Souris

1 584 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont anesthésiés puis rasés à deux semaines, reçoivent une application quotidienne sur le dos pendant quatorze à vingt-cinq jours, portent ensuite un patch occlusif deux semaines et sont isolés vingt minutes pour la récolte de leurs fèces. Une dermatite atopique est déclenchée à quatre semaines, avec démangeaisons, rougeurs, œdème et excoriations, et les gavages peuvent enflammer l'œsophage. Le produit testé est un émollient enrichi en sucre du lait maternel, dont le porteur espère qu'il ouvrira la voie à un essai clinique, alors que les essais menés chez des nourrissons ont déjà montré que les émollients trilipidiques ne préviennent pas la maladie.

Objectifs

La dermatite atopique (DA) est une allergie, touchant 10 à 15 % des enfants en Europe. Elle est associée à une barrière et un microbiote cutanés altérés et à un dysfonctionnement du système immunitaire.70 % des enfants guérissent naturellement et 30 % souffrent de symptômes persistants avec un risque accru d’autres allergies (asthme, rhinite ou allergies alimentaires :marche atopique). Il n’existe pas de stratégies préventives efficaces pour la DA. Plusieurs essais cliniques ont appliqué des émollients ou des huiles végétales sur la peau des bébés pour renforcer la barrière cutanée afin de limiter l'interaction entre les allergènes et le système immunitaire de la peau. Ils ont observé que les émollients trilipides ne prévenait pas la DA mais améliorait l'intégrité de la barrière cutanée en réduisant la perte d'eau transépidermique (TEWL). À l'inverse, les huiles végétales entravent la formation de structures lipidiques lamellaires dans la barrière et favorisent le développement de l'allergie alimentaire. Même si les émollients renforcent la barrière cutanée, cette approche seule semble insuffisante pour prévenir la DA. Les stratégies thérapeutiques qui ciblent la barrière cutanée, mais aussi le microbiote et le système immunitaire pourraient offrir des approches plus efficaces pour prévenir la DA. Certains sucres du lait maternel (oligosaccharides), peuvent moduler le microbiote intestinal en favorisant l'émergence de bactéries bénéfiques et en réduisant l'abondance des bactéries nocives. Ils peuvent renforcer la barrière intestinale et induire un environnement immunitaire tolérogène. Nous avons démontré chez la souris gestante, l’efficacité d’une supplémentation anténatale avec un sucre du lait maternel sur abrogation complète des symptômes de l'allergie alimentaire chez les petits. Nous disposons également de données préliminaires sur des modèles de culture peau humaine, montrant que l'exposition à un sucre du lait maternel sur des cellules de peau humaine dans des conditions inflammatoires renforce l'expression de l'involucrine (une protéine de la barrière cutanée réduite chez les patients atteints de DA)et de la substance P (ayant des fonctions anti-inflammatoires et de réparation des tissus). Notre hypothèse est que l'ajout de sucres du lait maternel aux émollients pourrait constituer une stratégie efficace pour cibler le microbiote cutané, le système immunitaire et la barrière cutanée et, par conséquent, pour prévenir l'apparition de la DA.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de valider une nouvelle stratégie thérapeutique préventive visant à prévenir l'apparition de la DA à un stade précoce par une intervention cutanée. A l'heure actuelle, il n'existe pas de stratégie préventive efficace pour la DA. L'approche ambitieuse du projet se concentre sur une méthode thérapeutique externe non invasive, facile à utiliser et sûre. Ce projet permettra également de comprendre la physiopathologie de la DA, lors de sa mise en place et de sa prévention. Nous focaliserons principalement notre recherche sur les 3 grands systèmes biologiques dysfonctionnels dans l’allergie : le microbiote (cutané et intestinal), le système immunitaire et les barrières (cutanées et intestinales). Valider cette stratégie chez la souris permettra d’ouvrir la voie à un futur essai clinique.

Procédures

- procédure 1 =souriceaux : anesthésie (15 minutes), rasage (5 minutes) et application journalière d’un traitement topique dorsale (5 minutes) pendant 14 jours puis d’un patch occlusif (5 minutes) pendant 14 jours, isolement pour la récolte des fèces (20 minutes). - procédure 2 = idem procédure 1 + gavage oral (2 minutes). - Procédure 3 : = souriceaux : anesthésie (15 minutes), rasage (5 minutes) et application journalière d’un traitement topique dorsale (5 minutes) pendant 25 jours, isolement pour la récolte des fèces (20 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont la gêne liée la présence d’un patch sur le dos qui peut induire des grattages, les symptômes liés à la mise en place de la DA (prurit, érythème, œdème et excoriations), les anesthésies gazeuses peuvent induire une hypothermie, une hypotension, une hypoventilation ou une hypoxémie, les gavages oraux peuvent induire une inflammation de l’œsophage, l’isolement pour la récolte des fèces ainsi que la prise de poids répétée des mères gestantes peuvent induire un stress.

Devenir

Les animaux seront tous mis a morts à la fin de l’expérimentation. Leurs organes et fluides biologiques seront analysés pour mesurer les biomarqueurs de la DA ou de l’allergie alimentaire et ainsi valider nos modèles.

Remplacement

Dans le cadre de l’étude de la dermatite atopique (DA), il est impossible de reproduire efficacement in vitro les symptômes cutanés mais aussi les interactions très complexes entre les systèmes biologiques notamment lorsqu’il s’agit des interactions entre le microbiote cutané, le système immunitaire et les barrières épithéliales

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum et calculé pour être statistiquement pertinent pour la mesure du score clinique mais aussi avoir assez de matériel biologique pour effectuer non seulement des coupes histologiques mais aussi les mesures des biomarqueurs immuns de la DA dans la peau et dans le sérum. De plus, en effectuant un test de puissance, il nous faut au moins 12 animaux dans chaque groupe pour observer des effets statistiques au niveau du microbiote et du système immunitaire.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 3-4 souris par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube ou coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Cependant, si nous observons que les souris enlèvent le patch des autres souris présentes dans la cage, alors elles seront séparées et hébergées à 1 souris par cage pour ne pas fausser les résultats du protocole mais aussi pour éviter les risques de blessures et d’ingestion de plastique et de l’allergène.

Choix des espèces

Les modèles murins sont largement utilisés dans la recherche sur la dermatite atopique (DA) en raison de leur capacité à reproduire plusieurs caractéristiques clés de la maladie humaine, notamment les altérations de la barrière cutanée, les réponses inflammatoires de type 2, et les déséquilibres du microbiote cutané. Ces modèles permettent d’explorer les mécanismes immunologiques et moléculaires impliqués dans le développement et l’aggravation de la DA, tout en offrant un système contrôlé pour tester l’efficacité et la sécurité de nouvelles approches thérapeutiques. De plus, les souris sensibilisées avec des allergènes spécifiques permettent d’étudier les liens complexes entre les facteurs environnementaux, la génétique, et les réponses immunitaires. Les souris BALB/cJRj femelles reproductrices seront âgées de 6 semaines et les mâles reproducteurs seront âgées de 10 semaines car c’est à ces âges là que nous avons observé la meilleure efficacité de reproduction. L’application topic des émollients se fera chez le souriceau de 2 semaines pour reproduire les applications topics d’émollients chez les bébés dès le plus jeune âge. La DA sera induite chez les souriceaux âgés de 4 semaines comme décrit dans les modèles de la littérature. Cela correspond à un âge jeune de la souris, similaire à la DA chez l’enfant qui peut apparaitre dès les premiers mois de vie.

Cinq semaines d'hébergement individuel pour 125 souris porteuses d'une prothèse fixée sur le crâne : 483 souris au total sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal subit une ou deux chirurgies cérébrales sous anesthésie, 45 d'entre eux reçoivent quatorze injections en une semaine, et 150 sont conduits vers un second établissement pour y être anesthésiés puis tués, leurs tissus servant à des expériences sur cerveau prélevé. L'objet du travail est de comprendre comment les neurones stockent les souvenirs et par quels mécanismes ils s'effacent. Le porteur reconnaît que l'isolement empêche les souris d'exprimer leur comportement social et qualifie la tâche de mémoire de "légèrement aversive", sans dire ce qu'elle leur inflige.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes cellulaires et neuronaux impliqués dans le stockage de la mémoire à court et à long terme au sein du cerveau des rongeurs. Cette recherche s’appuie sur des travaux antérieurs, qui ont révélé que certaines propriétés des neurones se modifient suite à une expérience ou une tâche comportementale. Nous cherchons à approfondir ces observations en explorant les facteurs moléculaires et les processus cellulaires responsables des changements observés. Pour les raisons techniques, le projet se déroule dans deux Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2

Bénéfices attendus

Notre projet aborde des défis importants pour comprendre les bases neurobiologiques de la formation de la mémoire. Grâce à la combinaison d'approches utilisées, le projet permettra : i) une meilleure compréhension du rôle du cerveau dans le stockage de la mémoire, ii) l'identification des mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine de l'oubli.

Procédures

Tous animaux subissent à une ou deux intervention(s) chirurgicale(s) (chacun d'une durée < 60 min) réalisées sous anesthésie, pour lesquelles ils reçoivent un traitement analgésique et des soins appropriés. Certains animaux (125) subiront une intervention sous sédation (sans acte invasif) d'une durée d'environ 60 minutes pour la pose d'une prothèse sur la tête. Pour des raisons techniques liées à la présence d'une prothèse, il est nécessaire d'adapter les conditions d'hébergement de ces animaux. 125 animaux seront hébergés individuellement pendant une période de 5 semaines, avec des périodes d'échange entre congénères. Ces mêmes animaux seront progressivement habitués à accepter la pose d'un appareil d'imagerie sur leur tête au cours de séances d'entraînement, dont la durée augmentera progressivement de 2 à 15 minutes. Tous les animaux sont soumis à une tâche comportementale classe de sévérité modère. La tâche comportemental se compose de deux séances, l'apprentissage de la mémoire associative et le rappel (chaque séance dure 6 à 7 minutes). Certains animaux (45) reçoivent également des injections bi-quotidiennes pendant 7 jours (14 injections en totale). Toutes ces interventions sont réalisées au sein de l' EU1. Certains animaux (150) seront transportés (trajet à pied de 5 minutes) vers une zone annexe de l'EU 2, où ils seront profondément anesthésiés, puis euthanasiés. Leurs tissus seront ensuite utilisés pour des expériences physiologiques aiguës.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent une ou deux procédures chirurgicales sous anesthésie. Les effets indésirables potentiels de ces interventions incluent un inconfort modéré, une perte de poids potentielle et un risque d'infection. Ce projet comprends également un test comportemental légèrement aversif. Ce test comportemental peut être stressant pour les souris. Les injections répétées peuvent également être une source d'inconfort. Certains animaux seront hébergés individuellement pendant 5 semaines. Cela représente un stress, car ils ne peuvent pas exprimer leur comportement social naturel.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.

Remplacement

Le projet se concentre sur l'étude des mécanismes sous-jacents à la formation et au stockage de la mémoire dans le cerveau. Il comprend les tests comportementaux. Pour mener à bien cette étude, nous avons besoin d'un modèle qui soit : i) complexe et intact, ii) modifiable génétiquement, iii) doté de la structure cérébrale ciblée, et iv) adapté aux approches comportementales complexes et les tests invasifs.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous avons estimé le nombre nécessaire pour obtenir une signification statistique en nous basant sur des études antérieures et des recherches bibliographiques. Nous nous engageons à utiliser le nombre minimal d'animaux requis pour atteindre les objectifs de l'étude. Pour ce faire, nous avons prévu une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce des données (c'est-à-dire, analyse effectuée en petits lots avec une expérience par jour). Cette approche nous permettra d'ajuster la taille de l'échantillon en fonction des résultats préliminaires et de détecter rapidement tout problème potentiel avec la procédure, afin de modifier notre approche pour les lots suivants si nécessaire. En ce qui concerne l'approche statistique, nous appliquerons les tests appropriés en fonction des caractéristiques de nos données.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne : Les animaux seront surveillés chaque jour pour assurer leur bien-être général. ii) Vérification de l'état de l'animal : Avant chaque manipulation, l'état de l'animal sera vérifié selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Critères d’évaluation de la souffrance : L’apparence générale et le comportement de l’animal seront observés pour détecter tout signe de souffrance, douleur ou détresse (par exemple : état prostré, pelage non toiletté, griffures, etc.). Tout signe de souffrance déclenchera une réponse immédiate et appropriée, comme des mesures conservatoires (isolement temporaire, administration de glucose, réchauffement en couveuse, soins des blessures, etc.). Si aucune amélioration n'est constatée après ces interventions, l'expérimentateur décidera de l'euthanasie de l'animal, en consultation avec le vétérinaire et l'équipe des zootechniciens si nécessaire. iv) Les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et analgésie. v) Manipulation quotidienne : Les animaux seront manipulés quotidiennement avant les expériences pour réduire leur niveau de détresse. vi) Intégration des techniques de raffinement : Nous intégrerons régulièrement de nouvelles techniques de raffinement en formant les expérimentateurs et en consultant des ressources éducatives visant à renforcer le respect des principes de raffinement. vii) Conditions d’hébergement : Les animaux seront maintenus dans des cages collectives avec un enrichissement comprenant des tubes en carton et du matériel pour la nidification.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris pour les raisons techniques liées à la réalisation du projet. Actuellement, la souris est la seule espèce mammalienne pour laquelle il est possible, de manière routinière, de modifier le génome, et pour laquelle les modèles créés ont été caractérisés tant au niveau comportemental que moléculaire. Les protocoles comportementaux décrits dans ce projet sont déjà validéspour ce modèle. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 12 semaines. Nous ne pouvons pas utiliser de souris plus âgées en raison de l'effet du vieillissement sur la formation de la mémoire. De plus, les souris de moins de 6 semaines (avec un cerveau en développement) peuvent avoir des mécanismes différents sous-jacents à la formation de la mémoire et sont également sujettes à un oubli plus rapide.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié soumise à un régime gras pendant dix-huit mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal passe 48 heures seul en cage de mesure de la dépense énergétique, subit sept pesées, une injection, un gavage et trois prélèvements, puis jusqu'à six tests évaluant l'anxiété, l'activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire et les capacités sensorimotrices. La faim liée à la mise à jeun, la peur pendant les manipulations et l'isolement figurent parmi les nuisances déclarées. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur "l'animal entier" et retient la souris pour la facilité d'y invalider des gènes, les corps servant ensuite aux analyses histologiques.

Objectifs

Le laboratoire étudie les mécanismes favorisant le développement des maladies métaboliques (maladies du foie, diabète, obésité) et vasculaires (athérosclérose). Il étudie aussi l'impact du vieillissement biologique dans la survenue des pathologies avec l'âge et le déclin des fonctions physiques et cognitives. Dans cet objectif, il utilise des modèles murins génétiquement modifiés sur des protéines ou récepteurs impliqués dans la régulation de l'homéostasie lipidique et aussi glucidique. Les objectifs du projet sont de 4 niveaux et décrits à la suite: - comprendre à l'échelle du vivant le métabolisme des lipoprotéines ainsi que le fonctionnement des mitochondries - mettre en évidence sur des animaux génétiquement modifiés les anomalies de ce métabolisme sous un régime normal et sous un régime gras - Etudier/décrire l'impact des délétions génétiques sur le fonctionnement des organes au cours du vieillissement - étudier les effets du régime alimentaire déséquilibré sur le long terme (vieillissement biologique). Le projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet aboutira à une avancée potentielle en connaissances scientifiques. Les bénéfices attendus: 1/ Dans le cadre des études de recherche fondamentale, il s'agira de: - Comprendre/décrire dans un organisme l'impact des invalidations génétiques de protéines, notamment mitochondriales impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique, sur la physiopathologie du métabolisme glucidique et lipidique. - Comprendre/décrire l'activité métabolique des mitochondries, l'expression des gènes du métabolisme lipidique et glucidique et de régulation de la fonction mitochondriale, et les réactions métaboliques au sein des tissus génétiquement modifiés. - Comprendre l'impact d'une alimentation déséquilibrée sur le vieillissement des organes, - Comprendre l'impact du vieillissement sur le fonctionnement des organes, 2/ Dans le cadre de la recherche d'outils, cibles à visée thérapeutique pour un transfert chez l’homme: - Identifier des voies de signalisation et cibles thérapeutiques du métabolisme énergétique et lipidique, visant au développement de futurs médicaments.

Procédures

Dans le premier établissement, la moitié des animaux (souris) seront mis sous régime gras pendant 18 mois. Ils subiront, des pesées (7 fois, 30 sec), une injection (5 sec), un gavage (30 sec) et des prélèvements à 3 reprises (5 sec à 3 min), une mesure de la composition corporelle en matières grasses à 3 reprises (4min) et une mesure de la dépense énergétique où l’animal est hébergé seul (1 fois pendant 48h). Dans le second établissement, ils subiront jusqu’à 6 tests de comportements (durée 6min à 30min) afin d'évaluer l'anxiété, l’activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire, les capacités sensorimotrices, et les capacités physiques de l’animal.

Impact sur les animaux

Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. Le changement de régime alimentaire peut induire un stress à l'animal. La faim est une nuisance pouvant survenir lors de la mise à jeun des animaux.La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, à l'occasion des prélèvements ou de leur isolement dans certaines procédures. La peur et le stress peuvent aussi survenir lors la découverte de nouveaux environnements, ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant prélèvement. D'autres nuisances sont la douleur à l'injection, lors des prélèvements, ou à l'occasion de certains tests comportementaux.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort à des fins d’analyse et d’études histologiques.

Remplacement

Nos travaux visent à étudier à l'échelle du vivant, dans un tissu ou organe, les mécanismes biologiques qui favorisent le développement des maladies métaboliques En parallèle,des tests de culture cellulaire sont à l'étude pour étudier des mécanismes précis et limiter le nombre d'animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est déterminé sur la base de nos études antérieures ou de la littérature correspondante. Dans ce contexte, le nombre d’animaux utilisé dans chaque groupe étudié sera suffisant pour réaliser les analyses statistiques. De plus, plusieurs données scientifiques pourront être obtenues avec un même animal ce qui réduira le nombre d'animaux dans le projet.

Raffinement

Pour optimiser la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire voire supprimer la douleur, le stress, et améliorer le bien-être des animaux sont mises en oeuvre : - les moyens pour limiter le stress aux animaux seront appliqués: avant les expériences, les animaux seront manipulés et habitués à l’expérimentateur afin de favoriser leur coopération dans les actes non invasifs et non douloureux. Ils seront acclimatés aux différentes conditions expérimentales (pièce, hébergement individuel, et différents expérimentateurs). Les expériences seront réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs. - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur. - des anesthésiques et analgésiques seront utilisés dans les procédures en terminal. Un transporteur agréé pour le transport d'animaux sera réquisitionné. La durée du transport entre les établissements utilisateurs n’excèdera pas les 30 minutes. Les animaux seront transportés dans leur cage d'origine (enrichissement compris) afin de limiter le stress lié au transport. Des points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis, - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits, - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après les actes quand c'est nécessaire, - la mise en place de procédures de mise à mort quand c'est nécessaire.

Choix des espèces

La finalité du projet est d'identifier les effets de la mutation de protéines, notamment mitochondriales, impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique et le vieillissement. Ainsi, il est indispensable de travailler sur l’animal entier pour comprendre le rôle de ces protéines. Le choix du modèle souris vient du fait que celui-ci offre de larges potentialités pour l'application des méthodes d'ingénierie génétique et d'étude expérimentale du comportement. Il est possible, grâce à ce modèle, d’invalider l’expression des protéines étudiées dans ce projet, et ainsi d'évaluer leur rôle. Nous disposons de lignées murines transgéniques sur ces protéines pour réaliser notre projet. Les procédures de notre protocole sont adaptées à la souris. Nous disposons de données scientifiques du métabolisme des lipides et des glucides sur ce modèle animal. Nous maîtrisons d'un point de vue scientifique l'état de l'art sur la physiopathologie de l'athérosclérose et de la maladie du foie (inflammation et stéatose) sur ce modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour démarrer le régime dans les études portant sur l'étude du métabolisme ou de l'athérosclérose. Les longues durées de régime sont classiquement utilisées pour étudier le développement de l'athérosclérose chez la souris et l'impact du régime alimentaire sur l'altération des fonctions au cours du vieillissement de l'animal. Dans les articles scientifiquement, le vieillissement chez la souris, est classiquement étudié chez des souris âgées de 12 à 18 mois.

Tester les molécules de clients industriels sur des reins malades occupe 2520 rats et 1620 souris, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux développent une néphropathie spontanément, par diabète ou par lupus, ou bien par induction chimique, puis reçoivent les composés à évaluer au fil de 55 études étalées sur cinq ans. Chaque semaine, ils passent jusqu'à vingt-quatre heures isolés en cage à métabolisme pour la collecte d'urine, subissent une vidange manuelle de la vessie, deux heures d'anesthésie gazeuse pour la mesure de la filtration rénale, des prises de sang et parfois l'implantation d'une pompe osmotique. Le porteur écrit ne connaître "ni la nature ni les effets secondaires possibles" des molécules testées, et retient un modèle de lupus dont la littérature annonce 50 % de mortalité à six mois, en gardant les animaux en vie jusqu'à sept mois.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments dans des modèles de néphropathie. Nous pensons réaliser 55 études dans ce projet sur 5 ans.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de néphropathie.

Procédures

Les animaux vont développer naturellement une néphropathie (animaux diabétiques ou ayant le lupus) ou celle-ci sera induite chimiquement. Les animaux vont recevoir des administrations de composés chimiques (inducteur de pathologie ou de candidats médicaments à tester). Ces gestes seront très rapides (moins d’1 minute) et seront réalisés par du personnel compétent pour diminuer tout stress. Les animaux seront mis dans des cages à métabolisme et isolés temporairement de leurs congénères (24H maximum 1 fois par semaine) afin de récolter de l’urine. Une vidange manuelle de la vessie pourra aussi être réalisée (environ 30 secondes pour ce geste sans douleur). Les animaux auront une anesthésie gazeuse afin de pouvoir leur « scotcher » un capteur afin d’évaluer la filtration glomérulaire pendant 2 heures et seront remis avec leurs congénères ensuite. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés au cours de l’expérimentation ainsi que des dosages de glycémie à l’aide d’un glucomètre (nécessité d’avoir 1 goutte de sang, geste durant 30 secondes). Les animaux auront une procédure chirurgicale rapide (10 minutes) que s’il y a implantation de pompes osmotiques.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). Nous utiliserons des animaux génétiquement modifiés développant spontanément des néphropathies selon le modèle étudié ou nous induirons chimiquement cette pathologie rénale. Les animaux vont donc ressentir les symptômes de cette pathologie à savoir des troubles rénaux (douleur possible) et par conséquent des troubles urinaires.

Devenir

Tous les animaux de l’expérience seront mis à mort et des prélèvements d’organes seront réalisés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des néphropathies. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) pour certains paramètres (récolte d’urines via des cages métaboliques, mesure de la filtration glomérulaire qui sont des méthodes non invasives). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience en expérimentation animale et pour ces différents modèles, les publications scientifiques publiées, un nombre minimum de 10-15 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables selon les modèles. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence entre les groupes

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, carré de coton…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux (aspect général de l’animal, pâleur, poils hérissés, sales ou toilettage, prostration ou non, difficulté à se mouvoir, plaie…) sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Les procédures sous anesthésie seront réalisées sur plaque chauffante thermorégulée afin d’éviter toute hypothermie de l’animal. Des analgésiques seront administrés selon les protocoles expérimentaux. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps, soigné, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et réaliseraient une mise à mort.

Choix des espèces

Tous les modèles sont bien décrits dans la littérature chez le rat ou la souris. Certains modèles nécessitent l’utilisation d’animaux particuliers : Modèle de néphopathie lupique : Le modèle choisi pour cette étude est un modèle murin génétiquement modifié. Elles vont développer de manière spontanée une néphropathie cliniquement similaire à ce qui est observé dans la pathologie humaine. Dans la littérature, il est précisé qu’il y a un taux de mortalité de 50 % chez des animaux âgés de 6 mois. A moins que les animaux présentent des signes cliniques nécessitant leur mise à mort, nous les garderons en vie maximum jusqu’à l’âge de 7 mois. Modèle de néphropathie diabétique : Il existe plusieurs modèles diabétiques développant une néphropathie chez le rongeur : certains chez le rat, d’autres chez la souris. Les modèles de néphropathie diabétique chez les souris génétiquement modifiées que nous avons choisis sont largement décrits dans la littérature et leurs caractéristiques sont très proches de la pathologie humaine du diabète de type II. En accord avec ces données et avec l’objectif de notre étude, nous avons choisi ces modèles pour évaluer l’effet de candidats médicaments sur la fonction et les dommages rénaux induits par cette pathologie. Toutefois, la réalisation de ce projet avec des rats rendus diabétiques chimiquement est tout à fait envisageable et dépendra des demandes des clients et de leur préférence. Selon les modèles, différents animaux seront utilisés : - animaux âgés de 7-8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines (lupus) - des rats de 100 -125 g ou 5 semaines au début de l’expérimentation seront utilisés pour un modèle induit chimiquement en accord avec la littérature et notre expérience. - des rats de 90-100 g ou 4 semaines au début de l’expérimentation seront utilisés pour un autre modèle induit chimiquement en accord avec la littérature et notre expérience. - des animaux d’au moins 6 semaines, stade auquel les animaux ont initié un diabète de type II avec une hyperglycémie ainsi qu’une albuminurie, principales caractéristiques de la néphropathie diabétique. Cependant, selon les demandes du sponsor, l’âge des animaux pourra être différent.

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune passant par une chirurgie du cerveau de quarante-cinq minutes puis par une quarantaine de séances comportementales, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après l'injection de vecteurs viraux dans le cerveau, elles enchaînent trente séances d'accès à une solution sucrée, six tests de motivation de quatre-vingt-sept minutes et trois séances où la boisson est rendue amère par la quinine. Les souris de huit cohortes sur douze reçoivent en plus une injection sous-cutanée dix minutes avant chacune de ces trente séances. Le porteur justifie le choix de la souris comme un "compromis phylogénétique", assez proche de l'humain pour valoir modèle et assez éloignée d'espèces qu'il qualifie de "plus sensibles éthiquement", au premier rang desquelles les primates non-humains.

Objectifs

La surconsommation de sucre est à l’origine de nombreuses maladies chroniques et est un enjeu de santé publique. Des travaux ont montré que le sucre exerce ses effets récompensants non seulement par l'intermédiaire des voies gustatives, mais également via des voies post-ingestives (i.e., la signalisation inconsciente provenant de l'intestin et de la veine porte hépatique). Les voies gustatives et post-ingestives induisent la libération de dopamine via le circuit neuronal « noyau caudal du tractus solitaire /aire tegmentale ventrale /striatum ventral », tandis que la voie purement post-ingestive déclenche la libération de dopamine via le circuit « noyau caudal du tractus solitaire /noyau parabrachial dorsolatéral /Substantia nigra pars compacta /striatum dorsal ». Récemment, il a été proposé que la motivation inconsciente induite par les sucres, et détectée par la voie intestin-cerveau, constituerait la principale cause de surconsommation de sucre. Compte tenu des spécificités des différents circuits neuronaux, nous postulons qu'ils ont une contribution différentielle dans le développement de la surconsommation de sucre. Notre hypothèse principale est donc que les deux circuits neuronaux de la voie post-ingestive favorisent la motivation accrue pour le sucre et sa surconsommation compulsive. Notre projet a pour but d’évaluer le rôle de cette voie post-ingestive dans le développement d’une consommation compulsive de sucre. Tout d’abord, nous évaluerons l’impact de la surconsommation de sucrose sur la motivation à consommer le sucre et sur le recrutement de ces circuits neuronaux chez des souris C57BL/6J de type sauvage. Nous testerons ensuite de manière causale les rôles respectifs de ces circuits dans le développement de l’addiction au sucre en combinant des approches d’activation ou d’inhibition sélective des circuits neuronaux et des approches comportementales chez des souris transgéniques. Nous évaluerons l'impact de l’activation et de l’inhibition de chaque circuit sur la consommation de sucre et la motivation. Nos recherches devraient fournir des informations inédites sur le rôle de l’axe intestin-cerveau dans le développement d’une consommation compulsive de sucre.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont essentiellement d’ordre scientifique. Le premier bénéfice sera de fournir des informations inédites sur le rôle de l’axe intestin-cerveau dans le développement d’une consommation compulsive de sucre et dans la motivation accrue pour consommer le sucre. Le second bénéfice sera de préciser les différents mécanismes neurobiologiques en jeu. Plus généralement, notre projet pourrait avoir des implications importantes pour les stratégies d'intervention en santé publique. En effet, si notre hypothèse est confirmée, les interventions ciblant la voie post-ingestive implicite devraient être plus efficaces que les interventions standards ciblant des choix conscients pour limiter la consommation de sucre.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une chirurgie stéréotaxique (45 min en moyenne) pour l’injection intracérébrale de vecteurs viraux. Cette chirurgie est effectuée sur couverture chauffante en conditions aseptiques alors que les animaux sont sous anesthésie gazeuse et sous analgésie. L’ensemble des souris seront soumises à différents tests comportementaux : accès différentiel à l’auto-administration orale de sucre (30 séances de 20 min ou de 3h), établissement d’une courbe concentration-réponse (2 séances de 20 min ou 3h), test de motivation (6 séances de 87 min) et test de dévaluation de la boisson sucrée par la quinine (3 séances de 20 min). Enfin, une injection sous-cutanée sera effectuée 10 min avant chacune des 30 séances d’accès différentiel à la solution sucrée et avant le test final de 80 min (Jour 85) pour 8 des 12 Cohortes de souris.

Impact sur les animaux

Les animaux seront testés dans différentes procédures successives dont le degré de gravité principal est léger et qui ne dépassera pas le degré modéré. Bien que toutes les précautions soient prises afin de prévenir ou de minimiser les nuisances au maximum (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, conditions aseptiques, suivi postopératoire…), des nuisances ou effets indésirables peuvent éventuellement survenir suite à la chirurgie stéréotaxique. Les nuisances attendues après la chirurgie comprennent : un possible risque d'inflammation ou d'infection, une apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée, une perte des points de suture avant cicatrisation complète. Nous n’anticipons pas de nuisances particulières pendant l’ensemble des tests comportementaux qui suivent. Les souris des cohortes 5 à 12 seront soumis à des injections sous-cutanées de façon quotidienne pendant la phase d’accès différentiel et pendant le test final. Les animaux seront sous surveillance quotidienne pour repérer et prévenir tout problème éventuel.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs cerveaux seront prélevés postmortem pour effectuer des mesures d’expression protéiques cérébrales par analyse immunohistochimique.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation de la souris de laboratoire (Mus Musculus, jeunes adultes, mâles et femelles), sauvages ou transgéniques, vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal se justifie pour les raisons éthiques suivantes : 1) l’éthique humaine actuelle interdit l’utilisation d’interventions invasives chez l’homme, compliquant ainsi l’étude directe des relations causales entre activité de certains circuits neuronaux et surconsommation de sucre ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces relations causales et 3) la consommation compulsive de sucre malgré les conséquences négatives associées est un désordre comportemental complexe qui ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire au projet est réduit au minimum. Un effectif final de 10 souris par sous-groupes est un compromis rationnel, compte tenu de l’exigence éthique de réduction du nombre d’animaux et des contraintes expérimentales propres au projet scientifique proposé. Nous devons en effet avoir un nombre suffisant d’animaux en fin d’expérience pour que nos expériences soient concluantes au plan statistique et que la puissance de nos tests soit satisfaisante. Le pourcentage d’attrition moyen est estimé à 15 % en fin d’expérience, l’effectif initial par groupe devra donc être de 12 souris (12-(12x15/100) = 10 souris). Donc le nombre total d’animaux utilisés pour tester les variables du projet sera égal à 768 souris (384 souris mâles et 384 souris femelles). Les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques paramétriques. Le seuil de significativité statistique sera fixé à p< 0.05.

Raffinement

Toutes les chirurgies stéréotaxiques (45 min-1h en moyenne par animal) seront réalisées sous analgésie, sous anesthésie gazeuse et en conditions aseptiques sur couverture chauffante. Un anesthésique local sera infiltré sous la peau du crâne au niveau du site d’incision pour prévenir toute douleur locale additionnelle. En fin de chirurgie, l’animal recevra une injection sous-cutanée de sérum physiologique pour favoriser la réhydratation. L’animal sera ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal sera relogé dans sa cage de stabulation avec ses congénères. Les animaux seront sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter d’éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et y remédier rapidement. Nos méthodes d’interventions pour réduire ou supprimer l’inconfort ou la douleur seront gradées. Quand nous constaterons les premiers signes d'inconfort chez un animal, nous mettrons en place des mesures de nursing avec un accès facilité à l’aliment (nourriture posée sur le sol de la cage). Si cela ne suffit pas, l’animal recevra plusieurs doses d’analgésique. L'animal sera aussi réhydraté par injection sous-cutanée de sérum physiologique . Enfin, si cela ne suffit pas au rétablissement de l'animal, celui-ci sera mis à mort sans souffrance. Avant le début des expériences, les souris connaissent une période d’acclimatation de 7 jours, durant laquelle elles sont délicatement manipulés de façon quotidienne. Cette approche permet de limiter le stress des animaux lors du démarrage des procédures en les habituant à la préhension et à la contention. Elles sont également habituées aux cages expérimentales (pendant 2 jours consécutifs, 2h/jour) afin de limiter le stress et l’anxiété.

Choix des espèces

Le choix de la souris de laboratoire constitue une sorte de compromis phylogénétique. Cette espèce est suffisamment proche de l’homme d’un point de vue phylogénétique pour servir de modèle animal valide des phénomènes « d’addiction au sucre » par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (e.g., invertébrés) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (e.g., primates non-humains). Les espèces invertébrées peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes neuronaux ou génétiques de certains comportements alimentaires mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine « des addictions alimentaires ». De plus, la souris transgénique, est un modèle animal unique, nous permettant d’étudier le rôle spécifique de certains neurones dans la surconsommation de sucre, ce qui est irréalisable avec les autres modèles animaux. Les animaux utilisés seront tous de jeunes adultes au début des expériences (plus vieux que 6 semaines). Ce stade du développement correspond à une maturation complète du cerveau et à une stabilisation de la fonction des systèmes neurobiologiques d'intérêt.