Souris

Un trou est percé dans le crâne de chaque souris à l'aide d'un scalpel circulaire, au cours d'une opération de dix minutes sous anesthésie. 50 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour prélever les tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec trois passages au micro-scanner. Il s'agit de comparer la réparation osseuse obtenue avec des hydrogels de collagène enrichis en verre bioactif, associés ou non à des cellules souches de pulpe dentaire ou de gencive. Le porteur annonce des douleurs modérées pendant environ trois jours après l'opération et un taux d'échec de 4 % dû à l'anesthésie, dans une intervention qu'il décrit comme bien maîtrisée au laboratoire.

Objectifs

La partie du crâne et du visage peut subir des pertes de tissu osseux à cause de traumatismes, de cancers ou de malformations présentes dès la naissance. Ces pertes de tissu peuvent entraîner des problèmes à la fois physiques et psychologiques, ce qui affecte la qualité de vie des personnes touchées. Les traitements actuels pour réparer ces pertes sont souvent invasifs et ont un taux d'échec élevé. Il est donc crucial de développer de nouvelles solutions thérapeutiques. Les recherches récentes se concentrent sur des biomatériaux innovants, qui peuvent contenir ou non des cellules capables de former de l'os. Par exemple, des hydrogels à base de collagène, contenant des cellules souches de pulpe dentaire, ont montré leur capacité à favoriser la réparation osseuse dans des modèles de défauts osseux du crâne chez les rongeurs. De plus, des cellules souches provenant des gencives ont démontré, en laboratoire, leur capacité à se transformer en cellules osseuses. Ces cellules sont facilement accessibles sans causer de traumatismes, ce qui les rend très intéressantes pour des applications cliniques. Par ailleurs, les verres bioactifs sont des biomatériaux particulièrement utiles grâce à leurs effets stimulants sur la croissance osseuse et leurs propriétés antimicrobiennes. Des études précliniques ont montré que ces verres ont un potentiel prometteur pour réparer des défauts osseux, bien que leurs mécanismes d'action ne soient pas encore totalement compris. Dans ce contexte, les objectifs de ce projet sont d'analyser, dans un modèle de défaut osseux chez la souris, la capacité de réparation osseuse des hydrogels de collagène enrichis en verre bioactif, associés ou non à des cellules souches de pulpe dentaire ou de gencives. L'objectif est de mieux comprendre leurs mécanismes d'action au niveau cellulaire et moléculaire. À terme, ce projet vise à établir les bases de traitements régénératifs plus efficaces et accessibles pour la réparation osseuse de grands défauts crânio-faciaux.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait apporter des informations essentielles sur l'utilisation de gels à base de collagène contenant des cellules souches de la bouche et/ou enrichis en verre bioactif pour traiter de grandes pertes osseuses au niveau du crâne et du visage. Il permettra d'acquérir de nouvelles connaissances sur la rapidité et l'efficacité de la réparation des os grâce à ces gels modifiés. De plus, il aidera à mieux comprendre le rôle des différentes cellules impliquées dans la régénération du tissu osseux.

Procédures

Chaque souris subira une opération de 10 minutes pour créer un défaut dans le crâne. L'intervention consiste à inciser la peau du crane puis à réaliser un trou au niveau de l'os du crane à l'aide d'un scapel circulaire de taille standardisé. De plus, chaque souris passera trois examens d'imagerie par micro-scanner, chaque examen durant 3 minutes. Aucun préléevement n'est envisagé sur animal vivant.

Impact sur les animaux

Un risque de baisse de température pendant l'anesthésie, que ce soit par injection sous la peau, dans le ventre ou par gaz. Un peu de stress et une légère douleur de courte durée à cause des piqûres et de l'anesthésie gazeuse. Des douleurs modérées après l'opération pendant environ 3 jours.

Devenir

À la fin de l'expérience, tous les animaux sont euthanasiés par une méthode rapide et indolore. Cela permet de récupérer les tissus nécessaires pour les recherches.

Remplacement

La capacité des cellules souches issues de la bouche à supporter la réparation osseuses et à réagir aux différents biomatériaux a été préalablement validée au laboratoire. Cependant, pour étudier comment ces cellules réagissent dans un environnement plus proche du corps humain, il est nécessaire d'utiliser des modèles animaux comme les souris. Pour l'instant, il n'existe pas de méthodes en laboratoire ou par ordinateur qui puissent reproduire fidèlement les interactions complexes qui se produisent dans un organisme vivant.

Réduction

Nous utilisons des souris de la même famille génétique, ce qui signifie qu'elles sont presque identiques génétiquement. Cela permet d'avoir des résultats plus cohérents et de réduire le nombre de souris nécessaires pour nos études sur les cellules de la pulpe dentaire et des gencives. Une étude a montré que 6 souris suffisent pour voir une différence significative dans nos résultats, soit 12 souris si on inclut des mâles et des femelles. Ces chiffres sont en accord avec nos résultats précédents. De plus, cette opération est bien maîtrisée dans notre laboratoire, avec un très faible taux d'échec (environ 4 %), principalement dû à des complications liées à l'anesthésie.

Raffinement

• Avant la chirurgie, chaque souris reçoit un antidouleur. • Après l’opération, les animaux sont placés au chaud, surveillés jusqu’à leur réveil, puis logés en groupe dans un environnement confortable et enrichi. • Un traitement antidouleur est poursuivi pendant 3 jours, avec une surveillance quotidienne renforcée pendant une semaine. • Une grille d’évaluation permet d’identifier les signes de douleur ou de détresse.

Choix des espèces

La souris est une espèce de laboratoire classiquement utilisée pour l’étude du tissu osseux en raison de la similitude de son tissu osseux avec celui de l’homme. Le modèle du défaut critique de la calvaria de réparation osseuse est classiquement décrit das la littérature et parfaitement dominé au laboratoire. De nombreux outils d’analyses sont donc disponibles et adaptés à ce modèle. Les animaux utilisés sont de jeunes adultes de 8 semaines. Ce stade de développement est optimal comme démontré par nos expériences antérieures et la littérature pour une bonne capacité de réparation/régénération tissulaire.

244 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et chacune subit deux opérations avant la chirurgie terminale. La première implante des cellules de gliome dans le cerveau sous anesthésie et cadre stéréotaxique, la seconde place une pompe osmotique dans l'abdomen. 96 animaux reçoivent en plus une immunothérapie injectée dans l'abdomen à l'état vigile et une séance de radiothérapie sous anesthésie. Le porteur attend une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les souris qui développent un glioblastome, et résume le bénéfice espéré en une phrase, "une amélioration des stratégies thérapeutiques innovantes".

Objectifs

Le glioblastome demeure une tumeur incurable présentant des caractéristiques propres participant à la résistance aux thérapies actuelles. Parmi ces caractéristiques, l’hypoxie qui correspond à une diminution de la concentration en oxygène est un facteur identifié de mauvais pronostic. L’objectif de notre étude est d’évaluer les effets d’une molécule vasodilatatrice ayant pour objet de réduire l’hypoxie intratumorale sur l’efficacité des traitements antitumoraux, ici la radiothérapie et les immunothérapies. L'étude a les objectifs spécifiques suivants : • Déterminer l'effet de la molécule vasodilatatrice en accompagnement d’une immunothérapie sur l'hypoxie tumorale et la réponse immunitaire. • Déterminer l'efficacité in vivo de la molécule vasodilatatrice en présence d’immunothérapie en tant que composé candidat dans un modèle de xénogreffes murin de glioblastome humain, déterminée par la survie des animaux et la charge tumorale. • Déterminer la cinétique des changements aigus de l’hypoxie in vivo induits par la molécule vasodilatatrice en présence de radiothérapie dans un modèle de xénogreffes murin de glioblastome humain

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques innovantes sur le glioblastome (IT+RT)

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, 244 animaux sont concernés. - Implantation de pompes osmotiques en intrapéritonéal : 15 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, 244 animaux sont concernés. - Injection intrapéritonéale de l’immunothérapie (animal vigile) : 3 fois tous les 3 jours à partir de J6 ; 5 minutes maximum par animal, 96 animaux sont concernés. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 1 séance de radiothérapie : 10 minutes maximum par animal, 96 animaux sont concernés.- Imagerie IRM pour suivi de croissance tumorale - Chirurgie terminale sous anesthésie : 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux ; 10 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés.

Impact sur les animaux

Suivant l’expérience du laboratoire, nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux développant de glioblastomes. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeur cérébrale peut induire des douleurs modérées. Les séances fractionnées de radiothérapie et les séances d’imagerie (IRM) n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. L’injection de traitements en eux-mêmes ne provoquent pas de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de récupérer différents organes pour analyses post-mortem.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la croissance tumorale et la réponse aux traitements comme la radiothérapie. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux différents traitements. Dans ce projet, nous nous intéressons aux phénomènes de vasodilatation, impossibles à appréhender in vitro.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasives se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est, dans ce cas, son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous estimons qu’au minimum, 12 animaux par groupe au départ sont nécessaires afin de réaliser des tests statistiques puissants, et ainsi comparer les effets des différents traitements et ce, en fonction du temps. Ces 12 animaux sont calculés sur la base d’un test de puissance connaissant la variabilité intrinsèque des modèles tumoraux (environ 25%) basés sur nos travaux antérieurs. Il est important de noter ici que le nombre d’animaux calculé est un nombre maximal. Grâce notamment aux études en imageries qui sont quantitatives, nous réaliserons des analyses séquentielles. Ainsi, les expériences seront réalisées par plusieurs lots et si les seuils statistiques sont atteints alors le protocole sera stoppé.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation (au minimum 7jours) avant toute expérimentation et bénéficieront également d’enrichissement (roue d’activité, stimulation sensorielle par différents objets). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement pendant les phases critiques (implantation, irradiation) et 3 fois par semaine par la suite. Une évaluation des éventuelles douleurs de l’animal est faite grâce à une observation de l’expression faciale. Si « un signe évident de douleur 2 » est atteint sans que pour autant les points limites entrainant la mise à mort ne soient atteints, une couverture analgésique sera mise en place par une injection quotidienne. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. . Les analgésies générales sont faites par injection sous cutanée et des anesthésies locales sont réalisées par application de gel (sur la peau avant incision et sur les barres d’oreille avant placement dans le cadre stéréotaxique). Lors des implantations chirurgicales, un gel est appliquée sur les yeux de l’animal afin d’éviter leur asséchement. Pour remédier à la perte de poids, les souris disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que du complément alimentaire si nécessaire.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux in vivo sont indispensables pour récapituler au mieux l’environnement inflammatoire des tumeurs qui se développent chez les patients. Nous utiliserons des souris immunocompétentes car ces souris présentent toutes les populations de cellules immunitaires et parce que le modèle de tumeur cérébrale utilisé repose sur l’implantation de cellules de gliome, développées depuis cette souche. De plus, pour cette espèce et pour les cellules étudiées, tous les outils de caractérisation en cytométrie en flux sont déjà validés dans la littérature et dans notre laboratoire. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 12 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expérimentaux utilisés.

1 556 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 1 056 d'entre elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses dans les deux flancs, 864 un traitement ou un placebo par gavage quotidien pendant quatre mois, et 480 une injection de cellules directement dans le cœur sous anesthésie gazeuse, suivie d'une lecture hebdomadaire de bioluminescence. Vingt animaux supplémentaires subissent l'injection intracardiaque au seul titre de l'apprentissage du geste. La mise à mort intervient dès qu'une taille de tumeur prédéfinie est atteinte ou que la dissémination devient trop importante, pour prélever organes et tumeurs, et le porteur affirme que la vascularisation et le micro-environnement tumoral réclament un "système biologique complexe" rendant "pour l'instant nécessaire l'utilisation d'animaux".

Objectifs

Le cancer du poumon est responsable de plus de 30 000 décès par an en France. La découverte de modifications génétiques fondamentales à l'origine de la survenue d'un certain type de cancer du poumon a permis une médecine de précision basée sur l’utilisation d'inhibiteurs d'activité enzymatique spécifique. Nous étudions plus particulièrement un récepteur présentant cette activité dont le dysfonctionnement est impliqué dans les cancers bronchiques, rénaux ou gastriques. Des inhibiteurs de l'activité de ce récepteur et des anticorps spécifiques dirigés contre ce dernier ont été développés. Plusieurs inhibiteurs ciblés de ce récepteur sont à ce jour cliniquement validés pour les patients atteints d’un cancer bronchique présentant un dysfonctionnement du récepteur favorisant la survie des cellules cancéreuses. Cependant, l’efficacité de ces traitements est restreinte avec des taux de réponse inférieurs à 50% et une durée de réponse moyenne de moins d'un an. Les causes de cette faible activité sont encore inconnues mais soulignent l’importance de mieux caractériser: -les mécanismes responsables de la survie des cellules cancéreuses suite au dysfonctionnement de notre récepteur -les caractéristiques des patients (marqueurs biologiques de sensibilité et mécanismes de résistance aux thérapies). La mutation génétique que nous étudions au niveau du récepteur d'intérêt montre une dépendance maintenue de ce dernier à sa molécule activatrice et il semble nécessiter un contexte spécifique pour initier le développement de la tumeur. De plus, chez les patients présentant un cancer du poumon avec un dysfonctionnement de notre récepteur d'intérêt, il a été identifié d'autres altérations génétiques additionnelles qui pourraient être à l’origine des échecs thérapeutiques. Dans ce contexte, nos objectifs sont de -caractériser le potentiel de survie des cellules cancéreuses lorsque le récepteur d'intérêt présente une mutation et comprendre le rôle de la molécule activatrice associée à ce récepteur dans ce cas de figure, -définir l’impact des 2ndes altérations génétiques identifiées chez les patients sur le développement tumoral et la dissémination métastatique dépendante du récepteur, (3) évaluer l’efficacité des traitements ciblant spécifiquement notre récepteur en fonction du contexte des mutations additionnelles, (4) rechercher les thérapies innovantes ou combinaisons thérapeutiques les plus efficaces basées sur les différents résultats obtenus dans notre étude

Bénéfices attendus

Nos travaux permettront de mieux comprendre les processus de transformation de cellules saines en cellules cancéreuses dans les cancers du poumon. Ils conduiront ainsi à identifier les patients pouvant tirer le plus grand bénéfice d’un traitement uniquement par inhibiteur spécifique du récepteur que nous étudions dans ce projet et d’éviter d’exposer les autres à un traitement inutile et potentiellement toxique. Pour les patients qui ne relèvent pas d’une thérapie n'utilisant qu'une seule molécule ou un seul anticorps spécifique, nos travaux permettront d'identifier des molécules efficaces pour une utilisation de combinaisons thérapeutiques ou d’inhibiteurs innovants. Ainsi, ce projet aidera à l’amélioration de la prise en charge des patients atteints de cancer du poumon.

Procédures

Le projet se déroulera en 4 parties. Plusieurs étapes sont communes à l’ensemble des parties. Pour les parties 1, 2 et 3, l’ensemble des animaux (1056) recevront une injection de cellules cancéreuses au niveau des 2 flancs (durée : 2 minutes). Toutes les souris seront pesées 2 fois par semaine (1 minute) et la croissance des tumeurs sera mesurée 2 fois par semaine (2 minutes). Dans les parties 2 et 3, 864 animaux recevront un traitement ou un placebo par gavage (une fois par jour, durée 1 min) et/ou par injection (1 à 2 fois par semaine, 1min) dès qu'un certain volume tumoral aura été atteint et jusqu’à la fin de l’expérience (durée totale maximale : 4 mois). Pour la partie 4, après une anesthésie gazeuse (durée 20 à 30 min), 480 animaux seront tondus au niveau du torse et recevront une injection intracardiaque de cellules cancéreuses. Cette injection se fera sans chirurgie. Pour apprentissage, 20 animaux supplémentaires subiront ce geste. Une fois les injections réalisées, l’état des souris sera contrôlé et les animaux seront pesés 2 fois par semaine (1 minute). Une lecture de bioluminescence sera réalisée une fois par semaine afin de suivre le développement des cellules tumorales. Pour cela les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse et maintenus sous anesthésie à l’aide d’un masque (durée anesthésie : 5 à 60 min). Ils recevront ensuite l’injection d’une molécule permettant la lecture de la bioluminescence (durée : 30 secondes). Les 480 animaux recevront également un traitement ou un placebo par gavage (une fois par jour, durée 1 min) et/ou par injection (1 à 2 fois par semaine, 1min) 48h après l'injection des cellules et jusqu’à la fin de l’expérience (durée totale : 3 mois). Enfin, l’ensemble des 1556 animaux seront mis à mort lorsqu’une taille de tumeur qui aura été prédéfinie sera atteinte ou lorsque la dissémination métastatique sera trop importante ou dès l’apparition du moindre signe de souffrance. Pour cela, les 1556 souris seront anesthésiées par voie gazeuse ou par injection avant d’être mises à mort.

Impact sur les animaux

Les procédures que nous prévoyons de réaliser pourraient être à l’origine d’un stress lié à la manipulation. L’injection des cellules et/ou de la molécule pour la lecture de la bioluminescence pourrait entraîner un stress ou une douleur chez les animaux. Pour limiter le stress des animaux, ces derniers seront anesthésiés lors de ces étapes de la procédure. Aux sites où les cellules seront injectées, le développement des tumeurs ne devrait pas entraver la liberté de mouvement des souris, cependant si cette liberté était altérée, une mise à mort des animaux sera réalisée.

Devenir

En fin de procédures, les animaux seront tous mis à mort car il est nécessaire de pouvoir étudier les organes et les tumeurs afin d’analyser le potentiel tumoral, métastatique mais également l’efficacité des traitements utilisés.

Remplacement

Avant d’initier la partie utilisant des modèles animaux de notre projet, de nombreuses études ont été réalisées sur des cellules de manière à pouvoir notamment étudier la prolifération cellulaire, la résistance à l’apoptose, la migration et la croissance sans ancrage des lignées que nous souhaitons étudier. L’évaluation des thérapies sera réalisée sur des cultures cellulaires en 3 dimensions afin de mieux représenter l’environnement et l’architecture complexes des tumeurs. Seuls les mutants présentant l’augmentation d’au moins une de ces capacités sont évalués dans les modèles animaux remplaçant ainsi l’animal dans le processus de sélection des lignées d’intérêt. Cependant, le modèle en 3 dimensions ne peut pas reproduire la complexité et la pathophysiologie des tumeurs in vivo, la croissance tumorale implique de nombreux processus biologiques comme la vascularisation tumorale, l’implication du micro-environnement tumoral, l’invasion des tissus voisins qui nécessitent pour leur évaluation un système biologique complexe rendant pour l’instant nécessaire l’utilisation d’animaux.

Réduction

Comme précisé précédemment, de nombreuses réponses biologiques dans les cellules ont été évaluées en 2D et 3D au préalable à l’étude dans des modèles animaux incluant la prolifération cellulaire, la résistance à l’apoptose, la migration et la croissance sans ancrage. Seules les lignées porteuses d’une mutation conférant des capacités favorisant le développement de tumeurs, soit une réduction de sensibilité aux inhibiteurs de MET, seront évalués dans les modèles utilisant des animaux. De plus, l’utilisation de l’imagerie pour évaluer la dissémination métastatique permet un suivi longitudinal de la dissémination évitant donc l’utilisation de plusieurs cohortes d’animaux à différents temps Pour l’évaluation de l’efficacité des traitements, les molécules sont d’abord utilisées sur les modèles de cellules. Seules les molécules capables d’inhiber au moins une réponse seront utilisées sur le modèle animal. Quand la conception de la procédure le permettra et afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, la lignée cellulaire parentale injectée sera comparée à plusieurs de ses dérivées co-altérées. Les groupes d’animaux par condition ont été déterminés en fonction de nos expériences précédentes pour donner une puissance statistique suffisante en tenant compte de la variabilité entre les animaux. Ainsi, nous avons réduit le nombre d'animaux au minimum nécessaire sans altérer la robustesse de nos résultats.

Raffinement

Afin de limiter au maximum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies dans un environnement enrichi (maison, carré de coton, copeaux de cartons...) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). Les animaux seront manipulés avant la mise en place de l’expérimentation afin de procéder à une habituation. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés avant les procédures pouvant induire un stress ou une angoisse chez l’animal ainsi qu’avant la mise à mort. Une fois l’injection intracardiaque de cellules tumorales réalisée, les animaux seront suivis quotidiennement de manière à pouvoir détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou d’angoisse. Des points limites ont été définis préalablement à l’expérience et seront suivis à l’aide d’une fiche d’évaluation des signes cliniques. En cas d’atteinte des points limites ou à leur approche, les animaux seront mis à mort selon la méthode définie. La mise à mort sera réalisée à distance des autres animaux.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix pour l’étude de la croissance tumorale expérimentale. Ce modèle permet notamment de disposer d’animaux immunodéficients compatibles avec l’injection de cellules tumorales humaines ainsi que d'utiliser des outils de modification génétique permettant le fonctionnement de notre modèle. Les injections de cellules tumorales seront réalisées comme classiquement décrit dans la littérature sur des animaux âgés de 6 à 8 semaines à la fois mâles et femelles.

400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever sang, organes lymphoïdes et intestin. 384 d'entre elles reçoivent dans leur eau de boisson des sucres complexes qui déclenchent une colite, avec selles molles, saignements possibles, perte de poids et baisse d'activité. 48 subissent une irradiation corporelle totale aux rayons X puis une greffe de cellules immunitaires, 48 autres une injection détruisant une partie de leurs globules blancs. Le porteur écrit que ces effets "restent limités dans le temps" et n'auront "pas d'effet durable sur leur santé", et attend du projet l'exploration de pistes thérapeutiques contre les maladies inflammatoires de l'intestin.

Objectifs

Chez l’homme, les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI), telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, résultent de réponses immunitaires non contrôlées contre la flore intestinale, entraînant une inflammation persistante et des lésions de l’intestin. Cette inflammation soutenue est due à de nombreuses molécules dont la production dépend d’une voie biochimique particulière. Nous travaillons sur un facteur capable de moduler cette voie inflammatoire et avons pour objectif de déterminer l’influence que ce facteur peut avoir dans l’inflammation intestinale. Pour ce faire, nous prévoyons d’utiliser un modèle utilisé en routine pour mimer chez la souris, l’inflammation associée aux MICI: induire une inflammation réversible au niveau du colon au moyen de sucres complexes administrés par l’eau de boisson. Nous étudierons les caractéristiques de cette inflammation influencée ou non par notre facteur d’intérêt. Nous examinerons en particulier le rôle de différentes cellules du système immunitaire dans ce processus. La compréhension du rôle de ce facteur régulateur dans la colite expérimentale pourrait ainsi ouvrir la voie à l’exploration de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant l’inflammation et aider à développer des approches innovantes pour moduler durablement l’inflammation chronique intestinale.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à une compréhension approfondie du rôle d’un facteur capable de moduler une voie biochimique majeure de l’inflammation qui est conservée chez l’homme et la souris. Cette étude se fera dans un modèle d’inflammation intestinale qui mime chez la souris, l’inflammation observable dans les maladies inflammatoires de l’intestin chez l’homme. Cette recherche pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques, en explorant la possibilité de manipuler l’activité de ce facteur pour réguler efficacement l’inflammation intestinale de manière ciblée et durable.

Procédures

Au total, 384 souris seront pesées individuellement une fois par jour pendant 7 jours (durée estimée : 30 secondes par pesée). 48 souris recevront une injection unique dans l’abdomen d’un produit anesthésiant (environ 20 secondes par injection), puis ces 48 souris subiront une irradiation corporelle totale unique aux rayons X (durée estimée : 10 minutes). Ces souris recevront également, 4 heures après, une injection intraveineuse de cellules pour permettre la reconstitution de leur système immunitaire (durée estimée : 1 minute par injection). 6 souris recevront une injection unique dans l’abdomen d’un produit conçu pour induire localement le recrutement de cellules immunitaires (environ 30 secondes par injection). 48 souris recevront une injection unique dans l’abdomen d’un produit destiné à éliminer une partie de leurs globules blancs (environ 30 secondes par injection). 4 jours plus tard, ces 48 souris recevront une injection de cellules par voie intraveineuse (durée estimée : 1 minute par injection).

Impact sur les animaux

L’induction de la colite peut provoquer un stress chez les animaux, principalement en raison de la gêne et de l’inconfort digestif liés à l’inflammation intestinale. Les symptômes incluent une modification de la consistance des selles et l’apparition possible de saignements entraînant une perte de poids et une diminution de l’activité. L’irradiation peut provoquer un stress modéré et affaiblir temporairement les défenses immunitaires, mais ces effets restent limités dans le temps. Les cellules immunitaires seront temporairement absentes pendant moins de deux jours, avant d’être remplacées par des cellules provenant d’autres souris, ce qui n’aura pas d’effet durable sur leur santé. Enfin, les injections peuvent provoquer une légère gêne localisée au point d’injection, mais celle-ci reste de très courte durée et limitée en intensité.

Devenir

À la fin de chacune des procédures, tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement du sang, des organes lymphoïdes et de l’intestin.

Remplacement

Les analyses in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité du système immunitaire, les interactions avec la flore intestinale, ni les interactions cellulaires qui régulent l’inflammation. En effet, l’inflammation intestinale implique non seulement les cellules immunitaires, mais aussi des cellules ayant des fonctions mécaniques, sécrétoires et régulatrices spécifiques, comme les cellules épithéliales intestinales, les fibroblastes locaux et des cellules du système nerveux. Ces différentes populations cellulaires communiquent via des médiateurs solubles, des interactions directes et des mécanismes d’activation complexes qu’il est impossible de recréer pleinement in vitro actuellement.

Réduction

De nombreux paramètres immunologiques ou paramètres tissulaires seront analysés sur chaque animal afin de limiter au maximum le nombre de répétitions tout en garantissant la robustesse des résultats. Pour le modèle de colite induite chez la souris, la variabilité biologique, mise en évidence par des données de la littérature scientifique, nécessite l’utilisation de groupes de 6 animaux par condition. Ce nombre a été optimisé afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, tout en maintenant des conditions statistiques suffisantes pour une interprétation fiable des résultats. Enfin, deux des procédures ne seront mises en œuvre que si les résultats de la première procédure le justifient, garantissant une utilisation raisonnée des animaux.

Raffinement

Dès le début de l’administration de l’eau de boisson modifiée, les souris seront surveillées quotidiennement et individuellement pendant 7 jours. Le suivi de l’inflammation intestinale sera assuré par une observation générale, une mesure du poids et un examen des selles. Toute souris présentant des signes manifestes de souffrance sévère sera immédiatement retirée de l’étude, anesthésiée sous anesthésie générale gazeuse et euthanasiée. Ces critères d’exclusion s’appliqueront également aux souris traitées pour des transferts de cellules. Toutes les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale profonde afin de minimiser la douleur et le stress.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence pour l’étude des maladies inflammatoires de l’intestin en raison de sa pertinence immunologique vis-à-vis des maladies humaines. C’est chez la souris que de nombreux modèles de maladies inflammatoires humaines, tels que celui de l’induction de colite, ont été développés et validés. De plus, la souris permet d’accéder à de nombreux variants génétiquement modifiés (indispensables pour explorer les rôles spécifiques de facteurs particuliers) et bénéficie d’une grande disponibilité d’outils d’analyse immunologique (anticorps, méthodes de dosage…). Sa proximité immunologique et inflammatoire avec l’homme, combinée à une reproduction rapide et des conditions expérimentales bien contrôlées, en fait un modèle pertinent pour cette étude. Enfin, l’utilisation de la souris permet une mise en perspective des résultats avec de nombreux travaux antérieurs connexes. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 6 et 10 semaines au début de la procédure, un stade correspondant à l’âge adulte jeune, optimal pour l’étude des mécanismes inflammatoires et immunitaires. Ce choix est justifié par plusieurs facteurs. Tout d’abord, à cet âge, le système immunitaire est complètement mature, ce qui garantit une réponse inflammatoire reproductible et évite les biais liés à l’immaturité immunitaire des jeunes souris ou aux modifications du système immunitaire associées au vieillissement. De plus, l’homogénéité des réponses immunitaires dans cette tranche d’âge permet de limiter la variabilité interindividuelle, garantissant des résultats interprétables sans nécessiter un nombre excessif d’animaux.

Une injection dans le cervelet suivie d'une électroporation, chez des souriceaux de sept à quatorze jours : 345 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 120 d'entre elles reçoivent en plus des injections dans l'abdomen deux fois par jour, répétées jusqu'à quatorze fois selon le stade étudié. Le porteur veut comprendre comment se développent les cellules granulaires du cervelet, qui représentent la moitié des neurones du cerveau, et rattache ce travail à l'ataxie, à l'autisme et aux tumeurs cérébrales de l'enfant. Toutes sont tuées pour des études histologiques, et 90 souris de plus, écartées faute du bon génotype, sont soit mises en accouplement soit tuées et prélevées.

Objectifs

Le cerveau se construit étape par étape : les cellules nerveuses se multiplient, se déplacent (migration), puis créent des connexions entre elles. Parmi ces cellules, on retrouve les cellules granulaires, très nombreuses dans une zone du cerveau appelée le cervelet, et qui représentent à elles seules la moitié des neurones du cerveau. Le cervelet joue un rôle important dans les mouvements, l’équilibre, mais aussi dans certaines fonctions comme le langage ou l’attention. Quand les cellules granulaires ou leurs connexions ne se développent pas correctement, cela peut entraîner des troubles comme l’ataxie (difficultés à coordonner les mouvements), l’autisme, ou certaines tumeurs cérébrales chez les enfants. Pourtant, on ne comprend pas encore bien comment ces cellules apparaissent et se développent. Nous proposons donc d’étudier la dynamique de développement des cellules granulaires et de leurs connexions neuronales en utilisant le modèle murin (souris normale ou génétiquement altérées sans phénotype dommageable), dont le développement des cellules granulaires est semblable à celui observé chez l’homme. Afin de visualiser les cellules granulaires et/ou de moduler ou suivre leur activité neuronale, nous utiliserons la méthode d’électroporation permettant l'introduction ciblée de matériel génétique dans des cellules spécifiques du cerveau en développement.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle de l’activité neuronale des cellules granulaires sur leur développement et la maturation de leur connexions neuronales, processus développementaux essentiels pour le fonctionnement du cervelet et liés à des maladies du cervelet telles que l’ataxie, l’autisme ou même des cancers pédiatriques. De même, à travers ce projet, nous determinerons le rôle encore inconnu d'une protéine candidate dans le développement des cellules granulaires, plus précisément dans leur migration. À long terme, ces connaissances permettront de mieux comprendre ces maladies, ce qui permettra d’améliorer les propositions de traitements qui sont pour l’heure très peu efficaces.

Procédures

Pour ce projet, un type d’intervention invasive est prévue chez les souriceaux: une injection intracérébrale dans le cervelet sous anesthésie générale, immédiatement suivie d'une électroporation. Cette intervention n’est réalisée qu’une seule fois (durée : 20 min maximum) pour tous les animaux de la procédure (total 345). Un lot de 120 animaux recevra des injections intrapéritonéales, deux fois par jour répétées entre 1 et 14 fois selon le stade de développement étudié. Cette injection génère un léger inconfort et ne nécessite pas d’anesthésie, elle dure moins de 30 secondes. L’euthanasie des animaux sera réalisée sous anesthésie générale par injection d’un euthanasiant. Elle concerne l’ensemble des animaux expérimentés soit 345 (durée : 15 min par animal).

Impact sur les animaux

L’incision de la peau lors de l’injection intracérébrale peut induire une douleur modérée et une irritation de la peau le premier jour après la manipulation. Les injections intrapéritonéales deux fois par jour peuvent induire un stress et une légère douleur de courte durée, ainsi qu’une légère sensibilisation de la peau, le site d’injection sera alterné entre droite et gauche afin de diminuer cet effet.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure pour des études histologiques. Les 90 souris non utilisées dans le projet car n’ayant pas le génotype souhaité seront soit mises en accouplement pour le maintien de la lignée, soit euthanasiées par une méthode règlementaire et prélevées pour analyse post-mortem .

Remplacement

L’expérimentation animale sur un modèle murin est essentielle pour nous, car aucun système in vitro ne permet de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. La culture cellulaire, bien adaptée aux cellules granulaires, ne permet ni d’étudier leur migration qui s'effectue de manière multidirectionnelle dans les 3 dimensions du cervelet, ni d’analyser la morphologie très particulière (en T) de leurs axones. Cependant, des études préliminaires ont été réaliséees : des cultures cellulaires ont permis de valider les plasmides utilisés ; et les électroporations ont été testées sur des tissus ex vivo afin de confirmer l’entrée du plasmide dans la population neuronale ciblée, ainsi que la présence des molécules dans ces neurones dès 24h après l’électroporation.

Réduction

Le projet est conçu pour limiter le nombre de souris au minimum dans la limite de ce qui est permis pour obtenir des résultats statistiquement et scientifiquement valides en prenant en compte la nécessité d’avoir plusieurs échantillons et de reproduire les résultats de manière indépendante pour éviter les différences dues à la variabilité biologique (sexe, caractéristiques génétiques…), à la variabilité environnementale (différence liée à la vie avec la mère). Nous réaliserons des tests statistiques adaptés aux petits échantillons et utiliserons des outils informatiques pour calculer la puissance de nos tests. Après sevrage des souriceaux, les mères peuvent continuer à être utilisées pour de nouveaux accouplements dans notre animalerie.

Raffinement

Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les animaux subissant des interventions feront l'objet d'une surveillance accrue pendant l'intervention et les jours suivants. Pour chaque intervention pouvant générer de l’inconfort ou de la souffrance, une grille de score a été établie, permettant la mise en place précoce de soin des animaux, évitant leur euthanasie. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des anesthésiques locaux sont également administrés pour limiter toute souffrance à l’animal après son du réveil. De plus, une attention particulière est portée à la stérilité de tous les instruments et au respect des bonnes pratiques de stérilité pour éviter toute infection. Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux.

Choix des espèces

Les souris sont devenues des modèles de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. En effet, elles permettent l’analyse de mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Les processus de développement du système nerveux central des souris étant similaire à ceux de l’homme, l’étude chez les souris permet également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. Notre projet concerne le développement des circuits du cervet, qui se déroulent principalement pendant les premières semaines après la naissance. Les animaux seront utilisés à 3 stades développementaux après la naissance correspondant à des moments clés du développement cérébelleux (tels que le pic de prolifération cellulaire à 7 jours de vie, la migration à 11 jours et la formation des connexions neuronales à 14 jours).

Des injections d'une molécule bactérienne provoquent chez les souris un état fébrile avec poil hérissé et prostration, avant deux séances d'imagerie avec pose d'un cathéter dans la queue et injection d'un radiotraceur. 496 souris transgéniques reproduisant la maladie d'Alzheimer sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus cérébraux. Le porteur teste deux inhibiteurs d'une protéine de l'inflammasome, injectés une fois par jour pendant cinq jours, et annonce comme bénéfices la validation d'une cible thérapeutique et un apport de connaissances. Il annonce aussi des tests comportementaux étalés sur quatorze jours pour évaluer la mémoire et le niveau de stress, sans préciser lesquels.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) constitue un problème de santé et sociétal majeur dans le monde, les causes et les nombreux facteurs contribuant à la MA sont encore mal compris et les essais cliniques n’ont jusqu'à présent pas réussi à stopper la progression de la MA. Une meilleure compréhension des mécanismes multifactoriels de la MA est nécessaire pour explorer de nouvelles approches thérapeutiques. La contribution de l'inflammation périphérique et cérébrale aussi appelée « neuroinflammation », à la pathologie de la MA est établie mais reste mal comprise. L’inflammation peut être ciblée via l’un de ses composants critiques : l’inflammasome qui est un complexe protéique impliqué dans l’immunité innée, et plus particulièrement l’une de ses protéines impliquées dans la neuroinflammation. Deux molécules inhibitrices de cette protéine seront donc testées. Ce projet vise à déterminer la contribution d’une réponse inflammatoire excessive induite par un stimulus pro inflammatoire, à la pathologie de la MA et à établir si la protéine peut être ciblée tant au niveau systémique qu’au niveau cérébral.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont : • De valider une cible thérapeutique innovante. • D’apporter de nouvelles connaissances dans le domaine des neurosciences et plus particulièrement du rôle de l’inflammation et de la neuroinflammation dans la MA.

Procédures

Un groupe d’animaux recevra : une injection par jour d’une molécule bactérienne pendant 2 jours (20 secondes par injection sur animal vigile). Ce groupe aura 4h ou 24h après cette injection une session d’imagerie d’une durée de 30 minutes : pose de cathéter (1 minute) puis injection du radiotraceur (1 minute) puis seront euthanasiés. Un groupe d’animaux recevra : une injection par jour d’une protéine bactérienne pendant 2 jours (20 secondes par injection sur animal vigile) puis une autre injection d’une des deux molécules inhibitrices de la protéine concernée, une fois par jour pendant 5 jours (20 secondes par injection sur animal vigile). Les animaux auront une session d’imagerie d’une durée de 30 minutes : pose de cathéter (1 minute) puis injection du radiotraceur (1 minute) et une séquence d’ultrasons (30 secondes à 1 minute, le tout sous anesthésie gazeuse). Les souris auront différents tests comportementaux pendant 14 jours pour une durée de 8 à 30 minutes en fonction du test (animal vigile). Les tests comportementaux auront lieu 2 fois et permettront d’évaluer l’évolution de la pathologie et les effets du traitement sur les fonctions cognitives notamment la mémoire ainsi que l’évaluation du niveau de stress. Les injections auront lieu 5 fois. Les sessions d’imagerie auront lieu 2 fois. Les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tissus cérébraux. Un groupe d’animaux recevra : une injection par jour d’une protéine bactérienne pendant 2 jours (20 secondes par injection sur animal vigile) puis une autre injection de la molécule, une fois par jour pendant 5 jours (20 secondes par injection sur animal vigile). Les injections auront lieu 2 fois. L’euthanasie aura lieu 1 heure après la dernière injection.

Impact sur les animaux

Le modèle transgénique de la maladie d’Alzheimer est très bien décrit dans la littérature nous avons une grande expérience de ce modèle. Les injections de la molécule bactérienne induisent généralement un état fébrile modéré (poil hérissé, prostration liée à la fièvre) après l’injection. Ces symptômes disparaissent d’eux-mêmes (12-24h). Les injections peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection et un hématome au niveau de la queue à la pose ou au retrait du cathéter peut être présent. Nous ne pouvons pas exclure que les animaux ressentent un léger stress lors du transport vers la salle de comportement. Lors des tests comportementaux, chaque souris sera testée individuellement donc séparée pendant quelques minutes de ces congénères, ceci peut engendrer un léger stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des études ex vivo complémentaires aux études d’imagerie.

Remplacement

Seules des études chez l’animal vivant peuvent reproduire la complexité de l’ensemble des processus physiopathologiques dans leur intégralité. De plus, il est important de noter que la méthode d’imagerie utilisée est intégralement transférable à la clinique et que l’étude chez l’animal nous informera de l’amplitude des différences entre groupes qui lors d’études similaires précédentes se sont révélées similaires à celles observées chez l’homme.

Réduction

L’utilisation de la méthode d’imagerie in vivo permet de réduire le nombre d’animaux utilisé (-25%) par le biais du suivi longitudinal. Le nombre total d’animaux est néanmoins dicté par les groupes expérimentaux requis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée. Ces groupes seront composés de 50% de mâles et 50% de femelles. Bien que des différences mineures de pathologie de la maladie d’Alzheimer aient été notées entre mâles et femelles dans notre modèle, celles-ci ne devraient pas affecter significativement les paramètres mesurés dans cette étude. Nous prévoyons ainsi d’inclure un effectif de 10 animaux/groupe (afin d’assurer un minimum de 8 animaux à exploiter, par exemple en cas d’échec de l’injection du traceur ou de mort au cours de l’imagerie), nombre qui a été suffisant lors d’études précédentes dans ce modèle. Dans ce projet, nous utiliserons des tests statistiques appropriés pour analyser les différents paramètres mesurés au cours du projet : en imagerie, en tests comportementaux et en études in vitro.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les animaux seront observés une à deux fois par jour. Toutes les stratégies d'anesthésie et de soin seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par les procédures. En cas de blessures, nous appliquerons un nettoyant et un désinfectant sur la plaie jusqu’à la cicatrisation complète. Pendant la durée du projet, le point d’injection, les expressions faciales, la posture et état du pelage, la réactivité de l’animal à des stimuli externes (bruit…) seront monitorés chaque jour. Si un animal montre des signes de mal-être, des mesures adaptées seront prises pour éviter toute souffrance prolongée, pouvant aller jusqu’à l’euthanasie si nécessaire. Le jour de l'imagerie, l’induction et le maintien se fera sous anesthésie gazeuse. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations d’imagerie sur tapis chauffant, le rythme respiratoire et la température seront sera surveillés. Dès son réveil, l’animal sera remis dans sa cage d’hébergement. Afin de limiter leur stress, dans toutes les procédures les animaux seront récompensés après chaque injection réalisée sur l’animal vigile

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix car la pathologie de la maladie d’Alzheimer (MA) est bien reproduite dans ce modèle d’animal transgénique et les processus inflammatoires lié à cette maladie dans ce modèle sont très similaire à ceux observé chez l’humain. La taille du cerveau de la souris est compatible avec la résolution spatiale de la caméra. Nous utiliserons des souris adultes car la MA ne concerne que les populations adultes/âgées.

Douze semaines sans aucun enrichissement physique dans la cage, pour installer un état d'anxiété-dépression : 1 224 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 924 subissent quatre semaines de stress chronique léger, 564 reçoivent quatre séances d'ultrasons crâniens sous anesthésie, et chacune passe deux séances d'imagerie pouvant durer deux heures. Six tests comportementaux mesurent ensuite la motricité, la dépression et l'anxiété ainsi induites. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes et vérifier que les signaux vus en imagerie correspondent bien à des altérations réelles de la barrière hémato-encéphalique.

Objectifs

Les traitements actuels contre la dépression restent insuffisants pour une partie des patients, et les rechutes sont fréquentes. Pour développer de nouvelles approches plus efficaces, il est essentiel de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans cette maladie. Notre projet de recherche s’intéresse à un élément encore peu exploré dans ce contexte : la barrière hémato-encéphalique (BHE). La BHE est une structure qui agit comme un filtre protecteur, en contrôlant les échanges entre le sang et le cerveau. Des études récentes suggèrent qu’elle pourrait être altérée dans certaines maladies psychiatriques, comme la dépression, et ainsi contribuer à certains symptômes. De plus, des travaux montrent qu’il est possible de moduler temporairement la perméabilité de cette barrière, ce qui permettrait de faire passer dans le cerveau des substances actives susceptibles d’agir sur les symptômes dépressifs. Ces découvertes ouvrent des perspectives nouvelles, à la fois pour mieux comprendre la maladie et pour envisager de nouvelles voies d’administration de traitements ciblés. Notre projet repose donc sur deux grands objectifs complémentaires : 1. Étudier l’état de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle animal (des souris) présentant des caractéristiques proches de la dépression humaine. Pour cela, nous utilisons des techniques d’imagerie non invasives permettant d’observer le cerveau (IRM) et son fonctionnement (TEP). 2. Tester la possibilité d’agir sur la barrière, en modifiant transitoirement sa perméabilité. Cela permettra d’évaluer si des composés potentiellement utiles contre la dépression peuvent franchir cette barrière et avoir un effet thérapeutique. Cette modulation sera testée par deux méthodes : l’utilisation d’ultrasons ciblés (FUS) et l’administration de substances spécifiques. L’ensemble de ces investigations vise à mieux comprendre le rôle de la BHE dans la dépression et à évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques en s’appuyant sur l’imagerie et la modulation ciblée de cette barrière.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à approfondir la compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans la dépression afin d’ouvrir la voie à des traitements plus efficaces et mieux ciblés. À court terme, il s’agit : • d’évaluer l’état de la barrière hémato-encéphalique (BHE), filtre naturel du cerveau, chez des animaux présentant des comportements similaires à la dépression, pour identifier d’éventuelles altérations ; • d’étudier comment des ultrasons ciblés ou certaines substances influencent la perméabilité de cette barrière et le passage de composés vers le cerveau, afin d’optimiser l’administration de médicaments ; • d’analyser les effets cellulaires de ces modulations pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques ; • d’explorer un éventuel effet bénéfique des ultrasons sur le comportement de ces animaux ; • et de renforcer l’usage de l’imagerie TEP pour étudier, de manière non invasive, la BHE et les processus cérébraux associés à la dépression. À long terme, ces recherches devraient permettre : • une meilleure compréhension des mécanismes complexes de la dépression, essentielle au développement de traitements plus performants et durables ; • l’évaluation d’une approche innovante reposant sur les ultrasons ciblés, potentiellement capable d’agir à la fois sur la BHE et sur les symptômes dépressifs ; • des avancées vers des stratégies thérapeutiques non invasives, précises et personnalisables ; • une meilleure connaissance des effets des ultrasons sur le cerveau, nécessaire à leur future utilisation clinique ; • et des retombées méthodologiques utiles à la recherche en imagerie et en neuropharmacologie. En résumé, ce projet combine neurosciences, imagerie et technologies innovantes pour explorer de nouvelles voies thérapeutiques dans la dépression, avec l’ambition d’améliorer à terme la prise en charge des patients.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : • Réalisation de sessions d’imagerie (2 imageries par animal) sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum ; 1224 animaux) • Induction du modèle dépressif : la dépression sera induite par un protocole standardisé de stress chronique léger, réalisé sur une période de 4 semaines (924 animaux) • Réalisation de sessions d’ultrasons (4 sessions d’ultrasons par animal) sous anesthésie gazeuse (durée 5 minutes au maximum ; 564 animaux) • Les rongeurs seront soumis à des tests comportementaux (6 tests par animal) afin de mesurer l'activité motrice (durée = 30 minutes), la dépression (durée = 5 minutes) et l’anxiété (durée = 5 minutes). • Administration 2 fois par semaine d’un candidat médicament par injection i (réalisée en 10 secondes ; 528 animaux) pendant 28 jours.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Induction d’un phénotype dépressif • Administration de médicaments par injection, ce qui induit une douleur suite à la piqure inférieure à 3 secondes. • Absence d’enrichissement physique dans les cages afin de favoriser le modèle d'anxiété-dépression (12 semaines), les enrichissements environnementaux de type sensoriel et social sont maintenus. • Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue lors de l’examen d’imagerie. Afin de minimiser ce stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage propre. • Stress possiblement induit par les tests de comportement mais tests réalisés sous étroite surveillance et interrompus en cas de stress trop important.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les organes, d’en analyser leur composition aux niveaux cellulaires et tissulaires. Ces analyses permettront d’obtenir des informations supplémentaires sur les mécanismes biologiques en jeu, notamment la distribution des biomarqueurs d’intérêt. Elles serviront surtout à valider et à interpréter les résultats obtenus par imagerie, en s’assurant que les signaux observés reflètent bien des altérations réelles et spécifiques de la barrière hémato-encéphalique. Cette étape est essentielle pour confirmer la pertinence de l’imagerie comme outil fiable d’investigation de la BHE.

Remplacement

En amont de ce projet, des études ont été menées en laboratoire, notamment en utilisant des matériaux simulant le cerveau (des "fantômes") et des cultures de cellules. Ces travaux préliminaires ont servi à tester et à ajuster les paramètres techniques, en particulier ceux liés à l'utilisation des ultrasons et à l'effet de certaines substances sur la barrière qui protège le cerveau (la Barrière Hémato-Encéphalique ou BHE). L'objectif était précisément de limiter le recours aux animaux. Cependant, ses recherches portent sur des pathologies complexes comme la dépression et sur les interactions fines entre le cerveau, sa barrière protectrice, et des interventions comme les ultrasons ou l'administration de substances. Actuellement, la complexité d'un organisme vivant, avec son environnement cérébral unique et l'interaction de ses différents systèmes, ne peut pas être reproduite fidèlement par des études en laboratoire sur des cellules isolées, des organoïdes ou par des simulations informatiques. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour étudier ces maladies complexes et pour évaluer la variabilité de la réponse à des approches potentielles de traitement.

Réduction

Pour ce projet, nous avons déterminé le nombre d'animaux à utiliser par une approche intégrée visant à utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables et reproductibles. Voici les techniques que nous mettons en œuvre pour réduire le nombre d'animaux nécessaires : - Imagerie longitudinale non invasive : nous utiliserons la tomographie par émission de positons (TEP) pour étudier les différences pharmacocinétique au sein de nos groupes. Cette méthode non invasive permet de réaliser plusieurs examens d'imagerie sur le même animal au fil du temps. En suivant les mêmes animaux à différentes étapes de l'étude, nous réduisons considérablement le nombre total d'animaux nécessaires. - Analyse statistique : l'analyse choisie permet de maximiser la précision des comparaisons entre groupes tout en tenant compte des variations individuelles. - Nous avons également utilisé des logiciels spécialisés pour optimiser la taille des échantillons.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, des mesures concrètes seront mises en place pour limiter au maximum la douleur, le stress et toute forme d'inconfort chez les animaux, conformément au principe de Raffinement. Les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de 1 à 4 semaines avant toute procédure, afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Elles seront logées en groupe pour favoriser leur bien-être social, et manipulées de manière douce et progressive pour réduire leur stress. Un suivi quotidien sera assuré par du personnel formé, qui observera leur comportement, leur aspect général, leur poids, ainsi que leur consommation d’eau et de nourriture. Ce suivi permet de détecter rapidement tout signe de mal-être. Toutes les procédures pouvant causer une gêne (examens d’imagerie, injections…) seront réalisées sous anesthésie générale. Pendant l’anesthésie, leur respiration et leur température seront surveillées. Le réveil se fera dans leur cage habituelle ou avec leur propre litière pour limiter le stress. Un système d’observation rigoureux des animaux a été mis en place afin de repérer rapidement d’éventuels signes de stress ou de souffrance, bien que toutes les précautions soient prises pour les éviter. Des points limites adaptés ont été définis, permettant d’identifier ces rares cas. Dans une telle situation, une évaluation précise de l’état général de l’animal sera réalisée, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires. Enfin, les différentes étapes expérimentales sont espacées dans le temps pour permettre aux animaux de récupérer entre les procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de cette étude, il a été décidé d'utiliser des souris. Ce choix repose sur des raisons scientifiques importantes. Premièrement, le modèle de dépression utilisé dans ce projet, qui est induit en donnant une substance (la corticostérone) dans l'eau de boisson pendant une certaine période, a été spécifiquement développé et validé chez la souris. L'utilisation de cette espèce nous permet donc de travailler avec un modèle dont les caractéristiques liées à la dépression sont bien établies. De plus, un type particulier de souris présente des avantages techniques pour les méthodes d'imagerie non invasives que nous allons utiliser, comme une meilleure transmission des ultrasons à travers le crâne. Ces souris sont également très similaires les unes aux autres, ce qui rend les résultats plus fiables et reproductibles. Concernant le stade de développement, nous utiliserons uniquement des animaux adultes. Ce choix est essentiel car la dépression est une maladie qui se manifeste principalement chez l'adulte. En travaillant sur des souris adultes, nous nous assurons que les mécanismes biologiques et les comportements que nous étudions sont pertinents par rapport à la maladie chez l'homme. Enfin, certaines des techniques d'imagerie non invasives employées nécessitent que le crâne soit complètement développé pour obtenir des données précises et comparables. Cela est généralement atteint à l'âge adulte chez la souris. En résumé, l'utilisation de souris adultes est la plus appropriée et la plus pertinente pour étudier les mécanismes de la dépression et évaluer de nouvelles approches dans ce projet.