Souris
Induction de tolérance au facteur VIII par thérapie génique dans un modèle murin hémophile A
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 666 souris vont être utilisées, dont 942 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est hémophile sévère, exposée à une hémorragie au moindre traumatisme, et reçoit jusqu'à dix injections sous anesthésie, quatre à sept prélèvements sanguins et une biopsie de queue pour le génotypage. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes lymphoïdes, celles qui n'ont pu entrer dans les procédures étant versées à d'autres projets quand c'est possible. Le porteur annonce une "preuve de concept" et des retombées en thérapie humaine à moyen terme, quand les injections, les prélèvements et le risque hémorragique courent, eux, sur toute la durée du projet.
Objectifs
L’hémophilie A est un trouble hémorragique héréditaire lié à un déficit en facteur VIII de la coagulation. 30 pourcents des patients hémophiles A traités avec du facteur VIII thérapeutique (afin de rétablir la coagulation) développent une réponse immunitaire contre le FVIII. L’apparition des anticorps anti-FVIII complique énormément la qualité de vie des patients et augmente considérablement le coût de leur prise en charge. Le but de ce projet est d’exploiter la thérapie génique pour induire une tolérance envers le facteur VIII. La thérapie génique ici consiste à introduire une copie fonctionnelle du gène codant le facteur VIII (transgène) dans les cellules hépatiques de l'hôte afin de restaurer la production endogène de facteur VIII. De nombreuses études dans divers modèles précliniques de pathologies humaines (hémophilie B, diabète de type 1, encéphalomyélite autoimmune expérimentale, ...) indiquent que la thérapie génique permet d’induire une tolérance envers la protéine que l’on fait produire par l’organisme. Pourtant, les expériences effectuées chez les souris hémophiles A sont décevantes, probablement en raison des faibles niveaux de facteur VIII exprimés après thérapie génique. L'objectif de ce projet est dans un premier temps de démontrer que la quantité de facteur VIII produit après thérapie génique est trop faible pour permettre une induction de tolérance du système immunitaire vis-à-vis du facteur VIII. Dans un deuxième temps, nous testerons la possibilité d’induire une tolérance immunitaire spécifique au facteur VIII en utilisant des transgènes correspondants à des fragments de facteur VIII (mieux exprimés par les cellules) au lieu de la protéine entière pour la thérapie génique. L’induction de tolérance vis-à-vis du facteur VIII représente un intérêt scientifique et clinique majeur. Son utilisation chez les patients pourrait améliorer considérablement les conditions de vie des patients hémophiles A et diminuerait le coût de leur prise en charge. Les différents aspects de notre projet sont évalués par des comités scientifiques indépendants qui, sur la base de l’intérêt scientifique des questions posées, décident de financer notre recherche.
Bénéfices attendus
Nous anticipons plusieurs bénéfices du projet avec des retombées en thérapie humaine à moyen terme. Tout d’abord nous aurons une confirmation que la concentration de protéine produite après thérapie génique est bien le facteur contrôlant l’établissement de la tolérance immunitaire dans le contexte d'une thérapie génique. Cette observation encouragera des recherches complémentaires destinées à augmenter l'efficacité de production des protéines dont l'expression est induite par thérapie génique. Nous apporterons la preuve de concept que la thérapie génique à l’aide de transgènes codant pour des fragments de la protéine d’intérêt permet d’induire une tolérance immunitaire complète contre cette protéine. Il y aura une application directe dans l'hémophilie A (maladie rare concernant 1 homme sur 10000 naissances) où le Facteur VIII de la coagulation est très mal produit par les cellules, et où la production de fragments protéiques transgéniques représente une alternative prometteuse. Nous apporterons aussi la preuve que cette stratégie fonctionne dans un contexte d’alloimmunité (réponse immunitaire non-désirée contre un médicament par exemple comme chez l'hémophile A) et dans un contexte d’autoimmunité (par exemple l'hémophilie A acquise qui concerne 1 à 5 personnes par million). Enfin, nous validerons une nouvelle approche thérapeutique basée sur l’exploitation du potentiel tolérogène de cellules T régulatrices exogènes qui pourrait avoir de multiples applications, notamment dans les situations d'hépatites autoimmunes (1 cas pour 6000 individus).
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections sous anesthésie. Jusqu'à 10 injections maximum seront réalisées (dont 8 injections hebdomadaire et 2 injections espacées de 2 semaines). Ces injections demandent moins de 1 minute d’immobilisation de l’animal. Les animaux seront également soumis à des prélèvements de sang sous anesthésie: 4 à 7 prélèvements d’une durée inférieure à 1 minute seront réalisés. Ces prélèvements seront réalisés à une fréquence hebdomadaire pour certaines procédures.
Impact sur les animaux
Un des modèles utilisés est un modèle préclinique de l'hémophilie A sévère, des risques hémorragiques sont possibles en cas de blessure ou traumatisme et demandent donc une adaptation de certaines procédures. L'induction d'un hématome, d'une hémorragie, d'une douleur ou d'une lésion lors des injections et des prélèvements sont possibles. L'induction d'un saignement et d'une douleur lors de la biopsie pour le génotypage est possible. L'induction d'une détresse respiratoire ou d'une hypothermie est possible lors de l'anesthésie, de même qu'un stress lors du réveil.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Une première partie dans le but de collecter les organes lymphoïdes pour l' évaluation de la réponse immunitaire ou pour des analyses ultérieures. Une seconde partie des animaux produits dans ce projet ne seront pas prélevés car ils ne pourront être inclus dans les procédures. Ils seront néanmoins si cela est possible inclus dans d'autres projets préalablement autorisés.
Remplacement
Le projet fera appel à différents modèles expérimentaux chez la souris. En effet, seule une approche expérimentale in vivo permet de rendre compte de la complexité des systèmes biologiques (notamment l’induction d'une réponse immunitaire ou d'une tolérance au FVIII). Néanmoins, les différentes constructions ont été validés sur des cellules in vitro (production/ sécrétion). Par ailleurs, toute information obtenue par l’expérimentation animale sera immédiatement transposée à des systèmes in vitro pour analyses ultérieures.
Réduction
Un nombre maximum de 1666 animaux sera utilisé pour ce projet. Le nombre de répétitions des expériences sera défini de manière rationnelle : si une expérience donne des résultats statistiquement significatifs avec une puissance appropriée, elle ne sera pas répétée, sinon elle sera répétée une à deux fois maximum. Les organes, sérum et cellules des souris euthanasiées en fin d’expérience seront conservés; ainsi, aucune expérience supplémentaire ne sera faite si des questions nouvelles surviennent. Nous optimiserons aussi les contrôles de manière à minimiser le nombre de groupes de souris. Enfin, les enseignements tirés des premières procédures seront utilisés pour réduire le nombre de groupe par lot dans les procédures suivantes.
Raffinement
Les souris seront hébergées en accord avec les lois d’éthique françaises. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées avec le personnel de l’animalerie. Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum (5 souris maximum par cage, ajout de nids végétaux et de tunnels en carton). Tout geste (injection/ prélèvement) susceptible d'entraîner une douleur/ souffrance sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Du matériel stérile et exempt d’endotoxine sera utilisé afin de réduire au maximum le risque de lésion/ inflammation lors des injections/ prélèvements. Des points limites ont été définis et les animaux malades seront soignés ou euthanasiés.
Choix des espèces
La seule alternative connue est l’utilisation d’un modèle canin hémophile. Cependant, la souris est la seule espèce qui permettent d’avoir un nombre d’individus de même âge suffisant, et de génotype homogène, qui permette l’obtention de résultats statistiquement fiables, et pour lequel les outils nécessaires à l’étude de la réponse immunitaire sont disponibles sans restriction. Des souris adultes, âgées de 7-14 semaines en début d’expérimentation (systèmes immunitaires matures) seront utilisées.
Développement d’anticorps de type VHH dirigés contre la protéine prion chez le rongeur, à visée diagnostique et/ou thérapeutique
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Chaque souris reçoit six injections d'immunogènes espacées de trois semaines, six prélèvements sanguins, puis trois injections supplémentaires dans les cinq jours précédant sa mise à mort. 100 souris sont utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire des nanocorps dirigés contre la protéine prion. Le porteur décrit ces quinze interventions comme de "légères gênes temporaires" qui ne devraient entraîner "ni douleur importante ni effet durable", quand la gravité déclarée du projet est modérée. Toutes sont tuées dès que la réponse en anticorps est jugée correcte, pour prélever la rate.
Objectifs
Ce projet a pour but de produire un type particulier d’anticorps appelés VHH ou nanocorps. Ces anticorps sont beaucoup plus petits que les anticorps classiques. Leur petite taille est intéressante car elle leur permettrait, en théorie, de franchir plus facilement la barrière protectrice qui sépare le sang du cerveau. Cela ouvre la possibilité d’imaginer un jour des traitements pour des maladies qui touchent directement le système nerveux. Nous voulons produire ces anticorps contre la protéine prion (PrP). Cette protéine est responsable des maladies à prion, qui touchent l’animal et l’Homme, et qui sont toujours fatales car il n’existe actuellement aucun traitement. Les nanocorps obtenus pourraient servir à mieux comprendre comment ces maladies se développent, à améliorer leur diagnostic et à explorer de nouvelles pistes de traitement. Nous cherchons aussi à produire des nanocorps capables de reconnaître non seulement la forme « normale » de la protéine prion, mais aussi certaines formes anormales associées aux maladies. Cela permettrait d’obtenir des anticorps plus spécifiques et plus utiles que ceux dont nous disposons aujourd’hui. Enfin, la protéine prion est également impliquée dans d’autres maladies, comme certains cancers ou encore la maladie d’Alzheimer et de Parkinson. La production de nanocorps dirigés contre la protéine prion pourrait donc avoir un intérêt bien au-delà des seules maladies à prion, et bénéficier à un domaine plus large de la recherche biomédicale.
Bénéfices attendus
Les anticorps de type VHH, aussi appelés nanocorps, sont des outils innovants qui possèdent plusieurs avantages par rapport aux anticorps classiques. Leur petite taille leur permet de se fixer sur des cibles difficiles d’accès et, en théorie, de franchir la barrière protectrice qui sépare le sang du cerveau. Cela ouvre des perspectives uniques pour envisager un jour des traitements de maladies qui touchent directement le système nerveux. Ils sont aussi très stables, faciles à produire en laboratoire et peuvent être utilisés sous différentes formes pour la recherche, le diagnostic ou le traitement. Ces nanocorps sont déjà étudiés dans d’autres maladies humaines, par exemple certains cancers, des maladies infectieuses, ou encore des maladies neurodégénératives comme Alzheimer et Parkinson. Leur potentiel d’application est donc très large. À ce jour, il n’existe aucun nanocorps dirigé contre les maladies à prion. Ce projet vise à combler ce manque en développant une nouvelle génération d’anticorps contre la protéine prion. L’intérêt dépasse les maladies à prion elles-mêmes, car la protéine prion est aussi impliquée dans d’autres pathologies. Les bénéfices de ce projet seront donc multiples : - fournir de nouveaux outils de recherche pour mieux comprendre le rôle de la protéine prion, - permettre un diagnostic plus précoce et plus précis des maladies à prions, - et à plus long terme, ouvrir des pistes thérapeutiques innovantes grâce à la petite taille des nanocorps, qui pourrait leur permettre d’atteindre le cerveau et de cibler spécifiquement les formes anormales de la protéine prion.
Procédures
100 souris sont prévues pour le projet. Pour chaque animal, les gestes techniques seront les suivants : - injection d’analgésique avant injection des immunogènes à hauteur de 6 injections toutes les 3 semaines sur animaux vigile. Il faut compter 30 secondes par intervention. - Injections des immunogènes à hauteur de 6 injections toutes les 3 semaines sur animaux vigiles. Il faut compter 1 minute maximum par intervention (contention et injection) - Prélèvements sanguins sur animaux vigiles 1 prélèvement avant la première injection puis toutes les 2 semaines après chaque immunisation, soit 6 prélèvements. Il faut compter 2 minutes par intervention (contention, prélèvement puis massage de la joue) - Cinq jours avant la mise à mort, 3 injections toutes les 24h d’immunogènes sur animaux vigiles. Il faut compter environ 1 minute par intervention (contention et injection).
Impact sur les animaux
Les interventions prévues (injections et prises de sang) peuvent provoquer de légères gênes temporaires chez les souris, mais elles ne devraient pas entraîner de douleur importante ni d'effet durable. Les effets observés peuvent être une petite rougeur ou un léger gonflement à l'endroit de l'injection ou de la prise de sang ; une sensibilité locale passagère ; un léger inconfort dans les heures suivant la manipulation. Il peut arriver que certains animaux soient un peu moins actifs ou mangent un peu moins pendant un jour ou deux, ou qu'ils perdent légèrement du poids. Ces effets disparaissent généralement rapidement, sans conséquence sur leur état général.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la campagne d’immunisation quand les réponses en anticorps seront correctes afin de prélever la rate.
Remplacement
Il existe aujourd’hui des méthodes permettant de produire des anticorps sans utiliser d’animaux, par exemple des techniques de sélection réalisées uniquement en laboratoire., Cependant, ces approches n’aboutissent pas encore à des anticorps de même qualité que ceux produits par le système immunitaire d’un animal. En effet, l’organisme possède un mécanisme naturel qui « améliore » progressivement les anticorps pour qu’ils se fixent très efficacement à leur cible, un processus qui ne peut pas être reproduit artificiellement avec les techniques actuelles. Dans ce projet, les souris sont utilisées pour générer des cellules capables de produire durablement des anticorps. Ces cellules seront ensuite immortalisées en laboratoire et permettront de produire les anticorps sur le long terme, sans avoir à réutiliser de nouveaux animaux pour chaque antigène ou chaque série d’expériences.
Réduction
Le nombre de 5 souris par antigène a été déterminé à partir d’un calcul statistique. L’objectif est de garantir, avec une forte probabilité, que au moins deux souris par lot développent une bonne réponse immunitaire. Cela est nécessaire pour pouvoir utiliser leurs cellules et produire les anticorps sans avoir à recommencer tout le protocole depuis le début. En pratique, il est bien connu qu’une ou deux souris sur cinq peuvent ne pas répondre correctement aux immunisations. Le choix de 5 animaux tient donc compte de cette variabilité naturelle tout en évitant d’utiliser plus de souris que nécessaire. De plus, si la première tentative de production d’anticorps en laboratoire échoue (ce qui est rare), les trois souris restantes du lot servent de filet de sécurité. Cela permet de refaire un essai sans devoir réimmuniser un nouveau groupe d’animaux, ce qui contribue directement à réduire leur nombre sur l’ensemble du projet.
Raffinement
Trente minutes avant l’intervention les animaux recevront une injection d’analgésique. Après les interventions, les animaux seront surveillés et placés sur un tapis chauffant à 37°C pendant 2 heures pour favoriser leur récupération. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Les lignées de souris de laboratoires sont classiquement utilisées pour l’immunisation et la production d’anticorps. Les souris transgéniques exprimant des anticorps de camélidés évitent le recours à ces espèces, protocole beaucoup plus difficile à mettre en œuvre. De jeunes adultes (6 à 8 semaines) seront utilisés au démarrage des immunisations ; ils ont en effet la maturité immunologique nécessaire pour produire de bonnes réponses immunitaires lors des immunisations successives.
PRELEVEMENT DE PRODUITS BIOLOGIQUES D’ORIGINE ANIMALE SUR RONGEURS
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Rats : 575
Fournir aux laboratoires du sang, de la bile, du liquide cérébral, de l'urine et des fèces de rongeurs sains : 3 700 souris et rats vont être utilisés, dont 825 anesthésiés puis prélevés sans jamais être réveillés. Les autres passent jusqu'à seize heures en cage à métabolisme, quatre nuits par semaine pendant deux semaines, à jeun et parfois isolés. Tous sont ensuite tués. Le porteur présente ces animaux comme des "surplus de stock" d'élevage et décrit un service de fourniture interne, les scientifiques demandeurs devant justifier que les matrices in vitro ne permettent pas "d'atteindre les résultats attendus".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de collecter sur des rongeurs (rats et souris) sains sans maladie des produits du corps : sang, liquide cérébral, bile, urine, fécès. Ces fluides servent par la suite à développer ou vérifier l’efficacité de tests de diagnostiques (tests permettant de vérifier l’absence ou la présence d’une maladie par exemple) ou servent dans des études regardant le devenir du médicament et sa toxicité dans le corps. Il n’est parfois pas possible de prélever ces produits sur animal non vivant car sinon la qualité ou la quantité n’est pas conforme aux besoins de la communauté scientifique pour des résultats fiables et pertinents (après la mort, le produit se détériore trop vite ; trop de produit est nécessaire ce qui demanderait de prélever beaucoup d’animaux après leur mort). Les produits sont donc collectés sur des rongeurs vivants si cela n’est pas douloureux (urine et fécès collectés grâce à un système collecteur le permettant dans la cage) ou sur rongeurs endormis et dont la douleur a été contrôlée et qui ne seront pas réveillés.
Bénéfices attendus
Les produits collectés servent dans la santé humaine et vétérinaire. Ils servent par exemple à développer ou vérifier l’efficacité de tests de diagnostiques (tests permettant de vérifier l’absence ou la présence d’une maladie par exemple) ou servent dans des études regardant le devenir du médicament et sa toxicité dans le corps.
Procédures
Prélèvement d’urines et de fécès pendant maximum 16 heures maximum 4 nuits par semaine sur maximum 2 semaines dans des cages permettant la collecte d’urines et fécès (présence de grilles pour collecte) pour les animaux entrant dans la procédure de collecte d’urines et fécès Une à deux injections (d’une durée de 10 secondes maximum par injection) d’analgésiques pour les animaux entrant dans la procédure de collecte de produits biologique sous anesthésie / analgésie générale Anesthésie générale d’une heure maximum pour les animaux entrant dans la procédure de collecte de produits biologique sous anesthésie / analgésie générale Collecte de produits biologiques (d’une heure maximum) sans réveil pour les animaux entrant dans la procédure de collecte de produits biologique sous anesthésie / analgésie générale
Impact sur les animaux
Dans le cadre de prélèvements d’urine ou de fécès, les animaux sont soumis à un hébergement en cage à métabolisme pendant une durée maximale de 16 heures maximum 4 nuits par semaine sur maximum 2 semaines. Hébergement isolé possible dans le cadre de prélèvements d’urine ou de fécès pour une durée maximale de 16 heures Mise à jeûn alimentaire dans le cadre de prélèvements d’urine ou de fécès pour une durée maximale de 16 heures 4 nuits par semaine sur maximum 2 semaines Stress dû à la contention et à l’induction d’une analgésie / anesthésie générale dans le cadre de prélèvements de produits biologiques d’origine animale sur animaux anesthésiés et analgésiés mais non réveillés
Devenir
Dans le but de réduire l’utilisation d’animaux (règles des 3R), les animaux ayant subi uniquement un prélèvement d’urine ou de fécès proviendront de nos surplus de stock puis mis à mort. Dans le cadre des animaux prélevés sous anesthésie / analgésie générale, tous les animaux sont mis à mort.
Remplacement
De nombreuses supports in vitro existent afin de mimer les produits biologiques d’origine animale et ont permis de réduire l’utilisation des animaux pour les études en question. Cependant, dans certains cas, ces matrices ne permettent pas d’atteindre les résultats attendus et une fiabilité forte des résultats (échec du diagnostic recherché par le test diagnostique, pas de possibilité de valider la matrice comme témoin pour des études de pharmacocinétique ou toxicologie). L’objectif du projet est donc de fournir aux scientifiques des produits biologiques d’origine animale de rongeurs (sang, sérum, plasma, organe, fluides) lorsque l’utilisation de matrices in vitro n’est pas possible. Une justification de l’obligation de l’utilisation de ces produits d’origine animale est demandée aux scientifiques avec support de la SBEA.
Réduction
Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont des animaux de surplus de stock. Grâce à l’application de ces procédures au sein de nos zones d’élevage plutôt que chez les scientifiques (pas de remise en stock possible), aucun animal n’est produit volontairement pour l’application de ces procédures, contribuant donc à la réduction du nombre d’animaux utilisés dans le cadre de ce projet. Sur la base de notre expérience passée dans ce type de prélèvements, des tableaux sont à notre disposition afin de calculer au plus près le nombre d’animaux nécessaires en fonction du poids, du sexe et de la souche de l’animal. Les méthodes de calcul sont régulièrement revues pour utiliser le moins d’animaux possible pour le besoin attendu. La meilleure balance nuisances / nombre d’animaux utilisés sur une durée maximale de 10 jours (temps de conservation de l’urine au réfrigérateur) sera effectuée avec support de la SBEA.
Raffinement
Les produits biologiques d’origine animale peuvent également être collectés sur animaux après la mort, en post mortem. La pertinence de prélèvements de ces fluides sur animal vigile peut donc être demandée en amont au scientifique (en cas volume concordant avec un prélèvement post mortem pour les urines et les fécès et en cas de faisabilité en postmortem pour les prélèvements sous anesthésie/analgésie) avec si besoin support de la SBEA. Lors des collectes sur animal anesthésié, une anesthésie adéquate ainsi qu’une analgésie couvrant la totalité de la procédure sera effectuée. Des points limites spécifiques et suffisamment prédicitfs ont été définis et seront appliqués pour chaque procédure. Les animaux sont manipulés selon de bonnes pratiques de manipulation (main en coupe, tunnel, …). Une récompense alimentaire type graines de tournesol sera proposée lors de la remise en cage d’hébergement des animaux dans le cadre des prélèvements d’urines et de fécès.
Choix des espèces
Les produits biologiques d’origine animale sont utilisés d’une part dans le cadre de réalisation de tests diagnostiques qui ont été créés à partir des espèces souris et rat d’où l’utilisation de ces espèces ; d’autre part dans le cadre d’études de toxicologie dans lesquelles sont inclus principalement les espèces souris et rat. Le prélèvement de sang, d’organe ou de fluide pourra être réalisé sur des rongeurs de la naissance jusqu’au stade âgé, en fonction du besoin du scientifique. En cas de demande de prélèvement sur animaux non sevrés ou gestantes, un accord préalable de la SBEA sera demandé.
Phénotypage/génotypage par prélèvement sanguin de lignées murines génétiquement modifiées, modèles pour l’étude des cellules myéloïdes
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Remises en accouplement pour produire de nouvelles portées, 2 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une contention et un ou deux prélèvements sanguins de quelques secondes, destinés à vérifier la fluorescence de ses cellules immunitaires. Ce projet entretient des lignées génétiquement modifiées destinées à d'autres travaux sur les macrophages, le porteur revendiquant un élevage calibré pour qu'un maximum de descendants portent le bon génotype. Celles qui ne le portent pas sont versées à d'autres projets déjà autorisés ou tuées pour prélever leurs organes.
Objectifs
Le projet a pour objectif d’assurer le suivi de lignées de souris génétiquement modifiées présentant des cellules immunitaires (monocytes et macrophages) avec différentes fluorescences permettant d’étudier leur complexité lors de processus physiologiques ou pathologiques. Le génotypage de ces souris nécessite un prélèvement sanguin pour analyser la fluorescence des cellules immunitaires.
Bénéfices attendus
Les études récentes montrent une implication de plus en plus importante des cellules immunitaires et en particulier des macrophages dans de nombreuses pathologies, notamment le cancer et les maladies inflammatoires. Cette étude de la physiologie des macrophages au sein de différents tissus permettra à moyen terme de mieux comprendre leur hétérogénéité et leur complexité notamment en présence des différents systèmes hormonaux. A plus long terme ce projet permettra d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre des immunothérapies.
Procédures
Les animaux au cours de ce projet seront soumis à une contention d’immobilisation et d‘un ou deux prélèvements sanguins. Ces gestes ont une durée de quelques secondes à une minute par animal.
Impact sur les animaux
Le principal effet indésirable attendu est la génération de stress lors de la contention et du prélèvement sanguin. Les prélèvements sanguins peuvent également provoquer un hématome dans de rares cas.
Devenir
A la fin de la procédure expérimentale les animaux seront remis en accouplement pour la génération de nouvelles portées dans le cadre du maintien et du développement des lignées. Ils seront utilisés en continu dans le cadre de projets expérimentaux autorisés ou mis à mort s'ils ne possèdent pas les gènes d'intérêt ou pour le prélèvement d'organes.
Remplacement
Nous disposons de modèles cellulaires et de tissus de patients nous permettant d’étudier les macrophages dans des systèmes simples. Cependant l’étude dynamique de la complexité des populations de macrophages et de leur localisation dans différents tissus et notamment de l’impact des systèmes hormonaux sur ces populations nécessite l’utilisation de modèles animaux.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux générés dans cet élevage, nous faisons particulièrement attention aux génotypes des parents afin qu’un maximum des descendants ait le bon génotype. Nous contrôlons le nombre de couples afin de ne pas générer d’excédent d’animaux. Les animaux dont le génotype ne correspond pas sont dans la plupart des cas utilisés dans le cadre d'autres projets déclarés afin de ne pas produire d'animaux inutilement. Les mâles et femelles sont utilisés ensemble ou indépendamment en fonction des projets.
Raffinement
Nous accordons un point important à la formation du geste technique des zootechniciens réalisant les prélèvements sanguins. Le prélèvement de sang est limité au strict nécessaire. Concernant l'hébergement, les animaux disposent dans leur une cage de trois types d'enrichissements : du papier kraft, des carrés de coton et une maison en cellulose pour le confort des animaux leur permettant d’exprimer leurs besoins naturels de nidification.
Choix des espèces
L'étude de la complexité des populations de macrophages dans les différents tissus dans des conditions physiologiques et pathologiques et particulièrement de l’impact des systèmes hormonaux sur ces populations sont des éléments importants pour comprendre le fonctionnement et le rôle du système immunitaire. Les souris génétiquement modifiées utilisées sont un moyen unique de suivre et d'étudier les cellules immunitaire d'intérêts grace à leur fluorescence.
Evaluation de l’intéret thérapeutique de molécules chimiques pour traiter l’amyotrophie spinale
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Les souris utilisées naissent avec une amyotrophie spinale, les plus atteintes étant incapables de se déplacer, de s'alimenter ou de respirer normalement et mourant vers dix jours. 2 168 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever muscles, cœur, cerveau et moelle épinière. Elles reçoivent des injections répétées dans la veine, dans le bas du dos ou directement dans le cerveau, jusqu'à une par semaine pendant six mois. Le porteur décrit chez la lignée moins atteinte des nécroses sèches qui gagnent la queue puis les oreilles, et affirme qu'elles n'entravent pas le comportement normal de l'animal.
Objectifs
L’amyotrophie spinale (SMA) est une maladie génétique rare qui touche les muscles et les mouvements. Elle est causée par la mutation d’un gène qui impacte la production d’une protéine importante pour la survie des cellules nerveuses responsables des mouvements. Sans cette protéine, ces cellules nerveuses se détériorent, ce qui entraîne une faiblesse musculaire et des complications graves. Il existe un autre gène dans le génome de la souris qui permet de produire une petite quantité de cette protéine. Plus le nombre de copies de ce second gène est grand, moins la maladie est grave. Pour mieux comprendre la SMA et tester de nouveaux traitements, nous utilisons des modèles de souris génétiquement modifiées. Certaines souris ont peu de copies du second gène, ce qui imite les formes les plus graves de la maladie, tandis que d’autres ont plus de copies de ce gène, représentant des formes moins graves. Ces modèles permettent d’évaluer l’efficacité des traitements et de développer de nouvelles thérapies. Ces traitements pourraient aider à produire la protéine manquante et ainsi améliorer la qualité de vie des patients atteints de la SMA.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques prometteuses pour de futurs essais cliniques destinés au traitement de l’amyotrophie spinale (SMA). Les bénéfices attendus incluent la sélection des molécules candidates ayant le plus grand potentiel thérapeutique ainsi que la détermination de la voie d'administration optimale, avec l'objectif à long terme d'apporter des bénéfices similaires aux patients traités
Procédures
Chaque animal recevra un seul type de procédure (injection intraveineuse, injection au niveau lombaire ou injection cérébrale). Les animaux pourront recevoir des injections chroniques (maximum une injection par semaine pour l'intraveineuse, ou maximum toutes les 2 semaines pour les injections cérébrales), sur une durée maximale de 6 mois. Les injections intraveineuses se feront sous anesthésie générale, avec un délai maximal de 10 minutes entre l'anesthésie et le réveil. Un analgésique local sera administré avant chaque injection. Les injections lombaires et cérébrales se feront également sous anesthésie générale. Compte tenu de la complexité de ces injections, le délai entre l'anesthésie et le réveil est compris entre 30 minutes et 1 heure. Un analgésique global et un analgésique local seront administrés avant chaque injection.
Impact sur les animaux
Les souris SMA type 1 ont une espérance de vie très courte (environ 10 jours). Cela limite les études à long terme sur la maladie ou les traitements. Ces souris présentent des anomalies sévères dès la naissance (faiblesse musculaire extrême, incapacité à se déplacer, à s’alimenter ou à respirer normalement, poids moindre), donc les manipuler n'est pas un acte anodin car elles sont extrêmement fragiles. Le modèle SMA type 3 (forme modérée à légère) présente une progression plus lente. À partir de 3 à 4 semaines de vie environ, ces souris présentent des nécroses sèches au bout de la queue, puis les nécroses évoluent au niveau des oreilles, et beaucoup plus tard (1 an environ) à quelques orteils. Ces nécroses sèches sont attendues chez ces animaux, sans automutilation et n’entravent pas le comportement normal de l’animal (alimentation, déplacements, survie …). Les injections intraveineuses et lombaires peuvent entraîner des douleurs, une légère perte de poids et un risque d’infection au point d’injection. Les injections dans le système nerveux (dans le cerveau avec chirurgie sont des actes nécessitant une chirurgie. Elles peuvent entraîner chez l’animal des douleurs, une perte de poids, des infections, des modifications du comportement (comme une diminution de l’activité, des prostrations, des paralysies en cas de complications).
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés afin d’analyser les différents tissus (muscles squelettiques, cœur, cerveau, foie, rein, cerveau, moelle épinière …).
Remplacement
Dans le cadre de notre engagement envers la règle des 3R, nous procédons systématiquement à une évaluation in vitro de nos molécules actives afin de ne retenir que les meilleurs candidats thérapeutiques, non toxiques pour les cellules, et ainsi minimiser le recours aux méthodes d'évaluation in vivo. Cependant, pour le développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux est essentielle pour identifier celles qui ont le meilleur potentiel thérapeutique.
Réduction
Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d’animaux nécessaire eu utilisant les données préliminaires.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées avec une anesthésie et une analgésie appropriée. Les souris recevront si nécessaire un régime alimentaire additionnel (nourriture gélifiée). Les souris seront inspectées quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être. Des mesures précoces pour prévenir toute souffrance ou stress de l’animal seront mises en place grâce à l’utilisation d’une grille scorée pour le suivi des animaux. Ceci permet également d’avoir des points limites précoces permettant de mettre en place des actions avant que les animaux ne souffrent.
Choix des espèces
La souris est l'espèce modèle de référence en recherche biomédicale, notamment pour les pathologies neurodégénératives et les maladies génétiques humaines. Elle présente une grande similitude génétique avec l’humain (environ 95 % de conservation des gènes) et une reproductibilité expérimentale élevée. Par ailleurs, des modèles bien caractérisés de la maladie de l’amyotrophie spinale (SMA) existent chez la souris, permettant une transposition pertinente des résultats précliniques. Le modèle type 1 reproduit une forme grave de la SMA, caractérisée par un déficit de la protéine impliquée, une faiblesse musculaire progressive, une perte rapide de motoneurones. Il permet de tester l’efficacité de traitements précoces et d'étudier les mécanismes pathologiques initiaux de la SMA. Ces souris seront utilisées au stade nouveau-né, car l’injection doit avoir lieu précocement, afin d’étudier les effets du traitement, sur ce modèle présentant une mortalité précoce (souvent avant l'âge de 10 jours sans traitement). Le modèle de SMA type 3 repose sur une mutation génétique similaire mais moins sévère, induisant une forme plus modérée de la maladie, avec une apparition tardive des symptômes et une espérance de vie normale. Il permet d'étudier les effets à long terme des traitements, la récupération fonctionnelle et les conséquences chroniques de la pathologie. Pour toutes ces raisons, ces animaux seront utilisés à partir de l’âge de 3-4 semaines, correspondant au moment d’apparition des symptômes.
Etude des mécanismes pathogènes et des facteurs environnementaux dans un modèle de sclérodermie chez la souris 3/3
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
1 214 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à 24 injections dans l'abdomen et 40 gavages sur deux mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent deux instillations dans la gorge sous anesthésie, un prélèvement sanguin, une séance d'imagerie, un acte chirurgical et des transports entre trois établissements. Le porteur indique que le modèle peut provoquer des atteintes cutanées à partir de quatorze semaines, puis une perte de poids et une mobilité réduite, pour étudier une sclérodermie déclenchée par la silice. Toutes sont tuées afin de prélever sang, poumon, rate et peau, une partie l'étant simplement faute de porter le génotype recherché.
Objectifs
La sclérodermie est une maladie rare du tissu soutenant les organes et des petites artères dont la principale caractéristique est un durcissement (fibrose) de la peau et des organes internes. Les atteintes pulmonaires constituent les complications potentiellement graves de la sclerodermie. Les artères allant du cœur aux poumons peuvent également être affectées ce qui entraîne une hypertension artérielle pulmonaire. La fibrose est la conséquence d’une réaction inflammatoire inadaptée, il existe en effet une activation anormale du système immunitaire. Les causes de cette maladie sont favorisées par des facteurs de l’environnement. La silice a été reconnue comme responsable du déclenchement de la maladie. Notre projet a pour but de bloquer, par une approche thérapeutique, les molécules engagées dans l’activation des cellules et d’explorer l'impact des contaminants environnementaux sur la gravité de la maladie.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront d'éclairer notre compréhension sur les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. Ces données nous permettront d'identifier de nouveaux candidats médicaments dans cette maladie capables de prévenir ou freiner le développement des atteintes potentiellement mortelles chez les patients.
Procédures
Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l’élevage et traitement dans l’établissement 1, l’imagerie dans l’établissement 2, la chirurgie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et injections intrapéritonéales tous les 2 jours pendant 2 mois, au total 24 injections d’une durée de 20 secondes 2) contention et gavage 5 jours consécutifs pendant 2 mois, au total 40 gavages d’une durée de 20 secondes, 3) injection intraveineuse caudale réalisée 2 fois d'une durée de 40 secondes. Les animaux anesthésiés seront soumis à : 1) Instillations oro-pharyngées réalisée 2 fois sous anesthésie générale en 2 minutes 2) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s 3) imagerie unique sous anesthésie générale en 5 minutes 4) acte chirurgical unique sous anesthésie générale en 15 minutes.
Impact sur les animaux
Le modèle va induire à partir de 14 semaines des potentielles atteintes cutanées. A partir de 17 semaines, une perte de poids et une mobilité réduite pourraient être observées. le gavage va induire une irritation potentielle et du stress, les injections intrapéritonéales et intraveineuses vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. L’instillation oropharyngée va induire du stress. La chirurgie pourra induire une douleur. Les transports des souris entre les 3 sites utilisateurs vont induire du stress aux souris.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, poumon, rate, peau, afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte pulmonaire et de l’hypertension artérielle pulmonaire par différentes techniques. Une partie des animaux seront euthanasiés car sans génotype d'intérêt.
Remplacement
Les cellules spécifiques du système immunitaire ont été traitées avec les différentes molécules thérapeutiques et ont montré leur intérêt dans des expérimentations in vitro. Néanmoins, ces expériences de cultures cellulaires ne permettent pas de recréer les interactions entre les différentes cellules de l’organisme. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Nous nous efforcerons quotidiennement de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les traitements débutent à un stade précoce avant l’apparition des premiers signes cliniques. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Une surveillance régulière et une application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra de garantir le bien-être des animaux. Une grille de score sera utilisée et des actions réalisées en cas d’atteintes, L’instillation oropharyngée a été choisie car elle est moins invasive et moins douloureuse qu’une chirurgie, elle sera réalisée sous anesthésie générale. Des anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sur souris ayant reçu un analgésique, puis une anesthésie générale. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoire. Seule cette espèce possède une lignée transgénique permettant l’étude de la fibrose et de l'hypertension pulmonaire avec une séquence temporelle identique à celle de la maladie humaine. Les souris jeunes adultes seront mises en accouplement à 8 semaines. Les souris génétiquement modifiées et les souris contrôles seront âgées soit de 6 à 14 semaines pour l’administration de traitement.
Evaluation de l’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques dans le modèle murin de dermatite atopique
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Rendues malades par un inducteur de dermatite atopique qui provoque des douleurs inflammatoires généralisées, 1 620 souris reçoivent jusqu'à 28 administrations de composés et jusqu'à trois prélèvements sanguins, dont un terminal. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 180 d'entre elles et modéré pour 1 440, toutes étant tuées à la fin pour prélever des tissus. La douleur est quantifiée par un score attribué chaque jour et peut entraîner une perte de poids, que le porteur estime à 5 % au maximum d'après ses études précédentes. Il indique que des modélisations tridimensionnelles in vitro des systèmes nerveux et immunitaire de la peau sont en cours de développement, et conclut que le remplacement complet n'est "pas encore possible" avant le passage des candidats médicaments en clinique.
Objectifs
La dermatite atopique, aussi appelée eczéma atopique, est une maladie chronique inflammatoire de la peau. Elle se développe préférentiellement chez le nourrisson et l’enfant, mais peut persister et apparaître parfois chez l’adolescent et l’adulte. Elle est caractérisée par une sècheresse cutanée associée à des lésions de type eczéma (rougeurs et démangeaisons, vésicules, suintement et croûtes) qui évoluent par poussées. Environ 1 enfant sur 10 est touché par cette maladie. Cette pathologie est souvent associée à des allergies alimentaires, des rhinites allergiques, des crises d'asthme. Les complications les plus fréquentes des dermatites atopiques peuvent être associées à des retards de croissance et des complications ophtalmologiques (kérato-conjonctivites fréquentes, cataracte, décollement rétinien). Comme de nombreuses maladies chroniques, la dermatite atopique peut avoir un retentissement psychologique important, source de troubles du sommeil, d’irritabilité voire de syndrome dépressif. Un traitement de fond vise à lutter contre la sécheresse cutanée et à restaurer la fonction de barrière de la peau. Il passe par l’application quotidienne d’émollients (crèmes hydratantes). Lors d’une poussée, les soins visent à réduire l’inflammation et les démangeaisons, pour soulager le patient et éviter une surinfection. L’application d’un dermocorticoïde, d’un immunomodulateur, d’une solution antiseptique, avec éventuellement des antihistaminiques en comprimé en complément, aident le patient à traverser la crise. Plus récemment, des biothérapies ont vu le jour, à base d’anticorps monoclonaux. A ce jour il n'existe aucun traitement curatif, ce projet a pour but d'étudier de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle murin de dermatite atopique.
Bénéfices attendus
Le traitement de la dermatite atopique est symptomatique. Il ne vise pas à faire disparaître définitivement la maladie, mais à traiter les symptômes lors des poussées et à prévenir les récurrences par une prise en charge au long cours. Ce projet a pour but de tester de nouveaux médicaments à visée anti-inflammatoire permettant de diminuer ou d’inhiber le développement de la maladie, qui pourront être proposés en essais cliniques à court terme. Au long terme, ce projet permettra de proposer de nouvelles thérapies et améliorer la qualité de vie des patients atteints.
Procédures
Prélèvements de sang : maximum 2 prélèvements (1 fois par semaine maximum, 30 secondes/souris) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal sous anesthésie gazeuse (30 secondes/souris). Administrations de composés : maximum 28 administrations (2x/semaine à 2x/jour selon la voie d’administration; 30 secondes/souris)
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires généralisées à l'animal liées au développement de la pathologie. La douleur pourra générer une perte de poids et être quantifiée par des scores attribués quotidiennement (pesée quotidienne). L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et le produit injecté va permettre, selon l’efficacité des molécules, de réduire les douleurs inflammatoires.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever des tissus biologiques permettant de réaliser des analyses pour vérifier l'efficacité des candidats médicament sur la maladie
Remplacement
Ce projet permets de continuer nos études pharmacologiques sur le modèle de dermatite atopique chez la souris afin de pouvoir tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies dans le cadre d’une monothérapie/combinaison thérapeutique. Les méthodes substitutives à l’expérimentation animale ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidat médicament, test nécessaire avant l’initiation d’une phase clinique. Les molécules sont testées en amont sur des explants de peau et des lignées cellulaires, mais il n’y a pas, à notre connaissance, de modèle expérimental in vitro ni de modélisation informatique permettant de mimer toutes les interactions cellulaires et moléculaires observées dans un organisme entier. Le remplacement complet des animaux de laboratoire avant le passage des candidats médicaments en phase clinique n'est donc pas encore possible, bien que des modélisations tridimensionnelles in vitro des systèmes nerveux et immunitaire de la peau soit en cours de développement actuellement.
Réduction
Les nouvelles thérapies sont en premier lieu testées et validées sur des lignées cellulaires afin de sélectionner les doses à appliquer in vivo pour l'étude d'efficacité. Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Par conséquent, 10 animaux/groupe seront necessaires. Les tests statistiques utilisés permettront soit de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable ou bien de comparer 2 groupes indépendants entres eux en prenant en compte 2 variables.
Raffinement
L'inducteur de la maldie est responsable d’une perte d’eau épidermique chez les souris recevant la molécule, des croquettes humides ou du gel de réhydratationl seront ajoutés dans les cages pour augmenter l’accès à la nourriture et pallier à la légère déshydratation et perte de poids (5% maximum d’après les études précédentes). Un suivi et scoring quotidien seront effectués. Un antalgique pourra être utilisé si nécessaire sur avis vétérinaire. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux pour lesquels les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. De plus leur génome possède 99% de similitude avec le génome humain, ne présente aucun gène manquant/supplémentaire pouvant modifier l’intensité de l’inflammation obtenue. Ces souris sont mondialement utilisées, permettant une continuité et un moyen de comparaison unique. Notre modèle a été initialement mis au point et développé à partir de données de la littérature. Ce projet est un renouvellement, le modèle est maintenant parfaitement maitrisé, et nous a permis de réaliser des études avec succès lors du précédent projet. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8-12 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).
Determiner les modulations du phénotype microglial dans les pathologies neurodégénératives pour détecter des biomarqueurs précoces et développer de nouvelles approches thérapeutiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Chercher des biomarqueurs précoces des maladies neurodégénératives dans la rétine et le cerveau conduit à utiliser 6 104 souris, toutes tuées à l'issue pour prélever système nerveux central, ganglions lymphatiques et rates. 5 240 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 64 un niveau léger, et 800 sont opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. 5 304 souris subissent des lavages oculaires vigiles, 6 040 des injections intrapéritonéales cinq jours de suite dont 2 000 des injections de toxine, et 3 240 des interventions chirurgicales de 30 minutes à 2 heures avant une mise à mort trois à neuf semaines plus tard. La toxine provoque une hypothermie marquée pouvant aller jusqu'à une mortalité aiguë, quand les retombées annoncées, prévenir ou ralentir des pathologies "toujours incurables", restent au conditionnel.
Objectifs
Avec près de 2 millions de cas en France, l’impact sociétal des maladies neurodégénératives est extrêmement élevé et devrait augmenter à l’avenir en raison de la proportion toujours croissante de la population âgée de plus de 65 ans. Ces maladies se caractérisent à la fois par la dégénérescence progressive de certains neurones et par l’apparition d’une inflammation marquée et chronique dans le cerveau. Cette neuroinflammation implique à la fois l’activation de cellules résidentes (astrocytes et microglies) et une infiltration de cellules immunitaires de la périphérie, notamment de lymphocytes et de macrophages. Plusieurs études dont les nôtres ont démontré que la neuroinflammation participe activement à la progression pathologique, a minima en exacerbant les lésions neuronales, voire précédant ces lésions. Dans de précédentes expériences, nous avons mis en évidence un rôle majeur d'une protéine dans la microglie, dans l’orchestration de ces phénomènes dans des modèles de la maladie de Parkinson. Le projet actuel vise d’une part à étudier le rôle de 3 partenaires de cette protéine sur le phénotype microglial, et d’autre part à élargir l’étude à d’autres modèles physiopathologiques impliquant la microglie, notamment au cours du vieillissement et de la maladie d’Alzheimer. Nos travaux permettront de mieux comprendre ces phénomènes biologiques complexes et de déterminer de nouvelles pistes thérapeutiques pour ces pathologies toujours incurables. Nous mettrons également en évidence des biomarqueurs précoces de ces conditions physiologiques et pathologiques permettant diagnostique et un pronostique précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et physiopathologiques impliqués dans les pathologies neurodégénératives, liées ou non au vieillissement. Il permettra en particulier de mieux caractériser la participation des phénomènes inflammatoires dans le déroulement physiopathologique, et de révéler les évènements précoces au niveau de la rétine. Les résultats obtenus pourront ainsi ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les fonctions microgliales, permettant la prévention ou un ralentissement de la progression de cette pathologie chez les patients. Par ailleurs, les résultats de ce projet permettront d’identifier des biomarqueurs pronostiques précoces, utiles à la fois pour le diagnostic et le suivi clinique des patients. Ces avancées sont particulièrement cruciales pour des maladies pour lesquelles aucune option thérapeutique curative n’est à ce jour disponible.
Procédures
Au cours de ces procédures, les animaux seront soumis à des prélèvements issus de lavages oculaires sur animal vigile (5304 animaux). Des animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales (5 jours consécutifs) sur animal vigile (6040 animaux). Parmi ces derniers, certains seront soumis à 2 séries d'injections intrapéritonéales sur 5 jours consécutifs dont des injections de toxine (2000 souris). Certains animaux seront soumis à des interventions chirurgicales sous anesthésie générale (3240 souris). Les interventions dureront 30 minutes à 2h et les animaux seront mis à morts 3 à 9 semaines après l'intervention.
Impact sur les animaux
Les injections par voie intrapéritonéale nécessitent une contention forte qui peut induire de l’anxiété, mais aucune des molécules injectées ne provoque de la douleur post-administration. LEs modèles de la maladie de Parkinson utilisés dans ce projet sont asymptomatiques. Néanmoins, l’administration de toxine entraîne une hypothermie transitoire marquée, susceptible de provoquer une instabilité cardiovasculaire pouvant aller jusqu’à une mortalité aiguë. Les injections stéréotaxiques et intravitréennes seront réalisées sous anesthésie générale, induisant une perte de la capacité de thermorégulation ainsi que des douleurs post-opératoires, minorées par les antalgiques.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure. Le organes (systèmes nerveux central, ganglions lymphatiques, rates) seront récupérés pour réaliser des analyses cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Contrairement aux modèles in vitro, l’expérimentation animale permet de restituer la complexité spatio-temporelle des réponses cellulaires dans leur environnement physiologique, en tenant compte de la diversité des types cellulaires impliqués, de leur état métabolique spécifique, ainsi que de leurs interactions fonctionnelles. Les modèles cellulaires immortalisés ou les systèmes in vitro, bien qu’utiles pour des analyses mécanistiques ciblées, ne permettent pas de reproduire avec précision les régulations métaboliques fines ni les interactions neuro-immunitaires observées dans un organisme vivant. Le recours à l’expérimentation animale constitue ainsi une étape indispensable pour valider les hypothèses dans un contexte physiologique pertinent. Une fois ces mécanismes validés in vivo, nous approfondirons l’étude des processus moléculaires à l’aide de cultures primaires de neurones, de microglies et de lymphocytes, ainsi que par le biais de cultures organotypiques de rétine murine que nous avons développées au sein du laboratoire.
Réduction
Nous planifierons rigoureusement chaque expérience afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant la robustesse statistique des résultats obtenus. Les modèles d’induction de la maladie de Parkinson sélectionnés ont déjà été validés au sein de notre équipe et chez nos collaborateurs, ce qui nous permet d’optimiser la taille des groupes expérimentaux ; des cohortes de 10 souris sont nécessaires pour obtenir des données exploitables. Pour le modèle de synucléinopathie, l’approche retenue repose sur l’injection unilatérale du vecteur d'intérêt dans un œil, tandis que l’autre œil reçoit un vecteur contrôle, ce qui permet de réduire significativement le nombre d’animaux tout en limitant la variabilité interindividuelle. Par ailleurs, dans la mesure du possible, nous analyserons un ensemble étendu de paramètres cellulaires, moléculaires et transcriptionnels sur les mêmes individus, afin d’optimiser l’exploitation des tissus et de limiter le recours à des procédures expérimentales supplémentaires.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera une priorité tout au long de nos expérimentations et fera l’objet d’un suivi rigoureux, conformément aux recommandations du comité local de suivi du bien-être animal (SBEA) de notre établissement. Les souris seront hébergées en groupes dans des cages de surface adaptée, avec accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L’environnement sera systématiquement enrichi (présence de coton pour la construction de nids, tunnels), et une période d’acclimatation à l’hébergement (1 semaine) puis à la manipulation et à la contention (2 semaines) sera mise en place afin de réduire le stress lié aux interventions. La douleur et l’angoisse seront systématiquement limitées par l’utilisation d’analgésiques et le recours à l’anesthésie générale lors des procédures invasives. Afin de prévenir cette baisse de température corporelle, les animaux seront placés sur un tapis chauffant pendant au moins une heure (ou jusqu’au réveil si anesthésie générale) après les interventions afin de leur permettre de maintenir une température compatible avec la récupération de leur capacité de thermorégulation. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé dès l’initiation des procédures expérimentales, permettant d’évaluer leur état général (prise alimentaire, comportement social, locomotion, toilettage), et d’intervenir rapidement si nécessaire, notamment via l’aide à l’alimentation ou des ajustements environnementaux. Des critères d’arrêt précis, validés par le SBEA, permettront d’interrompre immédiatement toute expérimentation en cas de dégradation de l’état de santé d’un animal. Tout animal présentant un ou plusieurs de ces signes sera euthanasié sans délai, dans le respect des protocoles en vigueur. Les responsables du projet sont titulaires des autorisations à l’expérimentation animale et à la chirurgie.
Choix des espèces
L’étude des processus de mort neuronale et de neuroinflammation nécessite le recours à des modèles capables d’intégrer l’ensemble des mécanismes physiopathologiques impliqués ces pathologies complexes, qui impliquent différents types cellulaires de différents systèmes physiologiques. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet d’obtenir des résultats exploitables et pertinents au regard de la pathologie humaine. La souris a été choisie en raison de son faible coût, de sa facilité de manipulation, et de sa bonne tolérance aux procédures expérimentales. Le fond génétique C57BL/6J est celui qui présente la meilleure susceptibilité aux modèles utilisés. Ce choix est également justifié par la disponibilité d’outils génétiques adaptés : notre projet repose sur l’utilisation de lignées murines génétiquement modifiées exclusivement disponibles dans ce modèle. Par ailleurs, de nombreux outils moléculaires et immunologiques validés sont disponibles pour cette espèce, rendant possible une dissection fine des mécanismes pathologiques à l’échelle cellulaire. Nous utiliserons des souris âgées de 6 à 10 semaines au début de l'expérience. A ce stade, les souris ont terminé leur croissance et possèdent un système neuronal et immunitaire mature et fonctionnel.
Elevage de souris trangéniques immunodéficientes à phénotype dommageable
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Les souris élevées ici sont transgéniques et immunodéficientes, ce que le porteur qualifie de "phénotype dommageable" et qui les expose à développer des infections. 1 225 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 103 d'entre elles et modéré pour 122, la seule intervention déclarée étant le déclenchement de ce phénotype. Le porteur affirme pourtant que ce phénotype ne s'exprime pas, les conditions d'hébergement en cages ventilées avec litière et aliments stérilisés l'empêchant, et que ces souris se reproduisent normalement en l'absence de pathogène. L'élevage sert à produire des souriceaux pour des greffes de neurones humains, les géniteurs étant tués en fin de fertilité vers six mois et les autres transférés en zone d'expérimentation pour être inclus dans d'autres projets.
Objectifs
Nous élevons des souris immunodéprimées en vue d'obtenir des souriceaux pour expérimentation (greffes).
Bénéfices attendus
Cette lignée est utilisée car son immunodéficience rend possible la greffe de neurones d'autres espèces, et donc la recherche en neurobiologie humaine.
Procédures
La seule intervention qui pourrait intervenir sur les animaux est le déclenchement de leur phénotype dommageable, soit le développement d'infections à cause de l'immunodéficience.
Impact sur les animaux
En présence de pathogène, ces souris risquent de développer des infections. Cependant, en l'absence de pathogène, ces souris se reproduisent normalement et n'ont pas de phénotype dommageable. Vues les conditions d'hébergement, ce phénotype ne s'exprime pas.
Devenir
Les animaux arrivant en fin de fertilité (maximum 6 mois d’âge) sont mis à mort. Les animaux destinés à être expérimentés sont transférés en zone d’Expérimentation et inclus dans d’autres projets d'expérimentation en utilisation continue.
Remplacement
Nous utilisons des souris pour un projet expérimental de greffe de neurones humains. Pour qu'il y ait tolérance de ces neurones, nous devons travailler avec des souris immunodéficientes.
Réduction
Nous élevons les souris en vue d'obtenir des souriceaux pour expérimentation. Il s'agit donc de produire de manière optimale des femelles et des mâles pour accouplement, et des petits pour expérimentation.
Raffinement
Tous les animaux sont utilisés soit en expérimentation soit en renouvellement de géniteurs. Nos conditions d’élevage permettent au phénotype dommageable de ne pas s’exprimer: cages ventilées, change sous hotte à la pince, litière, aliment et eau stérilisés. Les enrichissements sont variés et adaptés au type d’animaux dans la cage. Les points limites définis dans le cadre du suivi des animaux sont précoces avec grille de décision et d'administration d'analgésique de manière à éviter une installation de la douleur.
Choix des espèces
Nous étudions le cervelet humain. Nous avons pour cela besoin d'un modèle mammifère de cervelet. Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons pour des raisons éthique la souris comme modèle plutôt q'un primate ou autre Mammifère. De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé d’un point de vue cellulaire, développemental, anatomique, et fonctionnel. Les animaux utilisés auront entre 2 et 6 mois.
Évaluation préclinique des effets potentiellement anxiolytiques et pro-cognitifs d’une nouvelle classe de modulateurs allostériques (‘nanobodies’) du récepteur nicotinique alpha7
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Habituation à l'expérimentateur pendant plusieurs jours, puis une à deux injections de composés répétées jusqu'à quatre fois, deux à trois tests comportementaux d'une heure par jour, un stress aigu induit pharmacologiquement jusqu'à quatre fois, et pour certaines un stress chronique de contention d'une heure par jour pendant deux semaines : 832 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 264 d'entre elles et modéré pour 568. Le porteur attend une anxiété chronique, une perte de poids légère et de possibles altérations de l'état général chez les animaux soumis à la contention répétée. Il précise que les souris ne pourront pas être réutilisées pour tester plusieurs doses d'un même composé, faute de connaître l'ampleur et la durée des effets. Tous les cerveaux sont prélevés après mise à mort, pour des expériences ex vivo sur des modulateurs d'un récepteur nicotinique.
Objectifs
Les objectifs du projet sont de tester pour la première fois, chez des modèles murins en conditions basales ou après exposition à un stress, les effets potentiellement anxiolytiques et/ou pro-cognitifs d’une nouvelle classe de composés pharmacologiques très sélectifs et capables de stimuler des récepteurs ayant précédemment été impliqués dans les déficits cognitifs associés à plusieurs pathologies neuropsychiatriques et plus récemment à l’anxiété.
Bénéfices attendus
Les pathologies neurodégénératives, neurodéveloppementales et psychiatriques associées à des troubles anxieux et/ou cognitifs représentent l’un des enjeux majeurs de santé publique, et leur prévalence s’accroit. Il n’existe à ce jour pratiquement aucun traitement efficace pour soigner ces pathologies, notamment les troubles cognitifs et l’anxiété qui leur sont associés. A court terme, ce projet devrait permettre une première identification des effets thérapeutiques potentiels d’une nouvelle classe de composés pharmacologiques ciblant certains récepteurs aux neurotransmetteurs, sur ces aspects. Ce projet générera des bases solides pour des études précliniques plus approfondies en vue de futures études cliniques avec nos collaborateurs proches qui ont accès à des cohortes de patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux à trois tests comportementaux d’1h maximum par jour, ce jusqu’à quatre fois, susceptibles d’entraîner un stress passager. Ils recevront une à deux injections de composés pharmacologiques, ce répété un maximum 4 fois par animal. Certains animaux seront exposés à un stress aigu induit pharmacologiquement de durée d’une heure maximum, jusqu’à quatre fois. Certains animaux seront exposés à un stress chronique de contention pendant 1 heure par jour pendant deux semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent éprouver un inconfort et une douleur légers de courte durée liés à l’introduction de l’aiguille. Les animaux sont susceptibles d’éprouver une anxiété transitoire lors de la soumission à un stress aigu, celle-ci devrait disparaitre au bout de quelques heures maximum, on n’attend pas d’altération de l’état général. Les animaux sont susceptibles d’éprouver une anxiété chronique lors de la soumission à un stress chronique (contention quotidienne durant 1h pendant deux semaines). On peut s’attendre à une perte de poids légère et à de possibles altérations de l’état général et du comportement qui devraient rester légères pendant cette période (une étude montre une perte de poids de 5% après 4 semaines de contention quotidienne de 6h.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure car les cerveaux seront prélevés pour des expériences ex vivo
Remplacement
Pour identifier les effets potentiels thérapeutiques de nouveaux composés sur les processus cognitifs et anxieux, il est essentiel de faire des mesures sur des modèles animaux ayant un système nerveux entier et fonctionnel, et d’étudier les comportements et les états émotionnels associés au plus près de la façon dont ils se manifestent chez l’homme. Ceci ne peut, par essence, être réalisé autrement que sur des animaux vivants, ayant une connectivité physiologique intègre entre les différentes régions du cerveau et un degré de développement de leurs fonctions émotionnelles et cognitives suffisant pour en faire des modèles d’étude pertinents
Réduction
La méthodologie statistique a été réfléchie et discutée en amont de la soumission de ce projet sur la base de notre expertise de longue date et de la littérature. Dans nos études, la variabilité inter-individuelle est élevée. Il est donc nécessaire de tester au moins 12 animaux, respectivement, par groupe expérimental, sexe et conditions pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Un groupe contrôle adapté d’animaux sera systématiquement prévu pour chaque jeu d’expériences et sera spécifique de chaque condition expérimentale testée. Le nombre d’animaux par groupe se base d’une part sur notre expérience solide des procédures et des modèles et souche d’animaux qui seront utilisés dans ce projet, et d’autre part sur la littérature, très abondante sur le sujet et dans laquelle la même souche de souris est couramment utilisée. Notre expérience en études comportementales et marquages cellulaires nous a déjà permis de réduire cette variabilité et de mieux la prendre en compte pour l’expliquer. Les paramètres mesurés seront ensuite comparés entre groupes, sexes et conditions pour comparer les groupes. Les animaux ne pourront pas être réutilisés pour tester plusieurs doses d’un même composé car nous ne connaissons pas encore ni l’ampleur ni la durée des effets susceptibles d’être observés. Sur cette base, nous nous efforcerons de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés en ajustant au mieux les protocoles expérimentaux et les analyses statistiques pour obtenir des résultats statistiques robustes tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle des animaux testés.
Raffinement
Avant chaque expérience nous passerons plusieurs jours à manipuler les animaux afin de les habituer à l’expérimentateur et à la manipulation. Il y aura, sauf circonstance imprévue, seulement un expérimentateur par groupe expérimental. Entre les expériences, les animaux seront laissés tranquilles dans leurs cages au maximum et surveillés plusieurs fois par semaine. et nous nous rapprocherons de la structure responsable du bien-être animal (SBEA) pour redéfinir les conditions optimales d’enrichissement si besoin. Par exemple, du gel hydrique pourra être proposé aux animaux en cas de dénutrition et /ou perte de poids. L’exposition au stress étant utilisé pour la première fois par notre équipe, une évaluation sera faite en continue avec le vétérinaire et la SBEA pour améliorer le bien-être sans interférer l’objectif scientifique. Des points limites sont établis pour chaque procédure avec des actions correspondantes pour limiter la douleur à son minimum sans compromettre les résultats scientifiques.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire. La souris est, en outre, un modèle particulièrement intéressant lorsqu'on souhaite mettre en œuvre des tests relativement rapides mais largement validés et riches en information pour mesurer les fonctions cognitives et les niveaux d’anxiété. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 10 semaines), afin que le cerveau soit suffisamment développé notamment pour l’étude de leur comportement.
Etude préclinique de correcteurs de mutations non sens dans des modèles de cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les 1 800 souris reçoivent toutes une injection de cellules tumorales dans le flanc sous anesthésie gazeuse, puis 900 sont gavées une à deux fois par jour pendant 28 jours et 900 autres portent une pompe osmotique implantée dans le dos, agrafes retirées une semaine plus tard. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, toutes les souris étant tuées à la fin pour l'analyse moléculaire de leurs tumeurs, et la croissance tumorale est mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine. Le porteur écrit veiller à ce que les molécules testées ne portent pas atteinte aux "libertés individuelles de l'animal", définies comme l'absence de douleur, de lésion, de maladie, de peur et de détresse, dans un protocole qui commence par greffer une tumeur. Il ne décrit par ailleurs que des lots de cinq animaux en phase exploratoire puis quarante pour la démonstration d'efficacité, sans expliquer comment l'effectif atteint 1 800.
Objectifs
Les mutations non sens sont responsables d’environ 10% des maladies génétiques. La conséquence d’une mutation non sens est la dégradation rapide de l’ARNm porteur de la mutation par un mécanisme de surveillance des ARNm appelé NMD (pour nonsense-mediated mRNA decay). Certaines molécules sont capables de restaurer l’expression d’un gène porteur d’une mutation non sens. Ce type de molécules représente des candidats médicaments pour le traitement de certains patients atteints de maladie génétique. Nous recherchons au laboratoire des molécules capables de corriger les mutations non sens. Pour cela nous criblons des chimiothèques puis validons les molécules sur des lignées cellulaires. Une étude est ensuite entreprise pour déterminer la toxicité des molécules sélectionnées et leur mode d’action. L’étude préclinique est achevée après avoir démontré que les molécules sont capables de corriger les mutations non sens in vivo au sein d’un organisme complexe tel qu’une souris. L’étude in vivo consistera à déterminer la voie d’exposition, la concentration la plus efficace et la cinétique d’action de la molécule. Pour cela, les voies d’exposition qui seront testées sont la voie orale en gavant la souris avec différentes quantités de molécules et la diffusion sous-cutanée au moyen d’une pompe osmotique. Pour évaluer l’efficacité des molécules, nous effectuerons des mesures de croissance tumorale puis une analyse moléculaire sur les tumeurs après mise à mort des animaux.
Bénéfices attendus
La validation de l’efficacité de molécules permettant de corriger des mutations non-sens (entraînant la production de protéines généralement non-fonctionnelles) dans un organisme complexe comme la souris permettra à terme le développement de futurs médicaments pour traiter l’Homme souffrant de maladies génétiques telle que le cancer.
Procédures
L'ensemble des animaux (1800) seront anesthésiés par voie gazeuse afin de procéder à l'injection des cellules tumorales au niveau de leur flanc (durée de l'anesthésie : 10 minutes). L’ensemble des souris seront pesées 1 fois par semaine (1 minute) et la croissance des tumeurs sera mesurée 3 fois par semaine au moyen d'un pied à coulisse (2 minutes). Deux voies d'administration de traitement seront ensuite évaluées. - Traitement par voie orale : une partie des animaux (900) recevront une à deux fois par jour un traitement ou son placebo par voie orale (30 secondes). Le traitement durera au maximum 28 jours. - Traitement par voie sous-cutanée : une partie des animaux (900) auront une implantation au niveau du dos d’un système permettant la délivrance en continu du traitement ou de son placebo (Chirurgie pour implanter une pompe osmotique : 10 minutes). Une semaine après l’intervention, les agrafes sont retirées sous anesthésie gazeuse (1 minute). Le traitement durera au maximum 28 jours.
Impact sur les animaux
Ce projet a pour but de valider l’utilisation de nouvelles molécules comme éventuel candidat médicament. Bien que des tests de toxicité auront été effectués au préalable sur culture cellulaire, l’effet de ces molécules sur un organisme entier doit être évalué. Pour cela, nous veillerons à ce que ces molécules ne portent pas atteinte aux libertés individuelles de l’animal définies comme étant l’absence de faim, de soif et de malnutrition, l’absence de peur et de détresse, l’absence de stress physique et/ou thermique, l’absence de douleur, de lésions et de maladie ainsi que la liberté d'expression d'un comportement normal de son espèce. Cette observation servira à détecter une nuisance sur du long terme d'exposition à la molécule étudiée. Au cours des procédures, les animaux seront soumis à un stress léger de courte durée lors des anesthésies (par voie gazeuse ou par injection). De même, le traitement par voie orale, bien accepté par l'animal, pourra générer un stress léger et de courte durée lors de la contention. L'implantation de la pompe, réalisée sous anesthésie, ne devrait pas générer de gêne au mouvement de l'animal (placée sous la peau dans le dos) mais pourrait conduire à une douleur post-opératoire qui sera gérée par analgésiques. L'injection des cellules tumorales sera réalisée de manière à ne pas entraver les mouvements de l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience afin de pouvoir procéder à l’analyse moléculaire des tumeurs et d’autres tissus.
Remplacement
Dans la première partie du projet, nous disposons d’un programme de caractérisation des nouvelles molécules que nous identifions et sélectionnons basé sur le criblage cellulaire. Cette étape in vitro préalable est essentielle afin de déterminer la dose efficace en culture cellulaire (ce qui nous permet d'extrapoler pour définir une fenêtre de doses qui seront utilisées chez la souris), la toxicité cellulaire et le mode d'action. Cette étape permettra de remplacer l'animal dans la phase de sélection des molécules et d'évaluation des conditions optimales d'utilisation. Cependant, bien qu’une grande partie de l’étude se réalise in vitro remplaçant ainsi le modèle animal, l’expérimentation in vivo demeure nécessaire afin de pouvoir étudier l’effet de ces molécules sélectionnées avec soin dans un modèle physiologique pertinent reflétant la mutation étudiée à l’échelle de l’organisme entier.
Réduction
Le projet est conforme aux exigences de réduction puisqu'une phase exploratoire avec un nombre réduit d'animaux par lot (lot de 5) sera effectuée afin d'identifier la voie d'exposition, la concentration et la cinétique d'action de la molécule étudiée et ce afin d'abaisser au minimum le nombre d'animaux qui seront ensuite utilisés pour la démonstration de l'efficacité d'action de la molécule in vivo. Ce nombre sera de 40 ce qui correspondra à deux séries d'expériences avec 10 animaux par condition (avec et sans la molécule). La répétition de l'expérience est nécessaire pour s'affranchir d'un éventuel effet biaisé lié à la préparation de la molécule, au lot d'animaux ou à un stress survenu pendant l'expérience. Le nombre de 10 animaux par condition et par série afin de pouvoir réaliser ensuite un "student test" qui est le test statistique utilisé dans les expériences permettant d'évaluer l'efficacité d'un traitement.
Raffinement
Enfin, concernant le raffinement, l'expérience sera toujours menée de façon à prévenir ou à réduire au maximum toute souffrance. Ainsi, la voie d'exposition efficace la moins invasive sera privilégiée (la voie orale plutôt que sous-cutanée) et une anesthésie sera effectuée lorsque cela est compatible avec l'expérience. Des analgésiques seront utilisés pour pallier toute douleur pouvant survenir à la suite de l'implantation du système de diffusion sous-cutané. Les conditions d'hébergement seront telles que les animaux pourront bénéficier d'un enrichissement de leur environnement permettant une réduction de leur stress.
Choix des espèces
La souris présente l'avantage d'avoir un mécanisme de reconnaissance des codons stop prématurés étudié dans notre projet semblable à celui de l'Homme. De plus, la souris a un cycle de vie compatible avec le test in vivo sur plusieurs semaines de molécules à visées thérapeutiques. Les animaux seront utilisés à partir de la quatrième semaine après la naissance et jusqu'à 6 mois maximum après la naissance. La limite inférieure correspond à l'âge de maturité du système immunitaire chez la souris et la limite supérieure a été fixée à 6 mois car après, nous les considérons comme trop âgées ce qui pourrait compliquer l'interprétation des résultats.
Analyse de l’effet preventif et curatif du vieillissement par des extraits de plantes sur la mémoire et la cognition
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Six tests comportementaux, dont des tests destinés à évaluer des états de type anxieux ou dépressif, qualifiés de "simples, sans douleur" : 400 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. L'extrait végétal est administré dans l'eau de boisson, sans geste invasif, et la seule nuisance retenue est la contention nécessaire à l'injection de la surdose anesthésique qui les tue. Les cerveaux sont prélevés pour analyses histologiques, biochimiques et moléculaires, afin de tester si cet extrait prévient le vieillissement cérébral non pathologique. Le porteur retient des souris de douze mois, assez âgées pour présenter des signes de vieillissement et assez jeunes pour supporter un traitement long, et précise que le produit est déjà vendu dans le commerce et sa sécurité démontrée chez l'humain.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer les effets du traitement par un extrait végétal connu pour ses propriétés neuroprotectrices, sur la mémoire, la cognition et le bien-être général chez des souris âgées. Cet extrait végétal a aussi un effet bénéfique sur les sujets avec maladie d’Alzheimer. L’hypothèse centrale est que cet extrait végétal, administré par voie orale, pourrait prévenir ou atténuer les effets du vieillissement cérébral non pathologique. Ceci pourrait à long terme contribuer à la validation scientifique de substances d’origine naturelle comme options thérapeutiques ou complémentaires dans la prévention ou la prise en charge des troubles cognitifs.
Bénéfices attendus
Le vieillissement cérébral entraîne souvent un déclin progressif des fonctions cognitives (mémoire, attention, apprentissage) ainsi que des troubles de l’humeur et de la motivation. Les options pour prévenir ce déclin lié à l’âge restent limitées. Ce projet vise à tester les effets d’un extrait végétal, utilisé dans certaines maladies neurologiques, sur la cognition et le bien-être de souris âgées. Les tests comportementaux évalueront la mémoire, la reconnaissance d’objets, la motivation, l’exploration et la qualité des nids, offrant une vue d’ensemble de l’impact du traitement. Si les résultats sont positifs, cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies préventives chez l’humain, d’autant que cet extrait végétal présente un bon profil de tolérance. Le projet aidera aussi à identifier des biomarqueurs du vieillissement cérébral, utiles pour suivre de futures interventions.
Procédures
Les animaux seront soumis à six tests comportementaux simples, sans douleur, afin de mesurer leur mémoire, activité locomotrice, anxiété, dépression. Chaque test sera effectué une seule fois. La durée de ces tests varie entre 6 minutes et 20 minutes pour chaque souris. Une légère nuisance est engendrée lors de la contention pour l’injection de la surdose anesthésique qui dûre 3-5 secondes.
Impact sur les animaux
Les études précédentes n’ont mis en évidence aucun effet secondaire majeur ni indésirable sur les animaux. Toutefois, une légère nuisance peut être engendrée lors de la contention nécessaire pour l’injection de la surdose anesthésique. De plus, certains tests comportementaux, tels que ceux visant à évaluer des états de type anxieux ou dépressif, peuvent induire un niveau de contrainte ou de stress léger et transitoire pour les animaux. L’ensemble de ces nuisances est considéré comme léger et de courte durée, sans conséquence durable sur le bien-être animal.
Devenir
Mise à mort: La mise à mort des animaux est justifiée par la nécessité de poursuivre les analyses histologiques, biochimiques et moléculaires permettant de comprendre les effets des extraits végétaux sur le vieillissement cérébral et les fonctions cognitives. Ces investigations exigent le prélèvement de tissus cérébraux intacts, fixés ou frais, non compatibles avec la survie des animaux. L’analyse fine des structures neuronales, vasculaires et gliales, ainsi que l’évaluation des marqueurs de vieillissement cellulaire, requièrent donc la mise à mort des souris en fin d’expérimentation afin d’obtenir des échantillons de qualité et de répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Remplacement
Le remplacement des souris par d'autres modèles (in silico, in vitro, organoïdes, etc.) n'est pas envisageable dans le cadre de cette étude, car celle-ci vise à évaluer les effets d’un traitement oral par l'extrait végétal sur des fonctions complexes telles que la cognition, la mémoire, la motivation ou encore le bien-être général dans un contexte de vieillissement. Ces dimensions reposent sur des interactions dynamiques entre plusieurs systèmes (nerveux, immunitaire, endocrinien, digestif…) qu’aucun modèle alternatif ne peut actuellement reproduire de manière intégrée.
Réduction
Pour utiliser le plus petit nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs nous faisons les actions suivantes : 1. Calcul rigoureux de la taille d’échantillon : nous utilisons de logiciels de puissance statistique pour déterminer le nombre minimal de souris requis. 2. Mesures comportementales multiples : nous utilisons plusieurs tests cognitifs chez les mêmes individus pour maximiser les données par animal. 3. Utilisation de groupes contrôles minimum: nous utilisons seulement un groupe contrôle (boisson saline seulement) sans utiliser un groupe sans traitement car ceci est scientifiquement valable. 4. Analyse longitudinale : nous suivons les mêmes animaux à différents temps pour limiter le nombre total requis.
Raffinement
Pour améliorer les conditions de vie et réduire la souffrance des animaux, nous mettons en oeuvre les actions suivantes : 1. Surveillance rigoureuse : suivi clinique durant les deux premières semaines de traitement, puis bi-hebdomadaire, avec pesée hebdomadaire. Surveillance quotidienne assurée par l’équipe zootechnie suivant la grille d’observation (pelage, réactivité, etc) tout au long du traitement. 2. Traitement non invasif : Administration de l'extrait végétal via l’eau de boisson pour limiter le stress lié aux manipulations. Aucun geste invasif n’aura lieu durant ce projet. 3. Tests comportementaux non invasifs : Tous les tests choisis sont conçus pour être faiblement stressants, réalisés à luminosité faible et après acclimatation. Si besoin nous pourrons ajouter du matériel de nidification, d’abris (tunnels, igloos, cabanes), et d’objets à manipuler ou explorer (rouleaux en carton, plateformes, etc.). Ces enrichissements permettent de stimuler les comportements naturels (construction de nids, exploration, interaction sociale), de réduire le stress et d’améliorer les conditions de vie en captivité.
Choix des espèces
L’utilisation de souris dans cette étude est scientifiquement justifiée par les données existantes sur l'extrait végétal , déjà testé chez les rongeurs (souris et rats), avec des effets neuroprotecteurs documentés. Le choix des souris, bien caractérisées pour les études de vieillissement cognitif, permet une évaluation précise des effets du traitement sur la mémoire et le comportement. Les souris présentent également l’avantage d’une variabilité génétique réduite, d’une compatibilité optimale avec les tests comportementaux utilisés, et d’un accès à des outils analytiques validés. L’administration de l'extrait végétal par l’eau de boisson est non invasive, respectant ainsi les principes éthiques de réduction de la souffrance animale. De plus, ce produit est disponible commercialement et sa sécurité a été démontrée chez l’humain, renforçant la pertinence translationnelle du modèle murin dans un contexte de prévention ou d’atténuation du déclin cognitif lié à l’âge. Ce modèle constitue donc une étape essentielle avant une application clinique. Nous utilisons des souris âgées de 12 mois, qui présentent déjà certains signes de vieillissement cérébral tout en étant encore suffisamment jeunes pour permettre un traitement de longue durée.