Souris

882 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie d'entre elles subit une anesthésie de vingt minutes, une incision abdominale d'un centimètre et une injection de cellules tumorales directement dans le foie, puis jusqu'à sept nouvelles anesthésies en six semaines pour des imageries, et jusqu'à six injections de traitement. La preuve de concept recherchée, associer un vaccin à ARNm et un virus tueur de cellules cancéreuses contre le carcinome hépatocellulaire, reste une hypothèse de laboratoire, quand les tumeurs greffées, elles, grossissent réellement dans le foie des souris. Le porteur mentionne des organoïdes et des organes sur puce qu'il emploiera pour la toxicité, puis conclut à la "nécessité" d'un modèle animal pour le reste.

Objectifs

Le projet concerne un nouveau traitement du cancer du foie, une des causes les plus courantes de décès liés au cancer avec une incidence en constante augmentation (830 000 décès dans le monde en 2020). L’absence de traitement efficace et les difficultés de diagnostic précoce en font un cancer de mauvais pronostic par le plan stratégique national décennal de lutte contre le cancer (survie à 5 ans de seulement 18%). Le carcinome hépatocellulaire représente plus de 80% des cancers primitifs du foie et se développe fréquemment sur un fond de maladie hépatique chronique causée par l'alcool, l'hépatite virale B ou C chronique ou le syndrome métabolique associé à un excès de poids et au diabète. Le carcinome hépatocellulaire est souvent diagnostiqué tardivement et se prête mal à un traitement curatif. L'objectif du projet est d’apporter la preuve de concept du bénéfice de l’association d’une vaccination antitumorale avec l’action de virus capable d’éliminer préférentiellement des cellules cancéreuses dans un contexte de cancer du foie. Pour la formule de vaccin, nous utiliserons de l’ARNm comportant des modifications moléculaires qui ont démontré leur valeur dans les vaccins ARNm actuellement très utilisés dans la pandémie COVID. L’effet protecteur et curatif de la vaccination, ainsi que l’apport d’un traitement combinant le vaccin et le virus ciblant les cellules cancéreuses, seront évalués. Ce projet est réparti sur 3 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les traitements du carcinome hépatocellulaire restent insatisfaisants. Ils reposent essentiellement sur des interventions lourdes ou des thérapies peu efficaces. L’immunothérapie est basée sur la stimulation du système immunitaire du patient et reste une option thérapeutique de choix, mais en l’état elle doit être améliorée pour atteindre un niveau d’efficacité satisfaisant. Les vaccins en cours de test contre le cancer du foie utilisent surtout de petits morceaux de protéines fabriqués en laboratoire pour apprendre au système immunitaire à reconnaître et attaquer les cellules cancéreuses. De récentes avancées dans l’utilisation de l’ARNm et des nanoparticules ouvrent la voie à une nouvelle génération de vaccins contre le cancer. Par exemple, des essais sur le cancer de la peau ont montré qu’associer une immunothérapie ciblée avec un vaccin à ARNm transporté par des nanoparticules lipidiques pouvait renforcer la réponse du système immunitaire contre la tumeur. Le projet présenté ici innove en combinant deux approches puissantes : d’une part, des virus spéciaux qui attaquent directement la tumeur et facilitent l’accès du système immunitaire aux cellules cancéreuses, et d’autre part, un vaccin à ARNm qui entraîne le système immunitaire à reconnaître les cellules tumorales. Cette stratégie combinée vise à : (1) apprendre au système immunitaire à cibler précisément la tumeur grâce au vaccin, et (2) intensifier la destruction des cellules cancéreuses par l’action des virus, tout en stimulant davantage la réponse immunitaire.

Procédures

Un lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 5 minutes puis une injection de 30 secondes, réalisé dans l’EU1. Un autre lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une injection (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), puis 7 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune afin d'effectuer à chaque fois une échographie et/ou une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (5 imageries réalisées dans l’EU2 et 2 échographies réalisée dans l’EU3). D’autres lots d’animaux auront une anesthésie d'environ 5 minutes puis une injection de 30 secondes, suivi de 3 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), avec anesthésie (5 minutes pour l’injection) pour la moitié des animaux, entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). Un 5ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une injection (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), suivi de 3 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection) sous anesthésie (5 minutes) entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). 5 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune seront réalisées afin d'effectuer à chaque fois une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (réalisées dans l’EU2). Un 6ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 5 minutes puis une à deux injections de 30 secondes selon la pousse tumorale, suivi de 6 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), dont 3 réalisées avec anesthésie (5 minutes pour l’injection), entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). Un 7ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une à deux injections (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), suivi de 6 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), dont 3 réalisées avec anesthésie (5 minutes pour l’injection), entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). 5 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune seront réalisées afin d'effectuer à chaque fois une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (réalisées dans l’EU2).

Impact sur les animaux

Un stress peut intervenir lors de la préhension de l'animal dans le cadre des différentes interventions (injection, anesthésie, mesure de la taille des tumeurs) et une douleur légère peut apparaitre au point d'injection (cellules tumorales et traitement). La chirurgie pour injecter les cellules tumorales dans le foie peut entrainer une douleur post-opératoire au niveau de la suture, voire une infection locale. Le niveau de nuisance dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Le foie est un organe complexe composé de nombreux types de cellules, dont les hépatocytes et des cellules immunitaires. Les modèles classiques en laboratoire, comme les cultures de cellules, ne permettent pas de reproduire cette complexité. Des modèles plus avancés, comme les organoïdes ou les organes sur puce, imitent mieux certaines fonctions du foie et seront utilisés pour évaluer la toxicité des traitements. Cependant, ce projet repose sur des interactions complexes entre les cellules tumorales, le système immunitaire et l’environnement du foie. Aucun modèle de laboratoire ne permet aujourd’hui de recréer cette dynamique, d’où la nécessité d’utiliser un modèle animal

Réduction

Les traitements seront analysés et présélectionnés par une série d’essais in vitro sur cellules immunitaires et hépatiques en culture. Cette sélection in vitro des meilleurs traitements contribuera à réduire le nombre d’individus inclus dans le projet et permettra d’affiner les protocoles en fonction du type de réponses immunitaires désiré. Seuls les traitements présentant un intérêt seront testés chez la souris. Un suivi au cours du temps, sur un même individu, de la taille des tumeurs sera réalisé et permettra de réduire drastiquement le nombre d'animaux qui aurait été utilisé pour obtenir des courbes de croissance de la tumeur par mise à mort des animaux à chaque temps étudié. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.

Raffinement

Pour limiter la souffrance animale, la taille des tumeurs sera suivie afin qu’elles ne dépassent jamais les limites acceptées en recherche sur le cancer. Nous améliorerons aussi notre protocole en nous appuyant sur des études montrant que les nanoparticules utilisées sont bien tolérées et que le moment de la journée où la greffe est réalisée peut influencer son succès. Ainsi, nous choisirons le moment le plus adapté. L’utilisation d’analgésique et d’anesthésique sera réalisée lorsque nécessaire et des points limites prédictifs et précoces, basés sur des grilles score adaptés aux interventions sur l’animal, avec des critères d’arrêt seront mis en place afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux seront transportés par un expérimentateur compétant suivant la réglementation, dans des cages occultées, contenant de l'enrichissement et des croquettes mouillées.

Choix des espèces

Le développement de tumeur par greffe chez la souris est facilement réalisable, reproductible et est un modèle de référence dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les lignées de souris présentent l'intérêt d'être génétiquement homogènes, réduisant ainsi la variabilité des réponses immunitaires. Nous emploierons des souris de deux souches différentes qui présentent l'avantage d'être bien connues dans leur capacité de réponse immunitaire. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines pour les greffes, ainsi que décrit dans la littérature. C’est aussi le stade de développement auquel leur immunité est effective.

Des femelles gestantes gavées cinq fois de suite, des nouveau-nés injectés à 36 et 72 heures de vie, des biopsies de queue prélevées sur des petits éveillés entre le septième et le dixième jour : 912 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance majoritairement modéré. Les petits qui développent la maladie présentent une jaunisse et un retard de croissance, et sont tués à 14 ou 21 jours. Le projet vise à créer des lignées de souris reproduisant une malformation des voies biliaires plus tôt dans le développement que les modèles déjà publiés. Le porteur écrit que les nouveau-nés sont tués parce qu'ils sont "nécessaires" à l'étude, et renvoie l'effectif de 912 animaux à des "tests statistiques adaptés" dont il ne donne pas le détail.

Objectifs

l’objectif de ce projet est la création de nouveaux modèles génétiques de la malformation des voies biliaires lors du développement embryonnaire. Cela permettra d’étudier le développement de la maladie à des âges plus précoces par rapport aux publications précèdentes.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra le développement de nouveaux modèles génétiques de la malformation des voies biliaires chez la souris. Ils permettront d’étudier les mécanismes métaboliques et inflammatoires menant aux symptômes de la maladie. Cette étude se fera en parallèle avec l’utilisation de cellules du foies dérivées de biopsies de patients. Cela permettra de valider les mécanismes moléculaires impliqués et de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourront être testés sur nos nouveaux modèles de souris par la suite.

Procédures

Toutes les interventions sont réalisées sur animal vigile. Les nouveaux-nés subiront une contention d'une minute pendant laquelle une biopsie de queue de 1 à 2 millimètres sera prélevé pour le génotypage entre 7 et 10 jours après la naissance. Gavages répétés, 5 fois pendant 30sec, chez la femelle gestante entrainant une douleur modérée et passagère . Injections répétées, 2 fois pendant 10sec, aux nouveaux nés 36h et 72h après la naissance engendrant une douleur légère et passagère.

Impact sur les animaux

Risque de saignement vaginal et perte de poids pour la femelle gestante. Lors des procédures le gavage est un mode d’administration entrainant une douleur modérée et passagère. l’injection entraine une douleur légère et passagère sur un nouveau-né. Dans le cas où les animaux développent la maladie les symptômes seront une jaunisse et un retard de croissance (poids moins élevés).

Devenir

Tous les nouveaux nés seront mis à mort à 14 ou 21 jours d'âge car ils sont nécessaires pour notre étude et tous les animaux adultes des croisements seront également mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires en parallèle de nos modèles de souris pour ce projet. Néanmoins les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer les études in vivo pour l'étude du développement du foie et de la mise en place de la fibrose et de l'inflammation et l'étude de l'arbre biliaire lors de l'embryogénèse.

Réduction

Dans un souci de réduction des animaux nous utiliserons les deux sexes car nos études précédentes n’ont pas montré de différence en fonction des sexes pour le développement de cette maladie. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Pour les nouveaux nés l’utilisation d’une lampe chauffante durant les pesées permettra de limiter la perte de chaleur des animaux. L’injection et le gavage seront réalisés avec des sondes et des aiguilles adaptées à la taille de l’animal seront utilisés. Des points limites spécifiques ont été établis.

Choix des espèces

Le choix de la souris est lié à la similarité du métabolisme et du développement du foie entre l'humain et la souris. En particulier, le développement des canaux biliaire est similaire entre les deux espèces. Par ailleurs, nous disposons également de nombreux outils spécifiques pour la souris. Les femelles gestantes seront gavées à différents âges de la gestation : 10 et 12 jours de gestation (développement du foie et formation de la vésicule biliaire et du canal biliaire extrahapétique) ainsi que 14 et 16 jours de gestation (maturation du canal biliaire extrahépatique et formations des canaux intrahépatiques). Les nouveaux nés développent les symptômes visibles de la maladie à la naissance comme chez l’Homme. Nous utiliserons donc les animaux entre 1 et 21 jours après la naissance pour évaluer le développement de la maladie.

648 souris de trois à quatre semaines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent jusqu'à quatre séances d'irradiation cérébrale sous anesthésie générale, puis jusqu'à trois séries de tests portant sur la motricité, la vision, l'anxiété et la mémoire épisodique, des séances d'IRM de deux heures sous anesthésie et jusqu'à dix administrations de molécules étalées sur douze mois. L'objet du travail est de mesurer le vieillissement accéléré des vaisseaux du cerveau après radiothérapie. Le porteur décrit des modèles de culture en trois dimensions déjà développés par son consortium, les juge "largement insuffisants" pour reproduire la cognition, et conclut que le passage par un organisme vivant est "indispensable".

Objectifs

Notre équipe étudie l’impact de la radiothérapie sur le vieillissement accéléré (ou sénescence) du cerveau, dans le contexte des cancers du cerveau chez l’adulte (glioblastome) mais également chez l’enfant (gliome, médulloblastome). Le médulloblastome est la tumeur cérébrale maligne la plus fréquente chez l’enfant et la majorité de ces tumeurs surviennent avant l’âge de 10 ans. La combinaison de la chirurgie et d’une radiothérapie agressive a permis d’obtenir une survie à 5 ans de l’ordre de 50%. La surveillance à long terme des patients qui ont survécu plus de 5 ans sans récidive a montré qu’un tel traitement entraîne fréquemment de lourdes séquelles notamment cognitives. Des données de la littérature indiquent que la radiothérapie cérébrale induirait un vieillissement accéléré d’un certain type de cellules dans le cerveau, notamment celles impliquées dans sa vascularisation. Le rôle joué par ce vieillissement sur l’apparition des déficits cognitifs n’est pas connu. L’objectif de ce projet est donc d’étudier l’ampleur de ce vieillissement accéléré induit par une radiothérapie et son impact sur les troubles cognitifs. Notre étude sera réalisée dans 3 établissements utilisateurs différents sur des modèles animaux : de jeunes souris recevront une dose d’irradiation équivalente à celle d’un protocole de radiothérapie. Des tests comportementaux et des examens d’imagerie seront réalisés. Une étude en histologie du cerveau des animaux complétera le protocole. Toujours à l’aide d’un modèle murin, nous évaluerons la capacité de molécules pharmacologiques à limiter l’apparition des lésions cérébrales et des déficits cognitifs liés à la radiothérapie.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif une meilleure connaissance du rôle du vieillissement accéléré (ou sénescence) sur les troubles cognitifs après radiothérapie. Les résultats obtenus seront exploités pour permettre de proposer de nouveaux traitements visant à protéger au mieux les fonctions cognitives. L’utilisation de notre modèle pour étudier et traiter les troubles cérébraux radio-induits doit permettre une rapide application aux jeunes patients souffrant des médulloblastomes traités par radiothérapie. À plus long terme, les connaissances qui découleront de notre étude devront également bénéficier à d’autres cancers du cerveau aussi bien chez l’adulte (glioblastome) que chez l’enfant (gliome).

Procédures

Le projet se déroule dans 3 établissements utilisateurs nommés EU1, EU2 et EU3. Les animaux recevront une dose d’irradiation équivalente à celle d’un protocole de radiothérapie utilisé en clinique dans l’EU2, sous anesthésie générale gazeuse, à raison de quatre séances maximum espacées de 24h (séance d’une durée de de 5 min maximum). Les tests comportementaux réalisés dans l’EU1 sur une partie des animaux se focaliseront sur les capacités motrice et visuelle, l’anxiété et la mémoire épisodique. Ils seront répétés 3 fois maximum sur 12 mois et entraîneront environ une quinzaine de jours d’expérimentation (au maximum, 3 à 4 tests par animal, avec une phase d’entraînement et des phases de récupération, chaque test durant moins de 30 minutes par jour). Une partie des animaux recevront un examen d'imagerie par résonance magnétique dans l’EU3, examen d’une durée maximale de 2 heures réalisé sous anesthésie générale. Une partie des animaux recevra un traitement pharmacologique visant à limiter les effets de la radiothérapie. Le traitement se fera dans l’EU1 en plusieurs prises, entre 2 et 10 selon la molécule testée, sur une période de 12 mois maximum. L’administration dure moins d’une minute). Enfin des prélèvements de fluides biologiques seront réalisés en fin d’expérimentation, sur animaux anesthésiés, dans les EU1 ou EU3.

Impact sur les animaux

L’irradiation seule ne provoque pas de nuisance immédiate chez l’animal mais peut engendrer un stress léger du fait de la contention pour l’anesthésie (placement dans la chambre d’induction). Cette nuisance liée à l’induction de l’anesthésie sera légère et de courte durée. De plus, l’irradiation et les protocoles d’imagerie étant réalisés sous anesthésie légère, les potentiels effets indésirables sont une hypothermie légère transitoire et un risque faible d’arrêt respiratoire. Les déplacements pourront provoquer un stress modéré et éventuellement l’apparition d’agressivité. Cet effet pourra perdurer jusqu’au retour au lieu d’hébergement initial. Cependant, ces changements d’environnement seront les plus courts possible et il n’y aura pas de modifications des groupes sociaux. Les différentes études de comportement seront précédées d’une phase d’habituation à l’expérimentateur et à l’environnement de travail afin de limiter au maximum l’apparition de stress pour les animaux. Les administrations de molécules pharmacologiques pourront provoquer un stress léger lors de la contention et des effets secondaires. Les injections, quant à elles, entraînent une douleur légère de courte durée. Cependant, ces administrations étant répétées lors des semaines de traitements, la douleur pourrait passer de légère à modérée lors des phases de traitement. Enfin, avant la mise à mort des animaux, les prélèvements biologiques (sang et/ou liquide céphalo-rachidien) seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie complète (l’injection pourra provoquer une douleur légère de courte durée).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d’étude afin de corréler nos résultats obtenus in vivo avec des analyses histopathologiques.

Remplacement

Notre consortium a développé de nombreux modèles de culture cellulaire afin de pouvoir étudier les effets de l’irradiation in vitro. Ces modèles 2D ont été récemment complétés par le développement de modèles 3D multicellulaires (bioprint, organes sur puces). Ces modèles 3D permettent de recréer des conditions tissulaires simplifiées et ainsi étudier les effets de l’irradiation pour trier certaines conditions expérimentales et molécules pharmacologiques. Cependant ces modèles in vitro sont encore préliminaires et sont largement insuffisants pour reproduire la complexité d’organisation du cerveau et étudier des processus aussi compliqués que la cognition. Ainsi, le passage par un organisme vivant complexe est indispensable.

Réduction

L’utilisation des modèles in vitro 2D et 3D permet d’optimiser le design expérimental de nos études in vivo, et ainsi de limiter l’utilisation des animaux à leur stricte nécessité. Des études préliminaires nous ont permis d’optimiser la mise en place de notre modèle. Nous avons ainsi pu réduire la gamme de certaines modalités d’irradiation (doses, fréquence) pour lesquelles un effet ne serait pas suffisamment détectable. Différentes études statistiques ont été menées et ont permis de déterminer un nombre réduit d’animaux pour chaque procédure : entre 10 et 16 animaux par lot selon la procédure. Enfin, nous procéderons à une analyse statistique après chaque expérience qui sera stoppée dès que la significativité sera atteinte.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon des conditions d’hébergements réglementaires au sein de l’établissement utilisateur, à savoir : hébergement en groupe sociaux dans des cages de taille adaptée sur portoir ventilé (avec hygrométrie, température et cycle jour/nuit 12h/12h contrôlés). Les animaux auront de l’eau et de la nourriture à disposition à volonté et auront également à disposition dans leur environnement deux éléments d’enrichissement à minima : papier kraft pour la constitution du nid, tunnel en polycarbonate rouge et/ou une maison en cellulose pour l’abri. Les transports vers l’irradiateur ou l’IRM se feront par transporteur et véhicule agréés. Le confort et la sécurité des animaux seront garantis durant toute la durée du transport (aliment et eau à volonté, sans modifications des groupes sociaux, présence d'enrichissement). Une période d'acclimatation à l'arrivée sera observée pour garantir aux animaux une période de repos. Les irradiations seront réalisées sous anesthésie générale. Afin de limiter l’hypothermie due à l’anesthésie, les animaux seront placés sur tapis chauffant jusqu’au réveil complet. Un suivi clinique approfondi des animaux sera fait dans les 24h suivant l’irradiation, puis deux fois par semaine, ce qui permettra d’évaluer sur le long terme l’apparition éventuelle de points cliniques limites. Une phase d’habituation (à l’environnement, l’expérimentateur et la préhension) sera réalisée dans les 15 jours précédant les tests cognitifs afin de limiter le stress. L’imagerie IRM est réalisée sous anesthésie, dans un berceau chauffé, avec contrôle de la respiration et de la température. Lors d’une acquisition IRM, si la respiration sort des limites prévues, l’examen est immédiatement interrompu et l’animal est mis sous surveillance accrue jusqu’à sa récupération. Les prélèvements de fin d’expérimentation ainsi que les mises à mort des animaux seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie complète.

Choix des espèces

Le modèle retenu pour nos études est la souris car c’est une espèce couramment utilisée en neurosciences, qui présente l’avantage d’avoir une organisation des structures cérébrales relativement proche de celle de l’homme et un comportement très bien documenté dans la littérature. Ce modèle est très répandu en études pré-cliniques en cancérologie, et l'ensemble des études préliminaires du consortium (notamment de mise au point en histologie) ont été réalisées chez la souris. De plus, nous disposons de l'ensemble des équipements adaptés à cet espèce pour nos études : irradiateur, imageur IRM et enceintes pour études cognitives. . Les études seront menées sur animaux juvéniles, c’est-à-dire des animaux de 3 à 4 semaines au moment de l’irradiation. Ce stade est privilégié pour reproduire le cadre clinique des traitements du médulloblastome qui intervient durant le développement cérébral chez l’enfant âgé de 10 à 14 ans environ.

Un centimètre d'incision dans l'abdomen pour injecter des cellules tumorales directement dans le foie, puis sept anesthésies en six semaines pour suivre la tumeur en imagerie : 882 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. 694 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 188 d'un niveau léger. S'y ajoutent trois à six injections de traitement par animal, l'objet étant de tester une virothérapie associée à une stimulation immunitaire contre le carcinome hépatocellulaire. Le porteur indique utiliser des organoïdes et des organes sur puce pour évaluer la toxicité des traitements, et affirme qu'aucun modèle de laboratoire ne permet de recréer les interactions entre tumeur, système immunitaire et foie.

Objectifs

Le projet concerne un nouveau traitement du cancer du foie, une des causes les plus courantes de décès liés au cancer avec une incidence en constante augmentation (830 000 décès dans le monde en 2020). L’absence de traitement efficace et les difficultés de diagnostic précoce en font un cancer de mauvais pronostic par le plan stratégique national décennal de lutte contre le cancer (survie à 5 ans de seulement 18%). Le carcinome hépatocellulaire représente plus de 80% des cancers primitifs du foie et se développe fréquemment sur un fond de maladie hépatique chronique causée par l'alcool, l'hépatite virale B ou C chronique ou le syndrome métabolique associé à un excès de poids et au diabète. Le carcinome hépatocellulaire est souvent diagnostiqué tardivement et se prête mal à un traitement curatif. L'objectif du projet est d’apporter la preuve de concept du bénéfice de l’association d’une vaccination antitumorale avec l’action de virus capable d’éliminer préférentiellement des cellules cancéreuses dans un contexte de cancer du foie. Pour la formule de vaccin, nous utiliserons de l’ARNm comportant des modifications moléculaires qui ont démontré leur valeur dans les vaccins ARNm actuellement très utilisés dans la pandémie COVID. L’effet protecteur et curatif de la vaccination, ainsi que l’apport d’un traitement combinant le vaccin et le virus ciblant les cellules cancéreuses, seront évalués. Ce projet est réparti sur 3 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les traitements du carcinome hépatocellulaire restent insatisfaisants. Ils reposent essentiellement sur des interventions lourdes ou des thérapies peu efficaces. L’immunothérapie est basée sur la stimulation du système immunitaire du patient et reste une option thérapeutique de choix, mais en l’état elle doit être améliorée pour atteindre un niveau d’efficacité satisfaisant. Les vaccins en cours de test contre le cancer du foie utilisent surtout de petits morceaux de protéines fabriqués en laboratoire pour apprendre au système immunitaire à reconnaître et attaquer les cellules cancéreuses. De récentes avancées dans l’utilisation de l’ARNm et des nanoparticules ouvrent la voie à une nouvelle génération de vaccins contre le cancer. Par exemple, des essais sur le cancer de la peau ont montré qu’associer une immunothérapie ciblée avec un vaccin à ARNm transporté par des nanoparticules lipidiques pouvait renforcer la réponse du système immunitaire contre la tumeur. Le projet présenté ici innove en combinant deux approches puissantes : d’une part, des virus spéciaux qui attaquent directement la tumeur et facilitent l’accès du système immunitaire aux cellules cancéreuses, et d’autre part, un vaccin à ARNm qui entraîne le système immunitaire à reconnaître les cellules tumorales. Cette stratégie combinée vise à : (1) apprendre au système immunitaire à cibler précisément la tumeur grâce au vaccin, et (2) intensifier la destruction des cellules cancéreuses par l’action des virus, tout en stimulant davantage la réponse immunitaire.

Procédures

Un lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 5 minutes puis une injection de 30 secondes, réalisé dans l’EU1. Un autre lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une injection (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), puis 7 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune afin d'effectuer à chaque fois une échographie et/ou une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (5 imageries réalisées dans l’EU2 et 2 échographies réalisée dans l’EU3). D’autres lots d’animaux auront une anesthésie d'environ 5 minutes puis une injection de 30 secondes, suivi de 3 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), avec anesthésie (5 minutes pour l’injection) pour la moitié des animaux, entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). Un 5ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une injection (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), suivi de 3 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection) sous anesthésie (5 minutes) entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). 5 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune seront réalisées afin d'effectuer à chaque fois une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (réalisées dans l’EU2). Un 6ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 5 minutes puis une à deux injections de 30 secondes selon la pousse tumorale, suivi de 6 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), dont 3 réalisées avec anesthésie (5 minutes pour l’injection), entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). Un 7ème lot d’animaux aura une anesthésie d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre, puis une à deux injections (30 secondes) dans le foie (réalisé dans l’EU1 ou l’EU2), suivi de 6 injections de traitement (30 secondes pour chaque injection), dont 3 réalisées avec anesthésie (5 minutes pour l’injection), entre J+3 et J+17 post-greffe (réalisé dans l’EU1). 5 anesthésies d'environ 5 à 20 minutes chacune seront réalisées afin d'effectuer à chaque fois une imagerie, sur une durée totale de 6 semaines (réalisées dans l’EU2).

Impact sur les animaux

Un stress peut intervenir lors de la préhension de l'animal dans le cadre des différentes interventions (injection, anesthésie, mesure de la taille des tumeurs) et une douleur légère peut apparaitre au point d'injection (cellules tumorales et traitement). La chirurgie pour injecter les cellules tumorales dans le foie peut entrainer une douleur post-opératoire au niveau de la suture, voire une infection locale. Le niveau de nuisance dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Le foie est un organe complexe composé de nombreux types de cellules, dont les hépatocytes et des cellules immunitaires. Les modèles classiques en laboratoire, comme les cultures de cellules, ne permettent pas de reproduire cette complexité. Des modèles plus avancés, comme les organoïdes ou les organes sur puce, imitent mieux certaines fonctions du foie et seront utilisés pour évaluer la toxicité des traitements. Cependant, ce projet repose sur des interactions complexes entre les cellules tumorales, le système immunitaire et l’environnement du foie. Aucun modèle de laboratoire ne permet aujourd’hui de recréer cette dynamique, d’où la nécessité d’utiliser un modèle animal

Réduction

Les traitements seront analysés et présélectionnés par une série d’essais in vitro sur cellules immunitaires et hépatiques en culture. Cette sélection in vitro des meilleurs traitements contribuera à réduire le nombre d’individus inclus dans le projet et permettra d’affiner les protocoles en fonction du type de réponses immunitaires désiré. Seuls les traitements présentant un intérêt seront testés chez la souris. Un suivi au cours du temps, sur un même individu, de la taille des tumeurs sera réalisé et permettra de réduire drastiquement le nombre d'animaux qui aurait été utilisé pour obtenir des courbes de croissance de la tumeur par mise à mort des animaux à chaque temps étudié. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.

Raffinement

Pour limiter la souffrance animale, la taille des tumeurs sera suivie afin qu’elles ne dépassent jamais les limites acceptées en recherche sur le cancer. Nous améliorerons aussi notre protocole en nous appuyant sur des études montrant que les nanoparticules utilisées sont bien tolérées et que le moment de la journée où la greffe est réalisée peut influencer son succès. Ainsi, nous choisirons le moment le plus adapté. L’utilisation d’analgésique et d’anesthésique sera réalisée lorsque nécessaire et des points limites prédictifs et précoces, basés sur des grilles score adaptés aux interventions sur l’animal, avec des critères d’arrêt seront mis en place afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux seront transportés par un expérimentateur compétant suivant la réglementation, dans des cages occultées, contenant de l'enrichissement et des croquettes mouillées.

Choix des espèces

Le développement de tumeur par greffe chez la souris est facilement réalisable, reproductible et est un modèle de référence dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les lignées de souris présentent l'intérêt d'être génétiquement homogènes, réduisant ainsi la variabilité des réponses immunitaires. Nous emploierons des souris de deux souches différentes qui présentent l'avantage d'être bien connues dans leur capacité de réponse immunitaire. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines pour les greffes, ainsi que décrit dans la littérature. C’est aussi le stade de développement auquel leur immunité est effective.

2 823 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant passer jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie après avoir été infectée. 2 571 relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Le protocole commence par une encoche dans l'oreille, se poursuit par deux ou trois injections de vaccin à ARN espacées de quatorze jours et des prises de sang, puis par l'inoculation d'une mycobactérie dans la queue, qui provoque une inflammation locale. Le porteur annonce "peu d'effets indésirables" et un "inconfort léger de courte durée", et justifie l'effectif par une "vaste expérience" d'études in vivo validée par des biostatisticiens, sans donner le calcul.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de tester et de développer de nouveaux vaccins contre des mycobactéries. Ces agents pathogènes constituent une préoccupation croissante pour la santé mondiale en raison de leur résistance aux antibiotiques et de leur propagation continue. L'infection par ces agents pathogènes entraîne une morbidité à vie chez les personnes immunodéprimées, et leur traitement est extrêmement coûteux, long et complexe. Il est urgent de mettre en place de nouvelles stratégies pour prévenir l'infection et réduire l'impact de ces agents pathogènes sur la population mondiale, comme la vaccination. Le besoin de vaccins contre ces agents pathogènes reste non satisfait à ce jour, et il est urgent de mieux comprendre les corrélats immunologiques de protection contre chacune de ces infections. Cette demande concerne l'analyse fonctionnelle de la réponse immunitaire induite par la vaccination et la détermination de l'efficacité des vaccins à ARN contre le développement des infections mycobactériennes. Le projet a pour objectif de développer de nouveau vaccins en utilisant certains progrès technologiques permettant la découverte et la caractérisation non ciblée de nouveaux antigènes bactériens très certainement reconnus par le système immunitaire lui permettant de contrôler l’infection, et d’inclure ces antigènes dans des vaccins à base d’ARN. Le projet est donc de produire des vaccins ARN permettant l’expression des antigènes de ces mycobactéries et de tester l’efficacité de ces vaccins dans des modèles animaux. Les bénéfices du projet seront la production de vaccins protecteurs efficaces contre ces mycobactéries. Une fois défini, ces vaccins pourront être testés dans des essais cliniques chez l’Homme. Il est prévu dans le projet de tester une vingtaine de candidats vaccins pour chacun des pathogènes dans des expériences de protection chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait apporter des bénéfices de santé publique à court et long terme grâce au développement de nouveaux vaccins à ARN ciblant trois importantes mycobactéries non tuberculeuses (MNT). Ces agents pathogènes sont responsables d'infections graves, en particulier chez les personnes immunodéprimées ne disposant actuellement pas de traitement efficace. Bénéfices à court terme : 1. Avancement scientifique dans le développement de vaccins Le projet permettra l'identification et les tests précliniques de nouvelles cibles antigéniques pour le développement de vaccins à ARN. Il favorisera également le développement d'un nouveau processus de développement de vaccins contre les agents pathogènes mycobactériens, et pourrait être appliqué à divers agents pathogènes bactériens. 2. Évaluation des réponses immunitaires et de la protection En évaluant systématiquement les réponses immunitaires et l'efficacité protectrice dans un modèle murin, le projet identifiera les antigènes des agents pathogènes mycobactériens conduisant à une immunité protectrice. Ces connaissances amélioreront également notre compréhension des interactions hôte-pathogène pour les infections étudiées. De plus, l'étude des réponses immunitaires permettra de mieux comprendre les corrélats immunitaires de la protection contre ces pathogènes. 3. Innovation collaborative L'implication de laboratoires européens de premier plan, dotés d'expertises complémentaires, garantit un échange rigoureux de méthodologies et de connaissances. Bénéfices à long terme : 1. Développement de nouveaux vaccins contre les maladies négligées L'objectif ultime d'identifier les candidats vaccins les plus performants pourrait conduire à de futurs essais cliniques et, à terme, à la mise au point de vaccins humains efficaces. 2. Impact sur la santé publique La réduction de l'incidence et de la gravité des infections à MNT grâce à la vaccination pourrait réduire le recours à des traitements antibiotiques de longue durée, souvent mal tolérés et favorisant l'apparition de résistances aux antibiotiques.

Procédures

Toutes les souris utilisées dans ce protocole seront marquées par encoche à l’oreille prenant quelques secondes. Pour les animaux vaccinés, 2 à 3 injections de vaccins prenant une dizaine de secondes par animal. Les injections sont espacées de 14 jours. Si 2 à 4 prélèvements sanguins s’avéraient nécessaires pour nos analyses à deux semaines d’intervalle, ils prendront quelques secondes par animal. Pour certains animaux vaccinés, une injection sera réalisée prenant une dizaine de seconde par animal. L’injection pour l’infection sera réalisée à l’aide d’un dispositif de contention prenant une trentaine de seconde par animal. L’imagerie sera réalisée une fois par semaine après l’infection sous anesthésie et durera une quinzaine de minutes (8 séances d’imagerie au maximum sont prévues). Une autre infection sera réalisée sous anesthésie et ne prendra que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Pour ces études, nous prévoyons peu d'effets indésirables chez les souris. Les animaux reçoivent deux ou trois doses de vaccin, ou une dose de BCG (le vaccin antituberculeux Bacille Calmette Guérin). Il est maintenant reconnu que les vaccins à base d’ARN ou l’injection du BCG n’entrainent qu’un inconfort léger de courte durée sur le site d’injection lié à l’introduction de l’aiguille lors de la vaccination. Dans certains cas rares, les souris présentent une légère réaction inflammatoire localisée au site d’injection suite à la vaccination par les vaccins ARN. Un petit volume de sang sera prélevé une semaine après chaque vaccination et une semaine après l’infection. Les processus de prélèvement sont courts et n’engendreront qu’un inconfort léger de courte durée lié à l’introduction de l’aiguille. Ces prélèvements seront espacés de deux semaines pour faciliter leur récupération. L’infection des souris par des mycobactéries par voie sous-cutanée engendrera lui aussi un inconfort léger de courte durée lié à l’introduction de l’aiguille au niveau de la queue. Une inflammation pourra être observée au niveau du site d’injection. L’infection des souris sous anesthésie n’engendrera qu’un inconfort léger de courte durée.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort car le projet nécessite de faire des analyses sur des organes vitaux. Ces organes ne pourront être prélevés qu’après mise à mort de l’animal.

Remplacement

Ce projet vise à tester l'immunogénicité et l'efficacité protectrice de différentes formulations de vaccins contre divers agents pathogènes. Toutes les hypothèses pouvant être testées in vitro, telles que l'activation des cellules immunitaires ou l'expression de molécules vaccinales, seront d'abord vérifiées à l'aide de lignées cellulaires ou de cellules sanguines. En effet, ces tests invitro permettent d'analyser certaines composantes de la réponse immunitaire à la vaccination. Cependant, aucun modèle in vitro ne peut reproduire intégralement le développement de l'infection ou sa physiopathologie associée car il existe de nombreux éléments inducteurs et régulateurs impliquées dans ces réponses et certains ne sont pas encore connus. Les bénéfices potentiels des vaccins dans la prévention et le contrôle de l'infection, notamment leur capacité à induire une réponse immunitaire protectrice, ne peuvent être évalués de manière fiable que dans un organisme vivant, rendant ainsi l'utilisation d'un modèle animal indispensable pour leur analyse et leur validation.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans cette étude est basé sur une vaste expérience d’études in vivo pour des modèles d’infection et a été validé par des biostatisticiens. Le nombre d’animaux par groupe a ainsi été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs par l’utilisation de tests statistiques adaptés en fonction des expériences et des groupes analysés en prenant en compte la variabilité attendue de chaque paramètre et des expériences pilotes qui nous permettront d’évaluer la dispersion des valeurs individuelles au sein des groupes. Pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, 6 souris par groupe seront utilisées et deux expériences indépendantes, l’une avec des souris femelles et l’autre avec des souris mâles, seront réalisées. Si des différences entre les sexes est observée, une expérience supplémentaire comprenant des femelles et des mâles sera réalisée sur les vaccins les plus efficaces. Par ailleurs, nos protocoles visent à extraire un maximum d'informations de chaque animal en utilisant plusieurs techniques. Nous prélèverons tous les organes d’intérêt et un important volume de sang de tous les animaux de l’étude pour tirer parti de toutes les informations que peuvent nous apporter les animaux utilisés. Nous utiliserons des techniques expérimentales novatrices qui nous permettront d’analyser sur un seul individu de multiples facteurs d’intérêt pour obtenir le maximum d’information pour chaque animal utilisé maximisant ainsi les données tout en minimisant le recours aux animaux. Les études approfondies d'immunogénicité ne seront menées que sur les candidats vaccins les plus prometteurs afin de réduire davantage le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Plusieurs mesures sont mises en place pour améliorer le bien-être animal : - Les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation à leur nouvel environnement de deux semaines - Pour les souris vaccinées, après la vaccination, un léger massage est réalisé pour permettre la dispersion du vaccin. En cas de réaction inflammatoire au niveau du site d’injection, un traitement local sera réalisé. - Pour les souris infectées, l’infection va engendrer une inflammation localisée sur la queue au niveau du site d’injection. La zone inflammée sera massée avec de l’eau tiède pour soulager l’inflammation. Une litière plus douce à base de cellulose pourra être utilisée. -Après chaque prélèvement sanguin, les animaux seront réhydratés avec une solution de sérum physiologique pour faciliter leur récupération. - Nous avons choisi les temps d’expérience suite à l’infection pour que les animaux ne développent pas la pathologie associée et qu’ils ne soient pas susceptibles de développer des signes d’inconfort et de souffrance. Néanmoins, les animaux seront évalués une à deux fois par semaine. En cas d’apparition de signes d’inconfort des croquettes humides et du gel hydrique seront ajoutés et la surveillance renforcée à trois visites par semaine. Si des signes de souffrance sont détectés, l’animal sera réhydraté avec du sérum physiologique par voie sous-cutané et surveillé une fois par jour. Si les signes persistent pendant plus de 24h, l’animal sera mis à mort. - Si nécessaire, d’autres moyens de raffinement pourront être utilisés pour améliorer le bien-être des animaux comme une augmentation de l’enrichissement et le chauffage des cages.

Choix des espèces

Le modèle murin représente le meilleur compromis éthique parmi les modèles mammifères, avec des résultats proches de ceux de l'homme. Le système immunitaire de la souris est bien caractérisé et largement comparable à ceux de l'homme. De plus, le modèle murin a été largement utilisé pour la recherche sur les réponses immunitaires aux mycobactéries et sur les vaccins. Chacun de ces modèles d'infection a été précédemment publié dans d'autres laboratoires. Par conséquent, les résultats obtenus peuvent être facilement mis en contexte avec la littérature existante et avec nos connaissances préalables sur ces agents pathogènes. Le modèle murin, largement utilisé dans la recherche sur les maladies infectieuses, présente également l'avantage de disposer d'un large éventail de techniques adaptées et de réactifs. Cela nous permet de réaliser des analyses sur un plus large éventail de facteurs, avec un faible échantillonnage de souris. Des souris adultes âgées de 2 mois seront utilisées. À ce stade, le système immunitaire est pleinement développé et nous permet d'évaluer la réponse vaccinale.

Gavées ou injectées une à deux fois par jour pendant sept, quatorze ou vingt-huit jours, 480 souris et 480 rats reçoivent des molécules dont le porteur écrit lui-même que les effets sont souvent inconnus, les doses du dernier groupe étant choisies pour provoquer des effets indésirables. Tous sont tués pour l'examen histologique de leurs organes, 720 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 240 à un niveau léger. Le porteur affirme que la contention, l'anesthésie et la pose d'une puce sous la peau "ne devraient pas imposer de souffrance", tout en listant l'irritation par gavages répétés, les hématomes et la perforation de l'œil lors d'un prélèvement rétro-orbital. L'ensemble répond à une obligation réglementaire qu'il cite : les essais par administration réitérée "devront être effectués sur deux espèces de mammifères dont l'une ne sera pas un rongeur".

Objectifs

La mise en place d’un programme d’optimisation de molécules, depuis la synthèse jusqu’à la qualification d’une molécule comme potentiel candidat clinique pouvant entrer dans les phases de test de toxicité et de tolérance chez l’animal, est un long processus avec des coûts très importants. Ce programme consiste en une série d’études obligatoires comprenant notamment des tests de toxicité. Les épreuves de toxicité (tolérabilité) par administrations réitérées ont pour objet de mettre en évidence les modifications physiologiques et anatomopathologiques consécutives aux administrations répétées d’un composé et d'établir les conditions de l'apparition de ces modifications en fonction de la posologie. Ce projet nous permettra d'évaluer la tolérabilité de composés pharmacologiques développés par notre société. (MODIFICATION) L'évaluation de la toxicité pourrait nécessiter un suivi de la température corporelle. Celui-ci sera réalisé au moyen de puces sous-cutanées, d'où cette modification de projet. Nanmoins, aucun animal supplémentaire par rapport au projet initial n'est requis.

Bénéfices attendus

Grâce à ces études, nous pourrons identifier rapidement les molécules mal tolérées par l'animal et au potentiel toxicologique. Les molécules avec des effets secondaires seront éliminées du processus de développement. Nous limiterons alors le nombre de molécules à développer, le nombre d’études de toxicologie, le nombre d’études in vivo de modèles pathologiques, et réduirons in fine le nombre global d’animaux inclus dans des études précliniques. Cela apportera également de précieuses informations quant à la potentielle toxicité du composé, les organes cibles et son mode d'action in vivo. Ce dernier point nous permettra de modifier la constitution même de la molécule pour adapter les caractéristiques observées à celles attendues pour le développement de molécules efficaces.

Procédures

Les animaux recevront le composé une ou deux fois par jour (selon la demi vie de la molécule), pendant 7, 14 ou 28 jours (selon la phase de developpement de la molécule et l'indication envisagée). L'administration par voie orale dure une dizaine de secondes. D’autres voies alternatives d'administration (sous-cutanée - 10 secondes, intraveineuse - 1 minute, intrapéritonéale - 10 secondes) pourront être utilisées selon les caractéristiques intrinsèques des composés et leur propriétés pharmacologiques. Un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (3 minutes au total) sera fait préalablement au sacrifice afin d’analyser la réponse inflammatoire dans le serum et/ou de doser le composé pharmaceutique dans le plasma (taux d’exposition). Il est possible que plusieurs prélèvements soient réalisés chez le même animal au long de l'étude (1 par semaine maximum). (MODIFICATION) En cas de données préliminaires à ce sujet, un suivi de la température corporelle pourrait être fait via des puces implantées en sous-cutanée au niveau interscapulaire (1 fois (2 fois maximum en cas de problème de detection des données), procédure sous anesthésie et analgésie, 3 à 4 minutes au total).

Impact sur les animaux

Par le choix des doses de composé (aux effets souvent inconnus), il est attendu des effets indésirables sur les animaux du dernier groupe. La douleur ou le mal-être ressentis par les animaux peuvent se manifester, entres autres, par une hypo- ou une hyperactivité, des difficultés à se déplacer, une prostration, une modification des expressions faciales. La douce contention nécessaire pour le traitement par voie orale, ainsi que l'anesthésie pour le prélèvement sanguin et l'implantation de puce sous-cutanée le cas échéant (mesure la température corporelle), ne devraient pas imposer de souffrance aux animaux, même si il existe des risques d'hypothermie et de sècheresse oculaire. Ils pourront néanmoins engendrer un stress et une légère douleur. Malgré la très bonne formation du personnel et l'utilisation d'analgésie, il pourrait dans de rares cas y avoir des conséquences dues aux administrations ou aux prélèvements (par exemples : irritation lors de gavages répétés, hématome lors d'intraveineuse, douleur, perforation de l'oeil lors d'un prélèvement en retro-orbital).

Devenir

La mise à mort de tous les animaux est nécessaire dans la mesure où les organes seront observés et prélevés pour analyse histologique.

Remplacement

En amont des tests chez l’animal, les composés sélectionnés sont évalués sur des tests in vitro, permettant d’identifier les composés les plus prometteurs, de comprendre leur mécanisme d’action et de limiter le nombre de molécules inactives ou pouvant entrainer des nuisances ou effets indésirables chez les animaux (via les tests de toxicologie cellulaire). Les tests in vitro apportent des renseignements sur la toxicité potentielle des substances, mais ils ne sont pas encore suffisants pour éviter l'expérimentation sur l'animal entier avant l'administration à l'Homme. Un composé qui réussit les premiers tests de sécurité et de toxicologie peut être pris en considération pour les études à doses répétées sur les animaux. Ces études apportent l'essentiel des informations fondamentales sur la façon dont le composé agit sur l'organisme. La relation entre la dose et la réaction de l'animal au composé est étudiée plus en détail et les organes ayant subi d'éventuels effets toxiques sont examinés. Ces premières informations sont essentielles pour évaluer la dose initiale sûre pour les essais cliniques chez l'Homme.

Réduction

La sélection des composés est faite en utilisant des tests cellulaires ou non cellulaires in vitro. Seules les molécules présentant une activité sur les tests in vitro et ayant des caractéristiques pharmacocinétiques adéquates seront étudiées avec les animaux. Ce modèle a déjà été utilisé par le passé pour obtenir des informations sur la potentielle toxicité des molécules au sein de notre laboratoire. Les données obtenues précédemment ont été utilisées dans le but de déterminer le nombre d’animaux maximum nécessaire pour obtenir des résultats significatifs dans les tests statistiques utilisés.

Raffinement

Toutes les dispositions nécessaires en matière d’hébergement, d’enrichissement, d’observation et de soins aux animaux sont prises afin d’assurer les meilleures conditions de vie aux animaux. La Structure Chargée du Bien Être Animal (SBEA) émet ses recommandations en matière de prévention de la douleur, souffrance et détresse des animaux. Après réception, les animaux seront placés dans des cages par 4 à 5 souris ou par 2 à 3 rats. Un programme d’enrichissement permet de varier les éléments de la cage afin d’encourager leur comportement de rongeur : coton pour la construction de nid, dôme rouge pour se cacher, bois à ronger… (MODIFICATION) En cas d'implantation de puce sous-cutanée (mesure la température corporelle évitant des prises rectales plus impactantes), une anesthésie et une analgésie permettront de limiter stress et douleur potentiels. Afin de limiter le stress causé aux animaux, les composés testés seront administrés majoritairement par voie orale. Cette technique, rapide et nécessitant une contention courte, est bien tolérée par les animaux. D’autres voies alternatives pourront être utilisées selon les caractéristiques intrinsèques des composés et leur propriétés pharmacologiques (voies sous-cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). La formation du personnel, la taille de la sonde et de la puce, et l’adaptation des volumes administrés selon la voie d'administration permettront de limiter le stress ressentit par l’animal lors du traitement. Les animaux seront monitorés à chaque traitement pour la surveillance de signes cliniques éventuels et vérifier l'absence de souffrance.

Choix des espèces

Selon les textes réglementaires, « les essais de toxicologie par administration réitérée devront être effectués sur deux espèces de mammifères dont l'une ne sera pas un rongeur ». Nous pouvons alors réaliser la première étude sur rongeur. Comme mentionné plus haut, l’espèce de rongeur sera choisie en fonction de la connaissance de la molécule, des études antérieures et préliminaires de pharmacocinétique et de métabolisme. Nous travaillerons avec des rats ou des souris (mâles et femelles), pour suivre les textes réglementaires. Nous utiliserons des animaux adultes de 8 à 10 semaines environ pour les 2 espèces. Il n’est pas justifié d’utiliser des animaux très jeunes ou âgés.

140 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 56 d'entre elles et modéré pour 84. Les femelles reçoivent jusqu'à deux injections hormonales dans l'abdomen à 48 heures d'intervalle, les mâles sont vasectomisés, et une quinzaine de minutes d'incision abdominale sert au transfert des embryons. Le seul bénéfice annoncé est la fabrication de deux lignées mutantes, soit d'autres animaux destinés à de futures expériences sur la pluripotence embryonnaire, le porteur reconnaissant que les effets de la mutation sur les souris ne sont pas connus à ce jour. 130 souris sont tuées, les 10 mâles vasectomisés étant conservés pour resservir dans un autre projet.

Objectifs

LLes cellules souches embryonnaires sont des cellules très particulières qu'on trouve au tout début de la vie, dans l'embryon. Elles sont capables de se multiplier à l'infini et de se transformer en n'importe quel type de cellule de notre organisme (peau, cerveau, cœur, etc.). Grâce à ces propriétés uniques, elles sont très utiles pour mieux comprendre comment un organisme se forme et pour imaginer de nouvelles approches en médecine, notamment pour réparer des tissus abîmés. Ces cellules proviennent d’un stade embryonnaire très précoce, présent quelques jours après la fécondation. Elles permettent aux chercheurs d’étudier en détail comment les cellules se spécialisent pour former les différents organes. Ce processus est contrôlé par des gènes, qui jouent un rôle important, notamment dans la multiplication des cellules et leur spécialisation. Ce projet de recherche vise à étudier l’effet d’un gène particulier en le supprimant chez des souris. Cela permettra de voir ce qui se passe quand le gène ne fonctionne plus du tout et comment il influence le développement des embryons et des fœtus, notamment dans les premières étapes du développement embryonnaire. Il permettra d’apporter des réponses aux problèmes de reproduction, notamment chez l’homme et les espèces d’élevage.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera un modèle de recherche nouveau pour acquérir des connaissances sur le développement embryonnaire précoce des mammifères.

Procédures

Les types d’interventions sur les animaux sont : 1) les injections d’hormones dans la cavité abdominale, et (2) les interventions chirurgicales associées à la vasectomie et au transfert embryonnaire. Pour les injections, chaque souris est injectée au maximum deux fois (avec un intervalle de 48h entre chaque injection). Ces interventions sont rapides (une injection dure quelques secondes). Les interventions chirurgicales (incisions abdominales et cutanées) sont réalisées une fois et durent une quinzaine de minutes. La cicatrisation dure quelques jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les souris concernent : (1) douleurs liées aux injections, et 2) risques d’infection ou hémorragies et douleurs liées aux interventions chirurgicales. Les injections peuvent provoquer un saignement léger et des douleurs légères, comme celles associées à des blessures superficielles, équivalente à celle d’une piqure ou d’une petite coupure. Les interventions chirurgicales peuvent provoquer des douleurs modérées, essentiellement liées aux incisions et à leurs cicatrisations. Les effets indésirables lié à la mutation ne sont pas connus à ce jour. Nous n’attendons pas de conséquences dommageables pour les souris mais l’expérimentation permettra de déterminer s’il en existe, notamment par l’évaluation du bien-être animal de la lignée créée.

Devenir

Tous les animaux ayant servi à la création des deux lignées seront mis à mort à l’exception des mâles vasectomisés qui pourront être réutilisés dans un autre projet les nécessitant.

Remplacement

Le développement embryonnaire précoce implique de nombreuses interactions cellulaires entre les tissus embryonnaires, extra-embryonnaires et l’environnement utérin maternel. La validation de facteurs identifiés in silico et in vitro dans des lignées cellulaires nécessitent de recourir à l’animal pour valider sa fonction dans ce système complexe, impossible à recréer aujourd’hui in vitro.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire au projet a été optimisé pour permettre la production de deux lignées mutantes pour un gène d’intérêt. Ce nombre est basé sur l’expérience du laboratoire pour la production de lignées de souris transgéniques avec ces outils et à l’aide des principes généraux fournis par le guide européen « animaux génétiquement altérés » pour la procédure d’évaluation du bien-être animal des deux lignées créées.

Raffinement

Toutes les souris (mâles, femelles et juvéniles) seront élevées en groupe avec un enrichissement dédié dans chaque cage (maison en carton et coton). Elles seront nourries et abreuvées ad libidum. Si de l'agressivité entre les mâles est observée, ceux -ci seront isolés dans des cages en plastique transparent permettant un échange visuel avec les congénères des cages à proximité. Les souris mâles adultes vasectomisées utilisées pour les accouplements seront hébergés avec des femelles de compagnie (souvent de vieilles femelles) dans des cages en plastique transparent permettant un échange visuel avec les congénères des cages à proximité. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée pour évaluer leur bien-être et en cas de douleur suspectée par l’évaluation quotidienne des animaux, une injection d’analgésique sera administrée en sous-cutanée. Des analgésiques seront administrés en pré-opératoire et si besoin en post-opératoire. Du gel sera appliqué pour éviter tout dessèchement oculaire au cours des interventions chirurgicales. Les interventions chirurgicales seront réalisées sur un tapis thermorégulé afin d’éviter toute hypothermie. Des points limites décrits dans les procédures expérimentales seront appliqués afin d’éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La souris est le mammifère modèle pour la réalisation d’invalidation génique par édition des génomes. Les protocoles sont bien maitrisés et le développement embryonnaire extrêmement bien caractérisé. Enfin nous avons montré que le gène étudié était exprimé dans les cellules pluripotentes embryonnaires de souris, non encore spécialisées, tout comme les autres espèces de mammifères étudiés (porc, bovin, humain, mouton). L’utilisation du modèle souris est donc pertinente pour étudier la fonction de ce gène au cours du développement précoce (embryonnaire et fœtal) des mammifères. Pour la production de la lignée génétiquement modifiée, nous utiliserons des souris adultes mâles et femelles. Pour la caractérisation de la lignée nous utiliserons des souris nouveau-nés à adulte.