Souris

126 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées, 114 dans des procédures d'un niveau de souffrance modérée et 12 dans des procédures légères. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, dix-huit administrations par voie orale d'un premier anticancéreux, quatorze injections dans l'abdomen d'un second, une injection intraveineuse derrière l'œil sous anesthésie, et sa tumeur est mesurée au pied à coulisse jusqu'à sept fois par semaine. Le projet est réalisé pour un client dont la molécule, couplée à un élément radioactif, doit détruire les cellules cancéreuses. Le porteur écrit que le nombre d'animaux par groupe est déterminé par ce client, et qualifie le candidat médicament de "connu pour ne pas présenter d'effets délétères".

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles murins sont encore aujourd’hui indispensables en oncologie notamment pour comprendre la physiopathologie de ces maladies, trouver des thérapeutiques innovantes et évaluer leur efficacité. L’utilisation de radiopharmaceutiques (candidats médicaments détruisant les cellules cancéreuses quand il est apporté à la tumeur) est une nouvelle approche thérapeutique prometteuse. Notre projet vise à quantifier l’efficacité de la molécule thérapeutique fournie par notre client couplé à un élément radioactif pour le traitement de souris greffées avec des cellules cancéreuses. Ce traitement sera combiné à deux autres traitements anticancéreux complémentaires de la molécule thérapeutique et déjà utilisés en clinique humaine. Le but est d’évaluer le retard de croissance tumorale ou sa régression, ainsi que la toxicité éventuelle de l’association proposée. La molécule testée doit viser spécifiquement les cellules tumorales pour permettre à l’élément radioactif d’y accéder et de les détruire. Les deux anticancéreux permettent soit d’empêcher la réparation des cellules cancéreuses soit d’empêcher la croissance tumorale et potentialisent donc l’action de la molécule de notre client. Le candidat médicament, dilué dans un liquide respectant la physiologie de l’animal, a été testé chez notre client et est connu pour ne pas présenter d’effets délétères. Dans les essais de toxicologie préclinique, les deux anticancéreux ont montré des effets sur les paramètres hématologiques et biochimiques qui sont réversibles à la dose utilisée dans notre projet.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de tester l’efficacité de la molécule thérapeutique de notre client couplée à un élément radioactif. Ce traitement sera combiné avec deux autres traitements anticancéreux complémentaires de la molécule thérapeutique. Le but est de trouver une nouvelle piste thérapeutique ciblée pour les cancers de type épithélial afin de la transférer en clinique en fonction de son efficacité et de sa toxicité éventuelle.

Procédures

Sur animal vigile : pesée (de 2 à 7 fois/semaine, 20 s) ; administration de composés thérapeutiques (Anticancéreux N°1 : per os, 18 fois et maximum 1 fois par jour, 15 s / Anticancéreux N°2 : intrapéritonéal, 14 fois et maximum 1 fois par jour, 15 s) ; greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (flanc droit, 1 injection, 15 s). Sur animal anesthésié : administration de la molécule thérapeutique en intraveineuse retro orbitale (1 fois, 10 s); prélèvement de sang terminal en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min)

Impact sur les animaux

Stress lié à l’anesthésie gazeuse ; stress et douleur modérés liés à l’administration des molécules en intraveineuse, par gavage oral ou en intrapéritonéal ; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ou les mesures de tumeurs au pied à coulisse ; stress (ou gêne éventuelle) ou douleur légère liée à la pousse tumorale.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux de la procédure lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : prélèvement d’organes ou de tumeur en cours de l’étude, atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animal, fin de l’étude.

Remplacement

Les cellules ont préalablement fait l’objet de tests de cytotoxicité avec des traitements seuls de la molécule et son élément radioactif de notre client et en combinaison avec au moins l’un des anticancéreux, à différentes doses. Cependant, afin d’évaluer plus finement l’efficacité de ces molécules, il est nécessaire d’être en présence d’un système biologique complexe. De plus, dans le cadre de notre projet, nous devons vérifier que la molécule thérapeutique cible les cellules tumorales et suivre sa distribution dans d’autres tissus où il n’est pas souhaitable qu’elle soit en trop grande quantité. Il n’est pas possible aujourd’hui de faire ce suivi in vitro. L’animal semble donc être le modèle le plus pertinent pour ce type de traitement.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés par groupe est déterminé par le client par des méthodes classiques statistiques en fonction des résultats préalables qu'il a obtenu avec sa molécule d'intérêt et du modèle tumoral sélectionné (homogénéité de la croissance des tumeurs sous-cutanées). Ce nombre est réduit au minimum utilisable afin d'obtenir des données statistiquement relevantes.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux sont surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles sont mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux de 6 par cage maximum dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Toutes les cages de nos animaux contiennent trois enrichissements : tunnel placé en hauteur ou en bas en alternance, frisottis et coton ou buchette alternativement. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie éventuelle et de préhension des animaux. Les injections intrapéritonéales seront faites avec l’aiguille la plus petite possible : une seringue à insuline 30 gauge par animal. Les injections per os seront faites avec une canule en plastique souple par animal. Les groupes recevant les traitements répétés feront l'objet d'une vigilance particulière sur les points limites décrits pour chaque administration. Enfin, les souris immunodéprimées seront hébergées dans des zones sanitairement contrôlées.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies anti-cancéreuses. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 6 et 7 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est décrit comme mature.

76 souris seront transférées vers un autre projet, le porteur estimant le stress subi ici négligeable, et les autres seront tuées pour analyse de leurs tissus. 166 souris vont être utilisées au total, 52 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 114 dans des procédures modérées. Certaines sont opérées pendant deux heures à deux heures trente puis reçoivent trois injections, d'autres tiennent le rôle de souris stimulus et restent enfermées sous une coupelle pendant quatre séances de dix minutes, immobilisées, pendant qu'une congénère est observée. L'objet déclaré est de comprendre les bases neurobiologiques des difficultés sociales dans un modèle murin d'autisme, un travail que le porteur relie à l'inclusion des personnes neurodivergentes dans la société.

Objectifs

L’autisme est une condition neurodéveloppementale qui touche environ 3 % des enfants. Les déficits de la cognition sociale en constituent l’une des caractéristiques fondamentales et incluent, par exemple, une difficulté à accorder une importance appropriée aux signaux sociaux. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre les bases neurobiologiques de ces altérations, afin de favoriser une compréhension approfondie de ces troubles et de proposer des approches thérapeutiques susceptibles d’améliorer la cognition sociale ainsi que l’intégration des personnes autistes dans la société.

Bénéfices attendus

L’autisme touche environ un enfant sur 31. Il s’agit d’une condition permanente ayant un impact significatif sur l’intégration sociale, professionnelle et éducative tout au long de la vie des personnes concernées. Une meilleure compréhension des modifications neurobiologiques à l’origine des difficultés spécifiques rencontrées par les personnes autistes pourrait conduire à de nouvelles approches thérapeutiques visant à atténuer les symptômes ou à en améliorer la prise en charge. Ces interventions pourraient avoir un effet positif sur la qualité de vie des personnes autistes ainsi que sur celle de leurs familles. Ce projet s’intéresse aux déficits en communication sociale, qui constituent l’une des caractéristiques diagnostiques principales de cette condition. Il offre ainsi l’opportunité de mieux comprendre l’autisme et de contribuer à l’enrichissement des connaissances sur la manière dont notre société peut devenir plus inclusive et accueillante envers les personnes neurodivergentes.

Procédures

Les animaux seront soumis à un test comportemental d’une durée de 22 minutes. Certains d’entre eux subiront une intervention chirurgicale d’une durée comprise entre 2 heures et 2 h 30, ainsi que des injections répétées (trois injections d’environ 20 secondes chacune). Par ailleurs, certains animaux seront confinés dans une coupelle pendant le test, pour un maximum de quatre séances de 10 minutes chacune, soit un temps total maximal de 40 minutes.

Impact sur les animaux

Certains animaux subiront une intervention chirurgicale susceptible d’entraîner une altération temporaire du bien-être dans les heures ou les jours suivant l’opération. Les effets indésirables potentiels incluent un inconfort, une fatigue, une douleur transitoire, un risque d’infection et une perte de poids. Ces animaux recevront également trois injections, chacune impliquant une contention de courte durée (20 secondes). Cette contention peut induire un stress modéré. Par ailleurs, certains animaux seront utilisés comme souris stimuli dans le cadre du test de préférence sociale. Cela implique leur confinement dans une zone restreinte à l’intérieur d’une coupelle pendant toute la durée de chaque session (10 minutes). Ce confinement limite leur capacité à se déplacer librement, ce qui peut également constituer un facteur de stress modéré.

Devenir

Certains animaux seront réutilisés dans le cadre d’un autre projet, le niveau de stress engendré par la procédure étant considéré comme négligeable. D’autres seront mis à mort, et leurs tissus seront utilisés pour des analyses anatomiques.

Remplacement

Notre projet porte sur les altérations des circuits neuronaux affectant la communication sociale dans un modèle de maladie neuropsychiatrique. Pour cela, nous avons besoin d’un organisme intact, capable de riches échanges sociaux tels qu’on les observe chez les espèces mammifères. Nous avons également besoin de circuits neuronaux fonctionnels et d’une organisation cérébrale comparable à celle des sujets humains. Pour ces raisons, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences sur des organoïdes ou des cellules isolées. Il n’est pas non plus possible de mener ces études chez une population clinique, en raison de la nécessité d’approches invasives. Les rongeurs sont évolutivement proches des humains, et les souris, en particulier, sont largement utilisées en neurosciences car elles sont sensibles aux modifications génétiques. De plus, il existe des paradigmes comportementaux bien établis qui nous permettent de comparer notre travail à celui d’autres laboratoires. Nous ne pouvons pas non plus utiliser des animaux d’une sensibilité moindre (comme les mouches), car ils ne possèdent pas la complexité des réponses comportementales sociales requises pour explorer cette problématique.

Réduction

La conception expérimentale rigoureuse de notre projet permettra de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaires à l’exploitation statistique des résultats. Pour estimer ce nombre de manière précise, nous avons sollicité l’avis d’experts et consulté la littérature scientifique dans le domaine. Par ailleurs, nous avons intégré des études pilotes dans notre plan expérimental, afin d’évaluer la faisabilité technique de certains aspects du projet.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l’état de l’animal avant et après chaque expérience ou manipulation. iii) Perfectionnement des procédures chirurgicales afin de réduire les risques de douleur ou de souffrance : utilisation d’un gel oculaire pour prévenir le dessèchement des yeux, et d’un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle. Utilisation systématique d’anesthésiques et d’analgésiques lors de chaque intervention chirurgicale. iv) Mise en place de soins préventifs en post-opératoire : administration de sérum physiologique, distribution de nourriture humide déposée au sol de la cage. v) Habituation préalable à la salle de comportement. vi) Hébergement en groupe avec mise à disposition de matériel de nidification. vii) Définition de points limites spécifiques et de mesures conservatoires pour chaque phase de la procédure. viii) Intégration continue des techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de ressources pédagogiques en bien-être animal, et sollicitation d’experts du domaine.

Choix des espèces

Notre projet porte sur les altérations des circuits neuronaux affectant la communication sociale. Pour cela, nous avons besoin d’une espèce capable de riches échanges sociaux, tels qu’on les observe chez les mammifères. Nous avons également besoin d’une espèce présentant une organisation cérébrale similaire à celle des sujets humains. Les rongeurs sont évolutivement proches des humains, et les souris, en particulier, sont largement utilisées en neurosciences car elles sont sensibles aux modifications génétiques. De plus, il existe des paradigmes comportementaux bien établis qui nous permettent de comparer notre travail à celui d’autres laboratoires. Âge des animaux utilisés : Pour le test de préférence sociale : des animaux adultes (8 à 10 semaines) seront utilisés. Cet âge a été choisi afin d’assurer la cohérence avec les études antérieures, et parce que les circuits neuronaux sont matures à ce stade. Pour les interventions chirurgicales : les animaux seront opérés entre 5 et 7 semaines, afin de permettre une récupération complète avant les tests comportementaux, et pour des raisons techniques liées à la manipulation des circuits neuronaux.

Les souris qui n'ont pas le génotype recherché et les couples en fin de reproduction sont tués, comme les animaux entrés en procédure, dont les reins et le cœur sont prélevés après la mort. 2 043 souris vont être utilisées, 1 443 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 600 dans des procédures modérées. Ces souris forment spontanément des calculs de cystine, et 600 mâles subissent des recueils d'urine répétés jusqu'à treize fois, seize heures en cage métabolique sans nourriture, un gavage quotidien pendant deux semaines, pour certaines l'ablation d'un rein sous anesthésie. Le porteur précise que les animaux seront utilisés entre six et dix semaines, avant l'apparition vers six mois des calculs qui rendent leur état douloureux.

Objectifs

La cystinurie est une maladie génétique responsable de lithiase récidivante. La lithiase désigne la formation de calcul/concrétion solide dans les cavités rénales (dans les voies urinaires). Cette maladie touche près d'une personne sur 7000 mais représente la principale cause de lithiase génétique chez le sujet jeune et l'enfant. Cette maladie est causée par la mutation de transporteurs rénaux d'acides aminés (tel que la cystine) qui les empêche d'être réabsorbé de l'urine. La cystine se retrouve alors en quantité excessive dans l'urine et finit par précipiter sous forme de calculs urinaires (lithiase). L'obstruction causée par ce calcul est responsable de la crise de colique néphrétique. La répétition de ces crises de colique néphrétique peut conduire à une insuffisance rénale chronique, voire à la mise en dialyse dans les cas les plus sévères. La thérapeutique actuelle est insuffisante et repose essentiellement sur l'alcalinisation des urines, l'augmentation de la diurèse et sur l'utilisation de médicaments liant la cystine (D penicillamine, tiopronine) mais exposant les patients à des effets indésirables parfois sévères. Suite à l'apparition d'une mutation spontanée sur les transporteurs d'acide aminé urinaire dans un élevage, il existe un modèle murin présentant des lithiases de cystine comparables aux lithiases décrites chez l'homme. Cependant, elles ne font pas de colique néphrétique car les calculs se trouvent dans la vessie uniquement. Notre objectif est de prouver dans ce modèle murin, que l'alcalinisation urinaire est efficace dans la prévention des récidives de calculs cystinuriques et de déterminer quel traitement alcalinisant est le plus efficace.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce travail est de montrer que l'utilisation des nouveaux traitements peut permettre de réduire l'activité lithiasique chez les patients cystinuriques. Ces traitements pourraient permettre d'améliorer significativement la qualité de vie des patients cystinuriques et réduire le risque d'insuffisance rénale voire de mise en dialyse. Les procédures permettront de déterminer quel traitement est le plus efficace pour alcaliniser les urines, pour prévenir la précipitation de la cystine chez des souris sans dégradation de la fonction rénale et chez des souris rendues insuffisantes rénales.

Procédures

Les animaux utilisés pour ces procédures sont des souris cystinuriques. C’est-à-dire qu’elles forment spontanément des cristaux de cystines. L'accumulation de ces cristaux peut entraîner la venue de calculs urinaires conduisant au phénotype dommageable de ces souris. Cependant, les animaux seront utilisés à partir de 6-10 semaines, et les protocoles durant 4-6 semaines ou jusqu'à 3 mois, les souris n'auront pas encore développé ce phénotype dommageable survenant après 6 mois. Dans le cadre du génotypage d'une partie de ces animaux, les souris seront soumises au prélèvement d'une petite partie distale de la queue. Ce prélèvement ne dure que quelques secondes sur des souris vigiles. Les animaux seront soumis à des recueils urinaires soit par émission spontanée d'urine (technique du spot urinaire qui ne dure que quelques secondes), soit par recueil en cage métabolique de 16h (1 seule fois pendant la procédure). Les spots urinaires seront répétés de façon hebdomadaire : une ou deux fois par semaine durant 4 ou 6 semaines ou 3 mois, soit respectivement 4, 6, 8 ou 13 fois. Ces recueils sont effectués sur animal vigile. Certains animaux seront soumis à une chirurgie rénale réalisée sous anesthésie générale associé à une analgésie pré et post-opératoire (néphrectomie, chirurgie durant 25min). Certains animaux seront soumis à un gavage (procédure réalisée sur animal vigile, ne durant que 10 secondes) de façon quotidienne pendant 2 semaines soit 14 fois. A la fin de la période de maintien prévue, les animaux seront soumis à un unique prélèvement sanguin sous anesthésie générale puis d’une euthanasie, suivie des prélèvements nécessaires aux différentes analyses (rein, cœur, ...).

Impact sur les animaux

Le phénotype des animaux n'est pas dommageable avant un âge de plus de 6 mois, lorsque les calculs sont en nombre importants. Les expérimentations seront donc réalisées avant que ce phénotype apparaisse. Le prélèvement à la queue induit une brève douleur lors du prélèvement et un saignement est possible ainsi qu'une éventuelle infection au niveau du site de prélèvement. Toutes manipulations quotidiennes de l'animal peuvent induire un stress chez ce dernier, mais en particulier le recueil d'urine en cage métabolique, et le gavage. Le gavage oral peut être source d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris, de même qu'il peut occasionner des fausse-routes correspondant à l'administration involontaire du produit dans les voies aériennes. Concernant la chirurgie, il y a un risque de surinfection lié à la chirurgie, mais qui est relativement rare car tous les instruments chirurgicaux sont nettoyés et stérilisés avant chaque intervention. De plus, la chirurgie peut induire des douleurs à l'animal provoquées par la procédure (injections analgésie et anesthésie, ouverture des plans cutané et musculaire, sutures), des complications liées à l'anesthésie chimique (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire , stress thermique), une altération de l'état général de l'animal tel que la perte de poids ou la déshydratation, un stress de l'animal lié à l'hébergement individuel et privation d'aliment pendant 16 heures.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux expérimentaux par une méthode réglementaire. Les animaux qui n'auront pas le génotype requis pour les procédures ainsi que les couples en fin de reproduction seront euthanasiés par une méthode réglementaire

Remplacement

Une partie des données seront obtenues par des analyses in vitro. Nous étudierons ainsi la cinétique de dissolution des cristaux de cystine in vitro en alcalinisant des urines de patients jusqu'à la disparition des cristaux. Toutefois ces données seront insuffisantes pour mener à bien le projet. En effet, chez les patients et chez les souris, la quantité d'espèce alcaline excrétée dans l'urine n'est pas le reflet direct de la quantité apportée par voie orale. Autrement dit, même si nous montrons que l'alcalinisation directe des urines permet de réduire la précipitation de la cystine, il restera à prouver que l'apport d'alcalin par voie digestive peut effectivement faire varier favorablement le pH urinaire. Pour cela, le recours aux animaux est indispensable

Réduction

Le nombre minimal d'animaux par expérience a été calculé à partir des données déjà connues dans ce modèle et grâce à un calcul de puissance permettant de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux prévu est de 600 souris mâles de 6 à 10 semaines pour les procédure expérimentales. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Le nombre d'animaux prévu est de 2043 pour l'élevage, incluant les 600 souris mâles utilisés pour l'expérimentation. La production et donc l’élevage des souris sera adapté aux besoins des différents protocoles. Les souris pourront être cryo-préserver s’il n’y a plus de procédure en cours.

Raffinement

Concernant l'hébergement, le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments de différentes tailles permettant aux animaux de les décompacter, et grâce à des morceaux de bois à ronger. Les animaux sont observés quotidiennement. Si une agressivité est observée, des abris seront placés dans la cage, notamment au décours des cages métaboliques. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter tout signe de douleur. Les animaux seront pesés chaque semaine. Les critères d’arrêt sont la prostration, ou la perte de poids. Les gestes invasifs, à l'exception du gavage qui nécessite que l'animal soit vigile pour ne pas induire de fausse route, seront réalisés sous anesthésie/analgésie, et un suivi post-opératoire sera réalisé. Tous les autres gestes comprenant le recueil d'urine ne sont pas invasifs. Les animaux seront habitués aux cages métaboliques et aux contentions pour le gavage.

Choix des espèces

Le modèle utilisé est un modèle murin de cystinurie déjà existant suite à la survenue spontanée d'une mutation dans un transporteur rénal d'acide aminé. Ces souris sont viables, n'ont pas de phénotype dommageable dans les premières semaines de vie. Un élevage de ce modèle sera mis en place et constitué exclusivement d'animaux homozygotes pour la mutation et ne présentant pas de phénotype dommageable avant l’âge de 6 mois. Nous utiliserons des souris de 6-10 semaines, âge à partir duquel des cristaux sont analysables chez les souris mutantes, mais bien avant l'apparition d'un phénotype dommageable (lithiase urinaire) qui occure après 6 mois. Nous utilisons régulièrement le modèle in vivo murin et possèdons donc tous les outils nécessaires à l'élevage et l'utilisation de ce modèle.