Souris

Toutes tuées à l'issue pour que leurs organes soient prélevés et analysés, 616 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur canule les glandes salivaires sous anesthésie pour y injecter un adénovirus qui provoque un syndrome sec, et une partie reçoit en plus un gavage quotidien cinq jours par semaine pendant quatre semaines pour déclencher une fibrose de la peau. D'autres reçoivent une molécule chimique à trois reprises pour induire un lymphome, puis une stimulation immunitaire mensuelle, avec des prises de sang hebdomadaires et des séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'autre modèle que la souris pour le syndrome de Gougerot-Sjögren et la sclérodermie, et qualifie ce modèle d'"indispensable" pour suivre l'apparition des auto-anticorps.

Objectifs

Le Syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) est une maladie auto-immune principalement caractérisée par une inflammation des glandes salivaires et lacrymales responsable d’un syndrome sec. Dans 40% des cas, les patients atteints développent des structures lymphoïdes anormales (ELS) au niveau de leurs glandes salivaires. La présence de ces structures ELS est prédictive d'une expression de la maladie plus aggressive et d'un risque accru de développement de lymphome. Cependant les mécanismes responsables de du dysfonctionnement des glandes salivaires, de la formation des ELS et du développement de l'auto-immunité restent peu connus. Nos collaborateurs ont mis en place un modèle murin de SGS reposant sur la délivrance d'adénovirus non réplicatifs (une fois que le virus a infecté une cellule, aucun autre virus n'est produit) dans la glande salivaire permettant l'induction d'ELS semblables à ceux observés dans le SGS. Tout d'abord, nos objectifs sont donc de mettre en place et caractériser ce modèle murin, ainsi que d'explorer les mécanismes à l'origine du dysfonctionnement des glandes salivaires dans le SGS et les stratégies thérapeutiques potentielles pour y remédier. Ensuite, nous étudierons le SGS dans le contexte d'autres pathologies puisque les patients atteints de SGS ont un risque accru de développement de lymphome et les patients atteints d'une autre maladie auto-immune, la sclérodermie systémique sont à risque de développer un SGS.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le Syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) et pourra permettre d'identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques. Egalement, nous espérons faire avancer la compréhension du lien entre le SGS et d'autres maladies auto-immunes ou cancers.

Procédures

Les souris seront soumises à une chirurgie consistant à une canulation des glandes salivaires (l'acte chirurgical ne durera pas plus de 15 minutes) associée à une anesthésie et une administration d'analgésique. Egalement, pour certains animaux : traitement administré 1 fois par jour pendant 5 jours/semaine pour une durée maximale de 4 semaines (durée : 1 minute / administration) afin d'induire la sclérodermie systémique, une maladie auto-immune caractérisée par le développement anormal d’une fibrose de la peau. Dans d'autres cas (induction d'un lymphome), administration d'une molécule chimique à 3 reprises (durée : 30 secondes / administration) avec 2 jours d'intervalle pour induire l'expression des altérations génétiques associée à une administration mensuelle (durée : 30 secondes / administration) permettant de stimuler leur système immunitaire. Dans le cadre du suivi de ces animaux, des prélèvements de sang, dont la fréquence sera au maximum hebdomadaire et la durée de moins de 30 secondes, seront réalisés. Dans certains cas, de l'imagerie non invasive pourra être réalisée impliquant une administration du substrat d'imagerie et une anesthésie gazeuse, la session durera 20 minutes au maximum.

Impact sur les animaux

La canulation des glandes salivaires pour le modèle du Syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) résultera d'un syndrome sec, une attention particulière sera donc portée sur la consommation d'eau. L'administration par gavage peut générer un stress, un inconfort, voire une fausse route créant une détresse respiratoire, c'est pourquoi elle ne sera réalisée que par des personnes qualifiées pour ce geste et sur animal vigil, diminuant ainsi drastiquement les fausses routes. En cas de fausse route, l’animal sera surveillé le temps de l’évacuation du liquide, l’animal vigil aura le réflexe d’évacuer par lui-même le liquide. Dans nos expériences précédentes, nous n’avons pas observé de stress lié à la répétition de ce geste de gavage. Pour les animaux transgéniques du modèle lymphome, on peut observer un développement tumoral qui reste généralement indolent (non douloureux) comme chez l'Homme ; cependant ces souris seront observées régulièrement afin de détecter l'apparition de signes d'affaiblissement (perte de poids, léthargie, dos courbé...). Les autres nuisances attendues proviendront de l'administration de l'inhibiteur. Dans le cas de la sclérodermie systémique, les souris développent une fibrose cutanée au point d'injection (bas du dos) et une fibrose pulmonaire modérée à partir de la 2ème semaine. Celle-ci est localisée dans la région sous-pleurale et s'étend peu à l’ensemble du parenchyme pulmonaire ce qui évite les difficultés ou souffrances respiratoires dans ce modèle murin.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêt qui seront rigoureusement exploités et analysés afin de recueillir un maximum d'informations.

Remplacement

La compréhension des mécanismes responsables du dysfonctionnement des glandes salivaires dans le Syndrome de Gougerot-Sjögren ne peut se faire que partiellement in vitro/ex vivo puisque les modèles de culture ne nous permettent pas encore de reproduire l'entière complexité de l'environnement des glandes salivaires (présence de tous les acteurs cellulaires impliqués et complexité 3D) mais nous travaillons en parallèle à les développer afin d'avoir recours aux animaux uniquement sur les dernières étapes de notre projet. En effet, la première cible thérapeutique que nous allons explorer a été définie grâce à des expérimentations in vitro. Egalement, les autres cibles potentielles seront déterminées grâce à un modèle d'organoïdes mis en place par des collaborateurs.

Réduction

Les expérimentations sont mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations. De manière générale, nous nous sommes basés sur les résultats de nos collaborateurs décrivant que la méthode de canulation de la glande salivaire permettait dans 70% des cas le développement des symptômes, ce qui implique la nécessité d'au moins 8 animaux par groupe afin d'obtenir au moins 5 animaux exploitables. Les doses croissantes d'adénovirus déficient seront testées en séquentiel, ainsi si la première dose testée s'avère suffisante les doses supérieures ne seront pas réalisées. De même si la décroissance observée à J23 est suffisante, les études aux temps plus tardifs ne seront pas réalisées. Lorsque une analyse transcriptomique et une analyse par immunofluorescence devront être réalisées, il sera nécessaire de doubler le nombre d'animaux par groupe car ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur les mêmes échantillons. Dans le cadre de l'étude d'association avec le lymphome, les groupes sont dimensionnés grâce à notre expérience précédente nous permettant d'attendre un taux de développement tumoral de 40% (nécessité d'augmenter les groupes à 11 animaux pour avoir des résultats exploitables).

Raffinement

La mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel permettront de limiter le stress et la souffrance des animaux. Ils bénéficieront également d'un enrichissement constitué de coton et/ou « maisons » en carton afin de les stimuler, diminuer le stress et afin de se construire un «nid». Le stress sera également limité au maximum grâce à une habituation progressive à la manipulation. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux (apparence physique, comportement) et un suivi bihebdomadaire des signes cliniques permettront d’avoir recours à des anti-douleurs adaptés (par exemple du spray anti-démangeaisons ayant des propriétés antiinflammatoires si démangeaisons au point d'injection chez les animaux où la sclérodermie sera induite) si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, et à l’euthanasie dès que nécessaire. Le raffinement sera également obtenu par un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire avec des dispositions adaptées (collyres, maintien à 37°C...) pour permettre une bonne récupération des animaux. La technique de suivi non-invasif par imagerie bioluminescente nous permettra de réaliser une caractérisation en cinétique du modèle de Syndrome de Gougerot-Sjögren de façon non douloureuse.

Choix des espèces

Pour les maladies auto-immunes, le Syndrome de Gougerot-Sjögren et la Sclérodermie systémique, il n'existe pas d'autres modèles que le modèle murin. Par ailleurs, ce modèle est indispensable pour suivre l'apparition des effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Concernant le modèle murin de lymphome, l'utilisation de souris transgéniques permet de reproduire avec pertinence les mécanismes précoces de la lymphomagenèse ce qui n'est pas possible avec les modèles murins de greffes. Les souris seront utilisées à l'âge adulte à partir de 8 semaines d'âge comme cela a été décrit pour ces modèles qui nécessitent un système immunitaire complètement fonctionnel et mature.

Pour mesurer l'effet de composés candidats sur la mémoire, 300 souris et 300 rats sains reçoivent des électrodes implantées dans l'hippocampe ou le cortex préfrontal au cours d'une chirurgie de deux heures. Tous sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous sont tués à l'issue, le sang terminal étant prélevé au sinus rétro-orbitaire. Les administrations vont jusqu'à 180 fois par voie orale ou 21 injections intrapéritonéales par animal, avec jusqu'à huit prélèvements sanguins. Les composés testés ont déjà été évalués in vitro par les clients du porteur, ce projet constituant l'étape suivante d'une prestation commerciale.

Objectifs

La mémoire est une fonction essentielle du cerveau, souvent perturbée dans de nombreuses maladies neurologiques ou psychiatriques. C’est pourquoi elle représente une cible importante pour développer de nouveaux traitements. Ce projet a pour but d’étudier, chez des rongeurs sains (souris ou rats, selon les besoins), l’effet de nouveaux composés sur le fonctionnement du cerveau lié à la mémoire, et plus particulièrement sur la façon dont les connexions entre les neurones peuvent se renforcer ou s’affaiblir. La mémoire repose en grande partie sur ces modifications durables des connexions, appelées plasticité synaptique, comme la potentialisation à long terme (LTP) — un renforcement durable de la transmission entre deux neurones après leur activation répétée — ou la dépression à long terme (LTD) — une diminution prolongée de cette transmission synaptique. Ces mécanismes permettent au cerveau d’apprendre et de stocker des informations. Pour étudier ces mécanismes, nous utilisons une méthode appelée électrophysiologie in vivo, qui consiste à enregistrer l’activité électrique du cerveau chez des animaux éveillés. Concrètement, nous implantons de petites électrodes, avec une grande précision, dans des régions clés impliquées dans la mémoire, comme l’hippocampe ou le cortex préfrontal. Cela nous permet de mesurer l’activité des neurones et de voir comment les signaux entre eux changent après l’administration des composés testés. Les composés seront donnés par voie orale ou injectés, selon ce qui est le plus adapté, et nous mesurerons leurs effets à différents moments. En observant comment ces substances influencent l’activité des réseaux de neurones, nous espérons mieux comprendre leur impact potentiel sur la mémoire. Les résultats obtenus serviront de base pour des recherches futures dans des modèles animaux reproduisant des troubles de la mémoire.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment de nouveaux composés agissent sur les mécanismes qui permettent au cerveau de renforcer ou d’ajuster les connexions entre neurones, un processus essentiel à la mémoire. En étudiant leur effet sur l’activité des réseaux de neurones dans un cerveau vivant, nous pourrons mieux cerner l’impact de ces candidats médicaments sur la plasticité cérébrale. Les données obtenues, issues d’un modèle préclinique dans des conditions proches du fonctionnement normal du cerveau, représenteront une étape clé avant de tester ces composés dans des modèles de maladies. Elles poseront ainsi les bases pour développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les dysfonctionnements des circuits neuronaux impliqués dans les troubles cognitifs liés à différentes maladies neurologiques ou psychiatriques.

Procédures

Sous analgésie anésthésie une seule étape de chirurgie (2 heures). Administrations : sous cutanée 1 à 14 fois max 5 sec ou Intrapéritonéale 1 à 21 fois max 5 sec ou 1 à 14 fois max 1 minute ou voie orale 1 à 180 fois max 5 sec. Prélèvements sanguins maximum 8 fois sur animal vigile ou anesthésiés (5 secondes).

Impact sur les animaux

Les administrations et prélèvements sanguins peuvent induire un stress, dont l’intensité et la durée dépendent du type d’administration et de sa répétition. Les administrations uniques provoquent un stress aigu et transitoire, tandis que les administrations répétées, même sur une période prolongée, ne génèrent pas de stress prolongé si les techniques sont maîtrisées. Pour les administrations aiguës, les signes d’inconfort restent limités. Cependant, des administrations répétées peuvent entraîner une sensibilisation locale ou des modifications comportementales, telles qu’une réduction de l’activité spontanée ou des altérations dans l’interaction avec l’environnement. La toxicité des composés administrés a été évaluée en amont, de manière à minimiser les risques d'effets indésirables. Les produits administrés peuvent induire des modifications dans la consistance des selles, ainsi qu’une baisse de la prise alimentaire transitoire. Une irritation ou une inflammation locale peuvent persister plusieurs minutes selon le composé administré au lieu d'injection. Une injection provoque un inconfort temporaire et une douleur légère. Une rougeur peut persister plusieurs minutes selon le composé administré. Un prélèvement sanguin entraîne une douleur légère au moment de la piqûre et un stress transitoire lié à l’immobilisation. Les prélèvements terminaux de sang par la méthode du sinus rétro-orbitaire sont réalisés sous anesthésie. Un stress temporaire peut être associé à l’anesthésie. Les enregistrements électrophysiologiques in vivo réalisés sur animal vigile, dans leur cage habituelle, limitent considérablement le stress et les perturbations comportementales. L’implantation d’électrodes lors de la procédure chirurgicale peut provoquer une douleur au site d'incision ou des saignements. En post chirurgie, un risque inflammatoire ou infectieux est présent.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.

Remplacement

L’étude des réseaux neuronaux et de l’activité cellulaire est réalisée chez l’animal vigile à l’aide de techniques d’électrophysiologie in vivo. Ces approches permettent d’enregistrer l’activité neuronale dans un environnement physiologique préservé, en tenant compte des interactions complexes entre différentes structures cérébrales et des influences de l’état de vigilance ou du comportement spontané. Les approches non animales, telles que les modélisations in silico, les cultures cellulaires ou les modèles in vitro, apportent des informations précieuses en phase exploratoire, notamment sur les mécanismes moléculaires et cellulaires. Dans ce projet, les composés testés ont d’ailleurs déjà été évalués par nos clients sur des modèles in vitro, ce qui a permis d’identifier des effets initiaux sur l’activité neuronale à un niveau cellulaire. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’étudier l’intégration de ces effets dans un réseau cérébral fonctionnel et intact. C’est pourquoi l’expérimentation in vivo s’avère nécessaire dans ce contexte, afin de caractériser l’impact des composés sur l’activité neuronale dans des conditions physiologiques réalistes.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages adaptées, enrichies avec des éléments favorisant leur bien-être, comme des bûchettes de bois à ronger, de la frisure de papier et des carrés de coton. Des tunnels en carton faciliteront les transferts entre cages tout en limitant le stress. Des interactions régulières avec le personnel, ainsi qu’une transition progressive de la lumière, contribueront à améliorer leur acclimatation. Une période d’adaptation d’au moins 10 jours est prévue afin de permettre aux animaux de récupérer du transport et de s’habituer à leur nouvel environnement. Ils seront surveillés quotidiennement, y compris les week-ends et jours fériés. Après chaque intervention technique, leur comportement et leur état général seront observés avec attention pour détecter rapidement toute réaction anormale ou signe de douleur. Si nécessaire, une surveillance renforcée sera mise en place, en lien avec le responsable du bien-être animal. Les fiches d’observation et les seuils définis dans le cadre du projet seront scrupuleusement respectés pour assurer une détection précoce de toute souffrance. Les animaux seront pesés au moins deux fois par semaine après le début des traitements, afin d’adapter précisément les volumes administrés. Pour les injections répétées (intrapéritonéales ou sous-cutanées), les sites d’administration seront régulièrement changés pour limiter les réactions locales. Concernant les interventions chirurgicales, les animaux seront placés sous anesthésie générale / analgésie pendant toute la durée de l’opération. Une analgésie locale préventive sera administrée, avec une injection 10 minutes avant l’incision, ainsi qu’une application locale d’un mélange anesthésique au niveau du site opératoire. Le maintien de la température corporelle (tapis chauffant), le suivi pendant l’opération (monitoring) et des techniques chirurgicales stériles seront appliqués pour limiter les complications. Une solution ophtalmique sera appliquée sur les yeux pendant l’anesthésie pour éviter leur dessèchement, et une injection de solution saline tiédie à la fin de la chirurgie permettra d’assurer l’hydratation. Enfin, une analgésie post-opératoire sera assurée par l’ajout d’un traitement antidouleur dans l’eau de boisson pendant deux jours.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées sur la souris et le rat, deux modèles couramment utilisés en neurosciences pour étudier les mécanismes cérébraux. Ces espèces présentent des similitudes majeures avec le cerveau humain, notamment en ce qui concerne l’organisation des circuits neuronaux et les mécanismes synaptiques. Ces caractéristiques en font des modèles particulièrement adaptés pour explorer les bases du fonctionnement normal du cerveau ainsi que les processus altérés dans les maladies affectant la mémoire. Grâce à un cerveau moins complexe tout en restant suffisamment proche de celui de l’humain, les souris et les rats permettent d’étudier des fonctions essentielles telles que la plasticité neuronale, l’apprentissage et la mémoire, souvent perturbées dans les pathologies du système nerveux central. Ces modèles offrent ainsi la possibilité d’observer et de mieux comprendre les mécanismes fondamentaux du fonctionnement cérébral, fournissant des données précieuses pour le développement de traitements ciblés contre ces maladies. Les animaux seront utilisés du jeune l’âge adulte, c’est-à-dire à partir de 4 semaines. Ils seront suivis jusqu’à environ 8 mois, ce qui couvre la période d’âge adulte sans atteindre le stade de vieillissement avancé soit avant l’apparition des altérations liées à l’âge ou à d’éventuelles pathologies. Les données obtenues chez ces animaux fourniront une base fiable pour la comparaison avec des modèles pathologiques plus avancés.

Un lupus provoqué par une injection unique dans le péritoine, une arthrite par deux injections intradermiques, une colite chimique : 540 souris sont soumises à ces modèles inflammatoires puis à des séances d'imagerie de trente minutes, cathéter posé sous anesthésie profonde, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue. Le porteur veut valider un agent de contraste couplé à un anticorps pour visualiser sans biopsie les agrégats immunitaires qui se forment dans les tissus enflammés. Il décrit pourtant, pour la colite, une diarrhée, des saignements et une souffrance de durée possiblement prolongée sur plusieurs jours, et fixe la mise à mort à plus de 20 % de perte de poids ou à un score de grimace supérieur à 1,5.

Objectifs

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des agrégats immunitaires de quelques centaines de micromètres qui se développent dans les tissus sous l'effet d'une inflammation chronique. En temps normal, ces TLS possèdent probablement de nombreux avantages en permettant de générer une réponse immunitaire locale. Néanmoins, dans des situations d'inflammation chronique ces structures entretiennent la pathologie présentée. Il a ainsi pu être démontré chez l'homme que la présence de TLS était associé à un mauvais contrôle de la pathologie au cours de rhumatismes inflammatoires, de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin ou de pathologies auto-immunes. Afin de visualiser l'inflammation en imagerie, il est possible d'utiliser des agents de contraste magnétiques pouvant être détectés par des techniques d'IRM ou d'imagerie à particules magnétiques (une modalité d'imagerie récemment introduite qui repose sur la détection du signal émis uniquement par les microparticules d'oxyde de fer, et qui permet la réalisation d'une étude corps entier, contrairement à l'IRM) et sélectivement dirigées contre un marqueur inflammatoire spécifique de la structure d'intérêt. Les TLS sont entourées de cellules vasculaires très spécialisées, qui expriment un motif appelé PNAd. Ce motif est reconnu par un anticorps spécifique, qu'il est alors possible de coupler à l'agent de contraste afin de permettre la visualisation des TLS par une approche d'imagerie. Un nouvel agent de contraste biocompatible a récemment pu être développé, ouvrant ainsi la voie à une translation à l'homme. Nous souhaitons donc valider cette approche d'imagerie moléculaire des TLS en utilisant ce nouvel agent de contraste couplé à un anticorps dirigé spécifiquement contre PNAd dans différents modèles précliniques de pathologies inflammatoires ou auto-immunes. Ceci permettrait de valider la possibilité d'une imagerie moléculaire de l'inflammation chez l'homme, par l'utilisation de ce nouvel agent de contraste.

Bénéfices attendus

La présence de TLS au sein des sites inflammatoire a pu être démontrée comme associée à un mauvais pronostic, y compris sous traitement immunomodulateur. L'évolution de la présence et du nombre de TLS a également pu être associée à la réponse thérapeutique. Actuellement, l'identification des TLS au sein d'un organe d'intérêt repose sur l'analyse microscopique du tissu après réalisation d'une biopsie. Cette technique présente de nombreuses limites. Il s'agit en effet d'un examen invasif, avec un risque de complication (hémorragie du site de ponction, perforation...) non négligeable, ce d'autant plus si l'on souhaite évaluer l'évolution des TLS au cours du temps et donc répéter les examens. De plus, l'analyse d'une biopsie n'apporte qu'une information parcellaire et ne permet pas une analyse complète de l'organe d'intérêt. Outre l'absence de vision d'ensemble, le risque de faux négatif est donc important. Enfin, la réalisation d'une biopsie est un examen destructeur, qui empêche donc le suivi d'une structure donnée au cours du temps. Pour toutes ces limites, il apparaît aujourd'hui nécessaire de développer une technique non invasive permettant l'étude, le suivi et la caractérisation des TLS. Le développement et la validation de notre agent de contraste utilisable en IRM dans différents modèles de pathologies inflammatoires permettrait ainsi d'ouvrir la voie de l'imagerie non invasive de l'inflammation en pratique clinique humaine.

Procédures

Les animaux seront suivis aux interventions suivantes : induction d'un modèle de lupus par injection intra-péritonéale unique (30 secondes) ou induction d'un modèle d'arthrite par deux injections intradermiques sous anesthésie profonde (5 minutes chaque) ; pesées quotidiennes (durée inférieure à 5 minutes) ; pose d'un cathéter pour l'administration de l'agent de contraste sous anesthésie profonde (environ 15 minutes) ; réalisation d'examens d'imagerie avec injection de l'agent de contraste (environ 30 minutes) ; injection d'un traitement par voie intra-péritonéale (30 secondes)

Impact sur les animaux

Les modèles de colite utilisés sont susceptibles d'occasionner des effets indésirables chez les animaux. Compte-tenu de notre expérience dans l'utilisation de ce modèle et des données de la littérature, nous savons que le modèle de colite est susceptible de produire une diarrhée et des des saignements. Il est susceptible d'entraîner une perte de poids chez les animaux, un inconfort physique et une souffrance de durée possiblement prolongée (quelques jours). Le modèle de lupus est susceptible d'entraîner une ascite, puis l'apparition de douleurs articulaires. L'effet le plus sévère de ce modèle rapporté dans la littérature est la survenue d'un saignement pulmonaire. Néanmoins, les souris utilisées ici, ne présentant pas ce type d'évènement. Le modèle de polyarthrite est susceptible de produire des douleurs et gonflements articulaires. La réalisation de l'imagerie, accompagnée de la pose d'un cathéter veineux peut se traduire par une douleur au point d'injection, une inflammation, une infection du site, une perte de poids.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisés pour évaluer l'affinité de l'agent de contraste ciblant PNAd sur des cultures de cellules endothéliales. Néanmoins, il reste nécessaire d'étudier l'affinité de l'agent de contraste pour sa cible moléculaire à l'échelle de l'organisme, d'étudier le rapport signal/bruit à l'échelle de l'organisme, de comparer les données obtenues avec celles d'une imagerie sans produit de contraste spécifique. Les procédures expérimentales décrites ci-après sont donc nécessaires afin de pouvoir valider la faisabilité de notre approche à l'échelle d'un organisme complexe, avant de pouvoir envisager une translation à l'homme. D'autres méthodologies expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux ne permettraient pas l'obtention du même niveau d'information.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures utilisant le même type d'animaux et les mêmes modèles de colite, ainsi que selon les données de la littérature et la sensibilité/spécificité des méthodes utilisées. En fonction de l'expérimentateur (expérience, habitilité) et du taux de mortalité obtenu (notamment pour les modèles de colite), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. Enfin, l'utilisation de techniques non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés en répétant les analyses d'image à différents temps. Pour le modèle de colite, un calcul du nombre de sujets nécessaire a pu être réalisé à partir des données antérieures de l'équipe (8 sujets par groupe, inflaté à 12 pour tenir compte de pertes potentielles ; 16 sujets pour la modulation par un traitement) pour une puissance de 80% et un risque de première espèce de 5%. Concernant les autres modèles, l'utilisation d'une telle modalité d'imagerie n'y a jamais été réalisée. Nous considérons donc qu'il s'agit d'une étude pilote, et qu'il n'est pas possible de réaliser un calcul du nombre de sujets nécessaires.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'un temps d'acclimation d'une semaine afin de permettre une réduction du stress. Les animaux seront hébergés par groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. Le milieu sera enrichi par l'utilisation de matériel type boîte à oeufs, tunnel ou igloo, et coton. Dès l'initiation de la procédure, le suivi des animaux sera assuré deux fois par jour afin de rechercher l'apparition de signes de souffrance et de les prendre en charge (points limites cités plus loin). La douleur sera évaluée par utilisation de la par l'utilisation de la mouse grimace scale. Les animaux seront pesés quotidiennement (points limites cités plus loin). Les animaux des groupes colites ou présentant des arthrites bénéficieront d'une coupelle de croquettes humidifiées pour permettre une hydratation et une alimentation facilitée. Tous les animaux bénéficieront d'eau et de nourriture ad libitum. Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer. Les animaux seront mis à mort si : perte de poids > 20% ; le score moyen de la mouse grimace scale est supérieur à 1.5 ; l'animal est horripilé et recroquevillé ; l'animal est agité et/ou non alerte ; l'animal présente une respiration abdominale ; la provocation de l'applicateur n'entraîne pas ou peu de changement comportemental ; pendant la pose du cathéter, l'injection des particules ou la perfusion intracardiaque, un problème d'anesthésie survient, l'animal présente des saignement abondant, ou un arrêt respiratoire. Les animaux présentant une déshydratation seront réhydratés. Les animaux présentant des signes de douleur ou d'inconfort (mouse grimace scale > 0.5, isolement, horripilation, respiration rapide) recevront une antalgie. Au cours des différentes procédures expérimentales, les animaux recevront une antalgie, une anesthésie générale, une anesthésie locale.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale qui a le plus été étudiée dans le domaine des pathologies inflammatoires. L'anatomie et la physiologie sont, dans ces pathologies, globalement transposables à l'homme. L'ensemble des connaissances acquises au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour l'étude des TLS en conditions inflammatoires. Il faut également noter que la cible de notre traceur (PNAd) est un motif conservé entres espèces, autorisant une translation rapide des résultats obtenus de la souris à l'homme. Dans les modèles de colite, les souris utilisées seront des souris mâles âgées de 8 semaines, stade optimal pour l'induction du modèle. Le modèle de lupus utilisera des souris femelles de souche BALB/c ou C57BL6/J âgées de 8 semaines. En effet, les souris mâles ne présentent pas de phénotype lupique. Le modèle d'arthrite fera appel à des souris DBA/1 de 8 semaines, selon les données de la littérature. Le modèle de vieillissement fera appel à des souris Swiss âgées de 68 semaines, et de 8 semaines pour les contrôles.

Choisies adultes pour que leurs reins soient matures, 108 souris subissent une heure de chirurgie destinée à interrompre puis rétablir la circulation sanguine dans un rein, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux à trois prélèvements de sang et l'administration du produit testé, un ARN non codant censé protéger les vaisseaux rénaux, complètent le protocole. Le porteur indique que la chirurgie peut entraîner des douleurs pendant jusqu'à soixante-douze heures et une perte de poids, réduites par des antalgiques. Toutes les souris sont tuées en fin de procédure pour prélever leurs organes, qui rejoignent une banque de tissus destinée à d'autres projets.

Objectifs

La transplantation rénale est considérée comme une thérapie de choix pour l’insuffisance rénale terminale. Cependant, le nombre de patients en attente de greffe rénale est en constante augmentation alors que le nombre de greffes réalisées reste inchangé. Afin de remédier à cette pénurie d’organes, les critères de sélection des greffons ont évolué et incluent le prélèvement d’organes provenant de donneurs dit marginaux (âge avancé, historique d’hypertension). Cependant, les organes issus de ce type de donneurs sont plus sensibles au stress subi lors de la séquence délétère d’ischémie reperfusion qui entraîne des lésions sur le futur greffon et peut induire une reprise de fonction retardée, réduisant la survie du greffon sur le long-terme. L’ischémie reperfusion est inévitable en transplantation, l’ischémie commence lors de l’arrêt de la circulation sanguine ce qui entraîne l’arrêt de l’apport en oxygène et en nutriment dans le futur greffon. La phase de reperfusion commence lors de la transplantation lorsque la circulation est rétablie au sein de l’organe. Lors de l’ischémie reperfusion rénale, le système vasculaire est endommagé et il est ainsi nécessaire de développer des thérapies afin de préserver la vascularisation et permettre ainsi une meilleure survie du greffon Il a été démontré qu’une molécule d’acide ribonucléique spécifique appelée ARN non codant, était fortement exprimée dans le système vasculaire et a un rôle essentiel dans la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et leur intégrité. Ce projet cherche à évaluer l’effet protecteur de cette molécules d’acide ribonucléique sur les lésions du système vasculaire rénal dans un modèle d’ischémie reperfusion chez la souris.

Bénéfices attendus

A cout terme, ce projet permettra une avancée des connaissances sur la protection du système vasculaire rénal. A moyen terme, ce projet permettra de définir une cible thérapeutique dans l’ischémie reperfusion rénale rénales. A long terme, ces résultats pourront être étendus à d’autres organes, tels que le foie, le coeur, le pancréas. Ce projet vise à améliorer la qualité, la fonction et la survie des greffons après transplantation chez l’humain.

Procédures

Sur tous les animaux anesthésiés : 2 à 3 prélèvements de sang chacun d'une durée de 2 minutes pour des dosages ultérieurs, une administration (durée de 2 minutes) du produit dont on teste l'effet protecteur et une chirurgie d'une durée de 1 heure pour provoquer l'ischémie-reperfusion.

Impact sur les animaux

Suite à l’anesthésie générale, l’effet attendu est un léger inconfort au réveil d’une quinzaine de minutes. Les injections en intraveineux et les prélèvements sanguins sous anesthésie (acte de moins de 2 minutes) induisent une douleur faible minorée par l'utilisation d'un analgésique local. En post-opératoire, la chirurgie peut entraîner une mobilité réduite de quelques heures , des douleurs jusqu’à 72 heures post-chirurgie minorées par l’administration d’antalgiques . L’autre effet indésirable pouvant être observé post-chirurgie est une légère perte de poids dont l’effet sera reversée sous 72 heures.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de prélever les organes nécessaires pour effectuer différentes analyses moléculaires et tissulaires.

Remplacement

Notre molécule d’acide ribonucléique a déjà été testé sur des modèles cellulaires, cependant les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire fidèlement l'architecture rénale qui organise les relations entre les différentes populations cellulaires, entre les vaisseaux et le reste du rein et qui ne permettent pas d'apprécier la fonction rénale. A ce stade du projet, seul le modèle animal permet d'évaluer l'effet du produit d'intérêt sur l'architecture du rein et la fonction rénale dans son ensemble.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, des résultats préliminaires ont été obtenus à partir de tissus murins rénaux conservés dans une biobanque qui ont permis de déterminer les temps de reperfusion d’intérêts. Le nombre d'animaux requis par condition expérimentale pour obtenir des résultats fiables malgré la variabilité du vivant a été calculé à l'aide d'un outil statistique. Le projet sera fait en plusieurs étapes ; le résultat de certaines étapes conditionnera la réalisation d'étapes ultérieures, ainsi le nombre d'animaux indiqué est un maximum. Les organes prélevés seront placés dans une banque d'organes pour être mutualisés avec d'autres projets.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (grille de suivi individuel), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe). Des points limites gradés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de la souffrance seront mis en place à chaque étape de la procédure. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale et locale en asepsie stricte. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées en asepsie stricte, sous anesthésie générale avec une régulation de la température de l’animal contrôlée par un tapis chauffant. Les animaux bénéficieront également d’une analgésie adaptée en pré, per et post opératoire

Choix des espèces

Des études sur l’état de la vascularisation rénale après ischémie reperfusion ont déjà été réalisées chez la souris et concordent avec la physiopathologie de l’ischémie reperfusion chez l’homme. Des souris adultes de plus de 8 semaines seront utilisées. A cet âge, les souris auront des reins matures et fonctionnels ainsi qu’un poids approprié pour l’expérimentation.

1 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune gavée et injectée dans le péritoine une fois par jour, cinq jours sur sept, pendant un à deux mois. Une chirurgie leur greffe d'abord une tumeur du rein, de la prostate, de la vessie ou du testicule directement dans l'organe concerné, puis une échographie hebdomadaire sous anesthésie suit la croissance tumorale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les bénéfices annoncés, un nouveau traitement et une survie allongée pour les patients, sont énoncés sans étape intermédiaire, quand les atteintes, elles, durent un à deux mois par animal. La mise à mort permet de prélever les tumeurs pour des analyses histologiques, biochimiques et immunologiques.

Objectifs

Les cancers urologiques englobent la prostate, le rein, la vessie et le testicule. En 2018, près de 82 000 nouveaux cas de cancers urologiques ont été diagnostiqués en France. À eux seuls, ces cancers représentent plus de 36 % des tumeurs masculines, mais seulement 4,2 % des tumeurs féminines. Si certains se soignent aujourd’hui très bien, d’autres développent des résistances aux traitements et nécessitent de nombreuses recherches afin d’améliorer la prise en charge des malades. Nous avons identifié de nouvelles cibles potentielles impliquées dans la résistance aux chimiothérapies. Nous souhaitons démontrer que la combinaison des chimiothérapies avec des inhibiteurs de ces nouvelles cibles présenterait un effet anti tumoral synergique en favorisant le stress réplicatif, l’apoptose mais aussi en stimulant l’immunité anti-tumorale. Le but de notre recherche étant d’obtenir de nouveaux traitements pour le cancer, il nous faut donc valider l’efficacité mais aussi la « non dangerosité » du traitement chez l’animal. C’est pourquoi, nous utilisons des souris syngéniques ou immunodéprimées greffées en orthotopique avec respectivement des cellules murines ou humaines de cancer urologique et nous les traitons avec cette nouvelle combinaison. Nous évaluons la croissance tumorale par mesure du volume tumoral par échographie. Nous traitons les animaux par une combinaison de chimiothérapie + inhibiteur. Si notre nouveau traitement est efficace, nous devrions observer une diminution de la taille de la tumeur chez les souris traitées, voire même une disparition complète de la tumeur.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet apporteront de nouvelles connaissances fonctionnelles des résistances aux traitements des cancers urologiques ainsi qu'un nouveau traitement pour les patients atteints de ces cancers, augmentant ainsi leurs survies.

Procédures

Les souris subiront une chirurgie pour réaliser la greffe (EU1), sous anesthésie et analgésie (10-15 min) puis un traitement, par gavage (20s) et injection intra-péritonéale (10s) une fois par jour 5j/7j (EU2) pendant une durée d’un à deux mois et une échographie hebdomadaire sous anesthésie (5min) (EU2) pendant 1 à 2 mois.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux, sont : les risques et les nuisances liés à toute intervention chirurgicale (fatigue, hypothermie, infection) ; une gêne liée la présence et la croissance d'une tumeur ; les traitements quotidiens (gavage ou intra-péritonéal) et les nuisances (fatigue, hypothermie) liées aux anesthésies hebdomadaires pour les échographies.

Devenir

Nous avons besoin de prélever la tumeur à la fin de l'expérience afin de pouvoir procéder à des analyses histologiques, biochimiques et immunologiques. Ainsi, tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

L’alternative possible à l’utilisation d’animaux est l’utilisation de cellules en culture. Cependant cette alternative ne permet pas de connaitre les effets de nos traitements sur un organisme complexe vivant. En effet, il ne permet pas ni de déterminer le rôle du système immunitaire dans le traitement du cancer (analyser l’infiltration lymphocytaire ainsi que la prolifération et la mort cellulaire), ni de mimer la pathologie existante chez l’homme. Ainsi, l’utilisation d’animaux est le seul moyen de répondre aux questions scientifiques de notre projet.

Réduction

Après consultation des données de la littérature sur des expériences similaires, le nombre d’animaux a été réduit au maximum. De plus, nous réaliserons une étude préliminaire de toxicité afin de réduire le nombre d’animaux. Concernant l’approche statistique, chaque lot sera constitué de 8 animaux afin de réaliser les tests statistiques pertinents sur un effectif suffisant.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse et la contrainte des animaux, nous mettons en place un cadre de vie accueillant, enrichi en coton et de petites maisons pour permettre aux souris de créer des nids. Une observation quotidienne de l’état clinique des animaux sera assurée. La sévérité des signes sera déterminée selon une grille d’évaluation qui permettra la mise en place de soins adaptés éventuels (administration d’anti-douleurs, soins cutanés, nourriture enrichie) ou conduira à l’euthanasie des animaux. Les conditions d’hébergement enrichi en coton et en petites maison permettra un cadre de vie accueillant. Les cages seront disposées sur des portoirs adaptés permettant le suivi du statut sanitaire des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle permettant de mimer au mieux la pathologie existante chez l’homme et d’étudier les interactions entre la tumeur, le système immunitaire, le traitement et un organisme vivant complexe. Nous souhaitons des animaux adultes car les cancers urologiques sont présents principalement chez des patients adultes.

Pour savoir si une protéine étudiée par l'équipe participe à la fibrose de la cholangite sclérosante primitive, une maladie des voies biliaires, des souris d'une lignée qui développe spontanément une maladie du foie, génétiquement modifiées pour ne pas exprimer cette protéine dans le foie, sont étudiées à partir de 4 semaines selon le stade de la maladie. 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour la collecte de leurs tissus. La seule procédure décrite est une prise de sang terminale d'environ une minute sous anesthésie, mais la lignée développe une jaunisse liée à la rétention de bile, une fibrose des voies biliaires et une hypertension portale, avec une perte de poids et un stress à l'effort possibles entre 8 et 12 semaines. Les points limites, dits précoces, ne sont pas détaillés. Le porteur décrit les souris comme "de petits mammifères très proches de l'homme" et sa lignée comme "le modèle le plus pertinent en termes d'homogénéité et de reproductibilité" dont il dispose.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’implication de l’expression d’une cible thérapeutique sur le développement de la cholangite sclérosante primitive (CSP). La CSP est une maladie inflammatoire chronique des voies biliaires qui entraîne une fibrose et une destruction progressive des canaux biliaires, menant à des complications très sévères, telles qu’une insuffisance hépatique et des tumeurs hépatobiliaires. La CSP est relativement rare, touchant environ 1 personne sur 10 000 dans la population générale. Elle est plus fréquente chez les hommes que chez les femmes et est souvent diagnostiquée chez les patients atteints de colite ulcéreuse. À l’exception de la greffe du foie, qui est réservée aux patients les plus gravement touchés, il n’existe actuellement aucun traitement pour cette maladie. Nous étudions une protéine d’intérêt localisée sur la membrane cellulaire, jouant un rôle dans le développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement cette cible thérapeutique qui ralentit la croissance tumorale des cancers du foie et le processus de fibrose hépatique. Ainsi l’objectif de ce projet est d’évalué le rôle essentiel que joue notre cible thérapeutique dans le développement de la fibrose dans le cas d’une CSP. Pour cela, un nouveau modèle de souris a récemment été développé afin d’obtenir une suppression ciblée de cette cible au niveau du foie uniquement. Cela nous permettra d’évaluer l’implication de l’expression de notre protéine d’intérêt sur le développement de la CSP.

Bénéfices attendus

Notre étude vise à évaluer l’implication d’une cible thérapeutique sur le développement de la CSP. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre et d’affirmer le rôle de cette cible dans le développement de la CSP. L'objectif de l'ensemble du projet est de comprendre comment notre cible thérapeutique participe à l’évolution de la maladie et d’identifier des voies cellulaires dérégulées, et potentiellement de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Ce modèle de souris développe spontanément une maladie hépatique caractérisée par une cholestase intrahépatique avec ictère, une fibrose biliaire, une hypertension portale. Une perte de poids et un stress à l’effort entre 8 semaines et 12 semaines peuvent être observé.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues nécessaires qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier pour une meilleure compréhension du mécanisme et avant une transposition chez l’Homme.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées grâce à une précédente étude afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Des méthodes anesthésiques seront appliquées lors des gestes le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. C’est actuellement le modèle le plus pertinent en termes d’homogénéité et de reproductibilité dont nous disposons pour étudier le développement de la fibrose suite à une CSP. De plus le modèle de souris que nous utilisons est génétiquement modifiée pour ne pas exprimer notre cible thérapeutique au niveau du foie afin de compléter nos études sur cette cible. À présent, ce modèle n’est donc disponible que dans la souris. Les animaux seront utilisés à un âge de 4 semaines minimum. Ce choix permettra une étude en fonction du stade de la maladie.

Jusqu'à trente-deux injections dans le péritoine en quatre semaines, plus une tumeur colorectale greffée et, pour une partie d'entre elles, une pompe à médicament implantée sous la peau : 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur s'attend à une gêne de la locomotion liée au volume de la tumeur, à une possible nécrose de la masse tumorale, et à une immunosuppression exposant les souris à un risque infectieux accru. L'objectif est de tester un peptide anticancéreux breveté associé à des chimiothérapies courantes, dans une étape que le porteur qualifie de prérequis "indispensable" avant la clinique. Les procédures sont conduites en priorité sur des femelles, pour rester cohérentes avec des travaux antérieurs menés eux aussi uniquement sur des femelles.

Objectifs

Le cancer est la première cause de mortalité prématurée en France et le nombre de cas de cancer diagnostiqués est en constante augmentation depuis 30 ans, du fait du vieillissement de la population. En 2023, le cancer colorectal (CRC) est le deuxième cancer le plus fréquent chez l’homme et la femme et la survie à 5 ans des patients atteints de CRC est de 69% (INCa). Au sein du microenvironnement tumoral (humain et murin), la cible du candidat médicament est une protéine de la matrice extracellulaire qui est exprimée, voire fortement surexprimée dans les cancers tels que les colorectaux et ovariens. Ainsi, cette protéine est considérée comme un marqueur de mauvais pronostic et de récurrence dans de nombreux cancers tels que le CRC. Dans le cadre du CRC, les dépistages préventifs permettent une prise en charge précoce dans le développement de la maladie, cependant, il existe encore un besoin d’identifier de nouveaux agents thérapeutiques permettant de prolonger la survie des patients et d'outrepasser les résistances. Dans l’optique du développement de telles molécules, les modèles expérimentaux chez la souris permettent d’étudier la biologie de la tumeur en réponse à de nouveaux traitements. Le candidat médicament étudié dans cette procédure est un peptide anticancéreux ayant fait l’objet d’un brevet et qui permet de lever l’interaction entre une protéine de la matrice extracellulaire et l’un de ses ligands, une protéine membranaire présente à la surface de nombreux types cellulaires. Par la levée de cette interaction protéique, le peptide induit une diminution de la croissance tumorale liée à une augmentation de l’infiltrat immunitaire ainsi qu’une diminution de l’angiogenèse, et ceci dans différents types de modèles cancéreux. Ce candidat médicament a déjà fait état de fortes propriétés anti-tumorales en laboratoire et en développement préclinique réglementaire en vue de son utilisation en thérapie humaine. L’objectif de ce projet est d’évaluer le bénéfice de l’utilisation de ce traitement en combinaison avec deux autres types de thérapies couramment utilisées en clinique : la chimiothérapie et l’immunothérapie. Les capacités anti-tumorales du candidat médicament seront évaluées dans un modèle de CRC, décrit pour exprimer la protéine ciblée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus consécutifs à la levée de l’interaction entre la protéine cible et son ligand par le peptide anticancéreux sont une diminution de la croissance tumorale liée à une augmentation de l’infiltrat immunitaire ainsi qu’une diminution de l’angiogenèse. C'est dans l'objectif de répondre à ces deux questions que le modèle CT26 de CRC a été choisi pour cette étude. En effet, celui-ci est décrit dans la littérature pour favoriser l'étude de l'infiltrat immunitaire dans des modèles syngéniques de souris immunocompétentes. La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettrait de consolider les résultats obtenus in vitro et ex vivo et confirmerait la pertinence de la stratégie thérapeutique associée au peptide anticancéreux dans un modèle complexe de progression tumorale in vivo (tumeur vascularisée et système immuno-compétent). Cette étape, permettant de compléter l’étude du mode d’action du peptide anticancéreux en combinaison avec d’autres thérapies couramment utilisées en clinique, constitue un prérequis indispensable à la compréhension de ses mécanismes d’action dans l’anticipation de son utilisation en clinique afin d’améliorer la prise en charge et le traitement des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à 5 types d’interventions : - Injection des cellules tumorales de cancer colorectal sous anesthésie gazeuse, toutes les souris sont concernées, une fois au début des 3 procédures expérimentales, temps de manipulation estimé à moins de 15min -Injection en intraveineuse dans la veine de la queue en condition vigile, 15 à 75 souris concernées, pour un maximum de 12 fois durant la période de traitement, temps de manipulation estimé à moins de 5min - Injection intrapéritonéale, 105 à 195 souris concernées, pour un maximum de 10 fois pendant la période de traitement de la procédure 1, un maximum de 28 fois sur 4 semaines pour la procédure 2 et un maximum de 32 fois sur 4 semaines pour la procédure 3, temps de manipulation estimé à moins de 5min - Prélèvement sanguin dans une veine de la patte arrière en condition vigile, toutes les souris sont concernées, une fois à la fin de la période de traitement, pour un temps de manipulation estimé à moins de deux minutes. - Chirurgie sous anesthésie gazeuse pour la pose des pompes de diffusion du médicament en sous la peau, 30 à 120 souris concernées, une fois en début de la période de traitement pour un temps de manipulation estimé à moins de 15 min.

Impact sur les animaux

Des nuisances ou effets indésirables pourraients provenir de différentes sources dans ces procédures. L’ensemble des gestes réalisés sur les souris necessitant des contentions et manipulations répétées, un stress ponctuel ou chronique pourrait être constaté. La modèle de croissance tumorale pourrait induire une cachexie : d’après la biblio, la cachexie apparaît principalement au stade métastatique du développement tumoral environ 5 à 6 semaines suivant l’inoculation des cellules tumorales. Il est donc peu probable que la cachexie apparaisse après les 4 semaines estimées de procédure néanmoins le risque que quelques animaux en présentent n’est pas totalement exclu. Une gêne à la locomotion due au volume tumoral en raison de la localisation de la tumeur pourrait aussi être attendue. Une inflammation ainsi qu’une nécrose pourraient être constatées sur la masse tumorale. Le recours à des traitements standard anticancéreux) pourraient induire des effets secondaires comme une perte de poids, une deshydratation, de la fatigue, ainsi que de l’immunosuppression, exposant les souris à un risque infectieux plus élevé. De plus, ces traitements étant administrés de manière répétées et en conditions vigiles, les souris pourraient être exposées à un stress ponctuel (quelques minutes) ou chronique (plusieurs jours, stéréotypie) ainsi qu’une douleur ponctuelle (quelques secondes) ou chronique, les injections en intrapéritonéale ou en intraveineuse pouvant être sources d’inflammation ou d’hématomes. Une mauvaise cicatrisation ou une infection à la suite de la procédure chirurgicale pour la pause de pompes osmotiques pourrait survenir. En effet, malgré les précautions de traitements et la surveillance accrues des animaux, une douleur, un infection ou un hématome de plusieurs jours pourraient être constatés sur le site chirurgical. Lors des différents recours à l’anesthésie gazeuse, les souris pourraient présenter des signes de grand ralentissement du rythme respiratoire ainsi que des signes d’hypothermie. Enfin, le prélèvement sanguin dans la veine saphène en condition vigile pourrait êre une source de stress et de douleur ponctuels ou d’hématome si les conditions d’hémostase après le prélèvement ne sont pas respectées.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de limiter la douleur et/ou l’inconfort liés au développement des tumeurs.

Remplacement

La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettrait de consolider les résultats obtenus in silico, in vitro et ex vivo et confirmerait la pertinence de la stratégie thérapeutique associée au peptide anticancéreux dans un modèle complexe de progression tumorale in vivo (tumeur vascularisée et système immuno-compétent). En effet, une étude in vitro seule ne peut suffire pour représenter les mécanismes physiologiques d’un organisme entier et les approches informatiques ne permettent pas à ce jour de mimer la fonction d’un organisme et sa réaction face aux traitements. Ainsi, nous devons recourir au modèle animal pour apporter la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique du peptide anticancéreux en combinaison avec d’autres thérapies.

Réduction

Les souris mâles et femelles pourront être considérées dans les procédures de ce projet afin de pouvoir identifier, si necessaire, une réponse différentielle liée à la synthèse hormonale. Car au cours d’une de nos études préliminaires, aucun effet hormonal n’a été observé sur la croissance tumorale dans des souris males et femelles non traitées et porteuses de tumeurs. Cependant, nos précédentes études d’efficacité du peptide anti- cancéreux ayant été réalisées exclusivement chez la femelle, afin de maintenir une cohérance, les procédures seront prioritairement réalisées chez la femelle. Si une efficacité d’une des bi-therapies ou de la tri-thérapie est démontrée, une étude exploratoire sur des mâles sera programmée afin de pouvoir identifier une éventuelle réponse différentielle liée à la synthèse hormonale. Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé de manière à réduire au maximum la quantité d’animaux tout en permettant une interprétation fiable des résultats basée sur des analyses statistiques adaptées. Pour l’ensemble des procédures, le nombre de souris par groupe est déterminé statistiquement. Lors de la réalisation de ces procédures, des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux, à savoir, une randomisation afin de répartir les animaux dans les différents groupes de traitements.

Raffinement

Une observation quotidienne sera réalisée afin de garantir le bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou stress. Une anesthésie à l’isoflurane aura lieu lors de l’injection des cellules tumorales, de la pose chirurgicale des pompes, du suivi de la croissance tumorale, et au préalable de l’euthanasie. Un anti-douleur sera délivré à l’anesthésie pré-opératoire puis 24h après le geste afin de prendre en charge les douleurs opératoires et post-opératoires. Un anti-inflammatoire non stéroïdien sera délivré à l’anesthesie pré-opératoire puis 24h après le geste pour prévenir de l’inflammation provoquée par la chirurgie. Pour chaque manipulation sous anesthésie de plus de 5min les souris seront placées sur un tapis chauffant pour le maintien de la température, un gel oculaire leur sera administré et le reveil se fera sous lampe chauffante pour prévenir l'hypothermie. L’ensemble des procédures seront réalisées dans un environnement calme et par un personnel formé à la manipulation et la contention de l’espèce souris, aux injections, à la pose chirurgicale de pompes, aux prélèvements sanguins et à l’euthanasie par dislocation cervicale. Dans le cadre des injections répétées, une alternance des sites d’injection sera réalisée pour limiter la douleur et le stress de l’animal. Dans le cadre du prélèvement sanguin, une hémostase d’au moins 3sec sera réalisée pour limiter la douleur et le risque d’hématome. Afin de limiter le stress de la manipulation et la contention lors du suivi de la croissance tumorale qui sera réalisée tous les 2-3j à partir de l'injection des cellules, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane. Une attention sera portée à l'observation des points limites fixés tout au long du projet pour éviter toute souffrance non soulagée par les soins apportés, auquel cas l'animal sera euthanasié. Un soin sera apporté aux conditions d'hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement, vie en groupe, surveillance quotidienne).

Choix des espèces

-Souris génétiquement identique de la lignée de carcinome colorectal. Travaux antérieurs justifiant de la pertinence de ce modèle murin dans le cadre de l’évaluation de la combinaison d’agents thérapeutiques dans le traitement de différents cancers. -Homologie de la protéine cible -Travaux précédents réalisés sur le peptide thérapeutique dans cette espèce Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique, les souris seront receptionnées à l’animalerie à l’age de 6 à 7 semaines et utilisées seulement après une période d’acclimatation d’au moins 7 jours. L’injection des celllules tumorales sera réalisée sur des animaux agés de 8 semaines, ce qui correspond à un stade adulte chez cette espèce (entre 2 et 6 mois).