Souris
Étude de voies moléculaires et nouvelles cibles thérapeutiques dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Deux modèles de colite doivent mimer les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin pour tester une enzyme candidate au statut de médicament. 600 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever des organes entiers. Les donneuses reçoivent cinq injections intrapéritonéales en cinq jours sur animal vigile, les receveuses une injection puis, deux jours plus tard, soit un agent dans l'eau de boisson pendant sept jours, soit un agent par voie rectale sous anesthésie. Le porteur estime la colite modérée compte tenu des points limites retenus, avec un score de sévérité relevé chaque jour et un suivi de la prise hydrique et alimentaire.
Objectifs
Les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) sont caractérisées par une inflammation intestinale inappropriée. Elles représentent un fardeau majeur pour les populations occidentalisées. En effet, leur incidence et prévalence ont augmenté de façon spectaculaire au cours des dernières décennies. Les thérapies actuelles ne sont que partiellement efficaces et principalement basés sur des immunosuppresseurs (médicaments affaiblissant le système immunitaire). Celles-ci sont associés à des effets secondaires, notamment des infections et des cancers. Il est donc urgent de mieux comprendre leur origine et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons observé chez les patients atteint de MICI, une altération dans l’une des voies métaboliques qui est directement corrélée à l’inflammation. L'hypothèse principale du projet est de caractériser l'effet de notre enzyme d’intérêt dans les MICI afin de pouvoir développer l’enzyme humaine comme un candidat thérapeutique. Ces résultats ouvriront la voie au développement de nouveaux traitements pour les MICI.
Bénéfices attendus
Ce projet est dans la continuité d’un programme de recherche complet et ciblé sur le métabolisme dans le contexte de la santé et des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). En France, ces maladies touchent environ 300 000 personnes (données 2021), ce qui en fait un enjeu majeur de santé publique. L’approche que nous proposons est entièrement nouvelle, fondée sur des découvertes récentes concernant le rôle de certains métabolites dans les processus inflammatoires. Elle repose sur la modulation de voies métaboliques altérées dans les MICI, avec pour objectif de restaurer la production de métabolites anti-inflammatoires et de réduire celle des métabolites pro-inflammatoires. Ce projet est multidisciplinaire, à l’interface de l’immunologie et du métabolisme. Les études menées devraient permettre de mieux comprendre les mécanismes pathologiques impliqués dans les MICI, tout en ouvrant la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques transposables chez l’homme.
Procédures
Les souris donneuses seront soumises à un traitement par injections afin d’induire la modification génétique, à raison d’une injection par jour pendant 5 jours soit un total de 5 injections par souris. Les injections seront effectuées sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. Les souris receveuses seront soumises à une injection unique sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. Deux jours plus tard, ces mêmes animaux seront impliqués dans l’un des deux modèles de colites mimant les aspects des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). Une partie sera exposée à un agent dans l’eau de boisson pendant 7 jours puis replacée en eau standard durant 5 jours. Une seconde partie sera exposée à un agent par voie rectale (par voie naturelle) sous anesthésie générale à raison de quelques minutes. Afin de vérifier la composition du microbiote, les selles fraiches de chaque animal seront recueillies régulièrement sans contrainte pour l'animal. Les animaux seront simplement placés dans des pots transparents permettant aux animaux de bouger librement, et après quelques minutes (maximum 5 minutes) les animaux produisent des fèces spontanément. Afin de vérifier l’état métabolique des souris, les animaux subiront un prélèvent de sang de faible volume sur animal vigile par simple contention par une personne formée avec un matériel adapté en moins de 30 secondes. Les animaux seront ensuite euthanasiés selon une méthode réglementaire au temps prévu pour effectuer les différents prélèvements nécessaires pour répondre aux questions scientifiques du projet.
Impact sur les animaux
L’induction du modèle génétiquement modifié utilisé dans ce projet comme souris donneuses reposent sur une injection intrapéritonéale tous les jours pendant 5 jours pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection pour les animaux. Aucun effet secondaire n’a été décrit dans la littérature pour cette administration. Il existe un risque (faible) d’inflammation abdominale ou de péritonite. Les souris receveuses auront une injection unique pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection puis seront soumises à une colite induite expérimentalement. Les modèles de colites sont associés à des effets indésirables attendus liée à l’inflammation intestinale. On peut estimer que son intensité sera légère à modérée au maximum. Pour l’un des modèles de colite, une anesthésie est nécessaire et pourrait induire dans de rare cas, une mauvaise réaction (stress thermique, difficulté respiratoire, arrêt cardio-respiratoire). Nous réalisons des recueils réguliers de selles fraiches sans contrainte (animal libre de ses mouvements) qui ne devraient pas induire de nuisance ou tout au plus un léger stress lié au changement d’environnement durant quelques instants. Nous réaliserons également un prélèvement sanguin de faible volume pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie.
Remplacement
Malgré le développement et l’utilisation en première intention de modèle non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation normale et inflammatoire. A l’heure actuelle il n’est donc pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu, un modèle animal est donc de ce fait totalement indispensable.
Réduction
Ce projet impliquera donc un maximum de 600 animaux. Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Devant la variabilité biologique inhérente à ce type d’expérience, les expériences seront réalisées deux à trois fois pour s’assurer de la robustesse des résultats obtenus. Néanmoins nous ne répéterons l’expérience que si les résultats vont dans le sens de l’hypothèse de travail et que la puissance statistique n’est pas encore atteinte. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, suivi, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (grille de suivi, point limite) et des soins adaptés. La principale contrainte dans le cadre de ce projet est liée à la colite induite expérimentalement et aux signes cliniques qui y sont associés. Néanmoins, nous disposons d’une très grande expérience de ce type de modèle et assurons un suivi quotidien associé à un scoring de la sévérité de la colite permettant une prise de décision immédiate en cas d’aggravation des symptômes. Dans ce projet, la colite est estimée comme étant modérée compte-tenu des points limites mis en œuvre. En complément nous suivons également, la prise hydrique et alimentaire et l’aspect général des animaux quotidiennement. Pour les administrations, nous utilisons du matériel adapté (petite taille) afin de réduire au maximum la contrainte. De plus, les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.
Choix des espèces
Justification de l’espèce/modèle : La souris est une espèce de référence en immunologie, microbiologie et métabolisme, qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris non transgéniques mais également des lignées transgéniques (toutes sur le même fond génétique). Justification des stades : Les souris seront utilisées à l’âge adulte, entre 6 et 12 semaines de vie. Cet âge est couramment utilisé dans la littérature pour les modèles de colites.
Étude de l’activation des mastocytes sur l’activité sécrétrice des plexus choroïdes et sur le développement de la fonction du cerveau
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
4 003 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, certaines femelles gestantes subissant une laparotomie de quarante-cinq minutes suivie d'injections toutes les douze heures pendant deux jours en cas de douleur. Des nouveau-nés sont injectés directement dans le cerveau. Les souris menées jusqu'à l'âge adulte passent trois tests cognitifs de vingt minutes sur une à trois semaines, avant une chirurgie terminale sans réveil par perfusion, l'objet étant de savoir comment une réaction allergique induite après la naissance modifie les plexus choroïdes et le développement du cerveau. Le porteur justifie les effectifs par des groupes de cinq à sept animaux répétés en triplicat sur cinq stades de développement, sans détailler comment on parvient à 4 003 animaux.
Objectifs
Le cerveau a longtemps été considéré comme virtuellement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l'émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, notamment par les cellules immunitaires. Parallèlement, certaines barrières du cerveau ont été identifiées comme des interfaces de dialogue croisé actif entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières inertes.
Bénéfices attendus
Cette analyse permettra de mieux comprendre comment la mise en place physiologique du système immunitaire après la naissance façonne le développement de la fonction cérébrale via les cellules étudiées. Plus particulièrement, le but de notre projet est d’identifier comment une réaction inflammatoire de type allergique au cours du développement post-natal, modifie la physiologie des cellules étudiées, altère la composition de certains tissus et entraîne l’apparition de maladies neurodéveloppementales. Cette étude devrait permettre une meilleure compréhension de la biologie de cette interface barrière que sont les cellules étudiées et qui reste encore très peu étudiée, particulièrement au cours du développement après la naissance. Cette analyse permettra d’identifier les facteurs produits par les cellules étudiées et potentiellement impliqués dans la modulation de l’activité cérébrale au cours d’une réponse de type allergique et favoriser à terme la mise au point d’immunothérapie permettant de mieux lutter contre les maladies neurodéveloppementales.
Procédures
Une injection (quelques secondes) sera réalisée aux souris 16h avant une autre injection (quelques secondes). Une laparotomie sur femelles gestantes (environ 45 min de chirurgie) sera réalisée sous. A leur réveil, de nouvelles injections seront réalisées 6h après l’intervention puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur. 1 à 3 injections de quelques secondes seront réalisées en l’espace de 24h. Sur certains des animaux une injection supplémentaire de quelques secondes aura été réalisée 6 jours auparavant. Les animaux maintenus jusqu’à l’âge adulte seront testés pour leur capacité cognitive (30min-1h/jour). Trois tests de 20min chacun seront réalisés, à raison d’un test maximum/jour sur une période d’1 à 3 semaines. A la fin de la procédure, dans les heures suivants la dernière injection ou plusieurs semaines plus tard, la procédure s’achèvera par une dernière injection. Des injections dans le cerveaux des nouveaux nés seront réalsiées. Une chirurgie terminale sans réveil sera réalisée (perfusion).
Impact sur les animaux
Les injections en elles-mêmes pourront causer un peu de stress aux animaux mais peu ou pas de douleur. L’induction d’une inflammation de type allergique par les molécules injectées pourront augmenter le niveau d’anxiété des animaux dans la première demi-heure après injection ainsi qu’une légère hypothermie avant de revenir à la normale au bout d’une heure. Les chirurgies pourront s’accompagner d’une douleur légère à modérée pendant 4 à 5 jours, d’un inconfort et d’une légère augmentation du stress des animaux. Les tests comportementaux réalisés sur animaux adultes entraineront peu ou pas de stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par à la fin de chaque procédure soit pour la dissection des tissus afin de répondre aux questions scientifiques posées dans cette proposition, soit car les effets de la procédure que les animaux ont subie pourraient potentiellement introduire une variabilité indésirable/confondre les résultats de toute étude ultérieure.
Remplacement
Notre but est d’étudier comment certaines cellules agissent sur le développement du cerveau après la naissance. Le recours à l’animal est nécessaire car il n’existe aucun système in vitro qui puisse reproduire la complexité cellulaire de l’interface barrière du cerveau que nous étudions : les cellules étudiées sont en effet composées de plusieurs types cellulaires et tissus en intéraction. De plus, la fonction sécrétrice de l’épithélium des cellules étudiées est modulée par l’activation des cellules que nous cherchons à étudier varie avec l’âge et la réponse immunitaire locale et périphérique, et est spécifique de la première semaine après la naissance et ne peut être reproduites et étudiée in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu dans ce projet se base sur notre précédente expérience et des tests statistiques. Un des tissus étudiés est très petit et ne peut être utilisé que pour une seule analyse à la fois. Les analyses de la composition d’autres tissus et zones d’intérêt du cerveau pourront cependant être réalisées sur les même animaux qui auront au préalable été impliqués dans des tests de comportement (animaux maintenus jusqu’à l’âge adulte). Nous prévoyons pour chaque groupe de souris nouveau-nées 5 animaux par analyse, et 7 animaux adultes pour les tests de comportement, mâles et femelles. Des tripliquas d’expérience seront réalisés, à l’exception de certaines analyses pour lesquelles nous avons observé que 5 animaux par groupe permettaient l’acquisition de résultats significativement solides. Certaines études seront réalisées en comparant 5 stades de développement (5 variables). Les effectifs proposés (5x3 individus par groupe) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet forte à très forte. L’étude de certains effets sur l’activité du cerveau sera réalisée selon les cas en comparant 2 variables (5x3 individus par groupe seront néecessaires) ; en comparant 4 variables et 6 variables (5x3 individus par groupe nouveaux nés ou 7x3 individus par groupe adulte seront nécessaires).
Raffinement
Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Des points limites spécifiques et précoces sont appliqués pour chaque protocole, pour l’ensemble des protocoles de chirurgies sous anesthésie, et nous rechercherons à minimiser la douleur par injection d’antalgiques, ajout de gel hydrique, par un réchauffement continu des animaux, et par des solutions de réhydratation maintenues à la température corporelle. Nous renforcerons également l’enrichissement des cages. Nous surveillerons l’utilisation des cotons, et l’état de la nidification le cas échéant sous les dômes en carton.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives car de nombreuses lignées sont disponibles et est génétiquement modifiable. Elle est facile à élever et ses grandes capacités de reproduction facilitent les études sur embryons et nouveau-nés. La souris permet également l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Le nombre des cellules étudiées évoluant après la naissance, nous étudierons leur phénotype à différentes périodes du développement post-natal, de la naissance à l’âge du sevrage : P0/P1, P6, P10, P15 et P21. Le phénotype induit par nos expériences n’est analysable qu’au minimum 6-7 jours après injection. Afin d’étudier l’effet sur le développement du cerveau, nous injecterons des souris embryonnaires au stade E14-15 afin d’en étudier les effets chez les souris âgées de 0 à 2 jours, puis chez l’adulte enfin d’en étudier les effets à long terme sur la fonction cognitive.
Impact de l’immunité sur l’invasion intratumorale des bactéries dans le cancer du pancréas [MODIFICATION]
- Recherche fondamentale
- Oncologie
576 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour mettre leurs tumeurs en culture et y chercher des bactéries. Chacune peut subir une greffe de cellules tumorales pancréatiques par chirurgie, une à cinq prises de sang sous anesthésie, jusqu'à huit gavages, sept injections et quinze séances d'imagerie de vingt minutes. Le porteur reconnaît que la croissance d'un adénocarcinome pancréatique peut entraîner douleurs, troubles digestifs et ascite, et que la déplétion des cellules immunitaires augmente les risques d'infection. Sur le remplacement, il écrit ne disposer d'aucune alternative parce que le modèle est encore trop récent dans son laboratoire, en évoquant des organoïdes pour de futures expériences.
Objectifs
Le cancer du pancréas est généralement associé à un taux de survie relativement bas par rapport à d'autres types de cancer. Cette situation s'explique par plusieurs facteurs, notamment le diagnostic tardif, la nature agressive de la maladie et le manque de traitements efficaces dans les stades avancés. Le pancréas joue un rôle clé dans la digestion, en libérant des enzymes digestives, et dans la régulation de la glycémie, un élément crucial du métabolisme des glucides. Les traitements actuels pour le cancer du pancréas incluent la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie, les thérapies ciblées et l'immunothérapie, mais leur efficacité dépend du stade de la maladie. L'immunité innée et acquise protège généralement l'organisme, y compris contre les bactéries qui peuvent envahir les tumeurs. Dans ce projet, des bactéries ont été trouvées dans des tumeurs pancréatiques, même si elles étaient en petit nombre, suggérant qu'elles ont survécu aux divers composants du système immunitaire (cellules dendritiques, macrophages, neutrophiles, cellules NK, lymphocytes B et T). L'analyse métagénomique a révélé la présence de plusieurs ADN bactériens (impactant négativement le traitement contre le cancer) non détectés en culture, suggérant que ces bactéries ont pu être éliminées par le système immunitaire du patient, affaibli par le cancer. Deux études utilisant la transplantation de microbiote fécal (FMT) chez des souris ont montré que la modulation du microbiote influence la réponse immunitaire et la progression tumorale. FMT a permis d'améliorer la réponse à l'immunothérapie et de réduire la croissance tumorale dans un modèle de cancer du pancréas. Cela renforce l'hypothèse selon laquelle les bactéries intratumorales jouent un rôle dans la progression du cancer. L'objectif n°1 du projet est de démontrer que, dans un modèle de souris où l'immunité est complètement déplétée, la tumeur sera plus envahie par les bactéries par rapport à une souris immunocompétente. La validation de la 1ère expérience nous a permis d’observer une invasion bactérienne plus importante au niveau de la tumeur, notamment d’une prénommée Staphylococcus epidermidis dont certaines souches sont commensales comme pathogènes. Alors, l’objectif de la 2ème partie de ce projet est de déterminer comment cette bactérie parvient de l’intestin jusqu’à la tumeur et d’étudier son impact sur le dévelopement tumoral et l’immunité associée.
Bénéfices attendus
Nous essayerons de comprendre ici si l’immunosurveillance, même affaiblie, empêche l’invasion bactérienne dans la tumeur. De plus, cela nous permettrait de mieux comprendre le rôle de l’invasion bactérienne dans le microenvironnement tumoral et son rôle dans la progression du cancer. Cela pourrait aider à identifier des biomarqueurs du statut immunitaire et orienter le développement de nouvelles thérapies, notamment en modulant le microbiome tumoral. Cette compréhension permettrait également d’optimiser l’utilisation de l’immunothérapie et de réduire les risques de complications infectieuses chez les patients. De plus, cela éclaire les interactions entre l’immunité et les bactéries, pouvant ainsi influencer la réponse aux traitements et les décisions cliniques.
Procédures
Les souris pourront avoir entre 1 et 5 prises de sang, sous anesthésie générale (durée 5 minutes). La greffe des cellules tumorales se fera par chirurgie sous anesthésie générale et analgésie et durera environ 5 min par souris. Le gavage oral dure moins d'une minute par souris et se renouvelle tous les 2 jours (nombre maximal = 8) . Des injections seront faites 7, 3 et 1 jour avant l'implantation de la tumeur et à 5, 9, 13 jours après l'injection de la tumeur, par injection (anesthésie locale, durée 10 secondes). Des animaux auront des séances d'imagerie sous anesthésie générale (n maximal = 15, durée 20 minutes).
Impact sur les animaux
Douleur post-opératoires : l'ouverture de la cavité abdominale peut entraîner des douleurs post-opératoires modérées. Le prélèvement des fecès implique d'isoler l'animal pour une très courte durée, cela peut provoquer un léger stress temporaire (inférieur à 3 minutes). Le gavage oral est un geste technique car il nécessite de faire passer une sonde jusqu'à l'estomac, une gêne légère sera ressentie par l'animal mais sera très passagère (durée inférieure à 10 secondes). La déplétion des monocytes, macrophages et neutrophiles accroît légèrement les risques d'infections, altère la réponse immunitaire, entraîne des perturbations métaboliques (sasn effet clinique) et augmente modérément les risques d'inflammation intestinale. La croissance d'un adénocarcinome pancréatique peut éventuellement entraîner des conséquences sévères (douleurs, problèmes digestifs, ascite).
Devenir
Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure, le but étant de cultiver les tumeurs pour évaluer la présence de bactéries intratumorales.
Remplacement
Nous n'avons pas de modèle de remplacement pour le moment, car ce modèle est encore trop récent dans notre laboratoire. Il est possible qu'à l'avenir, si le projet apporte des éclaircissements pertinents sur les cancers pancréatiques chez la souris (PDAC), nous générions des organoïdes afin de perfectionner les expériences futures. Actuellement, nous utilisons des anticorps déplétants, et dans ces conditions, un système vivant complet est nécessaire pour obtenir une déplétion efficace et observer les changements dans le comportement tumoral. Le principal problème étant que nous voulons savoir s'il y a également des bactéries communes dans l'intestin et les bactéries que nous trouverons dans le pancréas, dans ce cas-là, il est impossible à l'heure actuelle d'avoir un modèle nous permettant d'étudier cette possible interaction in vitro.
Réduction
Pour ces études, nous utilisons un modèle tumoral validé et déjà publié. Afin de mener à bien cette étude, nous avons prévu de regrouper les expérimentations de manière à minimiser le nombre d’animaux témoins. Le nombre d’animaux est rigoureusement contrôlé pour optimiser les ressources tout en garantissant des résultats fiables. Pour garantir la fiabilité des données, les expériences seront réalisées en triplicata indépendants, avec des groupes de 4 souris chacun. Cependant, si des différences très significatives sont observées lors de la première répétition, les groupes suivants seront réduits, ce qui permettra de limiter l'utilisation d'animaux, tout en maintenant la robustesse statistique des résultats. Ce plan d'étude concilie l'exigence éthique et scientifique en optimisant le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions garantissant leur bien-être avec enrichissement environnemental adapté. Une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant le début de l’expérimentation afin de réduire le stress des animaux et d'assurer leur adaptation à l'environnement de laboratoire. Une surveillance quotidienne permettra d’observer tout changement comportemental et, si nécessaire, de mettre en place des adaptations ou des traitements. Toutes les injections seront administrées sous anesthésie locale afin de minimiser la douleur. Les souris seront pesées régulièrement, au moins une fois par semaine. Les points limites précoces seront strictement respectés et des soins adaptés seront prodigués, en consultation avec le vétérinaire, pour garantir le bien-être des animaux tout au long de l'étude.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. La génétique est proche de celle de l’Homme et bien connue. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines, ce qui correspond à leur maturité sexuelle et assure une stabilité hormonale. Cet âge est optimal pour garantir une réponse biologique cohérente et réduire les variations liées aux fluctuations hormonales. De plus, leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui est essentiel pour l’étude de la progression tumorale et des réponses aux traitements, tout en permettant des interventions expérimentales sur une période prolongée.
Cinétique et sites d’expression en modèles murins des facteurs de Salmonella impliqués dans le double stress Cuivre/stress oxydatif
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Inoculées par voie orale avec Salmonella après mise à jeun, les souris de ce projet peuvent ressentir de la douleur dès le troisième ou le quatrième jour, avec prostration, yeux fermés et difficultés motrices. 855 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, l'un des deux modèles reproduisant une infection systémique létale, l'autre une gastroentérite après prétraitement à la streptomycine. Toutes sont tuées pour prélever des organes, mesurer la luminescence bactérienne et compter les bactéries, l'objet étant de localiser où et quand Salmonella exprime ses facteurs de résistance au cuivre et au stress oxydatif. Au chapitre du raffinement, le porteur indique que réduire la douleur liée à l'infection n'est pas possible sans modifier la cinétique des symptômes, que les cages ne contiennent que du papier absorbant et que les souris ne recevront pas de récompenses.
Objectifs
Salmonella enterica serovar Typhimurium est un microorganisme pathogène à large spectre qui est responsable de gastroentérites ou de fièvre typhoïde en fonction de l’hôte infecté. Le principal mode de contamination passe par l’ingestion d’aliments d’origine animale contaminés (viande, poisson, œufs, lait). Cette entérobactérie colonise l’intestin et elle est capable de franchir la barrière intestinale. Ensuite, elle va circuler dans le sang jusqu’aux organes systémiques, la rate et le foie. Tout au long de ce processus infectieux, Salmonella va pouvoir entrer dans les cellules du système de défense de l’organisme (système immunitaire). Ces acteurs de l’immunité vont mettre en place différents mécanismes pour éliminer cet agent infectieux. Parmi ces mécanismes, on retrouve (i) l’import de cuivre, (ii) la production de molécules oxydantes, (iii) l’acidification ou encore (iv) la production de peptides antimicrobiens (lysozyme). Le cuivre, bien qu’étant un métal de transition essentiel pour différents processus biochimiques, devient toxique à fortes concentrations. Les molécules oxydantes produites sont quant à elles capables d’endommager les composants cellulaires des bactéries comme l’ADN, les protéines ou les lipides, pouvant alors causer un dysfonctionnement cellulaire ou un ralentissement de la croissance, voire la mort cellulaire dans certains cas. Récemment, un mécanisme de régulation original dépendant de la présence concomitante de cuivre et d’une molécule oxydante a été identifié chez Salmonella. Ce mécanisme permet l'acheminement du cuivre vers des protéines cibles de la cellule. Cela laisse entrevoir la possibilité d'une action simultanée des deux stress durant l'interaction hôte-pathogène et une réponse concertée du pathogène. Le projet présenté ici vise à déchiffrer l'orchestration du double stress cuivre et stress oxydatif en modèles souris reproduisant la gastroentérite à Salmonella ou la fièvre typhoïde, ainsi que les mécanismes d'adaptation utilisés par Salmonella pour faire face à ces stress pendant le processus infectieux.
Bénéfices attendus
Les stress métallique et oxydatif font partie des principaux mécanismes antibactériens utilisés par les cellules immunitaires de l'hôte pour combattre les infections bactériennes. En général, chacune de ces contraintes est étudiée individuellement, soit du côté hôte pour identifier les systèmes impliqués dans leur production, soit du côté pathogène pour comprendre les systèmes moléculaires utilisés pour éviter, assimiler ou dégrader ces composés. Dans ce projet, nous proposons d'étudier deux stress dont la concomitance n’a jamais été décrite, ce qui est un projet ambitieux et original. Cette approche intégrée et unificatrice vise à équilibrer durablement et à optimiser la santé des personnes, des animaux et des écosystèmes. Elle tient compte du fait que la santé des humains, des animaux domestiques et sauvages, des plantes, et de l'environnement au sens large (y compris les écosystèmes) sont étroitement liés et interdépendants. La complémentarité des expertises des partenaires (microbiologie moléculaire et infection/biologie cellulaire) nous offre une occasion unique de caractériser et de déchiffrer la voie du double stress Cu/stress oxydatif in vitro et in vivo. A court terme, nos résultats permettront de mieux comprendre l'importance du cuivre et du stress oxydatif durant la réponse immunitaire innée de l'hôte et auront un impact sur une grande communauté de biologistes. Ce projet produira des résultats directs sous forme de nouvelles données scientifiques et de nouveaux outils. A plus long terme, notre projet fondamental ouvrira également la voie à l'élaboration de stratégies nouvelles pour cibler différentes grandes questions de santé publique [virulence bactérienne ; action biocide ; biocapteurs Cu et ROS (Reactive Oxygen Species) ; physiologie des neutrophiles et macrophages].
Procédures
- Mises à jeun : 2 x 4h à 24h d’intervalle pour le modèle gastroentérite et 1 x 2h pour le modèle d’infection systémique létale. - Traitement antibiotique : sur animal vigile – une partie des animaux – 1 fois – durée = 10 sec maxi - Inoculation de Salmonella : sur animal vigile – tous les animaux – 1 fois – durée = 10 sec maxi - Anesthésie : tous les animaux de la procédure 1 – plusieurs fois pour certains animaux – durée = 5 min maxi par anesthésie - Imagerie in vivo : sur animal anesthésié – tous les animaux de la procédure 1 – plusieurs fois pour certains animaux – durée = 5 min maxi - Euthanasie : tous les animaux
Impact sur les animaux
Les animaux sont susceptibles de ressentir de la douleur à partir du jour 4 p.i. dans le modèle d’infection systémique létale et au bout de 3 jours p.i. dans le modèle gastroentérite. Les nuisances possibles liées à l’infection sont : prostation, yeux fermés et difficultés motrices. Autres nuisances (stress) liées à l’expérimentation : contention, dépilation, mise à jeun de 2 ou 4h et gavage.
Devenir
Pour les 3 procédures, tous les animaux sont euthanasiés en fin d’expérimentation afin de pouvoir prélever différents organes, pour mesure de la luminescence, purification de cellules ou numération bactérienne.
Remplacement
Nous travaillons sur des interactions pathogènes/hôte visant à comprendre l’arsenal dont dispose Salmonella pour infecter ses hôtes. La caractérisation phénotypique d’un gène de virulence in vitro est essentielle mais elle ne permet pas de comprendre le rôle de ce gène dans la pathogénie. Par exemple, in vitro, le gène cueP est important pour la prolifération intracellulaire de Salmonella au moins dans le macrophage et la régulation de son expression suggère un rôle fort pour que Salmonella résiste à la réponse immunitaire mise en place par les cellules de l’hôte. Cependant, in vivo, nous n’avons aucune idée du/des organes dans lesquels il est exprimé, de sa cinétique d’expression chez les hôtes de Salmonella, des cellules qu’il cible. Il est donc important de connaître ces informations. Il n’y a pas de modèle de remplacement qui reproduise à la fois l’environnement rencontré par la bactérie dans chacun des organes et la réponse de l’hôte à l’infection qui sont des facteurs influençant l’expression des facteurs de virulence.
Réduction
Stratégie pour réduire le nombre d’animaux - Gènes étudiés : Tous les gènes d’intérêt ont fait l’objet d’une caractérisation in vitro avant de passer à l’expérimentation animale (études de prévalence des gènes chez des souches de Salmonella, caractérisation biochimique de la protéine, caractérisation phénotypique d’un mutant de ce gène). Le choix des gènes d’intérêt à tester in vivo est déterminé en fonction de cette caractérisation in vitro. - Choix de la voie d’inoculation : La voie orale est la seule qui est testée systématiquement car c’est la voie d’infection naturelle utilisée par Salmonella pour contaminer ses hôtes. De plus, nous regroupons chaque fois que cela est possible les gènes à tester dans une même expérience pour qu’un seul lot témoin négatif soit utilisé, et cela afin de réduire le nombre d’animaux. Etude statistique : pour la procédure 1, tout signal luminescent détecté chez un animal reflète l’expression du facteur de virulence testé chez cet animal à cet instant. Aucun test statistique n’est donc nécessaire ni pertinent. Pour la procédure 2, les données d’expression du gène d’intérêt par les bactéries dans les différents types cellulaires présents pour chaque organe étudié seront soustraites avec les données d’expression obtenues pour le lot témoin. Tout comme pour l’axe I, aucun test statistique ne sera effectué ici, le but étant d’identifier dans quel type cellulaire le gène d’intérêt est le plus exprimé. Pour la procédure 3, le nombre d’animaux a été calculé afin d’utiliser le minimum d’animaux permettant de mettre en évidence une différence significative entre les lots testés.
Raffinement
Dès l'arrivée des animaux à l’animalerie, une semaine d’acclimatation est prévue pour permettre l'adaptation des animaux à leur nouvel environnement. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Les animaux sont hébergés selon les conditions de l’établissement utilisateur agréé, en tenant compte de l’état physiologique des animaux et enregistrement de la température ambiante. Pour éviter les problèmes de luminescence parasite, uniquement du papier absorbant est utilisé dans les cages de souris comme raffinement au cours de l’expérimentation. Pour la même raison, les souris ne recevront pas de récompenses. L’utilisation de méthode pour réduire la douleur liée à l’infection par Salmonella n’est pas possible car elle modifierait la cinétique d’apparition des symptômes et ne reproduirait donc plus la maladie. En revanche, après imagerie sous anesthésie gazeuse, chaque souris est placée individuellement sous une lampe infra-rouge pour optimiser son bien-être lors du réveil et surveillée jusqu’à sa remise en cage avec ses congénères uniquement lorsqu’elle a retrouvé son activité normale.
Choix des espèces
Salmonella est responsable chez l’homme et les animaux de la fièvre typhoïde qui est une infection systémique létale en l’absence de traitement et de gastroentérites. Nous disposons de modèles murins reproduisant ces deux syndromes. Le modèle en souris sensibles à l’infection par Salmonella est un modèle d’infection systémique létale naturel qui reproduit la fièvre typhoïde. Le modèle de gastro-entérite en souris prétraitées à la streptomycine reproduit la colite observée naturellement chez le veau et la réponse immunitaire associée. Les modèles murins utilisés sont donc particulièrement pertinents pour étudier les infections à Salmonella en choisissant la bonne lignée de souris et le prétraitement adapté en fonction de la pathologie ciblée. Les souris utilisées sont adultes, elles ont entre 6 et 8 semaines d’âge dans le modèle d’infection systémique létale et entre 8 et 10 semaines dans le modèle de gastroentérite et ce, conformément aux modèles établis dans la littérature. Les souris sont réparties en cages dès leur réception, et au minimum 7 jours avant l’inoculation.
Impact d’une supplémentation en tryptophane ou en nicotinamide sur les rythmes circadiens et métaboliques chez les rongeurs nocturnes et diurnes
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Autres rongeurs : 64
Trois mois et demi seul en cage, sans congénère, pour enregistrer des rythmes individuels. 128 souris et rats roussards vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, le porteur reconnaissant un stress d'isolement d'intensité modérée chez des rongeurs grégaires. À l'issue de cet hébergement, chaque animal subit un prélèvement de sang puis une chirurgie terminale sans réveil, pour mesurer hormones plasmatiques et activation neuronale après supplémentation en tryptophane ou en nicotinamide. Le porteur retient la souris comme modèle nocturne et le rat roussard comme modèle diurne, qualifiant la première de "modèle incontournable" en recherche animale du fait des lignées transgéniques disponibles.
Objectifs
Le tryptophane est un acide aminé essentiel, qui doit être apporté par l’alimentation. C’est un précurseur de nombreuses molécules dont la nicotinamide (NAM), l'une des deux formes de la vitamine B3, ainsi que de neurotransmetteurs comme la sérotonine. Les rythmes circadiens, comme le cycle veille-sommeil ou le cycle alimentation-jeûne, sont contrôlés par des horloges internes dont la principale est localisée à la base du cerveau. Par ailleurs, la sérotonine est un puissant modulateur de la mise à l'heure par la lumière ambiante de l’horloge principale dans le cerveau. Dans ce projet de recherche, nous proposons d’étudier in vivo l’impact d’une supplémentation nutritionnelle 1) en NAM et 2) en tryptophane sur le cycle veille/sommeil, la synchronisation à la lumière et la rythmicité circadienne de la prise alimentaire et du métabolisme. Les expériences seront basées sur la comparaison des effets chez un modèle animal nocturne, la souris et ceux chez un modèle animal diurne, le rat roussard (Arvicanthis).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont tout d’abord une meilleure compréhension de la modulation de la rythmicité circadienne par les facteurs nutritionnels chez des modèles animaux diurnes et nocturnes. Ensuite, si notre hypothèse 2 est validée par des effets positifs de la supplémentation en NAM et tryptophane sur l’amplitude des rythmes circadiens dans notre modèle animal diurne, cela permettra de développer des stratégies d’intervention nutritionnelle pour limiter ou contrecarrer la désynchronisation circadienne et ses effets néfastes sur la santé métabolique. Dans une perspective biomédiacle, la supplémentation alimentaire en NAM ou en tryptophane pourrait ensuite conduire à des traitements nutritionnels chronomodulés pour restaurer une organisation temporelle de forte amplitude chez les personnes âgées et les patients désynchronisés, par exemple, à cause de pathologies ou d’exposition chronique au travail en horaires décalés.
Procédures
Les animaux seront hébergés en cages individuelles pendant 3.5 mois pour mesurer des paramètres métaboliques et circadiens individuels puis soumis à un prélèvement de sang et une chirurgie terminale sans réveil tous deux étant réalisés sur animal anesthésié et analgésié.
Impact sur les animaux
Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles, ce qui pourra créer un stress d'isolement d'intensité modérée.
Devenir
La mise à mort de tous les animaux est nécessaire déterminer pour les changements plasmatiques des hormones et des métabolites circulants ainsi que l’activation des neurones dans l’hypothalamus en réponse à l'exposition aux deux molécules testées.
Remplacement
La régulation des cycles journaliers de la prise alimentaire et du métabolisme et la détection de la lumière impliquant plusieurs organes à la fois (notamment, rétine, cerveau, foie, pancréas, surrénales, muscles), l’investigation des interactions entre horloges circadiennes et nutrition nécessite l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro.
Réduction
Pour les tests in vivo circadiens et métaboliques, le nombre d’animaux proposé (n=8 par condition) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales recueillies dans des études antérieures. Notre suivi systématiquement longitudinal des animaux pour l’actimétrie et la calorimétrie réduit significativement le nombre d’individus utilisés.
Raffinement
Après 1 semaine de stabulation en cages collectives (n=4/cage), les souris seront ensuite maintenues en cages individuelles pour enregistrer des variables individuelles, circadiennes et métaboliques. Les arvicanthis mâles étant très territoriaux, les mâles sont hébergés dès le sevrage en cage individuelle. Pour limiter ce stress d'isolement chez les rongeurs qui sont des animaux grégaires, un barreau de bois à ronger, du matériel de coton et/ou de la frisure pour faire un nid constitueront un environnement enrichi. Tout au long de la procédure nous ferons un suivi de l'état général de l'animal à l'aide d'une grille de score et nous avons établi des points limites permettant de soustraire l'animal à la souffrance.
Choix des espèces
Pour mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, notre projet repose sur l’analyse comparative des réponses comportementales, physiologiques et neuronales entre un modèle animal nocturne et un modèle animal diurne. La souris de laboratoire Mus musculus est une espèce nocturne devenue un modèle classique en nutrition et en chronobiologie. C’est aussi un modèle incontournable en recherche animale par l’existence de nombreuses lignées transgéniques (y compris celles porteuses de mutations, celles avec gènes invalidés, ou avec gènes-rapporteurs). Une fois ce projet achevé, nous envisageons de rechercher les mécanismes moléculaires mis en jeu, en étudiant des souris transgéniques exposées aux mêmes procédures expérimentales. Les rongeurs diurnes tels que le Rat roussard sont des modèles expérimentaux appropriés pour la recherche biomédicale. Leur utilisation dans le projet présent est pertinente pour comprendre les différences de réponses entre espèces nocturnes et diurnes. C’est pourquoi les mêmes expériences seront faites en parallèle chez le Rat roussard, espèce diurne, et la souris nocturne. Jeunes adultes (2 mois) pour étudier un système circadien et un métabolisme matures et non-sénescents.
Interaction entre les protéines cellulaires et du virus de l’hépatite B dans la réponse immunitaire antivirale.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Une partie des souris est injectée à quinze jours de vie, âge auquel le porteur indique que le foie prolifère encore et permet d'induire l'atteinte hépatique. 840 souris mâles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec des atteintes du foie légères à modérées déjà observées lors de travaux antérieurs. Le génome du virus de l'hépatite B leur est transféré par injection sous anesthésie, un autre groupe recevant un réactif qui déclenche un cancer du foie, avec un à deux prélèvements sanguins sur des expériences durant de sept semaines à six mois. Toutes sont tuées pour prélever des organes et conduire histologie, virologie et immunologie post-mortem.
Objectifs
Le virus de l’hépatite B (VHB) est le facteur de risque majeur du carcinome hépatocellulaire (CHC). Le CHC est la seconde cause de mortalité par cancer dans le monde. Des travaux de recherche ont montré une corrélation entre certaines formes virales du VHB et la sévérité de l’atteinte hépatique jusqu’au cancer du foie. Ce projet a pour objectif de déterminer le rôle de l'interaction protéine-protéine d'une des protéines de VHB produites par ces formes virales avec une protéine cellulaire dans le mécanisme d'action de la pathogenèse hépatique générée par l'infection par le VHB.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est d'avoir une meilleure compréhension des mécanismes associés à la modulation de la pathogenèse hépatique liée à l’infection par le virus de l'hépatite B (VHB), qui pourrait conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques améliorant la prise en charge du carcinome hépatocellulaire de patients. Le virus de l’hépatite B (VHB) est un facteur de risque majeur du carcinome hépatocellulaire (CHC), augmentant d’un facteur x100 ce risque (800 000 décès par an par cirrhose ou CHC associés au VHB). De plus, le CHC est la seconde cause de mortalité par cancer dans le monde. Notre principale hypothèse est que l'interaction d'une des protéines du VHB avec une protéine cellulaire module l'atteinte hépatique. Grâce aux modèles murins, il est possible d'invalider l'expression de cette protéine cellulaire dans le foie, et ainsi réduire l'atteinte hépatique induite par l'infection par le VHB. À terme, ces travaux de recherche pourraient permettre d'interférer sur ces interactions protéiques et, en conséquence, de bloquer la progression de la maladie vers le CHC.
Procédures
Le transfert du génome du virus de l'hépatite B (VHB) sera réalisé sous anesthésie et analgésie sur l'ensemble des souris incluses de 7 à 10 semaines de vie (souris adulte) par injection. Un second groupe de souris vigiles subira une injection unique d'un réactif générant un cancer du foie. Deux groupes supplémentaires de souris recevront une petite injection de substances destinées à activer temporairement leurs défenses naturelles. Ces injections seront effectuées avec précaution, sous anesthésie ou sur animaux vigiles selon les cas, et avec des médicaments contre la douleur si nécessaire, quelques heures avant la fin de l’expérience. La durée de chaque injection est estimée à environ 3 secondes chez les animaux vigiles, et à 5 secondes chez les animaux anesthésiés, incluant la manipulation. Au cours de cette étude, nous serons amenés à prélever du sang. Le nombre de prélèvements varie de 1 à 2 selon la durée de l’expérimentation (de 7 semaines à 6 mois), et la durée totale de chaque acte de prélèvement est comprise entre 30 et 60 secondes. Tous les prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale, laquelle apporte également une analgésie efficace, garantissant l’absence de douleur pendant l’acte. À la fin de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Des études antérieures utilisant les mêmes protocoles ont montré des atteintes hépatiques légères à modérées chez les animaux traités. Les manipulations, en particulier les injections et les prélèvements sanguins, peuvent entraîner un stress modéré. Les injections peuvent provoquer une douleur légère, un petit saignement ou un hématome localisé, généralement transitoires. Les prélèvements sanguins peuvent également induire une douleur légère ainsi qu’un stress transitoire. L’anesthésie peut induire un stress thermique lié à la perte de chaleur corporelle. L’administration de certaines substances peut entraîner une inflammation hépatique, voire, dans certains cas, une tumorigenèse. Des troubles digestifs transitoires peuvent également survenir, sans conséquences durables.
Devenir
L'euthanasie est effectuée, apres anesthesie, afin de prélever differents organes. Ces animaux vont permettre de réaliser de nombreuses analyses post-mortem (histologie, quantification de paramètres cliniques, virologiques et immunologiques...) pour répondre à la question scientifique. Cet acte nécessaire sera réalisé par du personnel compétent et selon les bonnes pratiques d'euthanasie des animaux.
Remplacement
Nous avons précedemment effectué des cultures cellulaires à l'aide de modèles bidimensionnels (2D) et tridimensionnels (3D) pour diverses lignées cellulaires invalidées ou non pour un gène cellulaire afin d'examiner si l'effet de l'expression d'une des protéines du VHB in vitro est modulée. Cette protéine du VHB a des effets intra- et extracellulaires. C'est pourquoi un modèle de co-culture en compartiments séparés a été créé pour examiner les rapports entre les cellules hépatiques, qui expriment cette protéine du VHB, et differentes sous-populations immunitaires présentes dans le foie. Toutefois, il n'existe pas encore de modèle in vitro qui condenserait toutes les cellules présentes autour des hépatocytes dans le foie. Le modèle in vivo est donc indispensable pour déterminer le mécanisme d'action des effets intra- et extracellulaires d'une des protéines du VHB sur la pathogenèse hépatique.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé a été évalué par approche statistique afin que les résultats obtenus puissent être signigicatifs. Certains groupes contrôles seront utilisés pour plusieurs procédures, afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. À la fin des procédures, les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire, et un grand nombre de tissus seront prélevés afin qu'un grand nombre d'analyses puissent être effectuées. Le nombre total de souris mâles à utiliser sera de 840.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans une animalerie dont la température et l'hygrométrie sont contrôlées (vérifiée quotidiennement par les techniciens animaliers), avec un cycle de lumière du jour de 12 heures. L'eau et la nourriture sont fournies à tout moment. En outre, les cages seront enrichies de bandes de nidification en kraft et d'un bâton à ronger en bois. Les animaux ne sont manipulés que par du personnel qualifié et sensible au bien-être des animaux. Les procédures nécessitant le sommeil des animaux sont affinées par un protocole d'anesthésie et d'analgésie approprié, la gestion du risque d'hypothermie par l'utilisation d'une lampe chauffante ou d'un tapis chauffant, et l'ajout d'un gel protecteur pour les yeux afin d'éviter la sécheresse oculaire. Des limites sont fixées et respectées pour éviter la souffrance des animaux. Si les signes de douleur persistent ou si les points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés afin d'éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le modèle de souris utilisé dans cette étude est couramment employé en recherche car il permet d’obtenir des résultats fiables. Son système de défense naturelle fonctionne de manière similaire à celui de l’être humain, ce qui facilite l’étude de certaines maladies du foie. Les animaux seront utilisés à deux stades de développement, soit à 15 jours de vie (stade de développement murin pendant lequel le foie est encore en prolifération et permet l'induction de la pathogenèse hépatique), soit de 7 semaines (souris sevrées et adultes) car il est nécessaire que le foie soit mature.
étude du role du métabolisme du glucose dans la croissance du muscle chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
216 souris vont être utilisées, dans des procédures allant du sans réveil au niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur muscle plantaire. Quarante-huit d'entre elles sont opérées dix minutes sous anesthésie pour surcharger un muscle, puis marchent librement en cage pendant 21 jours en ne s'appuyant que sur lui, avec des douleurs et une inflammation post-opératoires. Seize reçoivent dans l'eau de boisson une molécule qui bloque la production d'énergie à partir des sucres, huit une injection quotidienne d'activateur pendant 21 jours, la fatigue et l'hypoglycémie faisant partie des effets attendus. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle alternatif pour l'étude du muscle à maturité, tout en indiquant que l'ensemble des analyses des mécanismes cellulaires sera réalisé sur lignées cellulaires.
Objectifs
La perte de masse musculaire est une caractéristique commune à de nombreuses maladies, altérant l’autonomie, la qualité de vie et la survie des patients. Les exercices de musculation sont efficaces pour prévenir cette perte, cependant, plusieurs pathologies sont associées à une moindre prise de masse musculaire induite par l’exercice, ce qui complique la prise en charge des patients. L’identification des facteurs impliqués dans la résistance musculaire à la prise de masse est une étape essentielle pour le développement de thérapies adaptées. Le contrôle de la masse musculaire dépend fortement de l’énergie disponible dans l’organisme. La prise de masse musculaire en réponse à un entraînement physique induit une augmentation d’environ dix fois de la consommation de glucose par le muscle, ce qui souligne l’importance de l’apport énergétique durant la croissance musculaire. Cette augmentation de l’absorption du glucose suggère que son utilisation par le muscle influence directement la croissance musculaire. Cependant, le rôle précis de la consommation musculaire de glucose lors de cette croissance reste encore mal compris. La détermination de l’impact des apports énergétiques sur la prise de masse musculaire constitue un domaine de recherche prometteur qui permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la croissance musculaire. Ce projet vise à identifier les mécanismes cellulaires responsables de l’adaptation musculaire, en se concentrant plus particulièrement sur les voies de production d’énergie au sein des cellules musculaires
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'insensibilité aux effets de l’exercice physique observée chez de nombreux patients (obèses et âgés notamment). Ce projet pourrait donc permettre d’améliorer la prise en charge des patients et d’améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Quarante-huit animaux seront soumis à un prélèvement peu douloureux au bout de la queue afin de déterminer, par analyse génétique, leur aptitude à participer à l’étude. Ces 48 animaux recevront une injection quotidienne (piqûre de 2 secondes) pendant 5 jours. Ils recevront également une injection de sédatif et d’analgésique (piqûre de 2 secondes) avant l’opération, puis une injection d’un autre analgésique immédiatement après celle-ci (piqûre de 2 secondes). Une fois endormis et sous analgésie, les animaux subiront une intervention chirurgicale (10 minutes). Les animaux des mêmes groupes effectueront une prise de masse musculaire par surcharge des muscles, ces derniers étant alors seuls responsables du travail mécanique de la marche pendant 21 jours, simplement par déambulation libre dans la cage. Seize animaux recevront un traitement par une molécule réduisant la production d’énergie à partir des sucres pendant ces 21 jours (cette molécule sera diluée dans l’eau de boisson et ne nécessitera aucune manipulation supplémentaire). Huit animaux seront traités avec un activateur de la production d’énergie, sous forme d’une injection quotidienne (piqûre de 2 secondes) pendant 21 jours. Enfin, huit animaux subiront un prélèvement peu douloureux au bout de la queue pour obtenir une goutte de sang destinée à mesurer la glycémie.
Impact sur les animaux
Les animaux opérés pourront ressentir des douleurs légères et de l’inconfort liées à l’opération, la surcharge du muscle ainsi qu’à l’inflammation les jours suivant l’opération. Les autres effets indésirables sont la fatigue induite pas l’inhibition de la production d'énergie et de potentielles hypoglycémies provoquées par l’activateur de la production d'énergie.
Devenir
Pour mener notre une étude et identifier les mécanismes impliqués dans la réponse à la croissance du muscle, nous devons prélever le muscle plantaire et réaliser des analyses moléculaires à l’issue de la procédure. Cela nécessite de mettre à mort les animaux en fin de projet.
Remplacement
Cette étude ne peut être conduite que chez l'animal car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude du muscle à maturité. Cependant, toutes les études visant à déterminer les mécanismes cellulaires impactés par l'utilisation des sucres par les cellules musculaires seront ralisées sur lignée cellulaires.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux nous analiseront les deux pattes des animaux réduisant de moitier le nombre d’individus nécessaire. La quantité de tissu prélevable pour ce genre d’expérimentation est faible ; pour éviter d’augmenter le nombre de souris nécessaires pour identifier les mécanismes cellulaires d’un côté et analyser la prise de masse du muscle de l’autre, nous réaliseront les études des mécanismes cellulaires sur des cultures cellulaires.
Raffinement
Les groupes contrôles ne seront pas incisés pour éviter les souffrances inutiles. Les souris sont opérées sous anesthésiant, analgésique et hypnotique, les muscles dont le tendon aura été sectionné ne sont pas enlevés de la loge (pas de retrait du muscle), cela réduit un peu les effets de prise de masse mais réduit la lourdeur de l’opération (plus petite incision et moins d’inflammation) et donc l’ampleur des douleurs et gènes post opératoire. Les souris sont placées sur un plateau chauffant (37°C) pendant la période de réveil post opératoire. Un gel hydraté (hydrogel) est placé dans la cage des souris et la nourriture est mise au sol la semaine suivant l’opération pour faciliter l’accès à l’hydratation et à l’alimentation. Les souris sont surveillées (apathie, toiletage, expression faciale et poids) pendant les 3 premiers jours post opératoirse. Une perte de poids de plus de 20% ou une apathie chronique (3jours) conduira à la mise à mort de l’animal de façon anticipée.
Choix des espèces
Les conditions d’hypertrophie du muscle chez l’humain que nous souhaitons étudier plus précisément sont bien reproductibles dans le modèle souris. De plus, nous utiliserons des modèles génétiquement modifiés qui n’existent que chez la souris. Les animaux seront utilisés au stade adulte afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.
Formations aux procédures peu ou faiblement invasives en recherche animale.
- Formation professionnelle
Rats : 200
Cochons d'Inde : 30
Hamsters dorés : 30
Lapins : 75
Chats : 10
Chiens : 30
Cochons : 5
Moutons : 10
Jusqu'à huit tentatives de ponction veineuse sur un chien ou un chat, deux ponctions par site, la bouche ouverte pour le geste d'examen. 590 animaux non-humains de neuf espèces vont être utilisés, dont 200 souris, 200 rats, 75 lapins, 30 chiens, 10 chats, 5 porcs et 10 brebis, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, sans finalité de connaissance et pour la seule formation du personnel de la plateforme. Le titre du projet qualifie ces procédures de peu ou faiblement invasives, et le porteur reconnaît que les nuisances augmentent quand la personne en formation est moins habile ou moins rapide. Tous ces animaux viennent déjà d'autres projets et seront gardés en vie pour être réutilisés, avec sept jours de repos entre deux séances sans anesthésie et quinze avec.
Objectifs
Notre établissement utilisateur est une plateforme expérimentale qui dispose d’un agrément pour un grand nombre d’espèces animales qui sont incluses dans des protocoles expérimentaux en fonction des autorisations de projets obtenues pour des équipes de recherche de notre institution ou d’institutions partenaires. Il arrive qu’une espèce animale pour laquelle nous disposons de l’agrément ne soit pas utilisée pendant une période d’un ou deux ans. Afin de réaliser au mieux les procédures expérimentales demandées, et l’application des procédures en limitant le stress et la douleur des animaux, tout en obtenant des résultats scientifiques fiables, il peut être nécessaire de faire appel à des séances de formation interne pour notre personnel. D’autre part, lors de l’embaûche d’un nouveau membre de notre équipe, une période de tutorat est mise en place pour l’acquisition ou la validation des compétences techniques. Dans ce cas, s'il n’est pas possible que ceci soit fait lors d’études en cours, nous organisons des séances de travaux pratiques avec ces personnes et les membres de l’équipe qui ont aussi besoin d’être formées, qualifiées ou re-qualifiées. La décision est prise par la personne en charge de l’organisation et la plannification interne, en accord avec la personne responsable du suivi des compétences, mais elle est soumise à l’avis de la Struture Chargée du Bien-Etre Animal de l’établissement.
Bénéfices attendus
Nous attendons des séances de formations pratiques en interne qu’elles donnent suffisamment de dextérité et d’assurance aux personnels pour que les procéures expérimentales exigées par les projets autorisés soient menées avec succès et en limitant le stress, l’angoisse et la douleur des animaux inclus.
Procédures
Rongeurs (souris, rat…) : 3 essais des actes différentes tel qu’une administration sous-cutanée ou une administration intra-musculaire ou intra-péritonéale, pendant l’anesthésie. Lapins : une injection sous-cutanée/ intra-musculaire et une prise de sang/pose de cathéter sous anesthésie général ou sur animal vigile avec anesthésie local, avec un maximum 2 ponctions par site. Chiens/chats : geste de l’ouverture de la bouche ainsi qu’un prélèvement sanguin, à raison d’un maximum de 8 essais de ponctions veineuses, mais au maximum 2 ponctions par site. Ceci est un maximum qui est rarement atteint, en général 2 à 3 essais sont suffisants. Porc : le prélèvement sanguin à la veine sous-clavière et la pose de cathéter à l’oreille sous anesthésie et pas plus de deux ponctions par veine et par séance (auriculaire et sous clavière). La durée de ces actes est estimée de quelques secondes à 2 minutes. De plus, les techniques propédeutiques seront également pratiquées, avec une durée maximale de 15 minutes. Brebis : le prélèvement sanguin et la pose de cathéter à la veine jugulaire sur un animal vigile ou anesthésié et pas plus de deux ponctions par veine et par séance. La durée de ces actes est estimée de quelques secondes à 2 minutes. De plus, les techniques propédeutiques seront également pratiquées, avec une durée maximale de 15 minutes.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, il s’agit principalement de permettre aux nouveaux arrivants d'apprendre les gestes techniques comme : le prélèvement sanguin / la pose de cathéter ou l'injection sous-cutanée / intramusculaire / intra-péritonéale, ou le geste d'ouverture de la bouche. Les nuisances sont celles qui sont inhérentes à chaque acte technique auquel les animaux sont soumis, mais avec, potentiellement, un peu plus de stress, de douleur ou d’angoisse si la personne en formation est moins habile ou moins rapide. À titre d’exemple, pour une séance de travaux pratiques, un rat peut subir deux ou trois injections par voie sous cutanée ou intraveineuse qui normalement dure moins d’une minute. Ici la durée sera un peu plus long.
Devenir
Dans ce projet, la grande majorité des actes techniques à mettre en place sont peu invasives. Ainsi, la plupart des animaux seront gardés en vie à l'issue de leur procédure, afin de pouvoir être réutilisés, après avis du vétérinaire sanitaire et de la structure chargée du bien-être animal, prenant en compte un temps de repos suffisant en fonction de la procédure qui a été effectuée sur l'animal, ainsi que leur état de santé et des possibilités de réutilisation.
Remplacement
La progression pédagogique pour l’acquisition des actes techniques passe par la formation théorique. Elle inclut un cours ou l’étude des documents qualité, le visionnage de photos et de vidéos, l’utilisation de cadavres ainsi que de modèles inertes de simulation présents dans notre institution. Tout au long du déroulement du projet, nous enrichirons notre banque d’images et de vidéos pour améliorer la qualité des cours. Ces éléments sont toujours à disposition de l’équipe de l’établissement pour un visionnage à volonté. Il est également possible de former les nouveaux arrivants au cours des études, ce qui est déjà le cas. Cependant, dans certains cas, il est nécessaire de pratiquer les gestes techniques sur des animaux vivants pour garantir la qualité des résultats d’étude. Il n’est pas toujours possible de remplacer l’animal dans le cadre des formations.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans une séance est limité au minimum et nous utilisons principalement des animaux qui ont déjà participé à un autre projet et qui n’ont pas de problème clinique suite à cette inclusion. L’acquisition d’un geste technique sur un rongeur ne nécessite pas plus de 3 répétitions bien réalisées par la personne formée. Pour les prélèvements et/ou administrations chez le rongeur : deux à trois animaux par personne et par séance sont donc suffisants. En revanche, chez les porcs, les brebis, les chiens et les chats, un animal peut être utilisé par plusieurs personnes successivement et anesthésié si besoin, ce qui peut mener à utiliser par exemple un porc pour former 2 à 3 personnes aux prises de sang. De plus, nous privilégions la formation des nouveaux arrivants pendant les études.
Raffinement
Les techniques utilisées sont les mêmes que celles que nous mettons en œuvre pour nos projets. Deux principales mesures de raffinement sont utilisées. La première est la limitation du nombre d’actes par animal et par séances. Deux à huit répétitions de geste par animal et par séance. Si ce nombre devait être dépassé, la séance se passe sous anesthésie générale. Les volumes administrés ou prélevés sont minimes (< 1 ml). Largement inférieurs aux recommandations d’usage en recherche, puisque ce qui compte est que le geste soit bien réalisé. L’autre est un enregistrement précis des utilisations et réutilisations de chaque animal en respectant un temps de repos de 7 jours entre deux séances sans anesthésie et 15 jours entre deux séances avec anesthésie. Toute blessure au cours de la séance est prise en charge et prolonge le temps de repos de l’animal. De plus, les conditions hébergement des animaux seront adaptées à chaque espèce, ainsi que leurs soins quotidiens. Seuls les animaux en bonne santé participent à ces séances de formation. Les séances sont interrompues si les animaux montrent un signe de mal-être ou de stress trop important.
Choix des espèces
Globalement, nous pouvons être amenés à organiser des TP sur toutes les espèces animales qui sont utilisées dans nos procédures de recherche. Les séances de formation sont organisées pour les nouveaux arrivants ou pour des rappels aux personnes déjà en place. Elles concernent les gestes techniques sur rongeurs, lapins, porcs, chiens ou volailles. Exceptionnellement et beaucoup plus raprement pour d’autres espèces, les formations se font par tutorat pendant les procédures. Les animaux sont des animaux réutilisés d’autres projets qui généralement font appel à de jeunes adultes
Création d’un modèle murin pour l’étude du rôle de la protéine CD276 dans la survenue du cancer de la surrénale et le développement de métastases.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Aucun acte n'est prévu sur ces souris avant leur mise à mort, la souffrance venant du cancer que leur génome modifié doit produire. 67 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, avec des douleurs attendues entre la seizième et la vingt-quatrième semaine, liées au développement du corticosurrénalome et de ses métastases. Il s'agit de créer une lignée invalidée pour une protéine dans les surrénales afin d'évaluer son rôle dans l'agressivité de ce cancer, les animaux des trois premières générations étant tués faute de porter le génotype recherché. Le porteur retient la souris parce que son génome et l'expression de ses gènes sont bien connus, et parce qu'il dispose déjà d'un modèle reposant sur l'invalidation surrénalienne de deux gènes suppresseurs de tumeurs.
Objectifs
Le corticosurrénalome est un cancer agressif avec environ 35 % des patients présentant des métastases au diagnostic. Le mauvais pronostic de ce cancer peut être attribué au manque de thérapies efficaces. En effet, un traitement curatif n'existe que pour les patients porteurs d’un corticosurrénalome de faible agressivité qui subissent une résection chirurgicale complète. Malgré des traitements lourds, les patients présentant une récidive ou une maladie métastatique, pour lesquels la chirurgie n’est pas une option, ont de faibles chances de survie à long terme. Des analyses préliminaires ont permis de mettre en évidence qu’une protéine est surexprimée dans les corticosurrénalomes de patients et que cette surexpression est associée à une diminution de la survie globale. Ainsi, l’objectif de ce projet est d’analyser l’implication de cette protéine dans la survenue et la progression métastatique des corticosurrénalomes. Pour répondre à cette question nous créerons une nouvelle lignée de souris présentant une invalidation de cette protéine dans les surrénales de notre modèle préclinique murin de corticosurrénalome métastatique et évaluerons l’impact sur le bien-être animal, le développement de tumeurs et de métastases.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet nous permettra de développer une lignée unique d’animaux génétiquement modifiés et cliniquement pertinente afin d’évaluer l’implication d’une protéine dans la survenue et la progression métastatique des corticosurrénalomes. Ainsi les résultats pourraient permettre de développer à terme des approches thérapeutiques ciblées et améliorer le traitement et la survie des patients.
Procédures
Aucune intervention n’est prévue sur les animaux avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Des analyses préliminaires ont permis de mettre en évidence que la protéine d’intérêt est surexprimée dans les tumeurs avancées du modèle de souris étudié précédemment. Notre hypothèse de travail étant que la protéine joue un rôle dans l’agressivité et la progression tumorale nous attendons dans les souris de cette étude un phénotype dommageable moindre que celui du modèle précédent. Les nuisances suivantes sont à envisager entre 16 et 24 semaines : Douleurs liées au développement tumoral associé à des métastases. Tous les animaux seront étroitement surveillés par du personnel qualifié et sortis de l’expérience lorsqu’un point limite sera atteint.
Devenir
Les animaux des générations 1 à 3 permettant l’établissement de la lignée ne possèdent pas de génotype d’intérêt pour notre étude. Ils seront donc mis à mort à la fin de la procédure et différents organes prélevés pour faire des mises au point de techniques utilisées par la suite. Tous les animaux avec un génotype d'intérêt seront mis à mort à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses histologiques et biochimiques permettant d’évaluer le rôle de la surexpression d’une protéine dans le développement du corticosurrénalome.
Remplacement
Afin d’éviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro. Ainsi, le rôle de la protéine d’intérêt dans la prolifération et la survie des cellules tumorales sera évalué in vitro sur une lignée cellulaire de corticosurrénalome invalidé ou non pour la protéine. Cependant, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.
Réduction
Dans l’optique de réduire le nombre d’individus, les croisements pour générer les souris génétiquement modifiées déletées pour la protéine d’intérêt dans notre modèle murin de corticosurrénalome seront optimisés. De plus, les individus utilisés pour l’évaluation du bien-être animal seront réutilisés. Enfin pour chaque expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées. De même, le sang des animaux sacrifiés sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Durant la procédure, nous veillerons au bien-être des animaux par l’ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate, de tunnels en plastique ou de billes en inox. Le choix de l’enrichissement sera réalisé en fonction de l’état général de l’animal, par exemple en cas de développement d’une tumeur importante l’ajout de plaques de papier à ronger ou de bâtons en bois sera choisi à la place de tunnels qui pourraient blesser l’animal. De plus, du coton sera ajouté dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Les animaux seront hébergés par groupes de 4 individus pour permettre le maintien d’un bien-être social. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, des points limites précis seront établis et les expériences seront arrêtées en conséquence.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant les corticosurrénalomes. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. La lignée murine utilisée pour générer notre lignée déficiente pour la protéine d’intérêt dans la surrénale est un modèle préclinique murin pertinent de corticosurrénalome métastatique reposant sur l’invalidation surrénalienne de deux gènes suppresseurs de tumeurs mutés chez les patients portant les corticosurrénalomes les plus agressifs. Nous réaliserons nos analyses aux 3 stades de développement tumoral identifiés dans le modèle de corticosurrénalome métastatique. Un stade d’hyperplasie à 2 mois, un stade de corticosurrénalome agressif à 4 mois et un stade de corticosurrénalome métastatique à 6 mois.
Etude du comportement et de l’activité cérébrale dans des modèles de souris pour l’étude d’un syndrome de retard mental d’origine génétique – EU2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Génétiquement modifiées, les souris de ce projet ne peuvent pas être placées ailleurs selon le porteur, qui prévoit leur mise à mort tout en indiquant que les génotypes en excès pourront servir à maintenir la colonie ou passer dans d'autres projets. Elles sont 1 282, dans des procédures allant d'un niveau de souffrance léger à sévère, une partie tuée par perfusion intracardiaque sous anesthésie terminale. Toutes subissent une biopsie de la queue pour génotypage, décrite dans le RNT comme provoquant une douleur aiguë et un stress de contention. Le porteur annonce quatre tests d'exploration des fonctions comportementales par animal, étalés sur plusieurs semaines et qualifiés de non invasifs et non douloureux, sans préciser lesquels.
Objectifs
Les troubles du neurodéveloppement (TND) concernent près d’une naissance sur 10 dans les pays développés. Ils constituent un groupe hétérogène d’atteintes du développement du système nerveux qui regroupe des maladies souvent invalidantes et avec peu de perspectives thérapeutiques, tels que des syndromes de retard mental, ou des déficits musculo-squelettiques. Ce projet a pour finalité l’étude en parallèle de trois gènes impliqués dans les TNDs. Notre objectif est 1) d'étudier les déficits comportementaux dans une lignée de souris porteuse d'une mutation inactivant un de ces gènes, pour mimer la pathologie humaine, et 2) de réaliser une cartographie de l’activité cérébrale dans les souris modèles pour ces trois gènes, au moyen de marquages histologiques validés lors d'une étude préalable. Cela nous permettra d’identifier les convergences de mécanismes pathologiques dans trois modèles de TND et donc de mieux comprendre la pathologie.
Bénéfices attendus
Les résultats de ces travaux permettront dans un premier temps de mieux comprendre les fonctions des gènes de notre étude, ce qui renforcera la connaissance des liens entre des perturbations au niveau cellulaire et les altérations comportementales chez la souris. En particulier, ce projet sera la première étude visant à étudier en profondeur les altérations cérébrales liées à un nouveau gène associé aux troubles du neurodéveloppement, imitant ce qui se passe chez les patients atteints d'un syndrome de déficience intellectuelle et autisme. Cette étude permettra également de mieux comprendre les troubles du neurodéveloppement et d'améliorer le conseil génétique aux familles.
Procédures
Les animaux subiront une biopsie avant le sevrage pour le génotypage (une seule fois, durée 1 minute environ). Les animaux seront soumis à des tests d’exploration des fonctions comportementales, non invasifs, et non douloureux, mais qui nécessiteront de manipuler régulièrement les animaux (4 tests prévus par animal, chaque test dure quelques minutes, les tests sont étalés sur plusieurs semaines). Ces procédures peuvent entraîner un stress léger. Certains animaux subiront une procédure sans réveil, sous anesthésie générale, d’une durée de 5 minutes environ.
Impact sur les animaux
Tous les animaux subiront une biopsie à la queue qui entraine une douleur aiguë et un stress au moment de la contention. Certains animaux reproducteurs pourront être isolés pour éviter les bagarres, entraînant un stress d’isolement social. Certains animaux seront soumis à des tests de comportement non invasifs mais qui entraînent un stress lié à la contention et la manipulation répétée. Certaines souris subiront une mise-à-mort par perfusion intra-cardiaque. Cette procédure est faite sous anesthésie gazeuse terminale, et est sans réveil.
Devenir
Les animaux sont des souris génétiquement modifiées, nous ne pouvons donc pas les replacer à l’issue de ce projet. Par conséquent les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Ce projet a pour objectif de mieux caractériser les altérations comportementales dans des modèles animaux mimant un trouble du neurodéveloppement d'origine génétique, et d’identifier des égions différentes du cerveau qui répondent de façon anormale à la stimulation. En préalable à ce projet, nous avons réalisé des expériences in vitro validant notre hypothèse sur les gènes impliqués ce qui permet de nous assurer que l’étude est pertinente. L’approche in vivo est une nécessité afin d’aborder des troubles complexes de la cognition et du comportement. Nos modèles permettent de réaliser des expériences qui ne peuvent pas être reproduites in vitro telles que des tests des fonctions cognitives ou du comportement social.
Réduction
Les accouplements seront optimisés afin de produire strictement le nombre nécessaire d’animaux et dans la mesure du possible pour que tous les génotypes puissent être utilisés dans les études ultérieures, soit dans le groupe expérimental, soit dans le groupe contrôle. Il y a toujours une possibilité que certains génotypes soient retrouvés en excès, dans ce cas les animaux pourront être utilisés pour maintenir la colonie ou pour d’autres projets avec les mêmes lignées. Nous pourrons utiliser certains animaux qui ont subi uniquement des tests de comportement non invasifs pour réaliser une autre procédure, complémentaire, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés dans les procédures est limité au minimum nécessaire pour déterminer la significativité statistique des résultats, et a été choisi par un test de puissance statistique sur la base de notre expérience préalable. Pour le test de sociabilité, utilisant en plus des congénères étrangers, nous aurons recours si possible à des animaux déjà présents dans l’animalerie, dans le but de ne pas utiliser d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Pour l'ensemble des procédures, nous avons défini des points limites prédictifs et précoces afin de prédire au mieux et le plus tôt possible des manifestations conduisant à la mise en place de traitements ou à l’arrêt de la procédure. Les animaux sujets aux tests de comportement seront acclimatés à la salle de test au préalable afin de réduire le stress causé par un nouvel environnement. Les différents tests seront réalisés avec un temps de pause suffisant entre chaque test pour limiter un stress éventuel des animaux. A noter que les tests de comportement ne sont pas invasifs et ne portent pas atteinte à l’intégrité de l’animal.
Choix des espèces
Le cerveau de la souris est très proche du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales tels l’autisme et/ou les déficiences mentales. Les tests seront réalisés chez des animaux jeunes adultes, idéalement entre 60 et 90 jours mais cet âge peut différer légèrement selon la disponibilité des animaux et la composition des cohortes. En effet, cet âge correspond à l’âge auquel nous avons préalablement identifié des altérations du comportement des souris dans d'autres lignées.
Utilisation de la souris pour l’évaluation de la gonadotoxicité d’une combinaison de chimiothérapies chez la femme atteinte de cancer du sein (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
Trois chimiothérapies du cancer du sein, administrées ensemble, vont être testées sur les ovaires de 154 souris femelles de six semaines, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Toutes seront tuées à des délais échelonnés pour compter les cellules reproductives de leurs ovaires. L'acte infligé tient en une injection unique de moins de cinq secondes, saline chez les témoins, et le porteur indique que la combinaison des trois molécules pourrait induire une toxicité cardiaque ou intestinale jamais évaluée. Sur le remplacement, il décrit des cultures d'ovaires entiers testées lors d'études préliminaires et jugées inexploitables, tout en précisant que ces données n'ont jamais été publiées.
Objectifs
Le dépistage précoce des cancers et les progrès de leurs traitements ont considérablement augmenté les taux de survie des jeunes patientes. Cependant la fertilité après la guérison est souvent très affectée. La préservation de la fertilité est donc un enjeu majeur dans la prise en charge de ces patientes. Dans l’ovaire de la femme, le stock des cellules de la reproduction est fixé tôt au cours de la vie et ne cesse de décroître jusqu’à la ménopause. Les effets de la chimiothérapie conduisent à une réduction drastique de ce stock, ce qui se traduit par une infertilité. Dans le cadre du cancer du sein, les patientes reçoivent habituellement une combinaison de plusieurs chimiothérapies. Les médicaments les plus couramment utilisés dans le cadre du cancer du sein sont au nombre de trois et sont administrés en même temps chez les femmes. Chaque médicament exerce, en plus de son action anti-cancéreuse, un effet néfaste sur les ovaires. Ces effets ont été étudiés, pour chaque médicament de manière indépendante, dans des modèles de souris mais l’effet toxique sur les ovaires de la combinaison de ces 3 médicaments, n’a jamais été étudié. Ce projet vise à explorer l’effet de cette association de trois chimiothérapies sur l’ovaire de souris. Nous utiliserons la souris comme modèle d’étude car l’expérimentation est impossible chez la femme. L’impact sur le stock de cellules de la reproduction sera étudié ainsi que les mécanismes par lesquels ces médicaments agissent pour le détruire. Les animaux recevront une seule injection soit d’une solution saline en guise de contrôle, soit d’un volume égal contenant la combinaison des trois médicaments. Les souris seront euthanasiées différents temps après le traitement et l’impact de la chimiothérapie combinée sur les ovaires sera évalué. L'exécution du projet ayant pris du retard, il est nécessaire d’en prolonger l’autorisation. Le nombre d’animaux reste inchangé.
Bénéfices attendus
L’amélioration de la compréhension des mécanismes impliqués dans la gonadotoxicité de la chimiothérapie permettra l’identification de molécules limitant l’impact négatif de ce traitement sur les ovaires. Les résultats de ce travail sont une étape essentielle avant de tester des traitements spécifiques pour prévenir la gonadotoxicité des chimiothérapies combinées habituellement utilisées dans le cancer du sein.
Procédures
Une injection de moins de 5 secondes
Impact sur les animaux
Les différentes drogues ont été testées individuellement sur des souris et n'ont pas provoqué d'effet indésirable notable. Bien que cela n’ait jamais été évalué, il est possible que la chimiothérapie combinée (Epi/Cy/5-FU) induise une certaine toxicité cardiaque et/ou intestinale chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés
Remplacement
L’ovaire est un système complexe composé de cellules de la reproduction et d’autres cellules qui communiquent entre elles. L’étude de l’effet de l’administration d’une combinaison de chimiothérapies sur les cellules de la reproduction ne peut être réalisée que sur un organisme vivant. Il n’existe pas de modèle cellulaire qui permettent de reproduire ce qui se passe dans l’ovaire. Des modèles de culture d’ovaire entier ont été testés lors d’études préliminaires, mais le tissu ovarien après culture ne permet pas d’évaluer le nombre de cellules de la reproduction ni leur croissance. Ces données n'ont jamais été publiées. Il n’existe donc pas de modèle in vitro reproduisant la structure et la physiologie ovarienne permettant de récapituler les mécanismes induits par la chimiothérapie. L’objectif final de ce projet est de trouver une nouvelle thérapie pour limiter l'impact de la chimiothérapie sur les ovaires chez la femme atteinte de cancer. Pour cela, nous devons tout d’abord déterminer le mécanisme de toxicité de la combinaison de chimiothérapie sur l’ovaire ce qui nécessite de réaliser des expériences in vivo chez la souris.
Réduction
Nous limiterons le nombre d’expériences et de souris. Il est essentiel d'utiliser le plus petit nombre d'animaux possible sans nuire à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a été intégrée à la construction du projet
Raffinement
Les souris sont hébergées dans une pièce avec un cycle 12 h jour/12 h nuit en présence d'enrichissement dans la cage. La température est maintenue à 22°C, l'accès à la nourriture et à l'eau est libre. Chaque jour, l'état des animaux est contrôlé par les personnes en charge de l’étude et/ou le personnel de l'animalerie. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
La souris est un animal dont les étapes de la physiologie ovarienne sont bien établies. Les souris femelles seront utilisées à 6 semaines juste après la puberté pour avoir une réserve ovarienne importante et des follicules en croissance.
Etude du développement et de la plasticité de l’unité gliovasculaire (1/2)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Une chirurgie d'amincissement du crâne ouvre la voie à l'imagerie du cerveau au microscope biphotonique à travers l'os, pendant quatre-vingt-dix à cent quatre-vingts minutes. 984 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées ensuite pour prélever leur cerveau. Il s'agit de suivre les contacts entre astrocytes et vaisseaux sanguins corticaux à cinq stades, de 7 à 60 jours après la naissance, une des lignées présentant un retard de développement pouvant aller jusqu'à des calcifications cérébrales et des troubles moteurs. Le RNT chiffre à 864 les souriceaux d'un ou quatre jours recevant une injection sous-cutanée et à 864 les souris subissant l'amincissement du crâne, pour un effectif total déclaré de 984.
Objectifs
Le système nerveux central, dont fait partie le cerveau, est composé de plusieurs types cellulaires : les neurones, mais également les cellules gliales dont les astrocytes. Ces derniers sont reconnus comme des acteurs essentiels à la physiologie cérébrale et impactés dans de nombreuses pathologies. Ils interagissent notamment avec les vaisseaux sanguins où ils participent à la régulation des fonctions vasculaires, comme l’intégrité de la barrière hématoencéphalique (BHE). Ils forment ainsi avec les vaisseaux l’unité gliovasculaire (UGV), qui est perturbée dans l’ensemble des maladies touchant le cerveau. Parmi les déficits actuels en santé publique, les pathologies liées au développement du cerveau et à l’établissement de ses capacités plastiques, comme les troubles du spectre autistiques, les maladies neurodéveloppementales ou psychiatriques, ont une place importante. Cependant les étiologies de ces maladies sont encore largement méconnues. En particulier, un possible rôle des astrocytes reste à démontrer. Une des raisons pour cela est le manque de connaissance sur les dynamiques de l’unité gliovasculaire au cours de la vie et les interactions entre les astrocytes et le système vasculaire cérébral. Cette étude permettra de caractériser les mécanismes de plasticité des contacts astrocytaires sur les vaisseaux sanguins corticaux dans de multiples conditions de développement physiologiques et pathologiques à l’aide d’analyses histologiques et d’enregistrements dynamiques en temps réel par vidéomicroscopie. Cela permettra une meilleure compréhension des dynamiques de l’unité gliovasculaire et du rôle des astrocytes au cours de la vie. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs. Cette étude nécessite l’utilisation de 984animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur les dynamiques et les fonctions de l’unité gliovasculaire, dont les défauts sont un facteur important des pathologies neurodéveloppementales et neuropsychiatriques.
Procédures
2 types d’interventions sont prévues dans ce projet : 1. Injection en stade périnatal : un réactif est injecté en voie sous-cutanée chez des souriceaux nouveau-nés de 1 ou 4 jours. Cette intervention n’est réalisée qu’une seule fois. Elle est sans douleur et ne nécessite pas d’anesthésie. Elle est effectuée dans l'EU1.Nombre d’animaux concernés : 864 (durée : 1min). 2. Procédure d’amincissement du crâne et imagerie in vivo au microscope biphotonique : Les souris subiront une intervention chirurgicale d’amincissement du crâne pour permettre l’enregistrement du signal fluorescent par microscopie biphotonique à travers l’os. L’intégralité de la procédure est faite sous anesthésie et analgésie. Elle est effectuée dans l'EU2. Nombre d’animaux concernés : 864. (durée : 90 à 180 min).
Impact sur les animaux
Une des lignées de souris présente des caractéristiques dommageables pouvant entrainer des nuisances, notamment un léger retard de développement pouvant aboutir sur des altérations du système visuel et cardiovasculaire ainsi que l’apparition de calcifications cérébrales pouvant engendrer des problèmes moteurs chez certains individus. Certains lots de souris subiront des interventions chirurgicales qui peuvent entrainer des effets modérés (douleurs post-opératoires) qui seront minorées par l'administration d'analgésiques.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés après chaque procédure afin de récupérer leur cerveaux pour faire les analyses.
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux par expérimentation : 5) a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible.
Raffinement
Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les nouveau-nés subissant une injection feront l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure et les jours suivants . Dans le cas des pups remis en cage avec leur mère, les manipulations des animaux seront limitées autant que possible afin d’éviter leur rejet par la mère. Pour chaque intervention pouvant générer de l’inconfort ou de la souffrance, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. En particulier, des points limites intermédiaires permettant la mise en place de soin aux animaux sera mise en place évitant la mise à mort des animaux. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des analgésiques seront coadministrés pour limiter toute souffrance chez l’animal. Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux (gestion optimale de l’élevage, actes de chirurgie ou d’injection intrapéritonéale, gestion de l’anesthésie/analgésie, analyse des points limites).
Choix des espèces
La souris partage 98% de son génome et permet ainsi dans la majorité des cas de pouvoir mimer une pathologie humaine via des modèles génétiquement modifiés. De plus cette espèce de petite taille présente une courte durée de gestation et génère un grand nombre de petits dans ses portées, ce qui en fait un modèle mammifère idéal. Les différentes étapes du développement cérébral et sa plasticité chez la souris étant bien décrites et similaires à l’humain, ce modèle est approprié à la recherche neurodéveloppementale. Les animaux seront utilisés à 5 stades développementaux postnataux : 7, 15, 21, 30 et 60 jours après la naissance. Ces stades correspondent à des moment clés du développement cérébral et en particulier des astrocytes et de leurs interactions avec les vaisseaux sanguins.