Souris

Toutes tuées pour que leur cerveau soit prélevé, 60 souris de quatre à six semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection de kaïnate déclenche chez elles des crises convulsives généralisées, cotées sur l'échelle de Racine, suivies d'un état épileptique puis de crises récurrentes. S'y ajoutent la pose d'un cathéter intraveineux et une incision du cuir chevelu avec fraisage du crâne pour installer une fenêtre crânienne, opération de trente minutes dont les animaux ne se réveillent pas. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro, ex vivo, in silico ou sur puce microfluidique ne reproduit la complexité en jeu, et conclut que le recours à l'animal est "indispensable".

Objectifs

L’épilepsie pharmacorésistante reste un défi thérapeutique majeur, notamment dans les formes sévères associées à des crises prolongées ou récurrentes. Le cannabidiol (Epidiolex®) et la fenfluramine (Fintepla®) ont montré une efficacité clinique dans certaines formes d’épilepsie pédiatrique (syndromes de Dravet et de Lennox-Gastaut), mais leurs mécanismes d’action restent mal compris, et leur efficacité dans d'autres contextes épileptiques n’a pas été pleinement explorée. Par ailleurs, des études chez la souris ont montré un rôle spécifique des récepteurs cannabinoïdes de type 2 (CB2) dans les mécanismes de protection dans le contexte d’épilepsie pédiatrique. Cependant, leurs effets sur les altérations neurovasculaires associées aux crises, notamment sur la barrière hématoencéphalique (BHE), restent peu étudiés. La BHE joue un rôle central dans le contrôle de l’environnement cérébral, et sa perturbation est maintenant reconnue comme un acteur clé dans la genèse et la chronicisation de l’épilepsie. Des études ont montré que les crises épileptiques induisent une ouverture de la BHE, facilitant l’infiltration de cellules immunitaires et de composants plasmatiques pro-inflammatoires dans le parenchyme cérébral, ce qui peut aggraver l’excitabilité neuronale. L’utilisation du modèle murin d’épilepsie induite par injection systémique de kainate chez la souris permet de reproduire de manière fiable des crises convulsives aiguës suivies d’un état épileptique et d’une phase chronique avec crises récurrentes, mimant certains aspects de l’épilepsie humaine. Ce modèle est largement validé pour l’étude des mécanismes physiopathologiques de l’épilepsie et pour l’évaluation préclinique de nouvelles approches thérapeutiques. Il est donc particulièrement adapté pour étudier l’impact de traitements antiépileptiques sur la restauration de l’intégrité de la BHE, la modulation de la neuroinflammation et les interactions neurovasculaires. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer si l’activation du système sérotoninergique et/ou du système endocannabinoïde (récepteurs CB2) est capable de préserver l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique et l’infiltration immunitaire dans le contexte des crises épileptiques pédiatriques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont significatifs. Il vise à évaluer l’effet thérapeutique d’un agoniste sélectif des récepteurs cannabinoïdes de type 2 (CB2) dans un modèle préclinique bien établi d’épilepsie induite par le kaïniate. En particulier, le projet se concentre sur l’impact de ce traitement sur l’intégrité et la perméabilité de la barrière hématoencéphalique (BHE), qui joue un rôle central dans la physiopathologie de l’épilepsie, notamment dans les formes pharmacorésistantes. Ce travail pourrait permettre de mieux comprendre le rôle des récepteurs CB2 dans la modulation de l’inflammation neurovasculaire et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans le contexte de l’épilepsie pédiatrique. À terme, il pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches de traitement non seulement pour les patients pédiatriques mais aussi ceux atteints d’épilepsie réfractaire.

Procédures

Type d’interventions, nombre et durée : 1. Induction du modèle d’épilepsie: Cette procédure dure environ 1 à 2 heures par animal (1 seule fois). 2. Pose d’un cathéter intraveineux (10 minutes/souris ; 1 fois). Intervention légère sous anesthésie générale avec analgésie préopératoire. 3. Chirurgie pour la mise en place d’une fenêtre crânienne sous anesthésie générale et analgésie (30 minutes/souris ; 1 fois). 4. Traitements pharmacologiques expérimentaux (durée 2 minutes, 1 fois/jour).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, l’induction du modèle d’épilepsie est susceptible d’entraîner des effets indésirables chez les souris. Ces effets incluent des crises convulsives généralisées (évaluées selon l’échelle de Racine), une altération de l’état général (perte de poids, hypomotricité), ainsi qu’un stress aigu durant la phase d’induction. Cette phase est considérée à sévérité modérée, et restera strictement encadrée par des critères de surveillance clinique renforcée de la part des expérimentateurs, avec mise en place de points limites clairs pour interrompre l’expérience en cas de souffrance excessive. Cette étude prévoit également une chirurgie pour la mise en place d’une fenêtre crânien. Cette procédure est associée à une nuisance modérée, incluant une incision cutanée et un fraisage du crâne. Une anesthésie générale et une analgésie préopératoire sera systématiquement administrée pour réduire au minimum la douleur et le stress liés à cette intervention. Cette dernière intervention sera sans réveil. Les traitements pharmacologiques expérimentaux ne sont pas connus pour induire de toxicité aiguë aux doses prévues, mais une surveillance spécifique de la part des expérimentateurs sera mise en place pour détecter d’éventuels effets indésirables (notamment sédation excessive, modifications cardiovasculaires ou comportementales). L’ensemble des procédures expérimentales respectera les recommandations du 3R, avec un effort particulier sur le raffinement (analgésie systématique, suivi clinique rapproché, intervention immédiate en cas de souffrance non anticipée) et une justification du nombre d’animaux utilisés.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort pour récupération de leur cerveau pour analyses ultérieures.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet d’un agoniste sélectif des récepteurs CB2, en comparaison avec la traitement utilisé en clinique, sur l’activité épileptique et l’intégrité de la barrière hématoencéphalique (BHE) dans un modèle in vivo d’épilepsie pharmacorésistante. À ce jour, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire fidèlement la complexité des interactions neurovasculaires, immunitaires et électrophysiologiques impliquées dans l’épilepsie et ses comorbidités, en particulier en ce qui concerne la dynamique de la BHE en situation pathologique. Les systèmes cellulaires en culture (cultures primaires, co-cultures ou organoïdes cérébraux) permettent d'étudier certains mécanismes moléculaires isolés, mais ils sont incapables de modéliser les crises épileptiques dans leur dimension systémique (réseau neuronal global, perfusion cérébrale, réponse immunitaire périphérique, comportement animal, etc.). De même, les modèles in silico ou les approches sur puce microfluidique ne peuvent pas intégrer la dimension spatiotemporelle et multifactorielle des altérations observées in vivo, notamment l’impact du traitement pharmacologique sur les paramètres physiologiques globaux. L’utilisation d’un modèle animal avec induction d’un status épileptique, est donc indispensable pour répondre à la problématique scientifique posée. Ce modèle est bien caractérisé, cliniquement pertinent et permet d’étudier de manière intégrée les effets d’un traitement sur les crises épileptiques, les altérations de la BHE, l'inflammation cérébrale et les effets comportementaux. Ainsi, aucun substitut expérimental ne permet aujourd’hui d’acquérir les données nécessaires avec un degré de pertinence biologique équivalent, ce qui justifie le recours à un modèle animal pour ce projet.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Tout d’abord, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives comme l’IRM permet de réduire le nombre d'animaux utilisés ; de cette manière, les procédures utilisées ont été réfléchies de manière à les rendre compatibles entre elles (nous utiliserons d’abord l’IRM –technique non invasive- et le lendemain l’imagerie biphotonique chez la même souris, ce qui nous permet de réduire de moitié le nombre de souris à utiliser dans le projet). Ainsi, nous avons conçu ce projet de façon à ce que les mêmes souris nous permettent d’obtenir des résultats sur l’inflammation vasculaire, la perméabilité de la BHE, la réponse immunitaire des cellules résidentes du cerveau (microglie) et les phénomènes d’infiltration leukocytaire (rolling et adhésion de leukocytes circulants aux parois vasculaires).

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, il est prévu l'utilisation d’analgésie péri-opératoire et post-opératoire ainsi que d'anesthésie pour toute procédure chirurgicale et imageries. Les points limites adaptés à l’étude ont été établis; une grille de score (grimace-scale) sera utilisée. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par les expérimentateurs 7/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l'accès à l'eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l'angoisse, la souffrance de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu'à la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et en immunologie. Le fonctionnement du système immunitaire de la souris se rapproche de celui de l'homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la dynamique de microglie dans les conséquences des crises épileptiques. Les animaux transgéniques utilisés seront âgés de 4 à 6 semaines et auront un poids d'environ 12-18 g. Nous réaliserons nos modèles sur des jeunes souris afin de pouvoir mimer la pathologie épileptique pédiatrique.

Ouvertes sous anesthésie générale pour qu'un mélange d'ADN soit injecté dans le cerveau de leurs embryons, des femelles gestantes comptent parmi les 706 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des nouveau-nés d'un à quatre jours reçoivent une injection de tamoxifène ou de virus, et 346 animaux subissent une perfusion intracardiaque sous anesthésie, sans réveil. L'objet déclaré est le rôle d'une protéine dans la formation de l'interface entre astrocytes et vaisseaux sanguins du cerveau, sans application annoncée. Le porteur écrit que des points limites intermédiaires permettront de soigner les animaux en "évitant la mise à mort", alors que toutes les souris du projet sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé.

Objectifs

Les astrocytes sont les cellules gliales majoritaires du système nerveux central et sont maintenant des acteurs reconnus de la physiologie de celui-ci. Notamment, les astrocytes sont importants dans le maintien dans le cerveau adulte des fonctions vasculaires comme la barrière hémato-encéphalique. In vitro leur rôle dans l’induction de ces propriétés a été largement étudié. Cependant, aucune claire démonstration de ce rôle n’a été faite in vivo. Une des raisons pour cela est le manque de connaissance sur le développement du compartiment astrocytaire périvasculaire et plus généralement l’évolution de l’interaction entre les astrocytes et les vaisseaux sanguins au cours du développement cérébral. Au cours d'une première étude, nous avons identifié une protéine qui pourrait jouer un rôle important dans le développement de cette interaction au cours du développement postnatal. Nous cherchons donc maintenant à étudier son rôle, en utilisant plusieurs stratégies d'imagerie et moléculaires. La première partie du projet consistera à mettre en place la délétion précoce spécifiquement dans les astrocytes de ce gène. Dans la deuxième partie du projet, nous réaliserons une analyse histologique, pour les différents marqueurs astrocytaires et vasculaires, ainsi que la densité cellulaire, pour identifier si son absence a des conséquences sur les propriétés de l'unité gliovasculaire et sa composition moléculaire. La morphologie des astrocytes sera également étudiée. Dans la troisième partie du projet, nous analyserons les potentielles modulations au niveau moléculaire.

Bénéfices attendus

Les astrocytes sont des cellules gliales indispensables au fonctionnement du cerveau qui ont une morphologie très ramifiée et complexe et qui contactent en particulier les vaisseaux sanguins cérébraux. Les astrocytes régulent les fonctions cérébrovasculaires mais les modalités de ces régulations sont encore mal caractérisées. Notre projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle d’une protéine chaperonne des lipides gras polyinsaturés dans le développement et la maturation des astrocytes cérébraux et en conséquence, le développement de l’unité gliovasculaire.

Procédures

4 interventions sont utilisées dans ce projet. 1) injection dans le cerveau d’embryon (in utero) : des femelles gestantes sous anesthésie générale sont opérées. Un mélange d’ADN et de colorant est injecté dans le cerveau des embryons. Nombre d’embryons concernés : 60. Cette chirurgie n’est réalisée qu’une seule fois (durée: 30 min maximum). 2) Injection de Tamoxifen : du tamoxifen est injecté chez des nouveau-nés de 1 ou 4 jours et à 30 jours de vie. Cette injection n’est réalisée qu’une seule fois (pour le snouveaux-nés) ou 5 jours de suite (chez les souris de 30 jours). Elle est sans douleur et ne nécessite pas d’anesthésie. Nombre d’animaux concernés : 700 (durée: 1min). 3) injection de virus chez des nouveaux-nés. Cette injection se fait une seule fois, sous anesthésie locale. Nombre d’animaux : 60 (durée 15min). 4) Perfusion intracardiaque: Réalisée sous anesthésie générale, cette intervention est sans réveil. Nombre d’animaux concernés : 346 (durée: 15min)

Impact sur les animaux

La totalité des animaux subiront une injection sous-cutanée d’un produit chimique, ce qui peut engendrer un stress lié à la contention de l’animal et une douleur locale liée à l’injection (nuisance légère). Certains animaux recevront une injection intraveineuse dans la joue de virus. Ce geste peut entrainer une gêne au niveau du site d’injection (nuisance modérée). Un lot de femelles gestantes subira une chirurgie pour l’injection d’ADN chez les embryons, qui peut entrainer des effets modérés. Une observation particulière des animaux dans les jours suivants et l’application des points limites permettent de limiter la nuisance et la souffrance des animaux.

Devenir

La mise à mort des animaux est nécessaire pour récupérer les cerveaux afin d’étudier les propriétés des astrocytes.

Remplacement

L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Tests statistiques : Pour l’ensemble des questions il faut obtenir les observations sur au minimum 5 réplicas biologiques pour chaque génotype, pur chaque sexe, à chaque stade et pour chaque condition de traitement. Ce nombre de 5 est un minimum pour intégrer dans notre étude la variabilité entre les animaux. C’est un prérequis dans l’ensemble des publications de travaux scientifiques. Elle est particulièrement cruciale pour l’étude développementale où les programmes de différentiation cellulaire peuvent légèrement varier d’un individu à l’autre. Après avoir vérifié la normalité des données et l’absence de différence entre les animaux de même génotype, les effets observés seront évalués

Raffinement

Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les nouveau-nés subissant une injection feront l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure et les jours suivants. Pour chaque intervention pouvant générer de l’inconfort ou de la souffrance, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. En particulier, des points limites intermédiaires permettant la mise en place de soin aux animaux seront mis en place évitant la mise à mort des animaux. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des analgésiques seront co-administrés pour limiter toute souffrance à l’animal. Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux (gestion optimale de l’élevage, actes de chirurgie ou d’injection intrapéritonéale, gestion de l’anesthésie/analgésie, analyse des points limites).

Choix des espèces

La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Nous prévoyons 4 stades à étudier : 10, 15, 60 et 200 jours après la naissance. Ces stades ont été choisis sur la base de nos études préalables (en particulier dans notre laboratoire) qui montrent que l’Unité Gliovasculaire se met en place entre 5 et 15 jours après la naissance, avec une période critique entre les jours 10 et 15. Il est par ailleurs important de déterminer si ce sont des phénomènes uniquement développementaux (étude aux jours 10 et 15) ou maintenu chez l’adulte (études aux jours 60 et 200).

2 120 souris immunodéficientes vont être utilisées, chacune pouvant recevoir le traitement jusqu'à sept fois par semaine et passer deux séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une greffe de cellules cancéreuses humaines sous la peau ou dans la prostate, des mesures répétées de la tumeur au pied à coulisse, un prélèvement de sang par semaine à la veine mandibulaire, puis une chirurgie de retrait de la tumeur. Toutes sont tuées pour que les tumeurs et les organes voisins soient prélevés. Le porteur indique que ses molécules ont déjà montré leur efficacité et leur spécificité sur des cellules, et renvoie au conditionnel la stratégie thérapeutique qui serait un jour proposée aux patients, alors que les greffes et les gestes répétés sont, eux, programmés.

Objectifs

Le traitement du cancer par chimiothérapie cible avant tout les cellules à renouvellement rapide dont les cellules cancéreuses mais pas que. Cette absence de sélectivité engendre des effets secondaires importants avec une une toxicité adjacente pour les tissus sains. Les autres traitements tels que les rayons peuvent également toucher les tissus sains autour de la tumeur et l'immunothérapie est un traitement lourd avec des effets secondaires qui altère l'état général car il y a nécessité de stimuler le système immunitaire. Au sein de notre laboratoire, nous avons développé des molécules thérapeutiques anti-cancéreuses dont l’efficacité et la spécificité ont été démontrées. L’innocuité du traitement chez la souris a été vérifié. Nous planifions d’utiliser des modèles tumoraux tels que 1) le développement des tumeurs primaires localisées sous la peau des souris (modèle classique d’oncologie pré-clinique) 2) le développement des tumeurs primaires localisées en orthotopiques (c’est-à-dire l’organe duquel les cellules tumorales sont issues) comme la prostate. Ces modèles permettront d'évaluer l’efficacité de molécules présentant des propriétés anticancéreuses. 

Bénéfices attendus

Ces molécules thérapeutiques ont déjà montré leur efficacité et leur spécificité sur des cellules Pour valider ces résultats, nous avons besoin que les tumeurs évoluent dans leur environnement de prédilection, à savoir dans un environnement en 3 dimensions complexe et multicellulaire, idéalement dans leur organe d’origine. C’est pour cela que nous allons réaliser des greffes de cellules cancéreuses humaines qui nous permettent de positionner les cellules tumorales dans leurs organes d’origine. En validant ces résultats chez la souris, nous pourrons à terme proposer une stratégie thérapeutique anti-cancéreuse aux patients qui ciblera spécifiquement la tumeur et aboliera la formation de métastases.

Procédures

Les animaux sont anesthésiés pour les procédures suivantes : - une implantation de cellules tumorales sous-cutanée (

Impact sur les animaux

La répététion des gestes techniques peuvent creer des nuisances chez les animaux . Pour limiter ces effets nous regroupons au maximum ces gestes pendant les séances d'imagerie où les animaux sont sous anesthésie générale. Les animaux seront soumis à l’injection des cellule tumorales sous cutanée avec une aiguille de très faible diamètre. Cette injection dure très peu de temps et n’aura lieu qu’une fois et sur des animaux endormis évitant leur douleur et stress. Par la suite, les gestes techniques : acquisition d’image , mesure du volume de la tumeur avec un pied à coulisse , retrait de la tumeur, prélevement d’un petit volume de sang à la joue auront également lieu sur animaux endormi pour éviter du stress supplémentaire. Une injection de d'une molécule permettant de visualiser la bioluminescence sera réalisée par voie intra péritonéale avec une aiguille de très faible diamètre d’un petit volume adapté qui nécessite quelques secondes de contention indolore. Des nuisances plus importantes peuvent être attendues dans la procédure de la greffe prostatique telles que des difficultés pour les animaux à se redresser completement sur les pattes arrières ou une gène liée à la chirurgie les heures suivantes. Pour limiter et éviter toute douleur et stress liée à la chirugie ou le retrait de la tumeur, les animaux seront sous anti douleur et l’accès à l’eau et la nourriture sera facilitée les heures suivant l'opération. Les animaux peuvent se défaire un point de suture ou la plaie peut ne pas bien cicatriser auquel cas l’expérimentateur refera immédiatement le point et desinfectera la plaie sous anesthésie. Par la suite, le développement de la tumeur peut générer une gène ainsi qu'une baisse de l'état général qui sera au maximum anticipé par l'expérimentateur. L’évolution de la taille de la tumeur sera donc surveillée 2 fois par semaine, sur animaux endormis, par le système d’imagerie in vivo (IVIS) non invasif qui detecte la luminescence de la tumeur.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, le développement des tumeurs sera suivi chez les animaux et les animaux seront mis à mort pour prélèvements. Les tumeurs ainsi qu'un grand nombre d'organes/de compartiments associés aux tumeurs seront prélevés juste après l'euthanasie.

Remplacement

Les molécules thérapeutiques ont été caractérisées in vitro avec la même lignée cellulaire utilisée chez la souris. Cependant le modèle d’étude doit nécessairement refléter la complexité multi cellulaire d’une tumeur avec son micro environnement multicellulaire complet. Les études réalisées in cellulo ne permettent pas de conserver et reconstituer le microenvironnement exhaustif des tumeurs et reproduire sa constitution globale, son évolution spatio-temporelle tels qu’ils ont lieu in vivo dans un organisme entier. En effet nous ne pouvons pas in vitro (ni dans les organoïdes, ni dans une flasque de culture) reconstituer tout le micro environnement sécrétoire, le stroma, le système immunitaire et l’endothélium autour des celles tumorales en 3 dimensions qui reflèterait la réalité d’une tumeur chez un patient.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux en expérimentation, nous avons réalisé une étude approfondie de la littérature actuelle concernant les modèles de greffe qu’on utilise pour ne pas reproduire des résultats d’expérience déjà réalisés. Grâce au système d’imagerie in vivo, il est possible de suivre longitudinalement et de manière non invasive les tumeurs bioluminescentes qui se développent au sein des animaux sans nécessiter d’euthanasie. Nous construisons également nos manips pour extraire un maximum d’informations par animal pour éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires. Un projet pilote est également inclus pour calibrer le protocole et réduire le nombre des animaux nécessaire pour qualifier l’efficacité de la nouvelle molécule.

Raffinement

Les conditions d’hébergement se feront selon les recommandations de la directive 2010/63 EU. Du papier absorbant, du sizzle (lanières de papier kraft), des tunnels seront placés dans les cages afin d’améliorer le bien-être des animaux, de diminuer leur stress et de leur donner la possibilité de satisfaire leur instinct de nidification. Les animaux étant immunodéficients, le statut sanitaire sera strictement contrôlé, l’expérimentateur portera systématiques les EPI adaptés et les animaux seront manipulés sous un poste à sécurité microbiologique. Notre équipe à une expérience solide (>20 ans) dans l’expérimentation animale avec une formation continue des expérimentateurs pour être en cohérence avec les pratiques éthiques les plus récentes et approprié à nos modèles. Cela permet un suivi, une évaluation et une anticipationau plus juste de la souffrance animale. Les expérimentations ont été réfléchie de sorte que la majorité des gestes techniques qui peuvent générer du stress soient réalisées sur animaux endormis. La préhension se fera de cette façon : l’animal sera dirigé doucement sur notre main posée en coupelle dans la cage, avant de le poser sur une grille et d’effectuer la contention de l’animal. Les personnes qui réaliseront la chirurgie possède le diplôme de chirurgie et microchirurgie. Les chirurgies se feront en début de semaine afin de garantir le meilleur suivi des animaux les jours suivant l’opération. Les animaux sont posés sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie et nous recouvrirons leurs yeux par du gel oculaire afin d’éviter le dessèchement. Les animaux sont sous anesthésie profonde surveillée par l’expérimentateur. De l’analgésique sera administré aux souris avant et après l’opération pour éviter toute douleur. En complément du tapis chauffant, les animaux seront délicatement déposés entre deux chaufferettes préalablement réglées à 37°C. Les animaux sont remis dans leur cage sur du coton afin d’améliorer leur confort. Des granulés alimentaires déposés dans la cage afin d’éviter le redressement. Une attention particulière sera portée à la récupération post-implantation des tumeurs. L’angoisse et la souffrance seront évaluées par des observations quotidiennes comportementales et physiologiques. Des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Dès les 1ers signes anticipant l’apparition du point limite, la décision d’euthanasier l’animal sera prise pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Les souris sont un excellent modèle d’étude selon plusieurs critères : -La littérature scientifique définit le modèle murin comme pertinent pour étudier le développement tumoral en particulier pour une greffe avec cette lignée cellulaire. -La souche utilisée est immunodeficiente pour limiter le rejet de la greffe. -Leur petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo où plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie Les souris adultes peuvent être utilisées pour le projet . En effet nous nous intéressons à la pathologie du cancer de la prostate chez l’adulte humain. Les souris utilisées dans nos expériences devront avoir atteint un âge considéré comme adulte (après la maturité sexuelle à 6 semaines).

530 souris juvéniles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont environ 280 qui subissent trente prélèvements de sang, un toutes les six minutes pendant trois heures, après une incision d'un millimètre à la queue. Nourries pendant cinq semaines d'un régime pauvre en protéines qui reproduit la malnutrition infantile, elles sont mesurées chaque semaine sous anesthésie, contentionnées chaque jour pour détecter la puberté, soumises à des frottis vaginaux quotidiens et à un jeûne de six heures. 48 femelles sont opérées des ovaires et d'autres reçoivent un régime qui provoque une hypothyroïdie, avec ralentissement de la croissance et baisse du tonus musculaire. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, y compris les mères, tuées au sevrage de leurs petits parce que leur exposition au régime interdit de les réutiliser.

Objectifs

La malnutrition infantile constitue un problème de santé publique majeur à l’échelle mondiale. Elle entraîne des altérations durables de la croissance, du métabolisme et de la maturation sexuelle. Des études récentes suggèrent que cette réponse à la malnutrition est modulée par le sexe, les garçons étant globalement plus affectés que les filles. De précédentes études ont confirmé ces observations dans un modèle murin : un régime déficitaire en protéines perturbe davantage la croissance et le métabolisme des mâles juvéniles, tandis qu’il retarde significativement la puberté chez les femelles. Ces observations suggèrent l’existence de compromis physiologiques différents entre les mâles et les femelles, coordonnés par des facteurs endocriniens. Plusieurs hormones candidates sont impliquées : les hormones sexuelles, les hormones thyroïdiennes, ainsi qu'un signal provenant du foie, induit en réponse à la restriction protéique. Ce dernier module trois processus clés pendant la période juvénile : la croissance, le métabolisme et la reproduction en fonction du statut nutritionnel. L’objectif général de ce projet est d’explorer comment l’ensemble de ces signaux module la réponse à la malnutrition juvénile, et dans quelle mesure ils participent à la différence de réponse entre les mâles et les femelles. Chaque signal indépendant permettant d’expliquer une partie de cette réponse, l’analyse de tous ces signaux donnera un point de vue global sur le contrôle de l’adaptation à la malnutrition protéique en fonction du sexe. À travers une série de sept procédures combinant approches génétiques, pharmacologiques et chirurgicales, nous chercherons à identifier le rôle causal de ces signaux dans trois processus physiologiques majeurs : croissance, reproduction et métabolisme. Ce projet contribuera à mieux comprendre l'origine de pathologies métaboliques et reproductives, en tenant compte du sexe et de la nutrition.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment différents signaux coordonnent les réponses physiologiques à la malnutrition protéique juvénile, en tenant compte du sexe. Ces connaissances contribueront à améliorer notre compréhension de la physiologie juvénile en contexte de malnutrition et pourraient, à terme, éclairer de nouvelles pistes de prévention ou d’intervention en santé humaine. Notamment, ce projet participe à comprendre les bases de la réponse différente entre le sexe à un même régime alimentaire, et pourrait donc permettre l'adaptation de la prise en charge de la malnutrition au sexe des enfants et individus concernés.

Procédures

530 souris seront utilisées dans le projet. Tous les animaux seront nourris soit avec un régime contrôle, soit avec un régime pauvre en protéines (modèle de malnutrition infantile) pendant 5 semaines. Toutes les souris seront mesurées chaque semaine sous anesthésie générale (3 minutes) puis pesées (< 1 min) entre 21 et 56 jours. Certaines souris subiront des contentions manuelles, tous les jours à partir de 21 jours (< 1 min par contention) pour détecter la puberté. Chez certaines femelles, un frottis vaginal sera réalisé quotidiennement à partir de cette détection et jusqu’à 56 jours (15 sec de contention). Pour étudier les hormones circulant dans le sang, environ 280 souris subiront une unique incision à la queue (1 seconde) puis 30 prélèvements d’une petite goutte de sang toutes les 6 minutes pendant 3 heures (≈ 5 secondes par prélèvement) sur animal vigile dans sa cage. Afin d’étudier l’effet d’une hormone, celle-ci sera injectée en sous-cutanée (10 sec), puis suivie de 3 prélèvements d’une petite goutte de sang à 0, 10 et 30 min. À 56 jours, un prélèvement final de 200 μL de sang sera effectué sous anesthésie générale (3 minutes). Dans les procédures chirurgicales, 48 femelles subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (20 minutes d’intervention), précédée d’une injection d’analgésiques et d’une anesthésie locale (10 sec). La couverture analgésique (par injections) sera maintenue le jour de l’intervention et le lendemain. Environ 320 souris subiront un test permettant d’évaluer la réponse de chaque individu à un sucre (glucose), et seront donc soumises à : 6 heures de jeûne, introduction orale de glucose (10 sec), incision à la queue (1 sec), 7 prélèvements d’une petite goutte de sang et 3 prélèvements supplémentaires de quelques gouttes (durée totale de prélèvement < 10 minutes). 52 souris de 0 à 21 jours et 10 souris adultes en lactation seront nourries avec un régime pauvre en iode et contenant un traitement bloquant la production d’hormone thyroïdienne, induisant un manque d’hormone thyroïdienne.

Impact sur les animaux

Les pesées, mesures et frottis vaginaux hebdomadaires induisent un stress modéré lié à la contention, ainsi qu’un inconfort de courte durée. La caractérisation de la puberté nécessite de manipuler les animaux, ce qui peut occasionner un stress de courte durée. Les prélèvements de petites gouttes de sang à la queue impliquent une incision d’environ 1 mm et un recueil répété des gouttes, provoquant une douleur légère à chaque point temporel. Le jeûne de 6 heures induit un stress modéré. Le gavage est source d’inconfort et peut entraîner un risque de fausse route ou d’irritation oesophagienne. Les injections sous-cutanées peuvent causer une douleur brève au point d’injection. Les chirurgies ovariennes induisent une douleur modérée de moyenne durée au réveil, limitée grâce à la prise en charge. Les hypothyroïdies induites, bien que transitoires, peuvent entraîner un ralentissement de la croissance, une altération du tonus musculaire, de la température corporelle ou du rythme cardiaque. Ces effets sont surveillés et réversibles après sevrage.

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d'intérêt. Les mères qui auront eu accès à un régime hypothyroïdien pendant la lactation seront mises à mort au sevrage de leurs petits, à cause de leur exposition temporaire au régime qui affecte leur physiologie et ne permet donc pas leur réutilisation.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires, ce qui nécessite une étude chez l’animal. De plus, ce projet vise notamment à comprendre des mécanismes systémiques et moléculaires (en utilisant des traitements et modèles génétiques), et ne peut donc pas être réalisée en clinique humaine.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en préservant la robustesse statistique des résultats. Ayant déjà des données solides et reproductibles sur l’effet de la malnutrition protéique chez les juvéniles, la procédure pilote ne comporte qu’un seul groupe, qui sera comparé aux données précédemment acquises. Pour les procédures complètes, le nombre de 14 mâles et 12 femelles a été déterminé à partir d’un calcul statistique. Nos études précédentes nous permettent de déterminer le nombre minimal d'animaux à utiliser pour détecter un changement, notamment sur nos critères d'évaluation de la puberté. Sur le plan statistique, la prise en compte simultanée de plusieurs facteurs (régime alimentaire, sexe, etc.) permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour pouvoir conclure sur le mécanisme biologique impliqué. Afin de limiter le nombre d’animaux à utiliser dans de futures expériences, tous les organes d’intérêt potentiels (muscle, tissu adipeux, etc.) seront prélevés à la fin des procédures et conservés pour d’éventuelles analyses ultérieures.

Raffinement

La procédure expérimentale ne sera initiée que chez des animaux avec un poids suffisant au moment du sevrage. La croissance sera mesurée individuellement chaque semaine. Pour les jeunes récemment sevrés, la nourriture sera placée directement dans la litière afin qu'ils puissent manger facilement. La prise alimentaire sera également suivie pour s’assurer que les animaux mangent. Le régime faible en protéine et le test métabolique sont déjà utilisés au laboratoire et n’induisent pas de souffrance manifeste. L’utilisation d’anesthésie gazeuse permet une induction rapide, un bon contrôle de la profondeur d’anesthésie pendant la chirurgie, et un réveil plus rapide. La température corporelle sera contrôlée pendant et après l’anesthésie. Après chirurgie, les animaux seront placés en cage propre et chauffée. Une grille d’évaluation de leur bien-être permettra d’adapter les doses d'analgésiques individuellement pendant 48 h. Toutes les mesures visent à limiter le stress et la douleur tout en assurant la robustesse scientifique des données. Des points limites précis et prédictifs ont été définis spécifiquement pour ce projet.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet des régulations endocrines dans une étude nutritionnelle. Les animaux utilisés seront suivis pendant les 5 semaines après le sevrage (procédure commencée à 3 semaines), jusqu’à 8 semaines. L'objectif du projet est d'étudier les effets de différentes hormones sur le métabolisme et la croissance pendant la période juvénile. Pour cela, les animaux doivent être inclus dans la procédure dès le sevrage, qui est une période clé pour les 3 paramètres d'intérêt : la croissance, la puberté, le métabolisme.