Souris

Trois heures d'imagerie sous anesthésie gazeuse, avec l'hypothermie que cela entraîne : 290 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent d'abord une greffe de cellules de glioblastome sous la peau, dont la croissance dégrade leur état général, puis une injection de radiotraceur par cathéter, geste qui peut laisser un hématome. Le travail vise à repérer par imagerie deux enzymes du métabolisme d'un acide aminé, marqueurs possibles de cancers et de maladies du système nerveux. Le porteur retient des souris immunodéficientes de six à dix semaines, jeunes précisément pour qu'une "légère immunocompétence" ne fasse pas rejeter la greffe.

Objectifs

Nous développons de nouveaux outils d’imagerie médicale appelés traceurs, qui permettront d’observer directement dans le corps deux enzymes importantes liées au métabolisme d'un acide aminé présent dans de nombreux tissus et cellules du corps humain. Quand ce métabolisme est perturbé, cela peut être lié à de nombreuses maladies, allant du cancer à des troubles du système nerveux (comme certaines maladies du cerveau). Ces perturbations entraînent souvent une augmentation de la quantité de ces enzymes. Pouvoir les détecter dans le corps pourrait donc aider à diagnostiquer certaines maladies, notamment les tumeurs, ou même à développer de nouveaux traitements. Il existe déjà des traceurs à base de tryptophane pour ce type d’imagerie, mais ils sont difficiles à fabriquer à cause de la complexité du processus de marquage radioactif. Une autre solution consiste à créer de nouveaux traceurs à partir de petites molécules capables de se fixer directement sur ces enzymes, plutôt que d’utiliser l'acide aminé lui-même.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier de nouveaux traceurs d’imagerie capables de se lier spécifiquement à deux enzymes majeures du métabolisme de l'acide aminé. Après une caractérisation plus précise de leurs propriétés, ces traceurs pourraient être proposés pour le diagnostic, le suivi et le traitement de nombreuses affections cancéreuses ou neurologiques.

Procédures

Injection de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse 1 fois pendant 10 min par animal. injection sous anesthésie gazeuse suivi d'une imagerie de 3h, 1 fois par animal pendant 5 min.

Impact sur les animaux

La manipulation avant l’anesthésie entraine un léger stress chez l’animal. L’injection des cellules peut infliger une douleur correspondant à celle d’une piqûre d’aiguille. La dégradation de l’état général des animaux induite par la croissance tumorale. Une hypothermie durant l’imagerie induite par l’anesthésie gazeuse. Un hématome peut se former suite à la cathéterisation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des études d’immunohistochimie cérébrales complémentaires aux études d’imagerie.

Remplacement

L’objectif du projet étant de développer un traceur d’imagerie utilisable chez l’humain, aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'animal entier, étant donnée la complexité des processus mis en jeu telles que les interactions avec le microenvironnement tumoral et ne permet d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable pour l'étude de la biodistribution et le développement de nouveaux radiotraceurs d'imagerie.

Réduction

L’utilisation de la méthode d’imagerie in vivo au cours de ce protocole va permettre de réduire le nombre d’animaux utilisé qui est néanmoins dicté par les groupes expérimentaux requis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée. La première étude permet grâce à l’imagerie d’évaluer la cinétique du radiotraceur après une injection intra-veineuse. Les moyennes de captation du traceur dans la tumeur et les différents tissus seront comparés entre les 2 groupes d’animaux par des tests statistiques. Nous prévoyons d’inclure un total de 28 animaux par traceur (2 groupes de 14 animaux) et par lignée cellulaire, toutefois, ce nombre de 14 animaux par groupe représente une valeur maximale car les sessions d’imagerie seront réalisées séquentiellement, à raison de 2 à 3 animaux/groupe. Pour exemple, si un traceur ne se fixe pas du tout dans la tumeur car il ne passe pas la barrière tumorale alors les sessions d’imagerie ne seront pas répétées et le nombre d’animaux utilisé sera moindre. Ces sessions d’imagerie seront répétées si nécessaire, jusqu’à atteindre, le cas échéant, le plafond des 14 animaux/groupe.

Raffinement

Dès leur arrivée, les souris seront hébergées en portoir ventilé afin d’empêcher l'installation du phénotype dommageable lié à l’immunodéficience. Elles seront hébergées en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique) et observées quotidiennement. Lors de l’injection tumorale en sous cutanée, les souris seront anesthésiées en gazeux et placées sur un tapis chauffant et une protection oculaire sera appliquée. Après ces implantations, les animaux seront récompensés (morceau de fruit...) et auront une surveillance accrue jusqu'à l'imagerie. Nous prendrons soin de mesurer tous les jours pendant 5 jours, l’évolution de la tumeur grâce à un pied à coulisse. Avant l'imagerie, les animaux auront une phase d'habituation à l'environnement de la pièce pour éviter le stress lors de l'imagerie. Pour cette dernière (maximum 3h), les animaux seront anesthésiés en gazeux, une protection oculaire sera appliquée, les souris seront maintenues dans un lit thermorégulé (environ 37°C) et la température corporelle sera monitorée. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la biodistribution/le ciblage de nouvelles sondes d'imagerie. Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.

Un morceau d'oreille prélevé sur des nouveau-nés de sept à dix jours, un rein retiré par chirurgie à deux ou trois mois pour accélérer la maladie, puis quinze mois de suivi : 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent six recueils d'urine et quatre prises de sang en tube de contention, sur animal éveillé, avant un jeûne de six heures le dernier jour. Le porteur décrit une maladie rénale qui reste silencieuse jusqu'à un stade très avancé, autour de quinze mois, où les souris commencent à perdre du poids, à se toiletter moins, à se prostrer et à moins se déplacer. Toutes sont tuées pour qu'on prélève leurs reins, leur intestin, leur foie, leur hypophyse, leur hypothalamus et leurs gonades.

Objectifs

La glycogénose de type 1 est une maladie génétique rare caractérisée par une incapacité de l’organisme à produire du sucre en dehors des repas. La maladie se caractérise par des chutes des taux de sucre dans le sang (hypoglycémies) sévères, rapidement entre les repas. A l’âge adulte, la plupart des patients développent une maladie rénale, qui reste longtemps silencieuse mais détectable par mesure de marqueurs urinaires (présence d’albumine dans les urines ; albuminurie). En progressant lentement, elle évolue vers une insuffisance rénale caractérisée par une perte de la fonction du rein et l’accumulation de déchets dans le sang. A ce stade, les patients présentant aussi des kystes (formation d’un « sac » rempli de liquide) sur la surface des reins ou dans les reins. Des études récentes ont montré que dans cette maladie les cellules du rein ont la capacité de se multiplier de façon anormale ce qui favorise le développement de kystes et possiblement de cancers (2 cas décrits chez des patients atteints de glycogénose de type 1. A l’exception d’un contrôle nutritionnel, il n’existe actuellement aucun traitement curatif pour limiter l’avancée de la maladie rénale. La dialyse puis la transplantation rénale sont les seules solutions lorsque l’insuffisance rénale est atteinte. Le développement de cette maladie a été reproduit chez la souris en ciblant la mutation génétique de la glycogénose de type 1 uniquement dans les reins, ce qui permet d’éviter les épisodes d’hypoglycémie car le foie peut produire du sucre dans ce modèle animal. Comme chez l’homme, l’évolution de la maladie rénale est lente et silencieuse mais irréversible et mène à une insuffisance rénale au bout de 15 mois environ, avec l’apparition de kystes. Les premiers signes cliniques (albuminurie) apparaissent entre 6 et 9 mois, et la maladie peut être suivie par le dosage des mêmes marqueurs biologiques que chez les patients. Le but de ce projet est d’identifier les cellules et les mécanismes impliqués dans le développement des kystes, voire des cancers rénaux. Pour accélérer le développement de la maladie rénale, un rein sera enlevé au cours d’une chirurgie peu invasive. Dès les premiers signes d’insuffisance rénale, les reins seront prélevés pour des études moléculaires. Cette étude sera réalisée chez des animaux des deux sexes et devrait également permettre de comprendre les mécanismes à l’origine du retard d’apparition de la maladie chez les femelles par rapport aux mâles.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe pas de traitement curatif qui permette d’endiguer la mise en place de l’insuffisance rénale sévère sur le long-terme. Cette complication est pourtant importante chez les patients atteints de glycogénose de type 1 puisque plus de 70-80% développent une maladie chronique rénale. Du fait du faible nombre de patients, nous n’avons pas le recul nécessaire pour évaluer les risques associés à l’apparition de kystes chez les patients, ni l’incidence de cancers rénaux. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l’évolution de la maladie à long-terme, permettant ainsi une meilleure prise en charge des patients. Plus précisément, identifier d’éventuelles nouvelles cibles thérapeutiques est primordial pour développer des thérapies efficaces

Procédures

Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un morceau de tissu (biopsie) sera prélevé pour caractériser leurs gènes. Le geste sera réalisé sur animaux vigiles en quelques secondes. Les animaux subiront une intervention chirurgicale courte (durée d’environ 15 minutes) à l’âge de 2/3 mois permettant l’ablation d’un des deux reins, sous anesthésie générale (maximum 30 minutes d’anesthésie) et après injection d’analgésiques (2 injections le jour de la chirurgie et 1 injection/jour pendant les 2 jours post-chirurgie, nécessitant quelques secondes/injection). Au cours du temps, les souris vont développer une maladie rénale. Des prélèvements spontanés d’urine auront lieu tous les 3 mois à partir de 6 mois. L’animal peut subir un léger stress (qui entraine le déclenchement de la production d’urine), même si ce geste ne nécessite pas forcément la contention de l’animal. Dès que les animaux auront atteint l’âge de 12 mois, des prélèvements urinaires et sanguins seront réalisés tous les mois. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles par un prélèvement en veine. La piqûre peut engendrer une faible douleur et un stress lié à l’immobilisation de l’animal pendant moins d’une minute dans un tube à contention. Au total, 6 prélèvements d’urine et 4 prélèvements de sang seront réalisés. En fin de protocole, les souris seront mises à jeun pendant 6h avant leur mise à mort. Même si la glycémie reste constante, les animaux peuvent subir un léger stress. Un prélèvement de sang sera réalisé immédiatement avant la mise à mort et durera au maximum 15 secondes.

Impact sur les animaux

A l’âge de 7-10 jours, les souris transgéniques subissent une biopsie au bord de l’oreille afin d’analyser leurs gènes. Ceci entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. Le risque de saignement est très faible. À l’âge de 2 ou 3 mois, les souris subiront l’ablation d’un rein sous anesthésie générale. Après l’opération, elles peuvent ressentir un peu de douleur et d’inflammation. Dès 6 mois, les souris peuvent développer une maladie rénale sans impact sur le bien-être animal jusqu’au stade très avancé de la maladie caractérisée par l’accumulation d’urée dans le sang (autour de 15 mois). A ce stade, les animaux commencent à perdre du poids et peuvent présenter des signes de mal-être comme une baisse de la fréquence de toilettage, une prostration, une diminution des déplacements. Pour suivre le développement de la maladie, des prélèvements urinaires spontanés seront effectués, ce qui peut provoquer un très léger stress. Les animaux subiront aussi des prises de sang après leur immobilisation dans un tube de contention. Ces gestes peuvent entrainer un stress de l’animal et une légère douleur, ainsi qu’un léger saignement dans certains cas. Enfin, en fin de protocole, les animaux sont mis à jeun pendant 6h ce qui peut entrainer un léger stress. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. La piqure entraine une légère douleur et la contention de l’animal entraine un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement des reins, de l’intestin, du foie, de l’hypophyse, du cerveau (hypothalamus) et des testicules ou ovaires afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires

Remplacement

Aujourd’hui, il est possible de fabriquer en laboratoire de petits modèles de reins (appelés organoïdes) qui reproduisent les différents types de cellules présentes dans cet organe. Mais ces modèles ne permettent pas d’étudier l’évolution de la maladie rénale ni le développement de tumeurs sur une longue période. Pour cela, il est indispensable d’avoir recours à des études chez l’animal, sur plusieurs mois. Le modèle de souris utilisé dans ce projet est le seul à reproduire fidèlement tous les problèmes rénaux observés dans la glycogénose de type 1. Ce modèle a été créé grâce à une méthode spécifique à la souris. De plus, le métabolisme de la souris est très proche de celui de l’être humain. Il faut aussi noter que la majorité des recherches sur l’insuffisance rénale été faite chez la souris. Il existe donc beaucoup de données scientifiques et d’outils disponibles pour poursuivre ces recherches dans ce modèle. Enfin, il est très difficile de mener ce type d’étude chez l’humain, car la glycogénose de type 1 est une maladie très rare (environ 1 naissance sur 100 000), ce qui rend les recherches sur des patients très limitées.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances de la pathologie étudiée, des modèles animaux, du métabolisme et grâce aux connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, des groupes de 24 souris, permettront de réaliser à la fois les études moléculaires et histologiques. Des tests statistiques permettront de comparer les différents groupes de souris entre eux. Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, les souris « contrôles » qui ne présenteront pas la perte du gène ciblé dans les reins seront issues des mêmes reproductions. Les expériences que nous prévoyons exigent de petites quantités de tissu rénal pour différentes analyses en laboratoire. Comme les échantillons disponibles sont très limités, nous devons organiser les prélèvements de manière à pouvoir réaliser toutes les analyses prévues sans gaspillage. Le protocole durera 15 mois, donc nous devons aussi anticiper la possibilité que certaines souris ne puissent aller jusqu’au bout de l’étude, en prévoyant une marge de sécurité (une souris en plus par groupe). En tout, nous aurons 4 groupes expérimentaux, chacun composé de 6 souris, soit 24 souris par série d’expérience. L’étude sera réalisée sur des souris des 2 sexes car des résultats précédents suggèrent une progression plus lente de la maladie rénale chez les femelles ; nous doublerons ces groupes, ce qui portera le nombre total de souris à 96 : 48 souris malades et 48 souris saines servant de témoins. Enfin, nous veillerons à limiter la production d’animaux en n’utilisant que les souris nécessaires, et en utilisant les animaux surnuméraires uniquement pour maintenir nos lignées. Une fois le nombre requis atteint, les reproductions seront arrêtées. Nos lignées de souris sont d’ailleurs conservées à long terme par congélation, ce qui nous évite d’avoir à produire des animaux en continu. Au total, ce projet réalisé sur 3 ans nécessitera au maximum 96 souris, incluant l’obtention de 48 souris transgéniques atteintes de la maladie rénale de la glycogénose de type 1 et de 48 souris contrôles, sans signes de maladie.

Raffinement

Les biopsies d’oreille, nécessaires pour identifier les souris porteuses de la maladie, seront réalisées entre 7 et 10 jours après la naissance, un âge où les nerfs ne sont pas encore complètement développés. Pour éviter que la mère rejette ses petits à cause de l’odeur humaine, l’expérimentateur frottera ses gants avec de la litière souillée. Pour réduire le stress lié aux manipulations, les souris seront habituées à la présence des zootechniciens et au contact avant le début des procédures. Un petit tunnel sera aussi utilisé pour transférer les souris d’une cage à l’autre. La glycogénose de type 1 sera déclenchée uniquement dans les reins, ce qui permet aux souris de continuer de produire du sucre normalement grâce au foie, et ainsi d’éviter de baisses de sucre dans le sang. Lors du retrait d’un rein, les souris recevront un médicament contre la douleur avant et après l’opération. Une crème analgésiante sera aussi appliquée sur la peau, et la température corporelle sera maintenue pendant la chirurgie grâce à une plaque chauffante. Les interventions se feront dans des conditions stériles pour éviter les infections. Après l’opération, les souris seront isolées au chaud et surveillées pour s’assurer qu’elles se réveillent bien et sans souffrance. Elles retrouveront leur groupe au réveil. Pour les prises de sang, la veine sera dilatée par le chaud pour faciliter le prélèvement. Le volume de sang prélevé sera très limité selon les recommandations. Les souris seront habituées aux tubes dans lesquels elles seront placées pendant ces prélèvements, pour réduire leur stress. Les analyses d’urine se feront sans manipulation forcée : nous attendrons que les souris urinent spontanément, ce qui évite de les isoler dans des cages spéciales. Concernant la maladie elle-même : Les premiers signes ne provoquent pas de souffrance visible (c’est une maladie dite « silencieuse »). Les symptômes graves, comme une forte perte de poids ou une dégradation de l’état général, apparaissent tardivement, et indiquent la fin du protocole. La mise en place d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés a permis de déterminer les critères d’arrêt de souffrance à tout moment du projet. Les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude, ou plus tôt si leur état de santé se détériore, afin de prélever les différents organes dont les reins.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car elle présente des similitudes importantes avec l’humain en ce qui concerne la régulation du sucre dans le corps. Chez des espèces plus simples comme le poisson, ces mécanismes sont différents et ne permettent pas d’étudier la maladie de manière fiable. De plus, ce modèle de souris est unique car il reproduit très fidèlement les signes de la maladie rénale que l’on observe chez les patients atteints de glycogénose de type 1 sans développer d’hypoglycémies qui pourraient être fatale. De plus, les outils moléculaires spécifiques à la souris, comme des anticorps, sont disponibles en laboratoire pour analyser finement les mécanismes biologiques impliqués. Ainsi, l’utilisation de la souris est aujourd’hui la seule option scientifiquement pertinente et techniquement possible pour faire avancer la recherche sur cette maladie rare. Les souris seront suivies tout au long de leur vie de la naissance à l’âge de 15 mois maximum, car la maladie rénale évolue très lentement puisque la perte de la fonction rénale qui est progressive. Voici comment se dérouleront les principales étapes du suivi : • Un prélèvement de tissu sera réalisé entre 7 et 10 jours après la naissance pour sélectionner les souris porteuses de la maladie. • À l’âge de 2 à 3 mois, une intervention chirurgicale peu invasive (le retrait d’un rein) sera réalisée. • Ensuite, nous effectuerons des analyses régulières nécessitant des prélèvements d’urine et de sang chez les souris adultes pour suivre l’évolution de la maladie jusqu’à la fin du protocole.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant une chirurgie de 45 minutes qui installe une douleur neuropathique durable, sept tests comportementaux, un jeûne de 24 heures et un isolement de 24 heures. Le porteur écrit que la douleur et le phénotype anxio-dépressif "ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude". Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, alors que le protocole consiste précisément à produire une douleur chronique doublée d'un état anxio-dépressif et à la laisser durer. L'effectif de 1 440 animaux est rapporté à la littérature, à l'expérience de l'équipe et à la variabilité entre individus, sans qu'aucun calcul soit donné.

Objectifs

La douleur chronique est étroitement liée aux troubles émotionnels et constitue la principale cause d’invalidité, impactant de manière significative la qualité de vie des patients. Elle représente un fardeau économique majeur pour la société, avec des coûts estimés à plus de 800 millions d’euros en Europe. Environ 30 % des patients souffrant de douleur chronique développent des troubles anxio-dépressifs. Il est donc essentiel de comprendre les mécanismes sous-jacents à cette comorbidité. À travers une étude transcriptomique, nous avons identifié une liste de gènes potentiellement impliqués dans cette pathologie. Pour valider ces cibles, nous prévoyons de manipuler leur expression sur un modèle murin in vivo à l’aide d’une approche virale, afin d’évaluer leur impact sur la chronicisation de la douleur et le développement du phénotype anxio-dépressif.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’élucider les réseaux de gènes impliqués dans la chronicisation de la douleur neuropathique et de ses conséquences anxio-dépressives et donc éventuellement la mise en place d'une stratégie thérapeutique permettant de soulager et prévenir la douleur et les troubles émotionnels associés.

Procédures

- Les animaux sont soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. - Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale pour une durée maximale de 45 minutes - Les animaux subissent 3 tests évaluant la douleur (15 minutes en moyenne - stimulation courte de maximum 20 secondes) et 4 tests évaluant l'anxio-dépression (durée de 5 minutes par test) - Les animaux subissent un jeûne unique de 24h pour un test comportemental et un isolement unique de 24h pour un autre test avec un délai minimal d’une semaine entre les 2 tests. - Les animaux subissent une chirugie terminale pour prélèvement de tissus sous anesthésie profonde pour une durée de 10 minutes.

Impact sur les animaux

- La présence de la douleur et l’apparition du phénotype anxio-dépressif chez le modèle animal sont inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie, une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais qui disparaît rapidement dans les 24 à 48h - La douleur post-chirurgicale est aigue, transitoire et inflammatoire. - Les animaux subissent un stress aigu ainsi qu’une douleur transitoire et de faible intensité lors des tests de comportement.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l’étude de la douleur et de la comorbidité anxio-dépressive nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez un animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement valides tout en se basant sur des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique interindividuelle.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes sociaux de 3 à 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Avant le début des procédures et sur une période d’une semaine, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur et acclimatés à l'environnement où les tests se dérouleront afin de réduire l'état de stress et d'angoisse chez l'animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA (structure chargée du bien-être des animaux) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Ce projet sera réalisé sur le modèle animal - Souris adulte (à partir de l'âge de 8 semaines post-naissance). Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier avec un système neurobiologique mature afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences.

Les souris dont l'état moribond persiste malgré les soins sont tuées pour abréger leur agonie, seuil que le porteur inscrit noir sur blanc dans ses points limites. 972 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent d'abord deux à quatre semaines d'un régime alimentaire qui déclenche une fibrose du foie, atteinte dont le porteur chiffre lui-même la durée à une à six semaines, puis certaines reçoivent une pompe implantée par chirurgie et passent 24 heures seules sur une grille pour qu'on recueille leurs urines. L'objectif est un test urinaire de diagnostic de la fibrose hépatique, dont le bénéfice pour les malades est renvoyé au long terme, quand la maladie induite chez les souris, elle, est immédiate.

Objectifs

La fibrose du foie est un problème de santé publique en France et dans le monde car elle concerne un grand nombre de malades. Elle est la conséquence de toutes les maladies chroniques du foie et aboutit inéluctablement à la cirrhose en l’absence de traitement, voire au cancer du foie. Cette maladie implique directement des composants biologiques appelés les métalloprotéases matricielles (MMP) qui sont produites par presque toutes les cellules du foie. Les MMP jouent ainsi un rôle dans l’initiation, la progression et la résolution de la fibrose du foie. L’expression et l’activation de ces MMP varient en fonction du stade pathologique, ce qui en fait des marqueurs biologiques potentiellement pertinents pour le diagnostic précis de la fibrose du foie et le suivi de sa régression potentielle ou de sa progression vers des formes sévères. De plus, certains inhibiteurs de MMP pourraient permettre de guérir certaines formes de fibrose du foie. Ainsi, ce projet a pour objectif de développer et valider de nouveaux outils de diagnostic de la fibrose hépatique qui permettent de détecter l’activité des MMP de manière non-invasive dans des échantillons urinaires. Ce projet a aussi pour but de tester in vivo l’effet de certains inhibiteurs de MMP sur l’évolution de la maladie.

Bénéfices attendus

Les études réalisées dans ce projet vont permettre de valider de nouveaux outils pour le diagnostic plus précis de la fibrose du foie, de son évolution et de la réponse des malades aux traitements. C’est donc la prise en charge même des malades qui devrait bénéficier de ces travaux à terme. De plus, le projet devrait conduire à l’identification de composés aux effets thérapeutiques. A terme, c’est donc le pronostic des malades qui pourrait bénéficier de ce projet.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à un régime alimentaire particulier pendant 2 à 4 semaines qui permet le développement de la fibrose du foie. Certains animaux recevront une seule dose du composé de diagnostic étudié (1 min), tandis que d’autres animaux auront une seule intervention chirurgicale courte de 5-10 minutes pour placer une pompe permettant de diffuser en continu un inhibiteur de MMP testé comme traitement de la maladie. Certains animaux seront hébergés individuellement pendant 24 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus lors de l’étude sont une souffrance occasionnée par le développement de la fibrose du foie (qui s’étendra sur 1 à 6 semaines), une éventuelle douleur et/ou une potentielle légère infection au niveau du point d’administration du composé de diagnostic étudié (qui durera quelques minutes à quelques heures), un stress dû aux manipulations des animaux pendant les procédures expérimentales (qui ne durera que de brèves minutes) et un stress lié à l’hébergement individuel sur une grille pendant 24 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines.

Devenir

L’étude de nouveaux composés pour le diagnostic et le traitement de la fibrose du foie nécessite de connaitre exactement le stade de développement de la fibrose au moment du diagnostic et/ou du traitement. Pour cela, il est nécessaire de mettre à mort les animaux afin de récupérer leur foie et de procéder à son analyse.

Remplacement

Etudier les propriétés de diagnostic et de traitement des composés nécessite le recours à des organismes entiers, pour suivre les effets locaux et systémiques. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les composants biologiques qui entrent en jeu dans la fibrose du foie.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux : - les doses des composés qui vont être étudiées ont été sélectionnées grâce à des études in vitro antérieures afin d’être réduites à leur stricte minimum (deux doses par composé); - chaque procédure expérimentale sera réalisée sur le plus petit nombre d’animaux par groupe déterminé via l’utilisation d’une application calculant les tailles d'échantillons minimales nécessaires pour qu’elles soient valables sur le plan statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi comprenant des maisons et des tunnels en carton, de la paille ou du mouchoir en papier pour leur nid, et des bâtonnets en bois à ronger. Les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue tout au long du déroulement des expériences. Afin de détecter et de limiter la souffrance et/ou la détresse des animaux, une surveillance de leur état général et leur comportement sera réalisée grâce à une grille de suivi utilisant un ensemble d’indicateurs suffisamment prédictifs et spécifiques au projet. Si un état moribond persiste malgré l’application de soins appropriés, les animaux concernées seront mis à mort pour arrêter leurs souffrances au plus vite. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs à l’administration unique de l’outil de diagnostic, un collyre sera appliqué localement sur le site d’injection et l’injection sera réalisée dans une pièce au calme sans passage. Afin de diminuer la douleur occasionnée par la chirurgie permettant de placer une pompe qui diffuse en continue le traitement, une analgésie locale sera utilisée accompagnée par un analgésique global à action diffuse. Pendant toute la chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis au chaud à 37°C, leur rythme respiratoire sera observé avec attention, et ils seront réhydratés avec du sérum physiologique. À leur réveil, les animaux seront remis dans une cage propre en groupe dans un milieu enrichi et étroitement surveillés. Enfin, pour réduire ou supprimer le stress lié à l’hébergement individuel sur grille durant 24 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines, les animaux maintiendront un contact visuel, olfactif et auditif car les cages sont transparentes, semi-ouvertes et localisées sur le même portoir dans la même pièce. De plus, des bâtonnets à ronger et des jeux suspendus seront ajoutés dans ces cages.

Choix des espèces

La souris est un modèle adapté pour l’étude des maladies du foie. Il s’agit d’un mammifère dans lequel le modèle de fibrose de foie utilisé dans cette étude est bien validé. Les animaux sont utilisés à l'âge adulte entre 8 et 14 semaines car la pathologie étudiée se développe essentiellement chez les adultes. Nous n'utilisons pas d'animaux trop vieux afin de nous affranchir des modifications des fonctions du foie dues à l'âge qui pourraient interférer avec nos résultats.

200 souris et 20 rats subissent une craniotomie de trente minutes à une heure pour recevoir une injection de virus dans le cerveau, puis sont exsanguinés une semaine à dix mois plus tard. Ces procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et aucun animal n'est gardé vivant. Le porteur qualifie pourtant l'ensemble de "courte chirurgie" "minimisée", tout en décrivant par ailleurs une chirurgie invasive et des souris porteuses d'une mutation Alzheimer qui développent des troubles de la mémoire dès huit mois et, parfois, des crises d'épilepsie. La mise à mort sert à prélever les cerveaux pour des enregistrements sur tranches, dans un projet dont le porteur reconnaît que l'impact pour les patients "ne sera pas immédiat".

Objectifs

Les objectifs de cette étude sont 1- d’évaluer la mise en place de la connectivité thalamocorticale au cours du développement, 2- de comparer les projections de deux populations thalamiques distinctes dans le cortex chez l’adulte, 3- d’évaluer l’évolution de la transmission thalamocorticale au cours du vieillissement dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer, 4- de comparer ces résultats obtenus chez la souris avec la connectivité thalamocorticale chez le rat.

Bénéfices attendus

Ce projet est principalement un projet de recherche fondamental dont l’impact pour les familles et les patients ne sera pas immédiat. Néanmoins, ce projet comporte des aspects translationnels car nous cherchons à comprendre comment évolue la boucle thalamocorticale dans un modèle de souris transgéniques récapitulant des aspects de la maladie d’Alzheimer. D’autre part, ce projet s’inscrit dans un projet plus large visant à comprendre l’importance de cette boucle dans la régulation du sommeil, qui est crucial pour la consolidation de la mémoire et pour l’évacuation des déchets du métabolisme. Enfin comprendre comment cette boucle se met en place pendant le développement pourrait permettre de mieux appréhender d’un point de vue thérapeutique la prise en charge des problèmes de sommeil dans des pathologies du neurodéveloppement qui sont très fréquents par exemple chez les enfants atteints de troubles du spectre autistique. Ces travaux permettront donc de mieux comprendre les fonctionnements du sommeil en contexte physiologique pathologique et pourraient permettre d’identifier des nouvelles pistes thérapeutiques pour améliorer la qualité du sommeil.

Procédures

Les animaux subissent une chirurgie invasive nécessitant une craniotomie pour permettre l’injection de virus qui dure entre 30 minutes et une heure ; suivi par une exsanguination 1 semaine à 10 mois plus tard. Cette deuxième étape dure 15 minutes.

Impact sur les animaux

Certaines souris utilisées pour ce projet seront un modèle génétique de la maladie d’Alzheimer. Ces animaux présentent des troubles de la mémoire à partir de 8 mois ainsi que dans de rares cas des crises d’épilepsie. Si tel est le cas, il est préconisé de leur permettre de récupérer dans un environnement enrichi et calme. C’est pourquoi ces animaux seront hébergés avec des enrichissements supplémentaires (grande roue et tunnel) et leur cage sera placée dans le bas du portoir afin de leur assurer le plus de calme possible. Toutes les procédures faites sur ces animaux seront de degré de sévérité modéré du fait de la chirurgie. Cette chirurgie peut entrainer des douleurs post-opératoires qui sont minorées par les antalgiques.

Devenir

tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure pour prélever leurs cerveaux afin de faire des enregistements sur tranche de cerveau.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet. En effet, ce projet nécessite le maintien intégral de deux structures le thalamus et le cortex ainsi que leur communication, ce qui n’est pas encore possible dans aucun modèle vivant complexe tels que les organoïdes qui de plus ne sont pas encore assez aboutis pour reproduire les connections entre les différentes aires corticales. De plus, ce projet vise à évaluer l’évolution de la connectivité au cours du vieillissement ce que les modèles in vitro ne permettent pas de faire.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques appropriés qui permettent de prendre en compte à la fois les mesures répétées sur le même animal et les mesures effectuées entre les animaux. Ces tests puissants permettent d'inclure des animaux même en cas de données manquantes et de réduire le nombre d'animaux grâce aux mesures répétées, dans notre cas le nombre de neurones enregistrés par animal. Les enregistrements électrophysiologiques sur tranche de cerveau permettent d’optimiser le nombre de neurones enregistrés et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour mener à bien cette étude. Le nombre d’animaux utilisé dans cette étude a été évalué d’après notre expérience lors de projets impliquant des techniques similaires.

Raffinement

Cette étude consiste en une courte chirurgie suivie après un délais de 1 semaine à 10 mois du sacrifice et du prélèvement du cerveau. La chirurgie est minimisée pour diminuer le niveau de souffrance et améliorer la récupération. Les souris ont des enrichissements supplémentaires par rapport aux autres animaux de l'animalerie : grande roue et tunnels. La mise à mort sera précédée d’une analgésie et anesthésie profondes avec des antalgiques et anesthétiques très puissants.

Choix des espèces

Ce projet requiert l’utilisation de souris car nous comparerons ici l’évolution de la connexion thalamocorticale chez les individus sains et dans un modèle de souris transgénique de la maladie d’Alzheimer. D’autre part, l’utilisation de rats dans la procédure 4 nous permettra de comparer les résultats obtenus chez les souris dans la procédure 3 et les rats, permettant de soutenir le caractère translationnel entre espèces de nos résultats. Finalement, les stratégies de transduction virale sont largement utilisées chez les rongeurs ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec ceux de la littérature. Les animaux seront utilisés à partir de 1 jour pour les injections puis ils seront sacrifiés entre 14 jours et 12 mois en fonction du groupe auquel ils seront assignés. En effet, ce projet vise à étudier l’évolution au cours développement jusqu’au vieillissement de la connectivité thalamocorticale chez des animaux sauvages et modèles murins de la maladie d’Alzheimer.

Jusqu'à trente injections intrapéritonéales, une par jour, sur des souris éveillées : 646 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. S'y ajoutent une à deux instillations intranasales sous anesthésie, trois prises de sang, une injection intraveineuse, une chirurgie de vingt minutes, puis un lavage broncho-alvéolaire et une perfusion intracardiaque terminale. Le travail cherche à comprendre comment se forment dans le poumon des cellules immunitaires résidentes, étape présentée comme utile à de futurs vaccins contre le cancer du poumon. Sur les alternatives, le porteur avance que les modèles in vitro ne miment pas les réponses immunitaires, que l'expérimentation animale est "indispensable" et qu'"aucune méthode alternative n'existe".

Objectifs

Le but des vaccins anti-tumoraux est d’induire des cellules immunitaires capables d’éliminer les cellules tumorales. Des travaux ont montré que dans le cancer du poumon, il est important d’induire localement des cellules immunitaires cytotoxiques résidentes dans cet organe, car ces cellules résidentes sont connues pour avoir une protection plus rapide et plus efficace du fait de leur localisation. Ces cellules ne peuvent être générées que par une voie de vaccination intranasale et non systémique ( sous-cutanée ou intramusculaire). L’objectif de ce projet est d’identifier les mécanismes qui favorisent la génération de ces cellules immunitaires cytotoxiques résidentes, après vaccination intra-nasale.

Bénéfices attendus

Une meilleure connaissance dans la génération de ces cellules immunitaires cytotoxiques résidentes dans les poumons, permettra de développer et d’optimiser des vaccins anti-tumoraux pour traiter les cancers du poumons.

Procédures

Injection par voie intra-nasale : 1 ou 2 fois à 2 semaines d'intervalles, sur animaux sous anesthésie générale, durée: 30min. Injection par voie intra-péritonéale d’anesthésique sur souris vigiles: 1 ou 2 injections à 2 semaines d'intervalles,durée: 10secondes/injection. Injection par voie intrapéritonéale de traitement sur souris vigiles : entre 13 et 30 injections ( 1 injection/ jour sur une période de 13 à 30 jours),durée 10 secondes/ injection. Prélèvement de sang: x3 sur souris anesthésiées,durée 1-2 min. Injection intraveineuse de produit : 1 fois sur animaux sous anesthésie générale,durée: 30 secondes. Injection d'analgésique par voie sous-cutanée sur souris vigiles : x1 fois, durée 10 secondes/injection. Prélèvement du lavage broncho alvéolaire (x1fois), perfusion intracardiaque et prélévement du poumon (x1fois) sur animaux sous anesthésie générale,durée totale environ 30 min. Chirurgie sur animaux sous anesthésie,durée 20 min.

Impact sur les animaux

La vaccination par voie intranasale peut induire une gêne respiratoire transitoire de courte durée pendant la durée de l’administration. Les injections répétées par voie intrapéritonéale peuvent induire une douleur légère et transitoire ou une irritation au niveau du site d’injection. La chirurgie peut induire des douleurs post-opératoire (traitée par un analgésique) et risque d’infection et problème de cicatrisation ( traitée avec un antiseptique locale).

Devenir

mise à mort pour récupérer les organes en vue d’analyse de la réponse immunitaires

Remplacement

L’analyse des réponses immunitaires après vaccination, dans différents organes au cours du temps, ne peut être évaluée que dans des organismes entiers. Les modèles in vitro ne permettent pas de mimer fidèlement les réponses immunitaires ni le microenvironnement muqueux pulmonaire. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de conditions observées chez l’homme. Aucune méthode alternative n'existe.

Réduction

Les paramètres expérimentaux (doses, cinétiques) ont été déterminés selon des données déjà publiées. Basé sur des études déjà publiées et avec l’aide d’un logiciel de calcul d’effectifs, nous avons déterminé un nombre d’animaux minimum pour avoir assez de matériel et garantir une analyse statistique fiable. Pour chacune des expériences nous avons maximisé les prélèvements et analyses biologiques.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les injections intranasales, les prélèvements de sang, les injections intraveineuses, et la chirurgie sont réalisés sous anesthésie pour le confort de l’animal. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout le long de la procédure, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Des analgésies pre et post-opératoires sont prévues ainsi que des solutions antiseptiques pour la cicatrisation. Tous les vaccins et traitements sont préparés dans des formulations validées pour des administrations chez l’animal et ne sont pas décrits comme toxiques aux doses utilisées. Les animaux sont surveillés tout au long du projet. Une grille de score et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L’atteint d’un point limite qui ne peut être soulagé induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée avec des souris, car nous avons des vaccins déjà utilisés et validés dans cette espèce pour induire une bonne réponse immunitaire dans les poumons ainsi que tous les outils et techniques d’analyse adéquats. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, car le système immunitaire est développé et mature.

Pour savoir si les lipides de la salive de moustique facilitent l'infection par les flavivirus, 397 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent en intradermique, sous anesthésie, des produits que le porteur décrit lui-même comme pouvant être irritants, puis une partie est tuée dans la foulée pour biopsie cutanée. Les autres sont infectées et suivies quinze jours, avec une prise de sang à la veine mandibulaire tous les trois jours, l'infection pouvant provoquer perte de poids, immobilité, troubles neurologiques et convulsions. Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids ou montrent des signes de souffrance sont tuées par dislocation cervicale sous anesthésie.

Objectifs

L'objectif du projet est de déterminer le rôle des lipides de la salive de moustique dans les infections par les flavivirus pour développer une nouvelle méthode de lutte ciblant les lipides de la salive.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme sont : i) Identifier une cible pour bloquer la transmission de tous les flavivirus au niveau de la peau, ii) Comprendre l’effet des lipides de la salive de moustique sur l'infection. A long terme, les résultats permettront le développement d’un médicament préventif ou curatif contre tous les flavivirus, lesquels infectent un demi-milliard de personnes et en tuent 250 000 par an.

Procédures

Dans toutes procédures, nous injecterons les souris avec des produits qui peuvent être irritants, mais cela se fait sous anesthésie. L'injection intradermique se fait en 2- 3 min. Nous collecterons, sur une partie des souris dans toutes les procédures, des biopsies de peau sur des animaux anesthésiés qui seront euthanasiés juste après. L‘autre partie des souris seront suivies pendant 15 jours pour la survie et les signes cliniques suite aux infections et nous réaliserons des prélèvements sanguins tous les 3 jours. Les biopsies et l'examen clinique prennenent environ 3- 5 min/ animal, le prélèvement sanguin prend 2- 3 min. Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure.

Impact sur les animaux

-Douleur passagère dans le site de l’injection lors de l’inoculation des virus avec les lipides. Nuisances suite aux prélèvements sanguins sur la veine mandibulaire qui se traduisent par une lésion et douleur passagères après la ponction. -Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, stress, comportement anormal, troubles neurologiques (dépression, excitation ou convulsions), liés à l’infection par les virus.

Devenir

Dans toutes les procédures, les souris seront euthanasiées sous anesthésie : après la réalisation des biopsies cutanées, si elles développent des signes de souffrance et à la fin des expériences.

Remplacement

Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun model autre que le modèle animal ne permet de tester l’effet des lipides de la salive de moustique sur la transmission des flavivirus. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles in vitro. Nous identifierons les lipides impliqués dans l'augmentation de l'infection virale sur des modèles in vitro en utilisant des cellules humaines avant de confirmer l’effet avec le modèle animal.

Réduction

Pour réduire le nombre des souris à utiliser, nous faisons toutes les optimisations sur les modèles in vitro. Nous avons étudié l'effet des lipides sur les différents flavivirus in vitro, et sur les souris nous validerons l’effet observé pour seulement deux espèces de flavivirus pour limiter l'utilisation des souris. De plus, nous testerons différentes doses sur des souris males et puis nous validerons la dose ayant un effet sur des souris femelles. Dans nos expériences, nous utiliserons dans chaque condition le minimum des souris nécessaire pour avoir des données statistiquement analysables (10 souris/ condition dont 3 seront utilisées pour la collecte de la peau à 24h post infection pour étudier la transmission, et le reste des souris seront suivies pour la survie, les signes cliniques et la virémie).

Raffinement

-Les souris seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées avec le mélange kétamine/xylazine avant l’inoculation intradermique des produits et les biopsies cutanées. Nous utiliserons des coussins chauffants et une lampe chauffante pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à l'anesthésie : suivi des grandes fonctions et desséchement de la cornée. -Nous ajouterons un gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée. En dehors des expériences, le suivi des souris s’effectuera chaque jour. -Les souris infectées seront euthanasiées après la collecte des biopsies cutanées par dislocation cervicale sous anesthésie. -Les souris seront aussi euthanasiées si elles développent des signes de souffrance ou perdent >20% de poids corporel et à la fin des expériences, par dislocation cervicale sous anesthésie.-Les souris seront maintenues par 3 à 5 individus/cage avec de la litière et des enrichissements en alternance. Nous changerons la litière tous les 3 jours.

Choix des espèces

Nous allons utiliser dans ce projet des souris immunocompétentes, contrairement aux autres modèles d’infection pour les flavivirus, qui utilisent généralement des souris transgéniques avec une immunité innée déficiente. Notre projet vise à étudier l'effet des lipides salivaires sur la transmission des flavivirus et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. De plus, nous avons déjà validé et établie les conditions sur les souris. Par ailleurs, les souris sont des animaux de petites tailles, faciles à manipuler. Les constantes physiologiques seront facilement mesurables avec des outils adaptés. Nous allons utiliser des sujets adultes de 5 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate nécessaire pour l'étude de la transmission, l'inoculation en intradermique, et leur manipulation.