Remplacement

Pour comprendre le rôle de la modulation du niveau d’activité physique dans le déconditionnement musculaire induit par la chimiothérapie, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, il n’existe pas à ce jour un modèle in vitro permettant de réduire le niveau d’activité physique et les modèles d’électrostimulation utilisés pour mimer l’exercice sont incomplets. De plus, pour comprendre les aspects fonctionnels (force et fonction musculaire), le recours à un modèle in vivo est nécessaire.

Réduction

L'équipe de recherche bénéficie de l’expérience et de l’expertise nécessaire pour permettre la mise en place d’expérimentations de qualité avec un nombre de souris réduit au minimum mais suffisant pour les analyses statistiques. Pour rappel, l’étude 1 vise à caractériser la contribution de la réduction du niveau d’activité physique dans le déconditionnement musculaire induit par une administration de chimiothérapie. Pour calculer mathématiquement le nombre d'animaux par groupe, le critère de jugement principal sest basé sur le degré d’atrophie mesuré au niveau histologique par la surface de section des fibres musculaires encore appelé taille de l'effet. Sur la base de la littérature, la chimiothérapie peut en moyenne induire une atrophie de 17, 9%. Les résultats obtenus seront comparés grâce à des analyses statistiques adaptées permettant de mettre en évidence l'effet de la réduction d'activité physique sur l'atrophie induite par la chimiothérapie.

Raffinement

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont maitrisées. Le bien-être des animaux sera constamment surveillé, et toute modification du comportement, telle que la manifestation de souffrance ou d'angoisse, sera immédiatement rapportée aux responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour mettre en place les mesures correctives nécessaires. En cas de signes de douleurs, un avis au vétérinaire sera demandé.Avant le début des procédures, les animaux seront habitués aux conditions environnementales et manipulés pour les habituer aux expérimentateurs ainsi qu'à la contention nécessaire à la réalisation des injections. Pour enrichir l’environnement des souris, les cages seront équipées de matériaux et d'objets adaptés pour leur permettre de nidifier et ronger. Les souris seront maintenues en groupes sociaux et, pour une des études, individualisées uniquement lorsque cela sera nécessaire pour atteindre les objectifs et la durée du placement en cage individuelle sera de durée très limitée (4j). Nous observerons attentivement la locomotion des souris afin de détecter tout signe de boitement ou de difficulté à se déplacer, ce qui pourrait indiquer des effets secondaires inattendus de la chimiothérapie. En parallèle, nous évaluerons régulièrement l'aspect général des animaux, incluant leur posture, leur tonus musculaire, leur comportement dans la cage, l'état de leur pelage et leur poids corporel via des grilles de scoring pour lesquelles des mesures correctives ainsi que des points limites ont été définies pour interrompre les procédures et limiter la souffrance animale. Pour exemples, en cas de signes de faiblesse musculaire, affectant potentiellement leur capacité à s'alimenter ou à se mouvoir, nous fournirons de la nourriture en gel en complément de leur régime alimentaire standard. Une réhydratation sous-cutanée pourra également être mise en place.

Choix des espèces

L’utilisation de modèles cellulaires est impossible pour comprendre le rôle de la modulation du niveau d’activité dans le déconditionnement musculaire induit par la chimiothérapie. Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel nous disposons de tous les outils nécessaires pour mener à bien cette étude. La souris présente un intérêt particulier du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l’Homme (99% d’identité de gènes avec l’Homme), tant au niveau histologique et cellulaire qu’au niveau du type de réponses aux traitements. L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle de la modulation du niveau d’activité physique sur le déconditionnement musculaire induit par la chimiothérapie utilisée chez les patientes atteintes d’un cancer du sein. Ainsi, pour se rapprocher de la réalité clinique, nous travaillerons sur des souris adultes (8 mois post natal environ). En effet, dans nos études cliniques, aucune patiente n’était âgée de moins de 26 ans. Conformément aux équivalences entre âge souris/humain, une souris de 8 mois correspond à un humain d’âge moyen.