Souris
Analyse de la réponse immunitaire, de la protection contre l’infection et de la stabilité d’un candidat vaccin universel antigrippal dans un modèle préclinique murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
992 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Toutes reçoivent deux vaccinations intramusculaires dans les pattes sous anesthésie, à vingt et un jours d'intervalle, et 37,5 % d'entre elles sont infectées par le virus de la grippe par inhalation sous anesthésie profonde, puis pesées chaque jour pendant quatorze jours. Le porteur indique que la dose élevée de virus peut provoquer une perte de poids marquée et des signes cliniques, et que les animaux sont mis à mort soit à l'atteinte d'un point limite, soit en fin d'étude pour les prélèvements. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la physiologie d'un "organisme entier" et que le recours à la souris est "nécessaire" pour satisfaire les exigences réglementaires.
Objectifs
La grippe est une maladie virale aigue, fréquente et très contagieuse causée par des virus grippaux circulant dans le monde. Elle provoque chaque année environ 1 milliard de cas, 3 à 5 millions de cas graves (infections respiratoires entraînant des hospitalisations), et entre 300 000 et 650 000 décès particulièrement chez les individus vulnérables (personnes âgées, les enfants et immunodéprimés). Les souches responsables de la grippe, principalement de type A ou de type B, peuvent coexister sur une saison, ce qui rend le taux d’incidence annuel imprévisible. La vaccination reste à ce jour la stratégie la plus efficace pour protéger les populations. Elle agit en induisant des réponses immunitaires contre la souche virale circulante, ciblant les protéines de surface du virus. Cependant ces vaccins présentent une efficacité limitée : ~32 % pour les personnes âgées et ~43% pour les personnes adultes. Cette efficacité réduite s’explique en partie par les mutations très fréquentes, diminuant la correspondance entre le vaccin en cours et la souche circulante. D’autre part, le virus de la grippe renferme une protéine interne, hautement conservée entre les différentes souches virales. Cette caractéristique fait d’elle une cible pertinente pour de nouveaux vaccins universels capables d’induire des protections plus durables et plus efficace, notamment en cas de pandémies. L’objectif est de renforcer l’efficacité en testant de nouveaux candidats, ciblant la protéine interne, chez la souris. Cela se fait via deux axes principaux : élargir la couverture vaccinale en ciblant simultanément les souches A et B, et renforcer la réponse immunitaire grâce à l’ajout d’un adjuvant. Le second axe vise à étudier si une réponse immunitaire préexistante, induite par des expositions antérieures aux virus grippaux, peut améliorer ou modifier la réponse à une vaccination contre la grippe. Ce projet vise ainsi à contribuer à la mise au point d’un vaccin plus performant et mieux adapté aux défis épidémiologiques posés par la grippe.
Bénéfices attendus
Contrairement aux protéines de surface du virus de la grippe qui mutent souvent, la protéine interne, située à l'intérieur du virus, est beaucoup plus conservée entre les différentes souches de grippe. Cette faible variabilité fait d’elle une cible intéressante pour le développement de vaccins à large spectre, pouvant offrir une protection universelle contre diverses souches grippales contre la grippe saisonnière humaine, mais aussi contre d'autres sous types de la maladie actuellement présents chez les espèces aviaires, ayant le potentiel de provoquer une nouvelle pandémie. Le bénéfice attendu du projet est donc d’accroître l’efficacité des vaccins antigrippaux saisonniers et de garantir une préparation optimale en cas de future pandémie grippale. À l’issue de ces recherches, le candidat-vaccin entrera en phase clinique chez l’humain, avec pour objectif de diminuer la mortalité et l’incidence des formes graves de la grippe, apportant un bénéfice majeur à la santé publique.
Procédures
Tous les animaux du projet vont recevoir 2 vaccinations, réalisées par voie intra musculaire dans les pattes sous anesthésie générale légère. Ces injections sont espacées de 21 jours et chaque injection dure quelques secondes. Au moment de la mise à mort, un prélèvement sanguin est réalisé sous anesthésie générale légère dans 3 procédures sur 4 (81% des animaux). Les infections virales (représentant 37,5% des animaux) sont réalisées par inhalation et sous anesthésie profonde par injection. Cette injection est réalisée en quelques secondes, 1 seule fois par souris. L’infection est réalisée en quelques minutes pour chaque souris, afin de garantir la réussite du geste et la sécurité de l’animal. Les souris infectées seront pesées tous les jours sur une période de 14 jours.
Impact sur les animaux
Le geste de l'immunisation intramusculaire peut entrainer une douleur locale mais temporaire suite à l’injection. Les formulations utilisées sont à base de solution saline et les volumes injectés limitent fortement les risques de souffrance. L’infection virale par inhalation peut provoquer un stress léger et transitoire. 2 doses de virus seront utilisées en fonction des expériences : - une dose faible à laquelle une légère perte de poids peut être observée dans les quelques jours suivant l’infection, paramètre qui sera surveillé. - une dose élevée pouvant entrainer une perte de poids plus importante avec des signes cliniques (modification du comportement et altération de l’aspect physique. Une surveillance quotidienne rigoureuse sera mise en place pour minimiser la souffrance animale
Devenir
L'ensemble des animaux du projet sont mis à mort soit après atteinte d'un point limite défini dans le protocole, soit en fin d'étude pour les prélèvements post mortem nécessaires. Cette approche garantit le respect du bien-être animal tout en se conformant aux exigences réglementaires post-exposition.
Remplacement
La vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire dans différents organes de la souris. Aucun modèle in vitro n’est actuellement capable de reproduire une telle dynamique. Des études de remplacement sont en cours de développement, mais cela ne permet pas mimer la physiologie d’un organisme entier. L’utilisation de la souris s’avère donc pertinent et est même nécessaire afin de satisfaire les exigences réglementaires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est basé sur nos études antérieures et des approches statistiques, afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables et robustes, permettant de détecter des différences significatives entre les groupes. Au sein d’une même procédure, plusieurs candidats vaccins seront testés en parallèle afin de réduire le nombre d’animaux du groupe contrôle. Le nombre d’animaux estimé correspond au nombre maximum d’animaux pouvant être utilisé dans ce projet. Cependant, durant tout le long du projet, en fonction des résultats obtenus à chaque procédure ou chaque temps points, les nombre d’animaux pourront être réduits et certains temps points supprimés.
Raffinement
Les souris seront acclimatées au minimum durant une semaine avant le début d’une procédure. Dans l’ensemble de nos groupes expérimentaux, un enrichissement de l’environnement est systématiquement mis en place dans les cages des souris afin d’améliorer leur bien-être. Cet enrichissement comprend, par exemple, l'ajout de maisonnettes en carton, de morceaux de bois, ainsi que d'autres éléments favorisant l'expression des comportements naturels des animaux. Ces mesures visent à diminuer le stress et à promouvoir un état émotionnel positif tout au long de l’étude. La vaccination est réalisée dans les pattes de la souris sous anesthésie légère, afin de limiter le stress lié à la préhension et la piqure. Les infections virales par inhalation seront réalisées sous anesthésie profonde. Des surveillances régulières sont assurées après les différentes études de pré-infection ou d’infection. Suivant l’infection, des croquettes et de l’eau pourront être mises à disposition dans la cage pour faciliter leur accessibilité. Une eau gélifié contenant l’équivalent nutritifs des croquettes pourra être utilisé comme substitut et déposé directement dans la cage. Enfin, au moment de l’euthanasie, un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie locale (Collyre anesthésique local) et sous anesthésie gazeuse pour minimiser toute sensation de douleur.
Choix des espèces
Parmi les différentes espèces animales utilisées en expérimentation, la souris est l’animal le mieux adapté pour le développement de modèles immunologiques d’autant plus que notre équipe maîtrise les outils et méthodes associés. Le modèle murin est par ailleurs largement documenté dans la littérature, ce qui nous permet de situer et de comparer nos résultats aux données existantes. Cette espèce offre donc tous les critères requis pour atteindre nos objectifs et mettre au point de nouvelles formulations vaccinales contre les infections grippales. Les animaux âgés de 5 semaines seront réceptionnés par l’animalerie et utilisés seulement après une période d’acclimatation d’une semaine. Nous allons donc utiliser des animaux sevrés de 6 semaines (jusqu’à 12 semaines si besoin). Le système immunitaire est décrit comme mature à partir de cet âge-là et non vieillissant.
Effet du transport et du métabolisme du fructose sur la régulation de la glycémie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour comprendre comment un transporteur intestinal du fructose influe sur la glycémie, 1 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever pancréas, foie, intestin et contenu du cæcum. Chaque animal reçoit trois gavages de glucose, une injection, jusqu'à six prélèvements sanguins et cinq coupures à l'extrémité de la queue, et subit deux jeûnes de quatre et six heures. Le porteur décrit ces gestes comme un stress de moins de vingt secondes et affirme que les jeûnes n'entraînent aucune hypoglycémie. Il justifie l'espèce par des lignées génétiquement modifiées disponibles uniquement chez la souris et par l'absence, selon lui, de tout modèle capable de simuler in vitro les interactions entre organes.
Objectifs
La régulation de la glycémie est placée sous le contrôle de l’insuline dont la sécrétion est fortement stimulée par le glucose lui-même et pas du tout par le fructose, lequel représente pourtant 50% des sucres consommés dans notre alimentation. Le fructose est structurellement proche du glucose mais est transporté, notamment au niveau de l’intestin, par un transporteur spécifique qui ne transporte que le fructose et est ensuite métabolisé par une enzyme également spécifique au fructose. Les souris dont ce transporteur ou cette enzyme ne sont pas présents, absorbent mal le fructose et présentent une modification de leur flore intestinale. De façon intéressante, elles présentent également une forte augmentation de leur glycémie et une diminution de l’insuline dans le sang. De plus, ces variations de glycémie ne sont pas les mêmes en fonction de leur alimentation. Ainsi, La découverte d’une nouvelle voie de régulation de la glycémie via ce transporteur et cette enzyme spécifique du fructose liée à l’alimentation, semble très importante à caractériser et c'est le but du projet proposé. Ce travail vise à déterminer chez des souris mâles et femelles qui absorbent mal le fructose, quel est l’effet de l’alimentation sur la régulation de la glycémie et quels sont les mécanismes impliqués via l’utilisation de différents régimes connus pour interagir avec la flore intestinale.
Bénéfices attendus
Les caractéristiques observées chez les souris dépourvues du transporteur du fructose et de l’enzyme responsable de sa métabolisation, à savoir une importante augmentation de la glycémie et une baisse du taux circulant d’insuline, reflètent ce qui est observé dans le diabète de type 1. Le diabète de type 1 représente environ 10% des cas de diabètes en France et dans le monde. Depuis une vingtaine d’années, le nombre de personnes atteintes de diabète de type 1 ne cesse d’augmenter (+ 3 à 4% /an). Les raisons de ces évolutions sont inexpliquées à ce jour, mais certaines modifications de l’environnement et leurs interactions avec le génome sont suspectées telles que les facteurs nutritionnels ou la modification de la flore intestinale. Bien que le fructose soit suspecté de conduire à la mise en place d’un diabète de type 2 (mise en place progressive de l’insulino-résistance) le rôle de son transporteur et de la principale enzyme de son métabolisme, dans la sécrétion de l’insuline et dans la régulation de la glycémie n’a jamais été étudié. Notre projet permettra possiblement d’identifier une nouvelle voie impliquée dans cette régulation et peut-être de mettre en évidence des cibles thérapeutiques potentielles.
Procédures
Les animaux vigiles recevront 3 gavages de glucose (intervention d’une durée inférieure à 5 secondes), 1 injection (intervention d’une durée inférieure à 5 secondes), 5 petites coupures à l’extrémité de la queue (intervention d’une durée inférieure à 1 seconde) et ils auront au maximum 6 prélèvements sanguins (intervention d’une durée inférieure à 20 secondes).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress sur des temps très courts au cours de la contention nécessaire lors des gavages, prélèvements et de l’injection (moins de 20 secondes). Les animaux seront soumis à stress lors du passage de leur salle d’élevage à la salle d’expérimentation. Les animaux seront soumis à une légère douleur lors des prélèvements et lors de l’ injection. Les souris seront soumises à 2 périodes de jeûne (4 et 6h) ce qui n’entraine qu’une diminution modérée de la glycémie et aucune hypoglycémie.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié afin de prélever et analyser certains tissus (pancréas, foie, intestin et contenu de caecum).
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro ou ex vivo permettant de simuler les interactions inter-organes impliquées dans le contrôle de la glycémie d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des paramètres spécifiques à chaque souris (génétique, microbiote, alimentation) et biologiques obtenues à partir du sang (glycémie, insulinémie), des tissus producteurs d’hormones (pancréas), intestinaux (tissus permettant de stimuler la sécrétion d’insuline via la production de molécules de type hormonales) et impliqués dans le métabolisme des sucres (foie).
Réduction
Nous avons prévu d’inclure 10souris par groupe expérimental, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives. De plus, nous avons fait le choix d’utiliser les mêmes groupes de souris ente 6 et 19 semaines et de n’effectuer les prélèvements finaux de tissus qu’à 19 semaines afin de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront habitués à la contention avant le démarrage des gavages pour limier le stress lors de la procédure expérimentale. Les expérimentations étant effectuées dans une salle différente de la salle d’élevage les animaux seront habitués à la salle d’expérimentation et maintenus dans leur cage d’élevage avec les mêmes congénères afin de réduire le stress. Les animaux seront surveillés visuellement 1 fois par semaine et leur poids mesuré 1 fois par semaine. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques. De plus, les données préliminaires existantes ont été obtenues à partir de ces modèles animaux qui sont des modèles génétiques originaux disponibles uniquement chez les souris et surtout nécessaires pour décrypter le mécanisme posé ici (rôle du transporteur et du métabolisme du fructose dans la régulation de la glycémie). Il est désormais bien établi que la nutrition lors de la gestation et de l’allaitement, joue un rôle clé dans la programmation métabolique à long terme. Dans cette optique, l’alimentation durant les premières semaines de vie semble particulièrement déterminante dans l’établissement de la capacité à réguler la glycémie. Afin de clarifier l’impact de la nutrition au cours de cette période dite périnatale, nous comparerons les effets d’un apport en fibres et de la malabsorption du fructose sur la régulation de la glycémie, selon que ces interventions soient mises en place dès la naissance ou seulement à partir du sevrage. Nous avons choisi de travailler principalement sur des souris âgées de 6 semaines, car nos données préliminaires mettent en évidence des différences marquées au niveau de la glycémie et du taux d’insuline dans le sang à cet âge. Par ailleurs, afin d’évaluer la persistance ou non de ces différences au cours du temps, la mesure de la glycémie de ces mêmes animaux sera suivie et analysée également à 12 et 18 semaines d’âge.
Traitement de l’inflammation et de la fibrose hépatique par des molécules pharmacologiques chez le souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
1 440 souris, chacune pesée chaque semaine, gavée ou injectée, saignée neuf fois à l'état vigile puis mise à jeun dix-huit heures avant un dernier prélèvement, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant vingt semaines un régime riche en graisses ou en sucres destiné à leur faire développer une maladie du foie, puis des médicaments anti-inflammatoires dont l'équipe veut mesurer l'effet sur la fibrose. Toutes sont tuées à l'issue pour analyser leur foie. Le porteur affirme qu'un modèle animal est "indispensable" pour étudier ces effets de manière intégrée et que les explorations sur animal vigile ne peuvent pas être substituées par des approches in vitro.
Objectifs
Les maladies métaboliques du foie représentent plusieurs syndromes qui vont de la simple stéatose du foie à la stéatose du foie inflammatoire et peuvent évoluer vers la fibrose et le cancer. L'inflammation est un facteur clef de l'évolution de ces maladies. Dans ce projet, nous souhaitons tester des médicaments ayant un effet anti-inflammatoire. Lors de cette étude, des souris ayant développées ces maladies du foie par une alimentation riche en graisse et/ou en sucres seront traitées avec des médicaments et nous caractériserons l'évolution de ces maladies afin de voir les effets positifs de ces molécules et les voies impliquées.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet est la potentielle mise en évidence d'un effet anti-inflammatoire et anti-fibrosant d'une nouvelle molécule pharmacologique. Nous pourrons en plus de cette mise en évidence étudier les voies impliquées dans la protection d'un régime
Procédures
La contention, le gavage et les injections causent un stress et une douleur modérée et de courte durée pour les animaux. Les animaux auront des injections (durée 15 secondes) ou des gavages (durée 1 mn/souris) et seront pesés une fois par semaine (30 secondes/souris). Un prélèvement de sang sera effectué 9 fois et prendra 1 mn/souris. Ils seront soumis un changement de régime ainsi qu’à une mise à jeun de 18h avec un prélèvement de sang (1mn/souris). Tous les prélèvements sont effectuées sur souris vigiles.
Impact sur les animaux
La contention, le gavage et les injections sont des sources de stress modéré pour les animaux. Les animaux seront soumis à des régulations nutritionnelles avec des changements de régime pendant 20 semaines pouvant induire un stress léger par une prise de poids avec possiblement une activité réduite . La mise à jeun peut entraîner un stress modéré aux souris.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin d'analyser l'effet des molécules sur le développement de la fibrose hépatique.
Remplacement
L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier de manière intégrée les effets de ces molécules sur l’inflammation et la fibrose. Par ailleurs, l'identification et la validation de ces cibles thérapeutiques nécessite l'utilisation d'un modèle in vivo mimant le plus fidèlement la pathologie humaine ). La réalisation d'explorations fonctionnelles sur animal vigile ne peut donc pas être subsituée par des approches entièrement in vitro.
Réduction
Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux nécessaires afin de vérifier nos résultats et les valider. Un nombre minimum de souris sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
La durée des régimes utilisés et les traitements relatifs aux tests métaboliques seront réalisés selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum et lors de la mise à jeun l'accès à l'eau est conservé. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés entraînant la mise à mort anticipée si nécessaire. En effet, l’application des points limites établis pour chaque procédure de ce projet sera effectuée.
Choix des espèces
L’espèce souris a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons de souris adultes âgées de 10 à 30 semaines, car le métabolisme énergétique est régulé de manière différente chez les jeunes adultes et/ou pendant le vieillissement.
Révéler les fonctions émergentes de la mitochondrie dans le contrôle de l’inflammation
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une souris qui perd plus de 15 % de son poids ou dont la température corporelle chute de plus de quatre degrés est mise à mort, et aucun analgésique ni anti-inflammatoire ne peut être administré, ces molécules faussant les réponses immunitaires étudiées. 490 souris vont être utilisées sur cette base, toutes tuées à l'issue pour analyse de leur système immunitaire et des atteintes d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit un gavage, une injection, une infection bactérienne et deux prélèvements de sang sous anesthésie. Sur la réduction, le porteur écrit en une phrase que "des tests statistiques stringents" ajustent le nombre d'animaux, sans donner le moindre détail pour ces 490 souris.
Objectifs
Les mitochondries, des organelles bioénergétiques fondamentales, émergent comme des régulateurs importants pour la mise en place des réponses immunitaires. En particulier, un enzyme liée au métabolisme cellulaire et localisée dans les mitochondries semble représenter un point critique de régulation par les mitochondries. Notre projet consiste à explorer et déterminer le rôle de cette enzyme dans a mise en place de réponses immunitaires antibactériennes. Afin de valider nos découvertes obtenues in vitro dans un environnement immunitiaire complexe, nous devons effectuer différentes analyses dans des modèles d’infections bactériennes chez le petit animal (souris).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet seront, d'une part, la description de nouveaux mécanismes immunitaires nouveaux liant métabolisme mitochondrial et régulation des réponses immunitaires. D’autre part, la description de ces mécanismes permettra le développement de nouveaux outils thérapeutiques dans les pathologies liées aux infections microbiennes.
Procédures
Sur l'ensemble de l'étude et pour chaque animal, il est prévu: un gavage (intervention de 1 minutes), une injection (intervention de 1 minute), deux prélèvements sur animaux anesthésiés (prise de sang, intervention de 3 minutes) suivis d'une injection (intervention de 1 minute) .
Impact sur les animaux
Les injections sur animal vigil peuvent entraîner une legère gène de courte durée. Les infections bactériennes peuvent également occasionner une gène pour l'animal. Une légère gène peut-être occasionée par l'anesthésie et le prélèvement sanguin.
Devenir
Les animaux à l'issue de chaque procédure seront euthanasiés afin de permettre d'une part une analyse détaillée du système immunitaire et évaluer l'inflammation ainsi que les atteintes d'organes.
Remplacement
La réponse immunitaire fait appel à une très grande variété de cellules immunitaires qui interagissent entre elles et avec les pathogènes. Il n'existe donc pas de modèle in vitro permettant d'évaluer globalement ces processus. Néanmoins, une large phase d'expérimentation in vitro nous permettra de diminuer au maximum le nombre d'animaux, notamment en ciblant nos expériences sur les souches bactériennes les plus pertinentes.
Réduction
Des tests statistiques stringents sont utilisés afin d'ajuster le nombre d'animaux nécessaire.
Raffinement
Le principe de raffinement décrit au second alinéa de l'article R. 214-105 du code rural et de la pêche maritime sera appliqué. Le bien-être des souris sera pris en compte tout au long de la procédure expérimentale. Le bien-être animal sera évalué en utilisant des points limites décrits et gradés dans les procédures. Les souris seront hébergées dans des cages de 2 L, à raison de 5 animaux par cage. Chaque cage recevra un enrichissement du milieu. Pour réduire la douleur et la souffrance, les gestes techniques effectués sur les animaux seront réalisés par du personnel habilité et chevronné. Les injections intrapéritonéales seront effectuées selon les directives officielles du IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee). L'état des animaux sera évalué tout au long de leur vie selon une grille d'évaluation de l'état des animaux spécifique de l'animalerie, assez large pour détecter toute détresse ou stress. De plus, tout au long des procédures, l’état général des animaux sera évalué quotidiennement par le personnel de l'animalerie. Il est admis que si l’animal perd plus de 15% du poids du corps ou si la température corporelle diminue de plus de 4 degrés, il doit être euthanasié. L'utilisation d'analgésiques ou de molécules anti-inflammatoires est impossible ici car ces molécules influencent les réponse immunitaires.
Choix des espèces
Il n'existe pas de méthode alternative pour l'objectif de ce projet (évaluation de la réponse anti-microbienne suite à une altération du métabolisme cellulaire via la déficience d'une enzyme ou de la dynamique mitochondriale). Un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculiare de notre objet d'étude n'existe pas. Il est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude, sans l'utilisation de lignée de souris (sources bibliographiques consultées). Le modèle souris est un modèle privilègié car il présente de grandes similarités avec l'homme, en particulier en ce qui concerne le système immunitaire. La littérature abondante concernant les fonctions du système immunitaire et du métabolisme basée sur des études chez la souris permettra d'ajuster nos approches et de limiter l'utilisation d'animaux au strict minimum. Les animaux utilisés seront à minima de jeunes souris adultes totalement matures du l'âge varie entre 10 et 25 semaines.
Reproduction assistée chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Fournir à des clients des lots de souris homogènes, environ 1 100 prestations sur cinq ans, suppose ici 11 260 souris, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles reçoivent deux injections d'hormones à 48 heures d'intervalle pour produire un maximum d'embryons, les mâles subissent une vasectomie par ouverture de l'abdomen et cautérisation de l'épididyme, et les femelles receveuses une implantation d'embryons par la même voie. Les superovulées sont tuées pour récupérer les embryons, les receveuses mettent bas, élèvent et sèvrent les petits avant d'être autopsiées pour contrôle sanitaire, et les mâles vasectomisés sont utilisés dix-huit mois, au-delà desquels leur "efficacité" s'affaiblit. Le porteur attribue une part de la réduction du nombre d'animaux au fait d'avoir "éduqué" ses clients.
Objectifs
La reproduction assistée est utilisée chez la souris pour produire des modèles murins utilisables par la communauté scientifique dans les domaines de la recherche fondamentale, bio-médicale, pharmaceutique, pré-clinique… Afin d’assurer la reproductibilité des études et garantir les résultats obtenus, il est indispensable d’utiliser des modèles génétiquements contrôlés et aux statuts sanitaires conformes aux standards européens (Exempts d’Organismes Pathogène Spécifiés voire Exempts d’Organismes Opportunistes et Pathogènes Spécifiés). La reproduction assistée est également utilisée dans les élevages pour synchroniser les naissances dans le but d’obtenir des lots d’animaux génétiquement identiques et au même âge (cohortes) pour des besoins expérimentaux ou réguler la production en programmant les naissances au moment où elles sont nécessaires pour les chercheurs.
Bénéfices attendus
La reproduction assistée permet l’obtention de lots d’animaux aux statuts sanitaires et génétiques souhaités. Ceci permet aux chercheurs d’utiliser des animaux en bonne santé et génétiquements contrôlés dans le but d’assurer la reproductibilité et la fiabilité de leurs études. De plus, cette technique permet d'éviter la génération de nombreux animaux par des accouplements classiques nécessaires pour obtenir une cohorte homogène.
Procédures
Injection sur animaux vigiles: 1 injection d'anesthésique ou 2 injections d'hormones à 48h d'intervalle ou 1 injection de buprénorphine si besoin après la chirurgie. Injections sur animaux anesthésiés: 1 injection d'anesthésique local plus une injection de buprénorphine Chirurgie ne dépassant pas 15min par animal: vasectomie (laparotomie et cautérisation épididyme) , implantation embryonnaire (laparotomie et implantation infundibulaire)
Impact sur les animaux
Les nuisances et les effets indésirables sont liés essentiellement aux injections ou à la chirurgie: douleur ou rougeur au lieu d'injection ou d'incision/suture, douleur abdominale suite à la chirurgie, mortalité pendant l'anesthésie. Ce projet étant un renouvellement d'un précédent projet, notre expérience sur le précédent projet a montré que nos mesures de raffinement et nos pratiques ont eu un effet bénéfique en réduisant les nuisances à moins de 2% des animaux utilisés (essentiellement mortalité en cours d'anesthésie). Certaines prestations pourront impliquer l'utilisation d'animaux à phénotype potentiellement dommageable ou induire la naissance d'animaux à phénotype dommageable.
Devenir
L'ensemble des animaux issus des 3 procédures de ce projet seront mis à mort à la fin de la réalisation de chaque procédure. Les mâles vasectomisés seront utilisés pendant 18 mois pour générer des femelles pseudogestantes. Au delà de cet âge, leur "efficacité" s'affaiblit. Les femelles super-ovulées sont mise à mort afin de récupérer les embryons d'intérêt. Les femelles receveuses sont laissées en vie après la chirurgie implantatoire pour donner naissance aux petits, les élever et les sevrer. Ces femelles sont ensuite adressées au sevice de diagnostic microbiologique afin d'effectuer une autopsie et vérifer la conformité sanitaire des petits avant leur utilisation pour des projets de recherche.
Remplacement
L’objectif de ce projet étant la production de lots d’animaux pour divers projets de recherche, il est donc impossible, dans ce projet, de remplacer les animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu à été calculé afin de pouvoir réaliser l'ensemble de nos prestations (1100 environ sur 5 ans) en utilisant le nombre d'animaux maximum nécessaire. L’utilisation de lots d’animaux homogènes (âge, génotype et statut sanitaire) permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés et optimise les résultats obtenus (éviter les répétitions notamment). La super-ovulation (stimulation de production des embryons par une femelle) permet d’obtenir un maximum d’embryons en réduisant le nombre de femelles utilisées. La technique de transferts d’embryons permet de sélectionner les embryons réimplantés pour obtenir directement les animaux d’intérêts. Pour les cryopreservations de lignées, dès que les caracteristiques génétiques de la lignée le permettent, une congélation de sperme (plus rapide et nécessitant 1 ou 2 mâles maximum) est privilégiée plutôt qu'une cryopreservation d'embryons (besoin de 3-4 femelles minimum) afin de reduire le nombre d'animaux. Ce projet étant un renouvellement d'un projet précédent, nous avons optimisé nos pratiques et "éduqué" nos clients pour réduire au maximum l'utilisation d'animaux tout en maintenant la qualité de nos prestations.
Raffinement
Les animaux sont hébergés sous statut sanitaire contrôlé en accord avec la règlementation. Autant que possible, les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Les animaux ont un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 10h/14h pendant toute la durée de l’expérimentation. Pour les microchirurgies, le bien-être animal est assuré pendant et après l’opération. Au vu de la douleur évaluée (modérée, incision lombaire
Choix des espèces
La souris est l’animal de laboratoire le plus utilisé par la communauté scientifique. Elle est l’espèce utilisée par l’ensemble de nos utilisateurs en recherche fondamentale ou préclinique. Les animaux sont utilisés à partir de 3 semaines pour les femelles pré-pubères (super ovulation). Les mâles vasectomisés doivent être matures sexuellement (7-8 semaines) pour les accouplements contrôlés, ainsi que les femelles pseudo gestantes réimplantées.
Evaluation d’un peptide permettant la restauration d’un canal sodique afin d’eviter des troubles neurodeveloppementaux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
À un ou deux jours de vie, des souriceaux sont séparés de leur mère jusqu'à dix minutes pour recevoir une injection, un geste qui peut les faire saigner. Une partie d'entre eux est tuée à neuf jours pour enregistrer l'activité de leurs neurones, les autres subissent à vingt-trois jours un prélèvement de queue pour génotypage et la pose d'une puce sous la peau, puis huit tests comportementaux entre trente et quarante-quatre jours mesurant l'anxiété, les comportements répétitifs et la mémoire. 558 souris vont être utilisées au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie portant les mutations observées chez des enfants atteints de troubles neurodéveloppementaux graves, les autres utilisées comme témoins. Le cerveau est prélevé sur chacune après sa mise à mort.
Objectifs
Les canaux sodiques (protéines qui transportent des ions sodium) sont essentiels pour les activités électriques des neurones, base du fonctionnement du cerveau. De nombreuses mutations de canaux sodium causent des "Troubles tardifs neurodéveloppementaux graves de l’enfance", apparaissant entre 3 mois et quelques années. Des études fonctionnelles des mutations humaines ont proposé que les mutations induisent une réduction de la fonction d'un canal sodique particulier (50% de diminution d'activité). Un nouveau mécanisme pathologique pour les mutations causant des "Troubles tardifs neurodéveloppementaux graves de l’enfance" a été montré : elles diminuent la fonction des canaux mutés, mais il y a aussi un effet d'inhibition des canaux mutés sur les canaux non mutés (dominance négative). Cela entraîne une réduction de l'activité des canaux anormalement supérieure à 50 %. Il n’existe pas de traitement efficace pour ces troubles. Aucun médicament activateur de l'activité de canaux sodiques n’est disponible. Dans ce projet, nous testerons une nouvelle molécule qui bloque l'inhibition des canaux mutés sur les non mutés. L'effet attendu est que cette molécule puisse restaurer la fonction des canaux sodiques, améliorer le fonctionnement des neurones et donc atténuer les troubles observés sur les animaux. Nous utilisons des souris porteuses des mêmes mutations génétiques que celles observées chez les enfants atteints. Des enregistrements sur neurones permettent d'étudier en détail l'activité des canaux sodiques présents dans les neurones. Plusieurs tests comportementaux permettent de mesurer les troubles induits par la mutation (anxiété, comportement répétitif, mémoire, interaction sociale, …). Nous allons par conséquent injecter les animaux avec la molécule décrite ci-dessus et étudierons ensuite les conséquences sur l'activité électrique des neurones et sur le comportement. En cas de succès, ce serait la première molécule améliorant l'activité de ce type de canal et utilisable comme médicament. Cette stratégie serait aussi applicable à d'autres maladies dont le mécanisme est dû à un effet de dominance négative.
Bénéfices attendus
Nos résultats peuvent fournir des informations importantes sur les mécanismes des troubles neurodéveloppementaux en général, et notre stratégie thérapeutique pourrait également être utilisés pour des études sur d’autres pathologies impliquant des dominances négatives. Les maladies liées aux canaux sodiques qui nous intéressent sont considérées comme des maladies orphelines pour lesquelles aucune solution thérapeutique satisfaisante n’est disponible. Ici, nous avons défini une stratégie qui peut aider à réduire l’impact sévère de ces mutations sur les caractéristiques du système nerveux central. Il est important de souligner que l’utilisation d’une molécule bloquant la dominance négative d’un canal muté sur un canal non muté peut avoir la capacité de traiter des dysfonctionnements de canaux indépendamment de la nature de la mutation génétique et peut représenter une solution uniforme pour un ensemble de symptômes et de patients divers.
Procédures
Tous les animaux âgés de 1 ou 2 jours subiront une injection (15 sec environ). Dans une procédure, les animaux subiront à l'âge de 23 jours un prélèvement sur la queue pour génotypage (2 sec) et la pose d'une puce nécessaire à un test (5 sec) puis 8 tests comportementaux (durées allant de 6 à 40 min, âge 30-44 jours) afin de mesurer leur niveau d'anxiété, d'éventuels comportements répétitifs, leur mémoire.
Impact sur les animaux
Dans toutes les procédures, l'injection peut induire un saignement et nécessite une séparation maternelle pendant un maximum de 10 minutes, cela peut induire un stress léger pour la mère et le petit. Dans toutes les procédures les prélèvements pour génotypage peuvent provoquer un saignement. Dans une procédure l'implantation sous-cutanée d’une puce, peuvent induire une légère douleur passagère et une gêne. Un test comportemental peut induire un stress léger.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour prélever le cerveau.
Remplacement
Nous avons réalisé des expériences sur des cellules exprimant les canaux sodium mutés d'intérêt et démontré les effets du peptide d’intérêt. Les modèles animaux sont maintenant essentiels pour ce projet car ils permettront d’étudier les effets du peptide appliqué sur un organisme entier et faire preuve de concept pour une utilisation thérapeutique.
Réduction
Le nombre d’animaux à utiliser a été calculé par une analyse de puissance statistique. Nous utiliserons les souris mâles et femelles et les souris mutantes et non-mutantes de chaque portée, soit la quasi-totalité des animaux sauf pour une procédure ou la fenêtre d'âge utilisable est très restreinte d'ou l'utilisation de 1 à 3 souriceaux par portée (cela concerne 28+7=29 portées au maximum et 10 au minimum).
Raffinement
Une fois sevrés, les animaux seront élevés dans un environnement enrichi : avec matériau de nidification, buchette en bois et igloo en polycarbonate offrant un abri sombre. Les animaux seront régulièrement manipulés pour réduire le stress dû à la présence d’un humain et une grille d'observation sera utilisée pour évaluer les points limites et apporter les réponses adéquates, dont l'injection d'un antalgique en cas de douleur. Des périodes d’habituation seront réalisées pour diminuer le stress provoqué par les appareils.
Choix des espèces
La souris permet un élevage rapide avec une période de gestation de 21 jours et un sevrage également après 21 jours. Nous avons fait la caractérisation phénotypique des 2 lignées, par conséquent nous connaissons bien ce modèle et les résultats attendus lors des tests comportementaux. Pour toutes les procédures, les souriceaux seront injectés à 1 ou 2 jours afin d’agir dès la synthèse des protéines canal. Une procédure nécessite de mettre à mort les animaux à 9 jours pour pouvoir enregistrer l'activité des neurones. L'autre procédure commence après le sevrage (23 jours) et les tests comportementaux entre 30 et 44 jours car après les problèmes comportementaux observés sont moins marqués.
Etude des neuropathies auditives
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Une anesthésie générale d'une heure quarante, répétée une à deux fois, est imposée à des souriceaux de trois semaines à un mois pour mesurer leurs seuils auditifs. 288 souris vont être utilisées, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance légère, le porteur écrivant qu'"en principe aucun animal ne devrait souffrir". L'étude porte sur le rôle du fer dans l'audition, une carence entraînant des pertes auditives chez l'humain sans que les mécanismes en soient connus. Toutes les souris sont tuées à la fin de l'étude pour que soit prélevé leur organe de l'audition.
Objectifs
Chez l’homme, une modification du taux de fer dans le sang entraine des pertes auditives. Cependant les mécanismes responsables de ce type de surdité sont inconnus. Il est donc nécessaire de déterminer le rôle du fer dans le système auditif pour envisager des stratégies de prévention et de thérapie chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les surdités sont un problème majeur de santé publique. L’organisation Mondiale de la Santé estime que 1,5 milliard de personnes dans le monde présentent des déficits auditifs et que ce chiffre devrait atteindre 2,5 milliards d'ici 2050. Il est reconnu que le traumatisme sonore est l'une des causes les plus fréquentes de surdité et un problème coûteux au sein du monde du travail. Outre la surdité, les traumatismes sonores sont responsables de la survenue d’acouphènes (sifflements, bourdonnements d’oreille), voire d’hyperacousie douloureuse (intolérance au bruit). L’identification de facteurs de prédisposition à des surdités est donc essentielle pour envisager des stratégies thérapeutiques. Chez l’homme, une modification du taux de fer dans le sang entraîne des pertes auditives. Cependant les mécanismes responsables de ce type de surdité sont inconnus. Ici, nous déterminerons si une atteinte auditive est liée à un déficit en fer. Ce projet a pour finalité d’améliorer la santé auditive chez l’homme, à savoir de développer des stratégies de prévention et de thérapie et notamment chez des patients ayant une carence en fer.
Procédures
LLes seuils auditifs des animaux seront mesurés en réponse à des sons. En principe aucun animal ne devrait souffrir au cours de la mise en œuvre de ce projet car les tests auditifs sont tous réalisés sous anesthésie générale. Cette procédure dure 1h40 et sera réalisée une à deux seule fois maximum chez les animaux âgés de 3 semaines à 1 mois. Tout au long de l'anesthésie, l’expérimentateur surveille attentivement la profondeur de l'anesthésie et le bien-être de l'animal. Le pouls et la température corporelle sont monitorées durant toute l'anesthésie. A l’issue des tests, les animaux sont placés en zone de réveil. Après leur réveil, ils sont réintroduits dans leur cage habituelle et le suivi consiste en une visite quotidienne.
Impact sur les animaux
L’exposition sonore utilisé dans ce projet a déjà été utilisé dans un autre laboratoire et est connu pour ne pas entraîner de surdité chez l’animal ni d’effets indésirables post-exposition. Les niveaux sonores utilisés dans ce projet sont bien inférieurs au seuil de la douleur de l’animal.
Devenir
A la fin de l’étude, toutes les souris seront euthanasiées. Cela est nécessaire pour permettre de prélever l’organe périphérique de l’audition et de réaliser des observations morphologiques et biochimiques.
Remplacement
Comprendre l’origine des surdités chez l’homme pour développer des thérapies nécessite de reproduire le plus fidèlement possible ces déficits sensoriels. Cependant, il n’existe pas de modèles issus de culture cellulaire qui miment tous les compartiments de l’oreille humaine. Cette dernière est composée d’un pavillon externe, d’une oreille moyenne, avec les osselets et le tympan, et d’une oreille interne, qui contient des fluides et des cellules spécialisées. Ces trois compartiments permettent de détecter les ondes sonores et les transforment en message compréhensible par le cerveau. Une approche alternative est la modélisation mathématique de l’audition humaine. Si cette approche nous permet de mimer le fonctionnement de l’oreille, cette technique repose sur des données préalablement acquises et doit être validée expérimentalement.
Réduction
Nous avons utilisé un logiciel de statistique pour calculer que l'inclusion de 12 souris par groupe expérimental est suffisante pour obtenir des résultats fiables et significatifs tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les souris sont examinées quotidiennement pour détecter d’éventuelles lésions cutanées et s’assurer qu’il n’y a pas d’infections. On cherche aussi des signes de douleur ou de souffrance, en utilisant des méthodes validées d’évaluation de la douleur. Par exemple en surveillant la perte de poids ou les changements dans leur comportement.
Choix des espèces
Le système auditif périphérique de la souris a une organisation similaire à celui de l’homme, à savoir des cellules sensorielles dont la fonction et l’anatomie sont identiques entre les deux espèces. Chez la souris, l’audition commence 10 à 12 jours après la naissance et se termine à 3 semaines post-natales. En raison de la maturation du système auditif périphérique, l'exploration fonctionnelle aura donc lieu entre 3 semaines à 1 mois après la naissance.
Immunité anti-tumorale d’un nouveau composé synthétique
- Recherche appliquée
- Cancers
760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de leurs tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales sous anesthésie générale, puis jusqu'à neuf injections hebdomadaires sur animal vigile, la tumeur étant mesurée au pied à coulisse ou par imagerie tous les trois jours. Le composé testé a déjà montré une forte activité antitumorale, y compris sur une xénogreffe de cancer du poumon, ce qui l'oriente selon le porteur vers des essais cliniques. Il écrit qu'il est "absolument indispensable" de passer par un modèle vivant pour confirmer que cette efficacité passe par le système immunitaire.
Objectifs
Les microtubules sont les composants majeurs du cytosquelette de la cellule et sont composés d’un seul type de protéine : la tubuline. Ils sont impliqués notamment dans la division cellulaire et la vascularisation tumorale. C’est pourquoi, en chimiothérapie antitumorale, cibler les microtubules est la stratégie thérapeutique à large spectre la plus efficace. Des petites molécules appelées agents ciblant les microtubules sont responsables de la régulation de la tubuline. Une société a développé un nouvel agent synthétique capable de réduler la tubuline et montrant une forte activité antitumorale ainsi que la capacité à outrepasser les mécanismes de résistance habituels. De plus, cette forte activité est également observée dans un modèle de xénogreffe de cancer du poumon non à petites cellules, orientant ainsi ce composé vers des essais cliniques en tant que nouveau médicament anticancéreux prometteur. Nos résultats in vitro (données non publiées) nous ont aussi permis d’observer que ce composé active la mort cellulaire immunogène, c’est-à-dire que le système immunitaire se retrouve activé par la mort des cellules tumorales. C’est pourquoi, nous souhaitons confirmer in vivo que l’efficacité antitumoral de ce composé synthétique est lié à l’activation du système immunitaire.
Bénéfices attendus
Notre composé a déjà démontré un fort potentiel in vitro pour le traitement du cancer du poumon. Cette étude in vivo explore le potentiel immunogène et l'efficacité d'un schéma thérapeutique combiné à une immunothérapie conventionnelle par blocage des points de contrôle immunitaire. Ainsi, cette étude préclinique ouvrira la voie à des essais cliniques ultérieurs et à une éventuelle homologation clinique.
Procédures
Les animaux recevront une injection sous anesthésie générale (2min) puis deux injections sous anesthésie locale (vigile,
Impact sur les animaux
Les nuisances découleront des interventions et greffes de cellules tumorales sous anesthésie générale, des injections de traitements, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse ou d’imagerie tous les trois jours. Ces différentes manipulations peuvent entraîner du stress chez l’animal et les croissances tumorales en sous-cutanées peuvent entraîner des douleurs locales et modérées. Une perte d’appétit modérée et donc une perte de poids modérée peuvent apparaître chez la souris suite aux traitements médicamenteux.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées pour analyse des tumeurs après traitement, post-mortem.
Remplacement
Ce projet ayant pour objectif de tester si notre nouveau composé synthétique induit une réduction de la croissance tumorale avec une activation du système immunitaire, il est donc nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument indispensable pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo.
Réduction
Nous avons déterminé le nombre minimum d’animaux par groupe statistiquement nécessaire afin de réaliser notre étude. Nous aurons donc 9 animaux par groupe. Une souris supplémentaire a été ajoutée par groupe (soit un total de 9+1 souris par groupe) pour prendre en compte d’éventuelles exclusions d’animaux dans l’étude, telles que des tumeurs hétérogènes au moment du traitement, des problèmes comportementaux, l’atteint précoce d’un point limite, où la mort pendant l’expérimentation. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lors que cela est possible. L’étude sera interrompue si l’hypothèse initiale n’est pas validée lors des premières procédures, les procédures suivantes ne seront pas entreprises. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tous changements. Nous enrichirons le milieu à l’aide de sizzlenests, tunnels, maisons. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes). La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons. Tout d’abord, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue, ce qui nous permet un contrôle précis de nos expérimentations. Ensuite, la souris est un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Et pour finir, la méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une grande pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.
Caractérisation de l’importance fonctionnelle de NDRG1 (N-myc downstream-regulated gene 1) endothélial dans l’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un accident vasculaire cérébral est provoqué chez des souris au cours d'une anesthésie qui peut durer quatre-vingts minutes, précédée d'une injection de virus modifié et suivie de deux passages en IRM. 388 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau et leur sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'AVC peut entraîner une baisse de force, des difficultés à marcher, des troubles de la mémoire et de l'anxiété, effets que le porteur classe comme légers, et le calcul d'effectif intègre une mortalité d'environ 15 %. Une série de tests comportementaux évalue les conséquences de l'AVC sans qu'aucun soit nommé, et les souris âgées, pourtant plus proches des patients, sont écartées parce qu'elles supportent mal les longues anesthésies.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d'une protéine appelée NDRG1 (le gène 1 régulé en aval de N-myc), produite par les cellules endothéliales qui tapissent l’intérieur des vaisseaux sanguins du cerveau, lors d’un accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique. Pour cela, une approche génétique utilisant un virus modifié (appelé AAV) permettra de bloquer spécifiquement la production de NDRG1 dans ces cellules. L’objectif est de savoir si cette protéine aide à protéger la barrière hémato-encéphalique, une structure qui contrôle ce qui entre et sort du cerveau, et si son absence pourrait favoriser l’apparition de saignements secondaires après un AVC. Deux types d’AVC seront étudiés, selon la nature du caillot qui bloque le vaisseau (riche en plaquettes ou en fibrine), car cela peut influencer la gravité de l’AVC. Le traitement utilisé en clinique, appelé tPA, qui aide à dissoudre le caillot et à rétablir la circulation du sang, sera également utilisé dans cette étude. L’objectif final est de déterminer comment l’absence de NDRG1 dans les cellules endothéliales influence les effets de ce traitement et la récupération après un AVC.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mettre en lumière le rôle essentiel de la protéine NDRG1 dans le maintien du bon fonctionnement de la barrière hémato-encéphalique lors d’un accident vasculaire cérébral (AVC). Les données obtenues pourraient également ouvrir de nouvelles perspectives pour le développement de stratégies thérapeutiques innovantes, ciblant spécifiquement cette protéine, afin d’améliorer la prise en charge des patients victimes d’AVC.
Procédures
Dans ce projet, deux types de protocoles seront appliqués aux souris, chacun impliquant plusieurs étapes sous anesthésie pour garantir leur bien-être. Pour les souris du protocole 1, cinq anesthésies seront nécessaires : la première servira à poser une petite aiguille dans une veine de la queue pour permettre l’injection du virus modifié (un outil génétique appelé AAV) (15 min). La deuxième permettra de provoquer un AVC dans des conditions contrôlées et d’insérer à nouveau une aiguille dans une veine de la queue pour permettre l’injection du traitement (80 min). La troisième et la quatrième seront utilisées pour réaliser des images du cerveau à l’aide d’un imageur (Imagerie par résonnance magnétique, IRM) (20 min), avec l’injection intraveineuse d’un produit de contraste pour mieux visualiser les structures cérébrales (15 min). La cinquième anesthésie servira à prélever un échantillon de sang et à procéder à la mise de l’animal (10 min). Ces souris suivront également une série de tests comportementaux pour évaluer les conséquences de l’AVC. Les souris du protocole 2 passeront par quatre anesthésies : une pour l’injection du virus modifié (AAV) (15 min), une autre pour provoquer l’AVC (50 min), une pour faire des images du cerveau (10 min), et une dernière pour le prélèvement sanguin et mettre à mort l’animal (10 min).
Impact sur les animaux
Certaines gênes ou effets secondaires peuvent apparaître au cours de l’étude, mais ils sont limités et surveillés de près. Parmi les effets possibles : une perte de poids peut survenir après les anesthésies ou la procédure provoquant l’AVC (effet indésirable léger). Des douleurs sont possibles après les interventions chirurgicales (injections dans la veine et induction de l’AVC) (effets indésirables modérés). Du stress peut être observé au début des tests comportementaux, le temps que les animaux s’habituent à leur environnement (effet indésirable léger). Enfin, l’AVC pourrait entraîner une baisse de la force, des difficultés à marcher, des changements dans la perception de la douleur, des troubles de la mémoire, de l’apprentissage ou encore de l’anxiété (effets indésirables légers).
Devenir
Tous les animaux de la procédure 1 et 2 seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer le cerveau et le sang pour des analyses.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants, car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est, avec le rat, l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Dans ce projet, le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, conformément aux principes éthiques en recherche animale. Ce nombre a été calculé en fonction de la précision des méthodes utilisées, des résultats déjà obtenus dans notre laboratoire, et des données publiées dans la littérature scientifique. Des outils statistiques ont été utilisés pour déterminer combien d’animaux sont nécessaires afin d’obtenir des résultats fiables, tout en limitant leur utilisation. Pour la première procédure incluant les tests comportementaux (qui évaluent la motricité ou la sensibilité après un AVC), les calculs montrent qu’il faut environ 18 souris par groupe, en prenant en compte un risque de mortalité d’environ 15 %. Pour la seconde procédure, le nombre d’animaux a aussi été déterminé en s’appuyant sur les expériences passées du laboratoire. Un groupe supplémentaire de 4 souris permettra de mettre au point de nouvelles méthodes d’analyse, jamais encore réalisées dans notre équipe. Si ces tests fonctionnent bien, ces animaux seront intégrés dans l’étude. Grâce à des techniques d’imagerie non invasive, il est possible d’obtenir de nombreuses données sur un même animal, ce qui permet aussi de réduire leur nombre total. Au final, 388 animaux répartis en 21 groupes expérimentaux seront nécessaires pour l’ensemble de l’étude. Chaque groupe comptera entre 18 et 21 souris, selon les besoins expérimentaux.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les animaux recevront une injection sous-cutanée d'un analgésique/antidouleur pour prévenir toute douleur occasionnée par la procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum et une période d’une semaine d’acclimatation sera respectée avant le début du protocole. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Après le réveil des animaux à l'issue de la chirurgie, les animaux seront observés jusqu'à l'obtention d'un comportement animal normal. La moitié de la cage des animaux sera placée sur une couverture chauffante leur donnant le choix quant à la température de la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l'alimentation après la chirurgie. Le transport des animaux en salle d'expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température en salle d'expérimentation est contrôlée et adaptée au bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence pour de l’ischémie cérébrale. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la réponse cérébrale après un AVC ischémique. Les souris utilisées dans le projet seront âgées de 8-15 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ces âges correspondent à ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC. De plus, les souris seront soumises à plusieurs anesthésies, dont une anesthésie pouvant durer jusqu’à 80 min pour les souris de la procédure 1. Bien que l’âge soit un facteur de risque majeur de l’AVC, les souris agées ne tolèrent pas bien les longues périodes d’anesthésie.
Caractérisation d’une nanoplateforme inorganique radiomarquée pour le ciblage de tumeurs. (1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour savoir si des nanoparticules radiomarquées échappent assez longtemps au foie et aux défenses immunitaires pour atteindre une tumeur, 106 souris vont être utilisées, toutes tuées puis disséquées. Trente-six d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance légère et soixante-dix d'un niveau modéré, ces dernières recevant une greffe de cellules cancéreuses sous la peau. Chaque animal passe cinq séances d'imagerie nucléaire de dix minutes sous anesthésie, après injection d'un produit radioactif dans la veine de la queue, et un transport de deux heures trente à trois heures entre deux établissements. Les souris qui perdent trop de poids, deviennent léthargiques ou développent une tumeur jugée trop grosse sont retirées de l'étude et tuées.
Objectifs
L'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une technique d'imagerie médicale qui permet d'obtenir des vues en deux ou trois dimensions de l'intérieur du corps avec une très grande précision anatomique. Elle n'utilise pas de rayons X, mais un champ magnétique puissant et des ondes radio pour créer des images détaillées des organes et des tissus mous. Ce projet se déroule entre deux EU différentes. Après avoir mené une première étude en laboratoire sur des cellules, ce projet a pour but de tester, sur des animaux vivants, de nouvelles substances issues des nanotechnologies. Ces substances pourraient améliorer les images médicales utilisées pour détecter et suivre l’efficacité du traitment du cancer. Elles combinent les avantages de deux techniques d'imagerie : la précision de l’IRM et la sensibilité de l’imagerie nucléaire. Cependant, un gros obstacle est que notre corps élimine ces substances très rapidement, en quelques minutes seulement. Le foie et le système immunitaire les repèrent et les capturent avant qu’elles n’aient le temps d’atteindre la tumeur. Pour éviter cela, on modifie leur surface avec des polymères (une sorte de revêtement spécial) pour qu’elles deviennent invisibles aux défenses du corps. Cela leur permet de rester plus longtemps dans le sang et d’avoir plus de chances d’atteindre la tumeur. Dans ce projet, nous allons d'abord tester trois types de ces revêtements et choisir ceux qui rendent les substances les plus « invisibles » pour le corps. Le but est qu’elles restent plusieurs heures dans le sang. Ensuite, sur des souris porteuses de tumeurs, nous testerons les deux meilleures versions. L’imagerie se fera avec un appareil spécialement conçu pour les petits animaux, sous anesthésie, afin d’éviter qu’ils ne bougent pendant la prise des images.
Bénéfices attendus
Ces nouvelles substances sont conçues pour que l’on puisse injecter des doses plus faibles et obtenir de meilleures images médicales. En effet, une seule méthode d’imagerie ne suffit pas toujours pour poser un diagnostic précis. C’est pourquoi il devient important de créer des produits capables de combiner deux techniques d’imagerie différentes et de viser précisément la zone malade. Ces produits "bimodaux" permettraient d’obtenir plus rapidement un diagnostic fiable et de choisir un traitement mieux adapté. Cela réduirait les effets secondaires, améliorerait la qualité des soins pour les patients et ferait aussi baisser les coûts pour le système de santé. Des études montrent que les professionnels de santé sont particulièrement intéressés par des substances qui combinent la précision des images IRM avec la sensibilité de l’imagerie nucléaire, car ces deux méthodes se complètent bien. Il existe d’ailleurs déjà des machines capables de faire ces deux types d’images en même temps. Pourtant, même si plusieurs études ont proposé des solutions, aucun produit de ce type n’est encore disponible pour un usage médical. Les nanomatériaux représentent de bons candidats pour développer ces outils, car ils peuvent être facilement modifiés pour mieux cibler les zones malades et combiner plusieurs fonctions.
Procédures
Suivant les procédures les animaux serons soumis : dans l'UE1 à une Injection de cellules cancéreuses sous la peau, cette étape dure environ 20 secondes. Elle est réalisée pendant que l’animal est endormi (sous anesthésie) afin de garantir un geste précis et sans douleur; et dans l'EU2 à cinq séances d’imagerie nucléaire, ces examens permettent d’observer ce qui se passe à l’intérieur du corps sans chirurgie. Ils sont réalisés sur des animaux anesthésiés pour qu’ils restent immobiles. Chaque séance dure environ 10 minutes et ne cause ni douleur ni traumatisme. Il y aura une injection intraveineuse sous anesthésie dans la veine de la queue de l’animal, sous anesthésie (procédure complète, incluant la préparation nécessite 10 minutes) qui permet d’administrer le produit radioactif nécessaire à l’imagerie.
Impact sur les animaux
L’imagerie nucléaire utilisée est non invasive et ne provoque que très peu de gêne pour les animaux. Le modèle de cancer, de sévérité modérée, ne sera utilisé qu’après une première phase de sélection des nanoparticules les plus prometteuses, afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Des antidouleurs seront administrés après la chirurgie si besoin.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédures expérimentales. Les animaux ayant reçu injection des nanoparticules seront disséqués post-mortem pour analyse de leurs organes.
Remplacement
Certaines étapes, comme la vérification de la stabilité et de la toxicité des nanoparticules, seront réalisées entièrement en laboratoire, sans animaux. En revanche, pour comprendre comment ces nanoparticules se répartissent dans le corps, sont éliminées (par les urines ou le foie) et ciblent les tumeurs, des tests sur de petits animaux sont indispensables. Ces études commenceront chez l’animal sain, pour évaluer leur comportement, avant de les tester sur un modèle tumoral afin de mesurer leur capacité à atteindre la tumeur.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, une méthode d’imagerie sera utilisée pour suivre les mêmes souris à différents moments (4h et 24h après l’injection). Cela réduit la variabilité entre les animaux et permet d’en limiter le nombre pour des temps différents. L’imagerie permettra de mesurer la répartition de nos nanoparticules dans les organes. Les analyses sur organes après mise à mort ne seront réalisées que pour les deux nanoparticules les plus prometteuses et aux moments les plus pertinents, identifiés grâce aux images, ce qui permet de réduire significativement le nombre total d’animaux.
Raffinement
La première phase de tests sera réalisée sur des souris saines afin de limiter l’utilisation d’animaux porteurs de tumeurs. Tous les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur. Ceux montrant des signes de souffrance (perte de poids importante, léthargie, tumeur trop grosse) seront retirés de l’étude et mis à mort. Un enrichissement adapté sera prévu dans chaque cage (igloo, tunnel, etc.). Pour les souris recevant une greffe de cellules tumorales, un antidouleur sera injecté avant l’intervention. Les animaux seront gardés au chaud et surveillés jusqu’à leur réveil. Si des signes de douleur apparaissent une nouvelle dose d’antidouleur sera administrée chaque jour jusqu’à amélioration. Un transport des animaux entre 2 EU sera fait par un transporteur agréé avec enrichissement dans les cages pour une durée de 2h30-3h.
Choix des espèces
Le modèle de souris est bien adapté pour évaluer les agents de contraste en imagerie. Comme chez l’humain, la souris possède une vésicule biliaire, ce qui permet d’observer une possible élimination par le foie. Le modèle de tumeur sous la peau est bien maîtrisé. Les souris utilisées seront jeunes adultes (entre 7 et 16 semaines), ayant atteint leur maturité. Pour étudier un effet spécifique tumoral des souris plus jeunes (6 semaines) recevront une greffe de cellules cancéreuses, et seront ensuite examinées par imagerie entre 7 et 10 semaines.
Physiopathologie du nœud sino-atrial cardiaque : implication de la protéine kinase AMPc-dépendante
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Toutes tuées pour que leur cœur soit prélevé et étudié hors du corps, 652 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère pour 604 d'entre elles et modéré pour 48. Ces 48 souris reçoivent un capteur télémétrique implanté sous la peau au cours d'une chirurgie de dix minutes, quatre-vingts autres passent un électrocardiogramme mensuel sous anesthésie d'une heure, et aucune procédure n'est décrite pour les plus de cinq cents restantes. Trois gavages et une injection d'agents pharmacologiques complètent le protocole, destiné à comprendre comment l'adrénaline accélère le cœur et pourquoi le nœud sinusal se dérègle avec l'âge. Le porteur écrit vouloir des conditions telles que les souris "ne subissent aucun stress", et présente la mise à mort comme un moyen d'éviter "toute souffrance inutile à l'animal".
Objectifs
Au cours d'une vie humaine, le cœur bat en moyenne plus de 2,5 milliards de fois. L’origine du battement cardiaque est un évènement électrique, provenant d’une petite région du cœur aux propriétés particulières, appelée le nœud sinusal. Chez les personnes âgées, ou dans le contexte d’une maladie cardiaque, il est fréquent que le cœur batte trop lentement et de façon irrégulière : c’est la dysfonction sinusale. Cette maladie entraîne de la fatigue, des essoufflements et des syncopes et dans les cas les plus graves, elle peut conduire à une mort subite. Les mécanismes qui mènent à ces dysfonctions ne sont pas bien compris et les patients qui en souffrent nécessitent le plus souvent l’implantation d’un stimulateur cardiaque, impliquant des contraintes et limitations (durée de vie limitée de l’appareil, coût financier important et complications suite à l’implantation). La dysfonction sinusale représente donc un enjeu de santé publique et le projet présenté se propose de mieux comprendre les mécanismes de cette maladie. Pour cela, nous auront recours à des modèles de souris génétiquement modifiées qui permettront de comprendre pour la première fois la fonction d’un gène présumé important dans l’activité électrique du nœud sinusal et dans le développement de la dysfonction sinusale. Une meilleure compréhension de ces mécanismes est importante afin d’être en mesure d’offrir de nouvelles perspectives thérapeutiques alternatives au stimulateur cardiaque.
Bénéfices attendus
L’ensemble de cette étude permettra de clarifier un mécanisme important par lequel l’adrénaline accélère le cœur, et les conséquences physiopathologiques de leur dérégulation sur la fonction du nœud sino-atrial cardiaque. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait être particulièrement bénéfique pour l’homme car la dysfonction sinusale représente un des principaux troubles du rythme cardiaque chez le sujet âgé mais elle est aussi fréquente dans plusieurs pathologies communes comme le diabète de type II et l’insuffisance cardiaque. La dysfonction sinusale entraîne de la fatigue, des palpitations mais également des vertiges, voire des syncopes et dans les cas les plus graves, des morts subites. A ce jour, la seule thérapie disponible est l’implantation d’un pacemaker cardiaque artificiel. Environ 60% des implantations de pacemakers (plus d’1 million par an dans le monde) sont liées à la dysfonction sinusale. Ainsi, ce projet présente des bénéfices à court terme pour la recherche fondamentale pour améliorer notre compréhension des mécanismes physiopathologiques de l’automatisme cardiaque. A plus long terme, il revêt un intérêt majeur pour la santé humaine car il pourrait en effet permettre de développer de nouvelles pistes thérapeutiques pour le contrôle de la fréquence cardiaque dans les maladies cardiovasculaires et le vieillissement.
Procédures
3 gavages d’une durée de 1 min par gavage sur animaux conscients et 1 injection sous anesthésie générale d’une durée de 3 secondes par injection. 48 animaux : Une chirurgie sous anesthésie générale et d’une durée de 10 minute pour une implantation d’un capteur télémétrique en sous cutanée. On évaluera le rythme cardiaque sur animaux vigiles sur la période jour/nuit puis en réponse à l’administration d’agents pharmacologiques par injection. 80 animaux : Pour un suivi du rythme cardiaque, chaque souris aura un électrocardiogramme de surface tous les mois. Cette intervention dure une heure maximum et les souris sont anesthésiées sur cette période
Impact sur les animaux
Dans le cadre de cette étude, certaines manipulations seront réalisées sur des souris. Par exemple, on leur administrera des substances par voie orale ou par injection dans l’abdomen. Ces gestes peuvent provoquer une légère douleur, gêne et un stress ponctuel chez l’animal lié à sa manipulation. Aucun produit n’est administré à des doses entraînant des effets délétères pour l’animal. Des capteurs seront implantés sous la peau pour enregistrer l’activité cardiaque. Cette intervention sera réalisée sous anesthésie. Une douleur légère peut apparaître lors du réveil et la gêne liée à cette opération est estimée à deux semaines, incluant une phase de récupération et une phase expérimentale. Les animaux seront surveillés quotidiennement et durant les 72h post-opération ils seront sous antidouleur. L’enregistrement du rythme cardiaque pourra entraîner un stress lié à une injection unique et à un bruit de courte durée. L’examen en lui-même est réalisé sous anesthésie et ne cause pas de douleur. Au cours de l’anesthésie l’animal sera placé sur un tapis chauffant et de la crème oculaire sera appliquée afin d’éviter l’assèchement des yeux. Les aiguilles des capteurs seront insérées en sous la peau au niveau des pattes. Cela peut occasionner une douleur légère après le réveil. La durée de cette nuisance est d’une heure. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Pour l’ensemble des animaux, des critères précis d'observation sont définis. Si un animal présente des signes critiques, il sera euthanasié sans douleur selon les procédures en vigueur.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés afin de permettre le prélèvement du cœur, qui est ensuite étudié en dehors du corps. Cette approche est essentielle car certaines analyses précises du fonctionnement cardiaque, notamment sur le rythme spontané et les mécanismes régulant l’activité du cœur, ne peuvent être réalisées que sur un organe isolé, dans des conditions contrôlées impossibles à obtenir chez un animal vivant. Travailler sur le cœur après la mise à mort permet donc d’approfondir la compréhension des mécanismes physiologiques et pathologiques du rythme cardiaque, tout en évitant toute souffrance inutile à l’animal.
Remplacement
Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d’étudier l’implication d’un acteur majeur dans l’automatisme cardiaque dans un contexte physiologique et physiopathologique. De plus, il se justifie par l’impossibilité d’obtenir des lignées de cellules cardiaques automatiques du cœur adultes fonctionnelles. Des résultats préliminaires obtenus ex vivo dans le cadre du projet montrent l’implication de cet acteur dans la régulation de la fréquence cardiaque.
Réduction
Des souris des deux sexes seront utilisées dans ce projet et ceci permettra de réduire le nombre d'animaux produits. Une planification minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité statistique de l’étude, et en conservant une puissance statistique suffisante pour observer un effet. Afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés, notre étude réalise un suivie de la fréquence cardiaque sur animaux anesthésié. Dans la mesure du possible, les cellules et les tissus sont partagés afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s’assurer qu’ils ne subissent aucun stress. En cas de douleur, même potentielle post-opératoire, les animaux seront sous antidouleur. Les procédures pouvant générer de la douleur ou un stress seront réalisées sous anésthésie. Au quotidien, l’aspect des souris sera examiné (poids, comportement, état du pelage, prostration éventuelle) et selon le problème l’animal sera pris en charge de façon adaptée (nourriture supplémentaire, changement de groupe social, ajout d’enrichissement). Si un animal souffre trop, il sera euthanasié par une technique qui ne procure aucune douleur. Afin d’améliorer leurs conditions d’hébergement de l’enrichissement sera ajouté dans leurs cages et des groupes compatibles seront formés.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée dans la recherche car le développement de la génétique de la souris en fait un modèle unique pour déterminer l’implication d’un gène d’intérêt dans un processus physiologique ou pathologique. Notre modèle d’invalidité étant inductible et tissu spécifique nous pouvons travailler sur un gène normalement létal à l'état embryonnaire. Cela permet à la souris de se développer dans les mêmes conditions qu’une souris sauvage. Des souris adultes âgées de 8 semaines à 24 mois seront utilisées lors de ce projet. Cela se justifie car la dysfonction sinusale est une pathologie qui se déclenche essentiellement à l’âge adulte mais peut être asymptomatique jusqu’à l’âge senior de 65 ans chez l’Homme.
Rôle des senseurs métaboliques dans le comportement et la motivation alimentaires chez un modèle murin de dénutrition_Amendement 1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une restriction alimentaire de trois à six semaines, la pose de canules cérébrales ou d'une pompe osmotique sous la peau lors d'une chirurgie de 45 minutes à une heure, huit injections directement dans le cerveau et des prélèvements de sang à la queue deux à trois fois par semaine. L'objectif déclaré est de comprendre pourquoi l'anorexie mentale persiste chez les patientes, en affamant des souris jusqu'à reproduire leur état de dénutrition. Un amendement ajoute des souris supplémentaires pour "confirmer et valider" des résultats déjà obtenus, et le porteur écrit que des explorations comportementales complexes sur animal vigile ne peuvent pas être remplacées par des approches in vitro.
Objectifs
L’anorexie mentale est un trouble des conduites alimentaires qui se caractérise par une restriction alimentaire et une activité physique compulsives aboutissant à une dénutrition chronique et à une détérioration de la santé physique et mentale. Elle a le taux de mortalité le plus élevé de tous les troubles psychiatriques et il n’existe, à ce jour, aucun traitement pharmacologique efficace. D’autre part, les taux de rechute sont importants (>40%) et la pathologieévolue souvent de façon chronique. La compréhension des mécanismes qui sous-tendent l’anorexie mentale et son évolution est donc essentielle et représente un enjeu de santé publique. L’objectif de ce projet, mené dans un modèle murin qui mime l’état de dénutrition des patientes, est de déterminer le rôle de facteurs sanguins qui sont dérégulés au cours de la dénutrition chronique, dans la persistance et l’aggravation des symptômes de l’anorexie et qui pourraient expliquer la chronicité de cette pathologie. AMENDEMENT 1: Ajout de souris supplémentaires pour confirmer et valider nos résultats et modification d'une étape du projet pour inclure l'implantation d'une mini-pompe sous la peau qui permet l'administration en continue des molécules mimant les facteurs sanguins dérégulés dans la pathologie humaine et ainsi éviter des administrations répétées.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous évaluerons comment un modèle murin innovant, rassemblant des facteurs de risque environnementaux de la maladie, peut apporter des éléments de compréhension des mécanismes mis en jeu dans les anomalies du comportement alimentaire dans l’anorexie mentale.
Procédures
Pose de canules cérébrales et/ou pompe osmotique sous anesthésie générale et analgésie: 1 fois, durée environ 45 minutes à 1 heure. Prélèvements de sang à la queue pour la mesure de la glycémie: 2 à 3 fois par semaine en cours de restriction alimentaire, durée 5 secondes. Prélèvements de sang à la queue pour la mesure des marqueurs métaboliques : 1 fois au cours de la procédure, durée 60 secondes. Injections pharmacologiques croisées souscutanées: 8 injections, durée 5 secondes. Injections pharmacologiques croisées intra-cérébrales: 8 injections, durée 5 minutes. Durée de la restriction alimentaire : 3 à 6 semaines.
Impact sur les animaux
Le protocole de restriction alimentaire entraine une perte de poids et une baisse de la glycémie. Les prélèvements sanguins à la queue peuvent provoquer une irritation locale et un stress. L’anesthésie des animaux lors de la chirurgie peut entraîner un stress. Une douleur peut également être associée aux injections d’analgésique et à l’acte chirurgical.
Devenir
Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer le cerveau afin de permettre des analyses biochimiques ou moléculaires de biomarqueurs en post-mortem dans les différentes structures cérébrales.
Remplacement
Ce projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles et comportementales complexes (cognition, comportement alimentaire, activité motrice) sur animal vigile, mimant la pathologie humaine et qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.
Réduction
Une analyse de puissance statistique a permis de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire. Les résultats obtenus sont analysés avec des tests statistiques adaptés à chaque procédure. L’utilisation d’un protocole de pharmacologie qui permet de tester l'effet de différents traitements chez le même animal permet de réduire de façon importante le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux sont surveillés quotidiennement par un personnel compétent pour vérifier leur état physique et comportemental et leur poids est mesuré au moins 3 fois par semaine au cours de la restriction alimentaire. Pour réduire le stress lié à l’isolement ponctuel pour la mesure individuelle du comportement alimentaire, les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi en cages ouvertes permettant de sentir et entendre leurs congénères. La chirurgie est effectuée sous analgésie et anesthésie générale. D’autre part, des grilles de points limites gradés et un arbre décisionnel adaptés à chaque procédure sont mis en place. En fonction des observations faites, des mesures sont prises, à savoir soit des soins quand ceux-ci peuvent être mis en place, soit l’arrêt de l’expérience.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle de choix pour l'exploration du comportement alimentaire et des comportements motivés permettant l’étude d’altération du système de la récompense. Les régulations mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant une similitude avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet des études anatomiques et fonctionnelles. De plus, les modèles génétiquement modifiés utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris et nous permettent de réaliser des études comparatives entre les observations faites chez la souris et certains aspects de la pathologie humaine. L’anorexie mentale fait partie des pathologies neuropsychiatriques qui touchent principalement des sujets adolescents et jeunes adultes. Dans ce projet, les procédures sont initiées aux stades équivalents chez la souris.