Souris

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue de leur procédure, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à neuf injections à l'état vigile de molécules toxiques pour les reins, subissent des recueils d'urine avec pression manuelle sur la vessie, deux anesthésies gazeuses à deux heures d'intervalle pour poser puis retirer un capteur de fluorescence sur le dos, une chirurgie avec pose de clamps pour certaines, et un prélèvement de sang terminal. Le porteur indique que l'insuffisance rénale induite entraîne une altération de l'état général, une prostration liée à une fatigue importante et une perte de poids, et qu'une lignée génétiquement modifiée plus sensible aux infections est employée. Il justifie le projet par le coût des maladies rénales, "approchant les 4 milliards par an", et par l'absence de thérapie ciblée, quand la molécule testée est déjà disponible dans le commerce et déjà utilisée en essais cliniques.

Objectifs

Les traitements actuels de l'insuffisance rénale aigue et chronique sont limités et non spécifiques. En effet, la plupart d'entre eux ne ciblent pas directement les cellules rénales lésées. Nous visons à développer des stratégies thérapeutiques pour cibler spécifiquement ces cellules, au lieu des thérapies actuellement utilisées qui visent le système immunitaire dans sa globalité. Des récents travaux ont montré qu’une interleukine (substance sécrétée par le système immunitaire) ainsi que sa voie de signalisation, favorisaient l'intégrité et la survie des cellules rénales, limitant ainsi l'issue de l'agression initiale. Par conséquent, nous pensons qu’un agent qui va activer cette voie de signalisation (nouvelle molécule testée dans ce projet) pourrait être bénéfique pour limiter l’impact des maladies rénales. L’interleukine ciblée et la nouvelle molécule sont disponibles dans le commerce et déjà utilisés dans des essais cliniques. Ces molécules ont déjà été testées dans deux types murins de maladies rénales qui ciblent les mêmes cellules (glomérules) mais elles n’ont pas eu le même effet bénéfique dans les deux modèles, pour des raisons encore inconnues. Les trois objectifs de ce projet sont : (1) Comprendre pourquoi la molécule à tester est protectrice dans un type de maladie glomérulaire chez la souris, mais pas dans un autre ? (2) Caractériser les effets de la molécule dans des modèles murins ciblant d’autres cellules rénales que les glomérules. (3) Optimiser l'administration de la molécule dans des modèles expérimentaux murins qui ciblent différents types de cellules rénales.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet ont un impact à la fois social et scientifique. Les maladies rénales sont un problème de santé publique et le développement de thérapies ciblées est nécessaire dans ce domaine. L'insuffisance rénale terminale est associée à un taux de mortalité élevé et à des coûts très élevés, en particulier associés aux thérapies de remplacement telles que l'hémodialyse ou la transplantation rénale. L'étude des mécanismes de survie glomérulaire conduira au développement de thérapies ciblées limitant la progression de la maladie glomérulaire vers l'insuffisance rénale terminale. Le coût extrêmement élevé du traitement des maladies rénales, approchant les 4 milliards par an, et l'absence de thérapies ciblées dans les maladies glomérulaires rendent nécessaire le développement de la recherche sur les mécanismes des lésions et de la survie des cellules rénales. Par conséquent, nous visons à développer des stratégies thérapeutiques pour cibler ces cellules, au lieu des thérapies actuellement utilisées qui ciblent principalement le système immunitaire. Notre approche, qui vise à développer de nouvelles cibles thérapeutiques, peut avoir un grand impact dans la compréhension des mécanismes menant aux lésions rénales.

Procédures

(1) Injections : Une grande partie des animaux recevra de 1 à 3 injections de la molécule à tester. Cette injection est réalisée à l’état vigile et dure 10 secondes. L’induction des modèles expérimentaux nécessite, soit des injections sous anesthésie gazeuse (de 1 à 3 injections, durée 30 secondes), soit des injections à l’état vigile (maximum 9 injections, durée 10 secondes). (2) Prélèvements : Une partie des animaux sera soumise à un recueil d’urine : en première intention, dans une boite propre pendant une durée d'au moins 30 secondes, puis si besoin, contention avec la main avec un léger frottement sur la vessie pour la vider le cas échéant. Un prélèvement de sang sera réalisé sur tous les animaux , sous anesthésie, sur un plateau chauffant : durée 5 à 10 minutes. (3) Contentions particulières : Tous les animaux du projet seront pesés régulièrement tout au long des procédures. (Durée 2 secondes par pesée) (4) Mesure de la fonction rénale : une grande partie des animaux sera soumise à la mesure de leur fonction rénale par une technique qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure cinq minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire deux heures plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que deux minutes. La mesure sera répétée plusieurs fois sur chaque souris à des jours différents selon la procédure. (5) Chirurgie : Une petite partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine les deux reins pendant 25 minutes. Elle s'accompagne d'injections pour l'analgésie et l'anesthésie. Ce protocole a une durée de 40 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent être générées par : (1) L’utilisation d’un modèle de souris génétiquement modifiée plus sensible aux infections. (2) Les manipulations régulières pour les injections, les pesées et les spots urinaires. Les animaux peuvent développer un stress lors de la contention. (3) Les injections : Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale et plus rarement une infection. Certaines injections peuvent entrainer un saignement, un œdème ou une irritation oculaire. (4) Les complications associées aux injections de molécules toxiques pour les reins : Prise de poids en raison de présence d’ascite ou au contraire dénutrition. L'induction d'une insuffisance rénale liée à ces molécules entraine une altération de l'état général, une prostration liée à une importante fatigue et une perte de poids. (5) Les complications liées à la chirurgie pouvant provoquer des douleurs malgré une prise en charge optimale de l'analgésie : ouverture des plans cutanés et musculaires, pose des clamps et sutures. (6) Les complications liées à l'anesthésie au moment de la chirurgie, de la mesure transcutanée de la fonction rénale et le prélèvement de sang terminal (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique).

Devenir

Tous les animaux (520) seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale par une personne expérimentée. Les différents prélèvements nécessaires pour les analyses sont réalisés après constatation de l’absence de battements cardio respiratoires.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet de la molécule étudiée dans ce projet sur le rein est l'amélioration de la fonction rénale.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité interindividuelle du phénotype étudié dans nos deux modèles expérimentaux. Des lots de dix animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux pour ce projet est de 520 souris. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

(1) Raffinement de l'hébergement et surveillance : les animaux sont acclimatés dans l'animalerie 1 à 2 semaines avant la procédure. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que par une pesée quotidienne pendant toute la durée des protocoles. Des points limites ont été définis pour chaque procédure. Le bien- être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme en cellulose dans toutes les cages. En dehors d'une courte période d'isolement limité à deux heures pendant la mesure de la fonction rénale, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. Le personnel impliqué dans le projet est qualifié conformément à la règlementation en vigueur. (2) Raffinement pour la lignée de souris plus sensibles aux infections : les équipements de protection individuelle sont changés plus fréquemment et tout le matériel d’élevage est stérilisé. (3) Raffinement pour les injections : toutes les injections sont réalisées avec une aiguille très fine , ce qui limite les risques hémorragiques. Le volume d'injection est règlementaire. En cas d’injections répétées, les sites sont alternés. Lors de certaines injections, les souris sont sous anesthésie gazeuse et placées sur un plateau thermostaté. Un collyre anesthésiant est appliqué une minute avant l’injection et un gel ophtalmique est appliqué après pour limiter l’irritation oculaire. Les injections sont réalisées par du personnel très expérimenté. (4) Raffinement anesthésie : pour limiter les complications liées à l’anesthésie (détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, stress thermique), les souris sont placées sur un plateau chauffant. (5) Raffinement Chirurgie (Clampage du rein) : pour assurer le bien-être pendant et après la chirurgie, les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une analgésie et d’une anesthésie appropriée. Les souris seront placées dans une couveuse pour faciliter la phase de réveil dans leurs cages initiales. Durant toute la procédure, de la nourriture humidifiée est mise à disposition des animaux dans la cage. Pour éviter tout risque de surinfection liée à la chirurgie, les instruments sont stérilisés.

Choix des espèces

Concernant le choix de l’espèce : Les modèles expérimentaux du projet sont bien maîtrisés dans cette espèce par le personnel du laboratoire et sont bien documentés dans la littérature scientifique. Concernant le stade de développement : Les animaux sélectionnés pour cette étude seront à un stade adulte, entre huit et dix semaines. À cet âge, ils possèdent un système glomérulaire mature, tout en ne présentant pas encore de lésions dues au vieillissement, ce qui garantit des résultats plus fiables et représentatifs.

Les souris utilisées sont immunodéficientes, condition posée par le laboratoire pour qu'elles acceptent des tumeurs humaines. 816 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'étude des tissus tumoraux. Chacune reçoit une injection sous anesthésie locale, puis une contention manuelle de trente secondes à une minute pour mesurer la tumeur au pied à coulisse, ou une anesthésie générale d'imagerie d'au plus vingt minutes, une à deux fois par semaine pendant douze semaines. Le porteur reconnaît que la tumeur implantée dans le flanc provoque une douleur et une gêne mécanique modérées et que des métastases peuvent apparaître, et annonce des "points limites précoces" strictement appliqués sans dire lesquels.

Objectifs

Le mélanome cutané est une tumeur maligne de la peau résultant de la transformation de mélanocytes spécialisées dans la production de la mélanine. Les cas pédiatriques de ce cancer sont très rares dans les pays européens, avec un taux d’incidence impliquant moins de 1 sur 100000 personnes par an, mais dont l’incidence augmente depuis plus de 20 ans, en relation avec une exposition au soleil non protégée. En général, les cancers à apparition précoce sont le signe d’une prédisposition génétique. Cependant, les patients qui ont développé un mélanome avant l’âge de 18 ans n’ont pas montré de mutations dans les gènes prédisposant au mélanome de l’adulte. Ainsi, pour déterminer l’origine génétique de ces mélanomes pédiatriques nous avons utilisé des technologies de séquençage à très haut débit de 55 trios, composés des deux parents sains et de l’enfant atteint d’un cancer de la peau, et de 6 tumeurs congelées. L’analyse de ces trios nous a permis d’identifier plus de 27 gènes porteurs de mutations de novo, c’est-à-dire présentent que chez l’enfant malade et absentes chez les parents sains. Ensuite, nous avons réalisé des expériences sur cellules, qui nous ont permis de réduire le nombre de gènes à étudier à 5, dont 3 gènes connus pour être impliqués dans des voies de régulations dperintents, ainsi que les deux gènes connus dans des voies de régulation de la prolifération et du métabolisme. Ces expériences in vitro ont été réalisées dans différentes lignées cellulaires, soit des lignées de mélanocytes pré-transformées pour étudier la capacité de ces mutations à transformer des cellules saines en malignes, soit des lignées de mélanome possédant des caractéristiques d’invasion et de prolifération contraire, afin d’étudier la capacité de ces mutations à favoriser des stades tardifs de la transformation tumorale. Maintenant,il est indispensable de confirmer les effets obtenus in vitro dans un modèle animal vivant de souris immunodéficientes car ce modèle permet l’implantation de tumeurs humaines avec une bonne efficacité. Ce projet a donc pour but de confirmer et d’étudier l’implication de ces mutations et de ces gènes dans le développement tumoral et la formation des métastases.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de confirmer l'implication de ces variants identifiés en clinique chez de jeunes patients dans le processus de cancérogenèse. La découverte de gènes impliqués dans la survenue des mélanomes pédiatriques permettra également d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans la croissance et la diffusion de ces cellules tumorales. La prise en charge des patients pourra également être améliorée en identifiant de nouveaux marqueurs ou de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Certains animaux auront une injection sous anesthésie locale pendant 1 min, une contention à la main pendant 30 secondes à 1 minute pour mesurer à l’aide d’un pied à coulisse la taille de la tumeur. D'autres auront une injection sous anesthésie locale pendant 1 min ainsi qu'une anesthésie générale pour imagerie, durée maximale 20 min, 1 à deux fois par semaine pendant 12 semaines.

Impact sur les animaux

La tumeur située dans le flan de la souris peut occasionner une une douleur et une gêne mécanique modérées. L'apparition de métastases peut entraîner potentiellement des symptômes cliniques modérés liés à la localisation de ces métastases, qui seront de petite taille.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour études au laboratoire sur les tissus tumoraux.

Remplacement

Les modèles cellulaires subsitutifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, hormones…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement tumoral ou des métastases du mélanome dans les organes distants.

Réduction

Nous avons pu identifier 27 gènes pouvant jouer un rôle dans l’émergence de tumeur ou de métastases. Grâce à des analyses bio-informatiques des données de patients et des expériences in vitro, nous avons réduit ce nombre à 5. Enfin, le nombre d'animaux a été réduit au minimum et déterminé grâce à une étude statistique permettant une interprétation précise et significative des résultats.

Raffinement

Pour respecter les exigences de raffinement, les animaux sont observés tous les jours par les membres responsables du projet, tout comportement anormal sera évalué selon la grille de score de douleur établie et les points limites seront strictement appliqués. De plus, les animaux sont observés et pesés deux à trois fois par semaine par les expérimentateurs confirmés responsables du projet. Si une perte de poids d'environ 10% par rapport au poids initial est observé,un aliment appétent et énergétique sera ajouté dans la cage. Si un signe de douleur est observé (prostration, agressivité), un anti-douleur sera administré et un enrichissement supplémentaire ou différent pourra être ajouté dans la cage. Les souris seront anesthésiées lors des différentes procédures. Des points limites précoces ont été définis et seront strctement appliqués.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux de notre laboratoire sont exclusivement développés sur la souris immunodéficiente qui est un modèle de référence en oncologie préclinique et qui peut recevoir des tumeurs humaines. Nous souhaitons utiliser les souris à maturité sexuelle, adulte, de 6 à 7 semaines. En effet le développement de la souris entraine des variations d'expression géniques, hormonaux, des changements physiologiques qui peuvent avoir des effets sur l'expression de certains gènes et donc biaiser nos résultats. Nous souhaitons limiter les variations de ceux-ci et pouvoir standardiser au maximum la physiologie des souris.

Quand l'injection d'insuline fait tomber leur glycémie sous 40 mg/dL, les souris reçoivent du glucose pour les remonter. 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après seize semaines d'exposition à une privation intermittente d'oxygène pour prélever leurs organes. Elles sont habituées progressivement au tube de contention servant aux mesures de pression artérielle, transportées entre trois établissements distincts, et certaines portent un implant de télémétrie posé au cours d'une chirurgie de trente minutes. Le porteur écrit que dix animaux par groupe suffisent pour ses analyses métaboliques et que cinq suffisent pour la télémétrie, sans détailler comment ces effectifs aboutissent aux 390 souris déclarées pour ce volet.

Objectifs

Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.

Bénéfices attendus

L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.

Procédures

Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).

Impact sur les animaux

Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.

Remplacement

Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.

Réduction

Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).

Raffinement

Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.

Huit heures de privation d'oxygène par jour, de 8 h à 16 h, pendant seize semaines : 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles subissent trois séries de tests de stimulation à l'insuline, au glucagon, à l'adrénaline ou à la dexaméthasone, trois électrocardiogrammes et trois échographies sous anesthésie, quarante-huit heures en cage de mesure des échanges gazeux, et des mesures de pression artérielle en tube de contention. Le protocole, réparti sur trois établissements voisins entre lesquels les animaux sont transportés, prévoit aussi soixante-dix chirurgies de trente minutes pour implanter un émetteur de télémétrie, suivies de quatorze jours de surveillance. La thérapie espérée contre les dérèglements métaboliques de l'apnée du sommeil reste énoncée au conditionnel, quand la privation d'oxygène, elle, court sur quatre mois.

Objectifs

Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.

Bénéfices attendus

L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.

Procédures

Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).

Impact sur les animaux

Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.

Remplacement

Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.

Réduction

Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).

Raffinement

Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.

Un agent qui détruit les cellules souches de la moelle osseuse est injecté à des souris vigiles, ce que le porteur décrit comme "une forte douleur abdominale disparaissant en quelques heures", avant la greffe de cellules souches sanguines humaines. 45 000 souris immunodéprimées vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les nouveau-nés étant anesthésiés par hypothermie sur glace jusqu'à dix minutes, avec en plus des injections de plasmides pouvant provoquer des troubles cardio-respiratoires, des prélèvements vaginaux quotidiens pendant plusieurs semaines, des prélèvements sanguins répétés et des chirurgies. 36 000 d'entre elles seront tuées et 9 000 transférées vers d'autres projets ou vers une formation interne aux gestes techniques, celles dont le taux d'humanisation reste sous 25 %. Le porteur écrit que le nombre d'animaux "sera réduit au maximum" et, dans la même rubrique, qu'"aucune approche statistique n'a été réalisée", l'effectif ayant été estimé d'après les années antérieures "en accord avec le plan commercial".

Objectifs

Ce projet a pour objectif de greffer des cellules souches sanguines humaines et leurs dérivées chez des souris immunodéprimées, et ainsi permettre la reconstitution d’un système immunitaire humain fonctionnel (ou représentatif d’une pathologie particulière) et pouvant être modifié par traitement, en vue d’essais préclinique chez la souris.

Bénéfices attendus

En greffant des cellules souches humaines, ou leurs dérivées, à des souris immunodéprimées, nous pouvons reconstituer un système immunitaire humain. Ce faisant, nous apportons un modèle d’étude spécifique qui peut jouer un rôle essentiel dans la compréhension et le traitement de pathologies d’importance, comme certaines infections virales (virus de l’immunodéficience humaine (VIH) ou hépatites), de nombreux cancers ou des maladies inflammatoires (asthme).

Procédures

Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésies. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. L’anesthésie des nouveau-nés sera réalisée par hypothermie avec de la glace pendant maximum 10 minutes. Des prélèvements vaginaux pourront aussi être pratiqués quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caractériser le cycle œstral. L’humanisation inclura l’administration d’un agent, détruisant les cellules souches de la moelle osseuse, sur souris vigile, suivie d’une greffe de cellules souches sanguines sur souris vigiles ou nouveau-nés sous anesthésie sur glace. Ces interventions dureront de quelques secondes à quelques minutes. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. Certaines procédures nécessiteront des actes chirurgicaux pour l’implantation de dispositifs sous-cutanés, réalisés sous anesthésie gazeuse avec une analgésie préopératoire et un suivi post-opératoire rigoureux. L’implantation durera moins de cinq minutes et pourra être répétée selon les besoins de l’étude. À l’issue des études, les animaux non intégrés aux essais précliniques seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

-Injection de l’agent myéloablatif : induit une forte douleur abdominale disparaissant en quelques heures. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides (pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt) : peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. Peut engendrer un hématome. -Prélèvements vaginaux : peut engendrer une irritation locale, une inflammation ou un stress temporaire. -Chirurgie : douleur, hémorragie, un défaut du système d’anesthésie / analgésie (ex : la souris se réveille en cours de procédure), un état clinique détérioré au réveil (ex : hypothermie), mauvaise cicatrisation. -Administration de traitements : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées) - Prélèvements sanguins : anémie, hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Rasage et crème dépilatoire : microlésions, irritations cutanées, gêne (sensation de brûlure de la crème), inflammation transitoire. -Anesthésie : risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire (ajout de gel ophtalmique en prévention). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne voire potentiellement douleur si présence de tumeurs au niveau abdominal. La manipulation chez le nouveau-né pourrait engendrer le rejet de la mère. Afin d’éviter cela, des éléments sont décrits dans la procédure expérimentale. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Le processus d’humanisation pourra être accompagné d’une phase de modulation ou de renforcement in vivo du système immunitaire humain en fonction des objectifs expérimentaux. Cette étape vise à préparer les animaux aux études précliniques envisagées en optimisant la réponse immunitaire du modèle humanisé. Les animaux n’étant pas jugés comme aptes à entrer en étude préclinique en projet de formation ou en projet de recherche interne seront euthanasiés. C’est-à-dire les animaux avec un état de santé jugé moyen et/ou avis vétérinaire défavorable. Dans le cadre d’une utilisation continue, pour réaliser les études précliniques, les animaux pourront être intégrés aux autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Les animaux concernés seront ceux ayant un taux d’humanisation < 25%. Un nouveau-né mal humanisé pourra être nouvellement humanisé en étant plus âgé. La décision est prise par le vétérinaire.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Dans le cadre d’une utilisation continue, les souris humanisées seront impliquées dans des études de recherches précliniques impliquants le système immunitaire. Il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire tout en objectivant les effets potentiellement toxiques d’une molécule en développement. La souris constitue un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 45 000 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser 720 études précliniques de 50 souris, en se basant sur un taux de succès de l’humanisation de 80%. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.

Raffinement

Les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus à partir du sevrage. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (dietgel). La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Cette couche de litière pourra être supplémentée par un échantillon de litière provenant de cages mâles dans le but de synchroniser le cycle œstral de la souris. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement etc) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération est observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire notamment buprénorphine 0,1 mg/kg (voie IP ou SC), administrée avant intervention chirurgicale ou toute procédure potentiellement douloureuse. Un rappel sera envisagé toutes les 4–6h selon l’évaluation. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8 mL/kg. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée, ou tout score clinique dépassant les seuils définis.

Choix des espèces

Le séquençage complet du génome de la souris a démontré la proximité phylogénétique des souris et des humains : 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes orthologues produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente permet la création de lignées humanisées. Depuis de nombreuses années, l'entreprise développe une expertise dans l’humanisation du système immunitaire de multiples souches de souris, notamment les NCG, NXG, NOG et BRG. Fort de cette expérience, il est pertinent de poursuivre le processus d’humanisation sur cette même espèce. La procédure expérimentale requiert l'utilisation de souriceaux nouveau-nés La procédure expérimentale requiert l'utilisation de souriceaux nouveau-nés jusqu'à [MODIFICATION] jusqu'à l'âge de 3,5 - 4,5 semaines, car leur immunité immature favorise la prise de greffe et limite le rejet, garantissant ainsi une reconstitution optimale du système immunitaire humain. À cet âge, le thymus et la moelle osseuse offrent un environnement propice à la maturation des cellules immunitaires humaines, permettant d'obtenir un modèle plus fonctionnel et reproductible.

7 624 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nés reçoivent une injection sous-cutanée dans leur première semaine de vie, les adultes et les femelles gestantes un gavage de tamoxifène, et une chirurgie terminale sous anesthésie peut être pratiquée dès le septième jour après la naissance pour vider le cerveau de son sang. Le porteur reconnaît que le gavage des femelles gestantes peut provoquer des mises bas prématurées ou difficiles et affecter les embryons, et que les souris du modèle Alzheimer développent à partir de neuf mois pertes de mémoire, apathie et comportements sociaux anormaux. Il affirme que ces phénomènes "ne peuvent pas du tout être modélisés in vitro ou in silico" du fait de la complexité des interactions avec l'"organisme entier", sans indiquer comment un calcul de puissance aboutit à 7 624 animaux.

Objectifs

​​La maturation du cerveau comprenant les processus de myélinisation, différenciation des neurones et mise en place des circuits cérébraux implique des processus complexes et des populations spécifiques de cellules liées au développement. Au cours des 10 dernières années, une grande diversité de cellules a été décrite par différentes techniques de bilogie moléculaire à haut débit et a mis en lumière une sous population de microglie spécifique qui joue un rôle clé pendant le développement pré- et post-natal. Cette microglie partage des caractéristiques communes avec la microglie spécifique de maladie présente dans les maladies neurodégénératives comme Alzheimer (AD). Cependant, le degré de similitude/divergence de ces états, le fait qu'ils agissent via des voies communes pour exercer des fonctions protectrices dans des contextes différents et le fait qu'ils soient transitoires ou liés à l'ontogénèse restent largement à élucider. Pour mieux comprendre le rôle des macrophages cérébraux, dans les pathologies telles qu'Alzheimer, nous utiliserons des approches génétiques et pharmacologiques afin de perturber les microglies et leurs fonctions au cours du développement embryonnaire et post-natal.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamentale a pour objectif de déchiffrer les dynamiques cellulaires de macrophages cérébraux, leur induction et leurs rôle dans les cerveaux en developpement et dans les cerveaux en vieillissement et neurodégénératifs. En étudiant avec des techniques et modèles murins innovants ces cellules à plusieurs stades : pré-natal, post-natal et adulte, nous pourrons apporter une vision cinétique et comparer les états des cellules de microglie jeunes et pathologiques. L’étude des deux sexes en parallèle permettra de donner des indications sur le caractère sexe spécifique. Les états et les fonctions des macrophages cérébraux sont généralement étudiés en parallèle, soit au cours du développement, soit dans les maladies neurodégénératives. Ce projet vise ainsi à mettre en place un pont entre ces périodes et comparer les rôles fonctionnels des cellules de microglie jeunes et pathologiques et notamment des deux principaux facteurs qu'ils produisent, afin d'identifier les facteurs et les voies qui induisent ces états et le lien ontogénétique potentiel entre eux. In fine, cela permettra d’ouvrir la voie à à des stratégies thérapeutiques très innovantes des maladies neurodégénératives telles qu’Alzheimer en exploitant les propriétés neuroprotectrices de la microglie.

Procédures

Les animaux vigiles recevront une injection sous-cutanée lorsqu'ils sont en première semaine de vie ou un gavage à l'âge adulte (pour les mères gestantes afin d'observer l'effet sur les embryons et pour les souris de 2 et 12 mois). En fonction de leur stade et de l'analyse prévue, les animaux seront soumis à une analgésie suivie d'une anesthésie et enfin euthanasiés afin de prélever le cerveau. Uniquement en cas de besoin, une chirurgie terminale sera réalisée sur les animaux à partir de 7 jours post-natals, toujours sous l'effet de l'anesthésie générale avec analgésie, pour éliminer les cellules sanguines du cerveau.

Impact sur les animaux

La molécule administrée par gavage aux femelles gestantes peut avoir un impact sur le déroulement de la gestation des femelles, provoquer des mises bas prématurées ou des difficultés de mise bas et avoir aussi un impact sur les embryons et les nouveaux-nés. De plus, la méthode d’administration par gavage peut induire un stress pendant la contention, et une gêne légère et transitoire. Le modèle murin d’Alzheimer utilisé dans cette étude développant des comportements ressemblant à la maladie d’Alzheimer humaine, les symptômes peuvent nuire au bien-être global de l’animal. Ces souris développent des comportements de perte de mémoire, apathie et comportements sociaux aberrants à partir de 9 mois liés à la perte neuronale dans certaines zones du cerveaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de prélever le cerveau et effectuer les analyses requises par le projet.

Remplacement

​L’étude des population microgliales au cours du développement et de la neurodégénérescence, de leur spécificité et de leur trajectoires nécessite l’utilisation d’un organisme vivant complet avec une maintenance de l’activité cellulaire, comme la synthèse ou la dégradation de protéines. Il est important de maintenir l’activité de l’organisme et des mécanismes physiologiques dans un état dynamique (c'est à dire en mouvement et fonctionnel) dans le cadre d’une étude temporelle. Ces phénomènes ne peuvent pas du tout être modélisés in vitro ou in silico, du fait de la complexité des interactions des cellules étudiées avec l'organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance statistique afin de garantir une robustesse des résultats tout en limitant l’utilisation d’animaux. Pour une analyse comparative multi-groupes (effet du modèle, Alzheimer, sexe, temps d'intêret), nous avons ainsi calculé et optimisé le nombres d'animaux nécessaires. Les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques telles que l'analyse de variance.

Raffinement

L'enrichissement sera augmenté pour les animaux vieillissants. Pour faciliter l'alimentation en cas de besoin, du Dietgel sera utilisé. Les manipulations (contention, gavage au tamoxifène, prélèvements, perfusion) seront effectuées par des personnes formées et compétentes. Les méthodes d'analgésie et d'anesthésie des animaux permettront de diminuer toute souffrance ou détresse liées aux manipulations. Des mesures de surveillance quotidienne sont mise en place par des personnes compétentes et formées. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les interventions invasives seront faites sous anesthésie et analgésie.

Choix des espèces

Les souris sont devenues des modèles de choix pour l’étude des fonctions biologiques et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et organique. Elles sont également utilisées pour créer des modèles d’étude des pathologies humaines. La proximité génétique avec l’homme, combinée à la disponibilité d’un grand nombre de lignées génétiquement modifiées, fait du modèle murin un choix idéal pour répondre à nos questions scientifiques. Le court cycle de reproduction et la petite taille des souris facilitent leur maintien, tout en conservant une espèce relativement proche de l’homme en termes de développement. De plus, la période de gestation courte et le nombre important d’embryons permettent de générer un nombre suffisant d’animaux pour plusieurs expériences à partir de relativement peu de parents. Ce choix stratégique garantit une compréhension globale des processus allant de la formation fœtale à la maturation et au maintien des circuits dans des contextes normaux et pathologiques​.

Greffées dans le cerveau de cellules de tumeurs cérébrales pédiatriques humaines au cours d'une chirurgie d'une dizaine de minutes, 472 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques ou génomiques. Certaines reçoivent en plus trois injections par semaine pendant quatre semaines, une prise de sang hebdomadaire pendant deux mois et jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie générale. Le porteur indique que la tumeur, en grossissant, peut provoquer des troubles neurologiques, des difficultés à se déplacer, une perte d'équilibre et une perte de poids. Les retombées annoncées, de nouvelles thérapies contre des cancers du cerveau de l'enfant aujourd'hui sans traitement efficace, sont renvoyées au long terme et suspendues à la démonstration qu'un gène est bien requis à la survie des cellules tumorales.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales pédiatriques sont des maladies rares, graves et peu accessibles aux traitements actuels. Elles touchent des régions profondes du cerveau, rendant les interventions chirurgicales difficiles, et leur évolution est souvent rapide. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la croissance de ces tumeurs, en étudiant l’effet de certaines modifications génétiques dans des modèles expérimentaux. Pour cela, des cellules tumorales humaines seront greffées chez la souris afin de suivre leur développement et de tester de nouvelles stratégies de régulation de gènes.

Bénéfices attendus

Nous cherchons à comprendre si certaines cellules cancéreuses du cerveau ont besoin d’un mécanisme particulier pour survivre. Pour cela, nous utilisons un modèle de souris qui reproduit les tumeurs cérébrales observées chez l’enfant. Si ce mécanisme s’avère essentiel à la survie des cellules cancéreuses, cela pourrait ouvrir la voie à de nouveaux traitements. À long terme, ces recherches pourraient aider à développer des thérapies innovantes pour des formes très graves de cancer du cerveau chez l’enfant, aujourd’hui encore sans solution efficace.

Procédures

Les animaux subiront une greffe de cellules tumorale dans le cerveau. Il s'agit d'une chirurgie qui dure une dizaine de minutes au maximum pendant le quelle la souris est anesthésiée et analgésiée. Certaines souris recevront en plus trois injections par semaine pendant quatre semaines, durée 1 minute, anesthésie locale. Une prise de sang sera réalisée chaque semaine pendant deux mois (n=8) pour l’analyse du plasma. avec anesthésie locale. Finalement, lors du suivi de la en imagerie, les animaux sont anesthésiés (anesthésie générale), durée maximum de 10 min, nombre maximal de séances : 12.

Impact sur les animaux

Les effets attendus chez les animaux sont liés à la croissance de la tumeur et à la chirurgie. La chirurgie entraînera une douleur légère et transitoire cutanée au lieu de cicatrisation.. Lorsque la tumeur devient volumineuse, elle peut provoquer des problèmes neurologiques, comme des difficultés à se déplacer et une perte d’équilibre. Les animaux peuvent également moins s’alimenter, entraînant une perte de poids. Concernant l’administration d'un médicament d'induction, aucun effet secondaire toxique n’est attendu via la consommation volontaire de croquettes enrichies, comme le rapporte la littérature pour une exposition prolongée par ce mode d’administration Les injections sous anesthésie locale entraîneront une douleur légère et transitoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures pour des analyses histologiques ou génomiques.

Remplacement

Les tumeurs cérébrales se développent dans des régions profondes et centrales du cerveau. Elles ont la particularité de s’étendre progressivement, d’abord dans les structures proches, puis dans tout le cerveau au fur et à mesure que la maladie avance. Cette propagation est influencée par l’environnement des cellules tumorales, un phénomène complexe qui ne peut être étudié que dans des modèles vivants capables de reproduire ces interactions. L’un des principaux obstacles au traitement de ces tumeurs est la barrière hématoencéphalique, une protection naturelle qui limite l’accès des médicaments au cerveau. Pour développer de nouvelles approches thérapeutiques, il est donc essentiel de disposer de modèles expérimentaux permettant d’évaluer ces traitements avant leur passage aux essais cliniques. Avant leur utilisation dans ce protocole, les modifications biologiques et les molécules ont été validées in vitro sur des cellules en culture. Toutefois, aucun autre modèle ne permettrait de reproduire avec autant de précision les défis posés par la barrière hématoencéphalique et les difficultés thérapeutiques qu’elle entraîne.

Réduction

Dans ce projet, nous avons appliqué le principe de réduction en utilisant le moins d’animaux possible, tout en assurant la fiabilité des résultats scientifiques. Pour cela, nous avons utilisé un logiciel de calcul statistique afin de déterminer précisément le nombre minimal d’animaux nécessaires pour répondre à nos questions de recherche. Ce calcul permet d’éviter les excès tout en garantissant que les résultats seront suffisamment solides pour être interprétés. Nous utilisons aussi une méthode d’imagerie qui permet de visualiser l’évolution des tumeurs de manière non invasive chez les animaux. Grâce à cette technique, nous pouvons suivre la progression du cancer sans multiplier les interventions, ce qui permet d’obtenir plus d’informations avec moins d’animaux. Enfin, des étapes de validation intermédiaires ont été intégrées dans le protocole : si une méthode ne fonctionne pas, nous l’ajustons avant de poursuivre, pour éviter d’utiliser des animaux inutilement.

Raffinement

Pour éviter toute douleur liée à la chirurgie, les animaux recevront un médicament antidouleur avant l’intervention. Une seconde dose pourra être administrée le lendemain si des signes de douleur apparaissent. L’opération sera réalisée sous anesthésie générale, pour que les animaux soient complètement endormis et ne ressentent rien. Pendant la chirurgie, leur température sera maintenue grâce à une plaque chauffante, et une injection de sérum physiologique leur sera donnée pour éviter la déshydratation. Un gel protecteur sera appliqué sur leurs yeux pour éviter qu’ils ne s’assèchent, et la zone opérée sera désinfectée pour prévenir toute infection. Après l’opération, les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil complet, ce qui prend seulement quelques minutes. Ils seront ensuite replacés en groupe avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Leur état de santé sera suivi de près, avec une pesée deux fois par semaine, puis trois fois par semaine dès l’apparition des premiers symptômes. Ils vivront par groupe de cinq, dans un environnement confortable avec des abris en carton, des tunnels, des bâtons à ronger et du papier pour faire leur nid, afin qu’ils puissent exprimer leurs comportements naturels et réduire leur stress. Des points limites ont été définis pour garantir une prise en charge éthique et rapide en cas de signes de souffrance ou de détérioration de l’état de santé.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris car ce sont les animaux les plus couramment employés pour étudier les cancers chez l’humain. Elles permettent de mieux comprendre comment les tumeurs se développent dans le cerveau et de tester des traitements dans un organisme vivant, ce qui n’est pas possible uniquement avec des cellules en laboratoire. Les greffes seront faites sur des souris jeunes adultes, âgées de 6 à 8 semaines. À cet âge, leur corps est suffisamment développé pour bien supporter les interventions, tout en permettant d’étudier correctement l’évolution des tumeurs.