Souris
Développement de nouveaux vaccins muqueux contre les infections à pneumocoque
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
9 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 728 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 3 072 en souffrance modérée. Elles sont vaccinées deux fois par voie nasale sous anesthésie gazeuse, puis reçoivent le pneumocoque dans les narines, ce qui provoque chez une partie d'entre elles une colonisation du nez ou une pneumonie avec perte de poids et altération de l'état général. L'objet est de mettre au point un vaccin nasal couvrant davantage de sérotypes que les vaccins actuels, qui n'en protègent qu'environ 20 %. Les souris qui survivent à l'infection sont tuées comme les autres, aucun animal infecté ne pouvant être adopté ni réutilisé, et un score clinique quotidien déclenche la mise à mort avant les signes les plus sévères.
Objectifs
La bactérie Streptococcus pneumoniae (pneumocoque), pour laquelle plus de 100 sérotypes ont été décrits, est la cause principale d’infection du tractus respiratoire supérieur et inférieur, et constitue un problème de santé publique majeur dans le monde. Les enfants de moins de 5 ans, les personnes âgées de plus de 65 ans et les individus avec un système immunitaire affaibli sont principalement affectés, et la sévérité de la maladie est exarcerbée chez les patients co-infectés par le virus de la grippe. Le pneumocoque colonise naturellement le nasopharynx, le plus souvent de manière asymptomatique (portage asymptomatique) ; les bactéries peuvent atteindre les poumons par aspiration des sécrétions nasopharyngées et induire une pneumonie (infection pulmonaire) qui peut évoluer vers une maladie invasive lorsque les bactéries pénètrent dans les vaisseaux sanguins des poumons et atteignent la circulation générale. Les vaccins commercialisés à l’heure actuelle protègent contre environ 20% des sérotypes du pneumocoque. Le développement de nouveaux vaccins capables d’induire une réponse immunitaire spécifique d’un motif bactérien conservé, partagé par les différents sérotypes, permettrait donc d’élargir la protection vis-à-vis d’autres sérotypes. D’autre part, les vaccins actuels, administrés par injection intramusculaire, préviennent l'apparition ou réduisent les symptômes d'une infection invasive mais présentent une capacité limitée à stimuler une immunité des muqueuses et à protéger contre la colonisation nasale ou la pneumonie. Afin de prévenir l'infection bactérienne pulmonaire et la transmission de la bactérie, l’utilisation de vaccins muqueux administrés par voie nasale, capables d’induire une réponse immunitaire au niveau du nasopharynx et des poumons, représente donc une approche d’intérêt. Le projet comporte les objectifs suivants : (1) Identifier des éléments conservés de S. pneumoniae nécessaires à la colonisation nasale (portage asymptomatique) et/ou à l’invasion pulmonaire et capables de stimuler une réponse immunitaire protectrice, (2) Développer des formulations innovantes pour les vaccins muqueux (à administration nasale), (3) Réaliser l’évaluation préclinique de l’efficacité et du mécanisme d’action de vaccins muqueux
Bénéfices attendus
Le résultat majeur du projet sera d'identifier de nouveaux vaccins candidats capables d’inhiber un stade de portage asymptomatique ou l’invasion pulmonaire, indépendamment du sérotype du pneumocoque. Il permettra d’autre part une caractérisation approfondie des mécanismes de l’immunité induite par la vaccination et l’infection au niveau du nasopharynx et au niveau pulmonaire. Ceci contribuera au développement d’outils applicables à long terme au développement d’autres vaccins à administration nasale, y compris dans d’autres contextes infectieux. Le développement de vaccins avec une efficacité accrue contre l’infection et la transmission présente un bénéfice pour la santé des populations au niveau mondial (impact sociétal) et un bénéfice économique lié à la prévention des infections à S. pneumoniae.
Procédures
Les souris seront vaccinées deux fois à 2 ou 3 semaines d’intervalle par administration nasale sous anesthésie gazeuse. Dans ce but, le vaccin anti-pneumocoque sous une forme liquide est déposé dans narines. Une solution saline est utilisée comme contôle négatif de vaccination. Pour comprendre le mécanisme d’action du vaccin et consolider l’innocuité du vaccin, les réponses en anticorps et cellulaire sont analysées. Dans certaines expériences, afin de caractériser le mécanisme d’action des vaccins, les souris recevront par injection des molécules qui modulent la réponse du système immunitaire. Pour étudier l’efficacité des vaccins, les animaux vaccinés recevront le pneumocoque 2 à 3 semaines après l’administration de rappel. La capacité des vaccins à diminuer la colonisation asymptomatique du nez, et ainsi la transmission entre individus, sera évaluée. L’efficacité des vaccins sera également testée contre une infection pulmonaire à pneumocoque. La colonisation et l’infection pulmonaire se font par administration nasale sous anesthésie par injection.
Impact sur les animaux
De façon similaire à une injection chez l’homme, les injections chez l’animal peuvent causer une douleur minime liée à la piqûre. Une aiguille la plus fine possible appropriée pour le type d’injection sera utilisée, et un nombre minimum d’administrations sera réalisé afin d’atteindre les objectifs scientifiques. Dans le cas des expériences comprenant une étape d’infection pulmonaire avec le pneumocoque, la majorité des analyses seront effectuées à des temps précoces, avant la survenue d’effets indésirables dûs à l’infection. Néanmoins, à des temps plus tardifs, les bactéries peuvent provoquer une infection respiratoire chez la souris qui peut se traduire par une perte de poids et/ou une altération de l’état général. Notre projet consiste à vacciner les animaux pour prévenir la survenue d’une infection pulmonaire et on s'attend donc à une amélioration de l’état général des animaux vaccinés en comparaison à des animaux non traités. Des critères d’arrêts de l’étude, évalués grâce à un score clinique, ont été définis afin de contrôler le bien-être des animaux. Ainsi, la mesure du poids de l’animal et l’inspection des signes physiques (pelage, respiration) et du comportement (mobilité) seront effectués de façon quotidienne, afin de détecter le plus précocément possible l’apparition de signes de souffrance. Les expérimentateurs sont formés à ces observations et procèdent à l’euthanasie des animaux si ces paramètres sont significativement détériorés, quel que soit le groupe expérimental.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés. Ainsi, les animaux seront euthanasiés afin d’analyser la réponse immunitaire dans différents tissus et/ou de déterminer le nombre de bactéries dans le nez, les poumons et la rate. Dans le cadre des expériences incluant une étape d’infection avec le pneumocoque, les animaux développant des signes sévères d’infections seront euthanasiés et ceux qui survivent à l’infection seront euthanasiés car ils ne peuvent être replacés ou adoptés (animaux infectés). La réutilisation de ces animaux n’est pas envisageable car la procédure réalisée peut altérer les résultats d’une étude ultérieure.
Remplacement
Des études in vitro seront développées pour mimer la colonisation nasale par S. pneumoniae et l’interaction des vaccins avec les muqueuses. Néanmoins, à ce jour, la complexité des processus infectieux et immunitaires ne peut pas être intégralement reproduite dans des tests in vitro et l’utilisation de souris sera donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet, dans le respect des stratégies de réduction et de raffinement ci-dessous.
Réduction
(1) Modélisation in vitro : des études sur des cellules isolées d’animaux seront développées afin de mimer la réponse aux vaccins. Une veille bibliographique sera réalisée afin d’identifier d’éventuels nouveaux modèles permettant de mimer la complexité des interactions entre les cellules du système immunitaire, les cellules épithéliales et la bactérie ou les vaccins. (2) L’utilisation de souris génétiquement identiques dans nos expériences permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats robustes. (3) La taille des groupes d'animaux dans les expériences réalisées est déterminée par des méthodes statistiques afin d’utiliser le strict nécessaire pour répondre à la question scientifique.
Raffinement
Lors de l’euthanasie, de multiples tissus (nasopharynx, poumons, ganglions drainants, rate, sang) seront prélevés sur chaque animal afin de rassembler un maximum de données exploitables pour chaque animal. L’utilisation de techniques de mesures à moyen et haut débit (qui mesurent plusieurs paramètres par échantillon) permettra également d’obtenir des données multiples sur chaque échantillon et de raffiner les analyses.
Choix des espèces
L’activation du système immunitaire et l’inflammation induites lors d’une infection respiratoire reposent sur le recrutement et l’activation de nombreux types cellulaires et sur la production d’une multitude de facteurs solubles. L’induction d’une réponse immunitaire protectrice par les vaccins implique aussi l’activation de multiples types cellulaires et leur interaction dans différents tissus. A ce jour, la complexité de ces processus infectieux et immunitaires ne peut pas être reproduite in vitro. Le modèle murin est le plus pertinent pour analyser l’efficacité et le mécanisme d’action de vaccins à un stade précoce de développement. De nombreux modèles de souris invalidées dans la réponse immunitaire sont disponibles et permettent de comprendre le mode d’action des vaccins. Les outils d’analyse nécesaires à l’évaluation des vaccins sont par ailleurs très développés pour la souris. Pour les souris obtenues auprès de fournisseurs agréés, des animaux adultes âgés de 6 à 10 semaines en début d’expérience seront utilisés. Pour les animaux provenant de l’élevage local, les animaux pourront être âgés de 6 à 20 semaines. A ces âges, le système immunitaire des souris est considéré comme compétent. Enfin, la détermination des doses de bactéries nécessaire à la colonisation nasale ou l’infection pulmonaire a déjà été établi par l’ensemble de la communauté scientifique. Ponctuellement, des tests pourront être réalisés sur des animaux jeunes (3 semaines) ou très âgés (>52 semaines) pour évaluer l'efficacité vaccinale aux âges extrêmes.
Etude des effets cocktail de perturbateurs endocriniens sur la production de Vésicules Extracellulaires (VEs) adipeuses chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
Tuées pour que leur tissu adipeux soit prélevé et mis en commun, une seule souris n'en fournissant pas assez, 720 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent neuf gavages hebdomadaires d'une huile contenant un mélange de quatre perturbateurs endocriniens, à faible ou forte dose, une partie d'entre elles suivant en plus un régime riche en graisses pendant toute l'étude. Une partie des souris est obèse par mutation génétique, ce que le porteur relie à des troubles de mobilité, une résistance à l'insuline et une inflammation chronique, en précisant que ces effets "ne provoquent pas de douleur directe". Les vésicules extraites de leur graisse seront ensuite testées sur des cellules en culture et injectées à des larves de poissons zèbres, toute application humaine restant hors du projet.
Objectifs
Les maladies du foie liées à l’accumulation de graisse (appelées MASLD, anciennement NAFLD) sont de plus en plus fréquentes et représentent un véritable problème de santé. Elles commencent par une infiltration excessive de graisse dans les cellules du foie (stéatose), ce qui peut entraîner des complications plus graves comme l’inflammation du foie (MASH), puis évoluer vers de la fibrose, une atteinte sévère du foie (cirrhose) et, dans certains cas, un cancer du foie. Parmi les facteurs qui pourraient aggraver ces maladies, l’exposition prolongée à certaines substances chimiques appelées perturbateurs endocriniens (PEs) est particulièrement inquiétante. Ces substances, présentes dans l’environnement et certains produits du quotidien, pourraient perturber le fonctionnement normal du foie et favoriser la progression de ces maladies. Dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment certaines substances chimiques de l’environnement, appelées perturbateurs endocriniens (PEs), pourraient influencer les maladies du foie liées à l’accumulation de graisse. Pour cela, nous allons produire en laboratoire des particules appelées vésicules extracellulaires adipeuses (AdVEs), issues de la graisse de souris ayant été exposées à différents niveaux de PEs. Ces particules pourraient jouer un rôle clé dans l’évolution de ces maladies. Pour cela, nous exposerons des souris de différentes souches (normales, obèses et nourries avec un régime riche en graisses) à des perturbateurs endocriniens. Après leur mise à mort, nous collecterons le tissu adipeux pour produire in vitro les AdVEs. Grâce à ces différents modèles expérimentaux, nous pourrons étudier comment le sexe et l’état métabolique des souris (obésité d’origine génétique ou liée à l’alimentation) influencent la production et la composition des vésicules extracellulaires adipeuses (AdVEs), ouvrant ainsi la voie à une meilleure compréhensions des interactions entre exposition environnementale, adiposité et dysfonctionnements métaboliques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer les effets d’une exposition prolongée à un mélange de substances chimiques appelées perturbateurs endocriniens (PEs), à deux niveaux d’exposition différents, dans des situations métaboliques variées. L’objectif est de mieux comprendre l’impact combiné de ces substances, en particulier lorsqu’elles sont associées à de l’obésité. Des études précédentes ont montré que certains de ces polluants, pris individuellement, ont peu d’effet, mais qu’en cocktail, ils peuvent perturber davantage le métabolisme en agissant ensemble. Cette approche aidera à mieux comprendre comment l’environnement influence notre organisme. Enfin, les vésicules extracellulaires issues de la graisse des souris seront utilisées pour étudier leurs effets soit sur des cellules en laboratoire, soit après injection dans des larves de poissons-zèbres. Ces modèles complémentaires permettront d’avoir une vision plus large des conséquences de ces substances dans un contexte pathologique particulier.
Procédures
Une partie des souris sera soumise à un régime riche en graisses HFD pendant toute la durée de l’étude. Et toutes les souris recevront, par gavage oral (5 secondes) et à neuf reprises, soit une huile servant de contrôle, soit une huile contenant un mélange de 4 perturbateurs endocriniens, à faible ou forte dose.
Impact sur les animaux
Le gavage hebdomadaire est la principale source de nuisance dans cette étude. Bien qu’indispensable pour une administration contrôlée des substances, cette méthode peut entraîner du stress pour les animaux. Pour réduire cet impact, les manipulations seront effectuées par du personnel qualifié, en utilisant une contention appropriée et en limitant la durée des manipulations. L’exposition aux substances étudiées vise à simuler une exposition environnementale chronique, comparable à celle à laquelle les humains peuvent être confrontés. Toutefois, l’administration répétée peut provoquer un stress physique, notamment à cause des manipulations fréquentes. L'obésité, qu'elle soit causée par un régime alimentaire spécifique ou une mutation génétique, peut entraîner des problèmes de mobilité, des troubles métaboliques tels que la résistance à l'insuline et une inflammation chronique. Toutefois, ces effets ne provoquent pas de douleur directe chez l'animal, bien qu'ils nuisent à son bien-être en réduisant sa capacité à se déplacer et en générant un stress physiologique.
Devenir
À la fin de la procédure toutes les souris seront mises à mort, afin de permettre le prélèvement du tissu adipeux nécessaire à l’isolement des vésicules extracellulaires.
Remplacement
Le développement des maladies hépatiques liées à l’accumulation de graisse est souvent associé à l’obésité et résulte d’interactions complexes entre plusieurs organes, notamment le foie, le tissu adipeux et le pancréas. Ces échanges impliquent également divers types cellulaires au sein du foie. Les perturbateurs endocriniens (PEs) agissent en perturbant les hormones, ce qui peut influencer ces mécanismes. En l’absence de modèle alternatif fiable pour reproduire l’obésité à l’échelle de l’organisme, nous utiliserons un modèle murin de souris déjà bien caractérisé. De plus, ces interactions complexes entre les organes, qui jouent un rôle clé dans les troubles métaboliques, ne peuvent être correctement reproduites qu’avec un modèle vivant.
Réduction
L’expérimentation sera réalisée avec un nombre d'animaux suffisant pour garantir des résultats fiables et statistiquement interprétables. Le nombre total d'animaux est déterminé en fonction du nombre de groupes nécessaires et du nombre d'animaux par groupe pour obtenir des données fiables. Pour extraire les vésicules extracellulaires provenant du tissu graisseux, une certaine quantité de matière est indispensable. Comme une seule souris ne fournit pas assez de tissu, il est nécessaire de regrouper celui de plusieurs animaux. Le nombre varie selon le type de souris utilisé : il en faut davantage pour les souris de poids normal, et un peu moins pour les souris obèses. Des tests statistiques ont montré qu’il fallait au minimum huit échantillons indépendants pour chaque condition afin de pouvoir comparer les résultats de façon fiable. Ces échantillons seront préparés séparément pour les mâles et les femelles, car les effets étudiés peuvent différer selon le sexe. Au total, ces besoins justifient l’utilisation de 720 souris pour l’ensemble de l’étude.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce, avec un enrichissement du milieu (cabanes, papier, tubes en carton, morceaux de bois). Le protocole expérimental prévoit un suivi quotidien des animaux, basé sur l’observation de signes physiques et comportementaux prédéfinis, qui permettront de repérer tout signe de mal-être. Leur poids sera contrôlé deux fois par semaine. En cas de douleur ou de souffrance, des antalgiques pourront être administrés. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas, une euthanasie pourra être pratiquée pour éviter toute souffrance prolongée, selon une grille d’évaluation spécifique. Les souris obèses, mâles ou femelles, seront placées par groupes de 2 ou 3 par cage, en tenant compte de leur poids et de la taille des cages, et des tétines plus longues seront installées sur les biberons d’eau pour faciliter la prise. Étant moins mobiles, une attention particulière sera portée lors de leurs transferts.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie pour ces études est la souris, c’est un modèle bien établi d’étude préclinique et facilement accessible, permettant d’étudier les effets des perturbateurs endocriniens dans un contexte physiologique complexe. Leur exposition à un gavage hebdomadaire est facile à réaliser, ce qui simplifie l’administration contrôlée des substances. Des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées, car les maladies liées à l'accumulation de graisses dans le foie touchent principalement les adultes.
Role des hormones thyroïdiennes dans les altérations de mémoire liées à la consommation de régime obésogène
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une canule est implantée dans l'hippocampe de 1 124 souris par chirurgie stéréotaxique, geste qui peut provoquer des crises d'épilepsie et que l'animal peut décoller en se frottant. 1 700 souris vont être utilisées au total, toutes tuées à l'issue, 1 124 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 384 dans des procédures d'un niveau sévère. Le porteur ramène les nuisances à leur durée, deux tests de cinq minutes pour les troubles émotionnels et trois minutes de contention pour la mesure de masse grasse, quand 384 souris relèvent tout de même du niveau de souffrance le plus élevé. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour analyse de l'expression des gènes, électrophysiologie ou immunohistochimie, afin de comprendre comment un régime gras et sucré consommé dès l'adolescence altère la mémoire.
Objectifs
Le thème général du projet porte sur l’effet délétère d’une alimentation déséquilibrée (obésogène) sur la mémoire. Une alimentation trop riche en gras et en sucre augmente le risque de problèmes cognitifs comme la mémoire. La période d’adolescence est particulièrement sensible à ce type d’alimentation car le cerveau est encore en maturation. Les conséquences de difficultés de mémoire chez les adolescents sont importantes car elles vont impacter la performance scolaire et influencer la mémoire pour toute la vie. Il est donc important de comprendre la vulnérabilité spécifique à l'adolescence et de trouver les moyens de prévenir ces déficits de mémoire. Nos études précédentes ont mis en lumière l'implication des hormones thyroïdiennes dans ces déficits de mémoire et ont montré que la chrononutrition permet de prévenir ces troubles. L'objectif du projet présenté ici est de comprendre comment les hormones thyroïdiennes altèrent la mémoire associée à la consommation de régime obésogène durant l'adolescence et comment la chrononutrition permet de prévenir ces troubles. Une recherche pré-clinique est indispensable pour cette compréhension des mécanismes neurobiologiques mises en jeu de par les conditions expérimentales contrôlées (mêle nourriture, même condition de vie) et la possibilité d'étudier le cerveau au-delà de l'imagerie cérébrale.
Bénéfices attendus
L’achèvement des expériences proposées, sur une durée de 4 ans, devrait fournir des preuves de concept pour de nouvelles approches thérapeutiques potentielles utilisant l’alimentation limitée dans le temps (chrononutrition) pour traiter les troubles de la mémoire induits par l’obésité. Le projet fournira également de nouvelles connaissances sur les actions des hormones thyroïdiennes sur le cerveau, ce qui pourrait aider à traiter les pathologies associées à l’hypothyroïdie légère.
Procédures
Nous effectuerons des chirurgies sur 562 males et 562 femelles. Nous ne ferons pas de prélèvements sur animaux vigiles. 1316 animaux feront des tests de comportement qui n'engendrent pas de souffrance. 384 animaux ferons 2 tests de comportement pour estimer les troubles émotionnels, qui peuvent engendrer de l'angoisse mais chaque test ne dure que 5 min par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie stéréotaxique bien que toutes les précautions soient prises pour réduire la douleur ou les infections. L'implantation de canule dans l'hippocampe de souris peut entrainer parfois des crises d'épilepsie. La souris opérée peut parfois décoller la canule implantée en la frottant. La prise de poids sous régime obésogène est modérée et n’entraine pas de nuisance observable. Certains tests de comportement sont stressants mais ils ne durent que 5 min chacun. Enfin la mesure de masse grasse par RMN oblige à faire une contention de l’animal qui entraine un stress mais ne dure également que 3 min et les animaux sont préalablement habitués à cette contention pour atténuer l'angoisse associée.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue de chaque procédure car nous faisons des analyses post-mortem: analyse de l'expression de gènes, de protéines, électrophysiologie ou immunohistochimie pour préciser les mécanismes moléculaires expliquant les déficits de mémoire et leur prévention par la chrononutrition.
Remplacement
L’objectif général du projet vise à comprendre chez l’animal les conséquences comportementales et neurobiologiques de régime obésogène sur la mémoire et les effets de la chrononutrition. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude de la cognition et des émotions reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous effectuons plusieurs mesures sur le même animal dans un ordre précis afin qu'une première mesure n'influence pas la seconde. Pour les chirurgies nous nous entrainons sur des animaux produits mais non utilisés (par exemple souris récupérées de croisements de souris transgéniques n'ayant pas le génotype désiré) afin dêtre au point et réduire les pertes pour la réalisation des expérimentations. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes n'obligeant pas à répéter l'expérience. Aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.
Raffinement
Dans ce projet nous avons 5 à 10 souris par cage (excepté après chirurgie où les souris implantées de guide-canules sont 2 par cage pour diminuer le risque d'arrachement des implantations par bagarre). Toutes les cages ont au moins un enrichissement (maison en carton, barre à ronger, frisoti et carré de coton pour fabrique de nid). Nous assurons une surveillance quotidienne afin d'apporter des soins rapidement si nécessaire. Nous privilégions les approches non invasives (imagerie in vivo) et pour celles qui ne le sont pas nous appliquons les soins pre et post opératoires, l'anesthésie et l'analgésie. Nous faisons des habituations aux souris qui doivent subir des brèves contentions afin que celles-ci ne soient pas associées à de l'angoisse. Nous avons mis en place des critères de points d’arrêt précoces où nous intervenons très rapidement pour réduire le stress et la douleur des animaux si cela apparait.
Choix des espèces
Nous utilisons uniquement des souris car les expériences de comportement sont validés dans cette espèce et les appareillages sont disponibles. Les traitements nutritionnels sont faciles à conduire et divers aliments/régimes alimentaires sont disponibles commercialement. Enfin, nous disposons pour ce projet de diverses souris transgéniques permettant de répondre aux questions scientifiques posées, par exemple des souris déficientes pour la signalisation des hormones thyroïdiennes. La plupart des expérimentations en neurosciences sont conduites sur des rongeurs (rat ou souris), nos expériences enrichissent le corpus de données en permettant des comparaisons directes avec ce qui est déjà publié. Nous étudions les souris entre 3 et 15 semaines d'âge. Ces âges couvrent la période d'adolescence jusqu'à l'état adulte. Cette période du développement est en accord avec nos objectifs d'étudier l'effet d'une alimentation obésogène consommée dès l'enfance et couvrant la période d'adolescence.
Mécanismes de développement et de régénération du système visuel chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un pincement de dix secondes sur le nerf optique, des injections directement dans l'œil, une chirurgie de quarante minutes pratiquée sur des embryons à travers l'utérus de leur mère. 4 520 souris vont être utilisées, dont 4 490 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées entre un jour et plusieurs semaines après la fin de leur procédure. S'y ajoutent trois tests de comportement de trois heures, trois fois par semaine pendant quatre semaines, pour mesurer si la connexion entre l'œil et le cerveau se rétablit, dans la perspective lointaine de traiter le glaucome. Le porteur écarte le poisson zèbre précisément parce que son système nerveux central régénère spontanément, et retient la souris pour la disponibilité de ses lignées transgéniques.
Objectifs
Le glaucome concerne plus de 10 millions de patients dans le monde. Cette maladie entraine la dégénération du nerf optique, le seul lien entre l’œil et le cerveau. Dans ce contexte, il s’agit de faire repousser le nerf optique et de le connecter correctement aux zones du cerveau qui traitent l’information visuelle. Ce projet a pour but de comprendre les mécanismes impliqués dans la mise en place de la connexion entre l'œil et le cerveau au cours du développement embryonnaire. Une fois ces mécanismes identifiés, il s’agira de les manipuler chez l’adulte pour induire la connexion entre l'œil et le cerveau et permettre un retour visuel fonctionnel.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre comment le système visuel se forme chez l’embryon. Les mécanismes identifiés peuvent ensuite être utilisés afin de générer des approches thérapeutiques pour des maladies comme le glaucome où il faut de nouveau connecter l’œil au cerveau.
Procédures
Les souris peuvent subir une ou plusieurs injections : -injection dans l’œil: les souris sont endormies environ 30 min. L’injection dans l’œil dure 20s. -injection dans le cerveau: les souris sont endormies environ 40 min. La chirurgie dure 15 min -lésion du nerf optique : les souris sont endormies environ 30 min. La procédure dure 5 min, la lésion correspondant à 1 pincement de 10 secondes. -chirurgie chez l’embryon : les souris sont endormies environ 50 min. La chirurgie dure 40min. Les souris participeront à 3 tests de comportement pour étudier le fonctionnement du système visuel du cerveau. Elles sont testées durant 4 semaines avec une fréquence de trois fois par semaine, chaque test a une durée de 3h, acclimatation comprise.
Impact sur les animaux
Lors de la procédure de chirurgie in utero, il y a deux types de nuisances. Premièrement pour la mère gestante : les sutures peuvent s’infecter (ceci represent un risque faible) ou alors les points pourraient être arrachées. Pour les embryons, la chirurgie peut entrainer la mort précoce des embryons. L’injection dans l'oeil chez les souris adultes peut entrainer l’inflammation de l’œil et/ou endommager l’œil La lésion du nerf optique chez les souris adultes peut entrainer l’inflammation de l’œil et/ou endommager l’œil. Le traitement génétique peut éventuellement entrainer des phénotypes dommageables.
Devenir
Notre projet nécessite de récupérer les tissus dans les meilleures conditions afin d’étudier l’étendue de la repousse axonale suite au traitement par nos molécules. A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort entre 1 jour et plusieurs semaines plus tard.
Remplacement
Pour atteindre nos objectifs, les expériences sur les souris sont essentielles et non remplaçables car les mécanismes de croissance nécessitent l’intervention de différents types de cellules qui ne peuvent être mimés efficacement dans un système unicellulaire ou modélisé. Il est à noter que tous les candidats identifiés testés in vivo seront étudiées d’abord sur des cultures de tissues. Seuls les candidats les plus pertinents (ceux qui montrent un effet significatif en culture) seront manipulés in vivo chez la souris.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet : - tester les candidats identifiés in vitro sur des cultures de tissus. -L’utilisation de tests statistiques optimaux pour avoir le nombre d’animaux le plus restreint tout en gardant une valeur biologique et statistique suffisante. Seuls les candidats les plus pertinents in vitro seront utilisées chez la souris. Les conditions de régénérations avec le meilleur résultat in vivo seront utilisés dans pour les tests de comportement.
Raffinement
L’état de santé des animaux sera suivi quotidiennement tout au long de l’expérience. Avant chaque injection réalisée sous anesthésie, les souris reçoivent un antalgique local en crème. Après chaque injection, les souris seront placées sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil... Les douleurs post-opératoires seront prévenues par l’addition d’un antalgique dans l’eau de boisson). Des grilles de points limites adaptées sont utilisées pour le suivi des animaux.
Choix des espèces
Le développement et la régénération du système nerveux sont des phénomènes multifactoriels qui permettent la formation d’un circuit neuronal. La modélisation de ces processus dans un système unicellulaire (telle que la culture cellulaire) ne permet ni d’identifier correctement les mécanismes moléculaires ni de tester efficacement les capacités de régénération. La souris représente le modèle in-vivo pertinent grâce à une grande similitude anatomique avec l’homme. Ceci n’est pas possible avec d’autres modèles telles que le poisson zèbre dont le système nerveux central régénère spontanément ou la drosophile dont le système nerveux est trop éloigné de celui des mammifères. La souris permet l’utilisation de toutes les chirurgies nécessaires pour les études scientifiques que nous réalisons. La souris permet aussi l’utilisation de tests de comportement pour analyser le retour fonctionnel. Enfin, tous les modèles transgéniques nécessaires à notre projet sont disponibles chez la souris ce qui n’est pas le cas pour d’autres modèles tels que le rat. Pour l’ensemble des expériences proposées nous utiliserons des souris dont le système nerveux est en cours de maturation et chez l’adulte. Nous voulons étudier les mécanismes de régénérescence et de plasticité dans le système nerveux central adulte pour être le plus proche possible des lésions chez l’homme.
Impact des sucres ou édulcorants sur la santé cérébrale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 488 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 152 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection ou un gavage de solution sucrée, une puce sous la peau, un test de tolérance au glucose de deux heures avec sept prélèvements de sang à la queue, et des tests comportementaux de cinq à vingt minutes que le porteur dit destinés à analyser les comportements émotionnels et mnésiques, sans les nommer. L'objet déclaré est d'améliorer les recommandations alimentaires sur le sucre, bénéfice renvoyé à des travaux ultérieurs quand les procédures, elles, sont immédiates. Le porteur affirme que les comportements anxieux, dépressifs et les performances cognitives ne peuvent s'étudier que sur des animaux vivants, et que la nutrition ne se modélise pas in vitro.
Objectifs
La consommation de sucres (naturels ou artificiels), qui a fortement augmenté ces dernières années notamment par l’utilisation de sirop dans les produits transformés, est parallèle à celle du nombre de patients atteints d’obésité. Ces données suggèrent un rôle de ce sucre dans le développement des désordres métaboliques et ont conduit l’Anses à émettre des recommandations pour développer des recherches plus approfondies sur « le lien entre consommation de sucres et pathologies associées ».
Bénéfices attendus
Le projet permettra de déterminer quels est l'impact de la consomation de ces sucres naturels ou artifiicels sur la santé cérébrale. Ces données seront clefs pour améliorer les recommandations alimentaires liées à la consommation de sucre.
Procédures
Les animaux seront injectés ou gavés une seule fois avec une solution de sucre. Les injections ou gavages durent 5 secondes. Les animaux subiront des tests comportementaux durant 5 à 20 minutes permettant d'analyser les comportements émotionnels et mnésiques. Les animaux recevront une puce sous la peu (procédure durant 1 minute) et réaliseront des tests de tolérance au glucose (suivi de la concentration sanguine de glucose pendant 2 heures suite à une injection de glucose). Du sang (une goutte) sera prélevé à la queue des animaux 7 fois durant les 2h du test de tolérance au glucose). Chaque prélèvement de sang dure 5 secondes.
Impact sur les animaux
Les gavages ou inections intrapérotonéales de solutions sucrées peuvent induire un inconfort aux animaux. Les mises à jeûn induiront également un inconfort aux animaux. Les tests comportementaux induiront des stress modérés aux animaux le temps de ces dits tests. Les régimes pourront entrainer une prise de poids. Le placement d'une puce en sous-cutané pourra induire un inconfort des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour analyses biochimiques ou immunohistochimiques.
Remplacement
L’étude des comportements de type anxieux et dépressif, des performances cognitives et de la prise alimentaire ne peuvent être réalisées que sur des animaux vivants ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro. L'étude de l'effet de régimes alimentaires et plus largement de la Nutrition ne peut pas non-plus être modélisé in vitro et nécessicte l'utilisation vivants.
Réduction
Le nombre d'animaux sera reduit au mieux en se basant sur des articles scientifiques qui ont montré par le biais de tests statistiques des differences entre plusieurs groupes. D’après les études scientifiques sur l’analyse de marqueurs comportementaux et cérébraux, nous estimons que 12 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour atteindre une signification statistique.
Raffinement
Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux la douleur (antalgique et sédation avant mise à mort) et l’inconfort (manipulation régulière et enrichissement de l’hébergement) des animaux. L’hébergement se fera à 5 souris/cage et l’environnement sera enrichi : igloo et carré de coton. La mesure de la prise alimentaire se fera dans des cages automatisées collectives. Les expérimentateurs et soigneurs sont titulaires de leur certificat d’expérimentation animale niveau concepteur et/ou opérateur. Les expérimentateurs travaillent avec des animaux depuis de nombreuses années et sont très fortement sensibilisés au sujet du bienêtre animal de par leur thématique de recherche (stress, anxiété, bien-être cérébral) et de par le travail de la structure du bien être animal (SBEA). La SBEA procède à des contrôles réguliers de respect des procédures et de bien-être des animaux. Des points limites précoces ont été définis afin de limiter au mieux la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. La souris est un mammifère comme l’Homme, avec des cycles de reproduction rapides. Il est largement utilisé dans le champ de la cognition et de l'entrainement physique, ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec les études antérieures. C’est un animal sur lequel les évaluations comportementales sont faciles à conduire et maitrisées au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille (faciles à manipuler) et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l’animalerie de l’unité. Les souris mâles et femelles arriveront à l’animalerie à l’âge adulte (3 mois), âge auquel les expérimentations seront réalisées. L'âge adulte a été choisi du fait de l'absence de données de l'impact de la consommation de sucres ou édulcorants sur la santé cérébrale à ce stade de développement.
Tutorat sur les gestes techniques peu invasifs utilisés dans les procédures expérimentales sur le modèle rongeur
- Formation professionnelle
Rats : 10
Nés dans l'élevage de l'établissement avec un génotype inutilisable pour ses projets de recherche, 350 souris et 10 rats étaient de toute façon promis à la mise à mort. Ils vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, pour entraîner du personnel aux gestes techniques, et tués à l'issue. Chaque animal peut recevoir jusqu'à trois types de gestes différents sur des jours distincts pendant trois semaines, administration orale, injections sur animal vigile ou anesthésié, deux prélèvements sanguins au maximum, et jusqu'à trente minutes d'anesthésie pour l'apprentissage de l'échographie. Le porteur indique qu'un apprentissage préalable sur mannequins sera proposé aux apprenants pour fixer la technique, sans le rendre obligatoire avant le passage sur les animaux.
Objectifs
Ce projet est consacré à l’entrainement du personnel sur les gestes techniques nécessaires à la bonne réalisation des procédures expérimentales, sur les espèces déclarées dans les projets de recherche de l’établissement. En complément de la formation, initiale le programme du tutorat permet d’assurer le niveau de compétence requis pour la qualification au poste de travail. Ce programme inclut la formation aux aspects pratiques et aux gestes techniques sur les espèces concernées par le poste de travail. Un entrainement régulier et une bonne compétence du personnel sont indispensables à une réalisation efficace des études, augmentant la fiabilité des résultats, et respectant le bien-être animal par la pratique de gestes maitrisés. La formation aux différents gestes techniques peu invasifs sera mise en place dans ce tutorat. Les tutorés seront supervisés dans l’accomplissement de leurs tâches par un tuteur présentant les qualifications et l’expérience adéquates, jusqu’à ce qu’ils aient démontré qu’ils possèdent les compétences requises. Ce programme de tutorat sur différents gestes techniques permettra de 1-donner les éléments théoriques sur la bonne réalisation du geste en respectant le bien-être des animaux, 2-réaliser des démonstrations par le tuteur, 3-mettre en pratique sous surveillance rapprochée, 4-valider la compétence et l’autonomie du tutoré.
Bénéfices attendus
Ces sessions de formation sur l’animal permettront une amélioration de l’apprentissage des concepteurs et applicateurs concernant les gestes de base et puis secondairement plus complexes sur le vivant. Les enseignants seront présents pour parfaire les gestes des apprenants, discuter et faire un « debriefing » à chaque fin de séance. Ces sessions viendront compléter les formations reçues au préalable par l’apprenant. L’avantage de la formation par tutorat est de pouvoir acquérir des gestes plus assurés et efficaces pour améliorer le confort des animaux avec une diminution du temps d’exécution des gestes, une contention ou anesthésie d’une plus courte durée et une meilleure récupération des animaux qui seront utilisés dans les futurs projets. Un entrainement régulier et une bonne compétence du personnel, sont indispensables à une réalisation efficace des études, augmentant la fiabilité des résultats, et respectant le bien-être animal par la pratique de gestes maitrisés.
Procédures
Les gestes concernés par ce tutorat seront des techniques d'administrations avec le geste d'administration orale, les techniques d'injections sur animaux vigiles ou anesthésiés et l'apprentissage du suivi des animaux en echographie. Trois types de gestes techniques peu invasifs pourront être réalisés au maximum sur un même animal sur des jours différents. Un interval de minimum 3 jours sera à respecter entre les séances de formation. Les prélèvements de sang seront limités à un prélèvement par semaine pour un maximum de 2 prélèvements par animal. Les animaux entrant en procédure pourront être utilisés pendant 3 semaines. Ils seront pesés avant de commencer la procédure et chaque geste technique. Les gestes d'administration et injection peuvent occasionner un stress ou douleur de faible intensité de trés courte durée (quelques secondes). Pour l'acquisition en echographie, il n'y a aura pas de douleur car aucune injection mais les animaux peuvent rester sous anesthésie 30 minutes.
Impact sur les animaux
L'ensemble des procédures seront légères, les gestes qui le nécessitent seront réalisés sous anesthésie pour limiter le stress des animaux. Lors des contentions les animaux même habitués peuvent avoir un léger stress. L’introduction d’une aiguille lors des gestes d’injection et prélèvements peut occasionner une très légère douleur de courte durée.
Devenir
Les animaux utilisés dans cette procédure de formation sont des animaux surnuméraires d'élevage ayant un génotype non adéquat pour les projets de recherche de l'établissement et sont donc destinés à l'euthanasie. Ils ne pourraient pas être réutilisés pour d'autres études ni être replacés.
Remplacement
Ce projet consiste à former les personnels aux gestes techniques sur animaux vigiles, il ne sera donc pas possible de remplacer completement le modèle animal dans ce projet. Mais il sera proposé aux apprenants de débuter par un apprentissage théorique sur des mannequins pour fixer la technique avant de passer à la réalisation des gestes sur animaux. Ainsi des entrainements sur supports inertes pourront être réalisés afin que les apprenants puissent se concentrer ensuite sur les gestes techniques
Réduction
Un nombre minimal d'animaux est prévu pour assurer un bon enseignement à chacun des participants et la possibilité de renouveler les phases de tutorat. En effet, l’acquisition des compétences nécessite de pouvoir répéter les gestes techniques pour que la personne atteigne le niveau de compétence requis. Ce niveau de compétence est évalué par le formateur, lors des séances de tutorat. Le nombre d’apprenants choisi sera fait avec soin et limité pour un meilleur apprentissage, suivi et maintien des compétences. Des essais sur mannequins pourront être faits avant de passer sur l'animal pour réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs procédures pourront être réalisées sur le même animal pour limiter le nombre d’animaux. Les animaux utilisés pour ce projet ne seront pas générés pour ces études car nous réutiliserons des animaux de nos élevages destinés à l’euthanasie.
Raffinement
Les animaux de ce projet seront acclimatés à leur salle d’expérimentation et hébergement et habitués à la présence des apprenants au minimum 5 jours avant le début des procédures pour limiter le stress généré lors de leur préparation. Une étape cruciale avant de réaliser les gestes techniques peu invasifs sera d'apprendre et de maitriser la préhension et la contention des animaux. En effet la contention correcte des animaux est déterminante pour la qualité des administrations à réaliser ensuite chez les animaux. Une première partie du tutorat pourra être réalisée sur modèles inertes pour fixer la technique des apprenants avant de passer sur l'animal. L’apprentissage du maintien de l’anesthésie, de l’analgésie et du monitoring sera également enseignée et à maîtriser avant de passer à une procédure complète d’acquisition sur animaux vivants anesthésiés ou vigiles. Une attention particulière sera également faite sur le suivi des animaux et leur observation (reconnaissance des signes de douleurs, pesée à l'aide d'une grille de score). En effet le suivi des animaux en expérimentation repose sur la capacité à savoir reconnaitre des signes de souffrance et remplir correctement une grille de score. Cette étape sera donc vérifiée en tutorat.
Choix des espèces
Les apprenants seront formés sur les rats ou souris en fonction du modèle d’étude choisi dans leurs procédures expérimentales. Les animaux utilisés pour ce tutorat seront des adultes à partir de 8 semaines. Ce seront des animaux surnuméraires d'élevage sevrés et ayant effectués une période d'habituation avant de débuter les formations. Attendre un âge de 8 semaines permettra d'avoir des animaux aldultes suffisamment habitués et manipulés avec un poids correct pour débuter les formations.
Etude du rôle des Heat Shock Protein (HSP) dans les glomérulopathies avec prolifération extracapillaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Un sérum toxique pour le rein, obtenu en immunisant des moutons contre des composants du glomérule de souris, est injecté sous anesthésie à toutes les souris du projet. 760 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, avec selon les protocoles un gavage ou une injection quotidienne pendant dix à quatorze jours et un recueil d'urine deux fois par semaine. Il s'agit de tester si l'inhibition d'une protéine de stress freine la formation des croissants cellulaires qui détruisent le filtre du rein. Le porteur décrit une prise de poids par ascite et par œdèmes après l'injection du sérum, puis conclut que les protocoles sont "relativement courts" et qu'il ne devrait pas observer de complications trop sévères.
Objectifs
Les maladies rénales affectent dix pour cent de la population mondiale avec une incidence croissante et elles représentent de nos jours un véritable enjeu de santé publique. Si ces maladies ne sont pas prises en charge, elles peuvent aboutir à une insuffisance rénale terminale (IRCT). L'IRCT est associée à une importante mortalité cardiovasculaire et à un coût élevé pour la société (environ 4 milliards d'euros par an en France). L'une des causes les plus sévère d'IRCT sont les glomérulonéphrites extracapillaires (GEC). Les GEC sont associées à une prolifération anormale de cellules rénales : les cellules épithéliales pariétales formant un "croissant" cellulaire dans le glomérule, unité de filtration du rein. Des données suggèrent l'implication des protéines de stress dans le développement de ces croissants. Il a été démontré que l'une de ces protéines de stress aurait un rôle délétère dans la GEC faisant de cette protéine une cible thérapeutique potentielle. Le principal modèle murin de GEC est caractérisé par l'injection d'un sérum toxique pour les reins (sérum obtenu après immunisation de mouton contre des composants du glomérule de la souris). Dans ce modèle, les animaux développent une atteinte rénale rapide dès le dixième jour, caractérisée par des lésions de croissants (reproduisant les caractéristiques histologiques et fonctionnelles des GEC humaines). Pour préciser le rôle in vivo de cette protéine de stress et l'intérêt thérapeutique éventuel de son inhibition, nous nous sommes fixés plusieurs objectifs : 1/ Etude de l'expression de la protéine de stress au cours du développement de la GEC expérimentale pour affiner le rôle in vivo de cette dernière 2/ Inhibition pharmacologique de la protéine à visée thérapeutique 3/Inhibition génétique de la protéine de stress dans plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées pour déterminer quelles cellules rénales sont impliquées dans la signalisation de cette protéine.
Bénéfices attendus
Les maladies glomérulaires représentent la première cause d'insuffisance rénale terminale. Le développement de thérapies ciblées agissant spécifiquement sur les cellules épithéliales glomérulaires (cellules locales) est donc essentiel afin de contrôler ces maladies glomérulaires. Ces travaux pourraient permettre de proposer la protéine de stress (étant déjà la cible de différents traitements) comme une cible thérapeutique prometteuse dans diverses maladies glomérulaires rénales. Comme nos premiers résultats l'indiquent, cette protéine pourrait être impliquée dans le développement de pathLaologies dévastatrices comme la glomérulonéphrite extracapillaire (GEC) aboutissant dans la majorité des cas à l'apparition d'une Insuffisance Rénale Chronique (IRC). De nos jours, l'insuffisance rénale chronique à des conséquences socio-économiques majeures. Son traitement représente l'un des couts les plus importants du budget de la santé pour une petite fraction de la population : il est urgent de disposer de davantage de biomarqueurs et de cibles thérapeutiques. De plus, actuellement, le traitement de la GEC repose principalement sur une thérapie qui a des effets nefastes importants pour les patients concernés. Ce projet a l'ambition de proposer des stratégies thérapeutiques inhibant les mécanismes physiopathologiques clés impliqués dans le développement des croissants.
Procédures
(1) Tous les animaux recevront une injection de sérum sous anesthésie environ 3 minutes par souris sur un plateau thermostaté à 37degrés. (2) Pour les protocoles, certains animaux recevront un gavage par jour sur les périodes de traitement soit dix jours ou quatorze jours sur animal vigile,environ 1 minutes par souris. (3) Pour un autre protocole, certains animaux recevront une injection d'un traitement soit dix jours ou quatorze jours sur animal vigile,environ 1 minute par souris. (4) L'ensemble des souris auront un recueil des urines pendant le protocole deux fois par semaines environ 1 minute par souris. (5) Prélèvement de sang sous anesthésie et analgésie (1 minute environ/souris).
Impact sur les animaux
Le stress et la douleur peuvent être générés par : 1.les différentes injections des medicaments. Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent developper une inflammation et un stress lors de la contention pour la bonne administration. 2. Les manipulations quotidiennes en particulier pour les pesées et les spots urinaires. Les animaux peuvent developper un stress lors de la contention pour le recueil d'urines quand elle est nécéssaire. 3. Les complications associées au modèle murin. Suite à l'injection du sérum toxique pour le rein, les animaux peuvent prendre du poids en raison de l'ascite et des oedemes développés lors de la mise en place des lésions rénales. 4. Complications liées à l'anesthésie au moment de l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique). Les protocoles mis en place dans le projet sont relativement cours, nous ne devrions pas observer de complications trop sévères pour les reins (perte de poids, baisse de la température corporelle).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.
Remplacement
En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs est la fonction rénale, qui doit être mesurée par le dosage de la concentration plasmatique de créatinine et d'urée.
Réduction
Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter-individuelle du phénotype étudié (lésions tissulaires rénales) dans nos deux modèles d'insuffisance rénale aigue. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux est de 760 souris. De plus, nous utiliserons des tests statitiques adaptés.
Raffinement
Les nuisances pour les animaux seront réduites au maximum grâce à l’application de mesures de raffinement appropriées. Avant le début de la procédure, les animaux seront acclimatés dans l’animalerie pendant au moins une semaine afin de les préparer à leur environnement. Leur bien-être sera assuré par un enrichissement optimal de leur environnement, comprenant une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments de tailles différentes. Cette litière, initialement compacte, sera décompactée par les animaux eux-mêmes. Des morceaux de bois à ronger et un dôme refuge en cellulose seront fournis dans chaque cage, offrant aux animaux des éléments pour explorer et se cacher, contribuant ainsi à leur confort. La gestion de la douleur sera une priorité, avec l’utilisation de méthodes d’analgésie et d’anesthésie adaptées pour minimiser toute souffrance. Des points limites ont été définis pour assurer une surveillance stricte du bien-être des animaux tout au long de l’expérience. Afin de garantir leur état de santé optimal, une surveillance quotidienne de leur aspect physique et du poids des animaux sera effectuée par le personnel qualifié de l'animalerie ou les responsables du projet. Les animaux seront hébergés dans des conditions strictement conformes à la réglementation en vigueur. Chaque cage contiendra un maximum de cinq animaux, et l’animalerie respectera des conditions de température, d’humidité et de renouvellement de l’air rigoureuses conformément à la réglementation en vigueur.Enfin, pour la mesure de certains paramètres, des efforts seront faits pour réduire au maximum le stress lié à la contention, garantissant ainsi le bien-être des animaux tout au long de la procédure
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans cette étude est bien maîtrisé par le personnel du laboratoire, qui possède une grande expérience avec cette espèce. De plus, de nombreuses données relatives à ce modèle sont déjà disponibles dans la littérature scientifique, ce qui en fait un choix particulièrement pertinent, surtout en comparaison avec d'autres espèces. Cette étude bénéficie également de la possibilité de tester l'implication de voies de signalisation spécifiques à certaines cellules, grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Les animaux sélectionnés pour cette étude seront à un stade adulte, entre 8 et 10 semaines. À cet âge, ils possèdent un système glomérulaire mature, tout en ne présentant pas encore de lésions dues au vieillissement, ce qui garantit des résultats plus fiables et représentatifs.
Rôle d’AhR et de MCP1 dans les processus de sténose et de thrombose de la fistule artério-veineuse
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Poils hérissés, dos courbé, posture prostrée : ces signes, attendus plus tôt chez les souris rendues insuffisantes rénales, déclenchent la mise à mort. 192 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour histologie. Chacune subit trois interventions chirurgicales de vingt minutes, deux pour provoquer une maladie rénale chronique et une pour créer une fistule entre une artère et une veine, une partie d'entre elles recevant en plus vingt-quatre gavages sur sept semaines. L'objet est de comprendre pourquoi les fistules de dialyse se bouchent, complication qui cause 30 % des hospitalisations de patients dialysés, et le bénéfice annoncé se limite pour l'instant à "proposer des cibles thérapeutiques".
Objectifs
Au stade terminal de maladie rénale chronique (MRC) les patients bénéficient d’un traitement par dialyse qui consiste à épurer le sang en remplacement des reins qui ne fonctionnent plus. La fistule artério-veineuse (FAV) qui consiste à relier chirurgicalement une veine superficielle du bras à une artère, est indispensable pour épurer le sang par dialyse. Cependant, il arrive fréquemment que la FAV rétrécisse ou se bouche amenant à son dysfonctionnement. C’est une complication majeure qui est responsable de 30% des hospitalisations des patients en dialyse et les mécanismes liés à cette dysfonction ne sont pas décrits à ce jour. Notre hypothèse est que des toxines, dont la concentration est élevée dans la circulation sanguine de ces patients, provoquent ce dysfonctionnement amenant à l’échec de fistule artério-veineuse. Notre objectif est d'étudier in vivo, dans un modèle animal de maladie rénale chronique et de FAV, le rôle des toxines et de leur récepteur dans l’échec de création de fistule artério-veineuse (FAV). Nous testerons : 1) Si la maladie rénale chronique augmente le taux d’échec de FAV, et 2) si l’inhibition du récepteur aux toxines permet d’augmenter le taux de réussite de création de FAV.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence des mécanismes liés à l'échec de création de fistule artério-veineuse (FAV) et de proposer des cibles thérapeutiques afin d'améliorer la qualité des séances de dialyse et par conséquent la qualité de vie des patients atteints de maladie rénale chronique.
Procédures
Dans la première procédure, les animaux seront soumis à des 2 interventions chirurgicales pour reproduire une maladie rénale chronique, sous anesthésie générale, espacées d'une semaine et chaque interventionchirurgicale durera 20 minutes. Deux semaines après, ces mêmes animaux seront soumis à une 3ème intervention chirurgicale pour la création de la fistule artério-veineuse (FAV) qui durera 20 minutes également. Les animaux de la procédure n°2 seront soumis aux mêmes interventions chirurgicales que ceux de la première procédure à savoir 3 chirurgies de 20 min (à 8, 9 et 11 semaines de vie). Ces mêmes animaux seront également soumis à un gavage oral toutes les 48h pendant 7 semaines et chaque gavage durera quelques secondes, soit 24 gavages sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont liées aux différentes procédures chirugicales (douleur et/ou risque infectueux), aux gavages par voie orale (stress), ainsi qu'à la détérioration de la fonction rénale des souris qui aurons une maladie rénale chronique (MRC). Chez ces souris MRC, nous nous attendons à observer une perte de poids et une apparition plus précoce des points limites par rapport à l’apparence physique (poils hérissés, dos courbé ou posture anormale), aux signes cliniques (augmentation de la fréquence respiratoire par exemple) et aux comportements non provoqués (attitude prostrée par exemple).
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prèlèvements de tissus à des fins d'histologie. Ceci permettra de comprendre les mécanismes liés aux échecs de fonctionnement des fistules artério-veineuses.
Remplacement
Les animaux de ce projet ne peuvent pas être remplacés. Il n'existe pas de modèles in vitro suceptibles d'apporter le même niveau d'information sur les mécanismes de dysfonctionnement des fistules artério-veineuses (FAV) qui sont fréquentes chez les patients traités par dialyse. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux sauvages et génétiquement altérès afin d'envisager des approches thérapeutiques transposables à l'homme.
Réduction
Dans ce projet, nous utiliserons tous les animaux, à savoir 192 souris. Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées afin d’utiliser le moins d’animaux possibles : rédaction d'un protocole expérimental avant toute expérimentation, utilisation des statistiques lors de la conception du protocole expérimental pour une estimation préalable du nombre d'animaux nécessaire et suffisant à l'obtention de résultats statistiquement exploitables. Afin de réduire le nombre d'animaux, le partage d'organes ou de tissus d'animaux mis à mort sera également effectué, avec d’autres d’équipes du centre de recherche et d'autres équipes s'intéressant à la maladie rénale chronique.
Raffinement
Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, et angoisse que pourraient ressentir les animaux. Les animaux resteront sous surveillance journalière pendant la durée entière du projet. La douleur ou la détresse de l’animal sera évaluée sur les paramètres suivants : poids, apparence physique externe, signes cliniques, changement dans les comportements non provoqués, réponses comportementales aux stimuli externes. Des scores seront établis en fonction de ces observations et grâce à une grille d’évaluation de la douleur. Des mesures seront prises en fonction de ces scores pour éviter tout inconfort de l’animal. Nous serons particulièrement attentifs à la perte de poids qui est un symptôme lié à la détérioration de la fonction rénale et aux suivis postopératoires. Le contrôle quotidien des animaux sera réalisé par un technicien animalier et la mesure du poids sera réalisée au moyen d'une petite balance de paillasse deux fois par semaine. Les animaux seront hébergés par groupes de 5 individus au maximum par cage et un enrichissement sera mis en place par l’ajout de dômes ou de matériaux de nidification de type « Nestlets ». Les quantités de nourriture et d'eau de boisson seront aussi vérifiées quotidiennement. Concernant la chirurgie, l’utilisation de l’anesthésie gazeuse est établie comme permettant une induction rapide des animaux, un ajustement facile de l’anesthésie pendant les chirurgies en fonction de la fréquence respiratoire, et permettant un réveil plus rapide et plus facile pour les animaux. La température des animaux sera maintenue grâce à un tapis chauffant pendant et après chirurgie et une analgésie avant et après les chirurgies sera mis en place pour permettre un rétablissement rapide. L’augmentation du nombre de visites après la chirurgie est prévue. Pour l'administration d'un composé par gavage, des canules en plastique seront utilisées afin de réduire le risque de blessure et cette procédure d'administration sera réalisée par une personne expérimentée à cette technique.
Choix des espèces
Les modèles animaux de maladie rénale chronique (MRC) sont essentiels pour l’étude des évènements physiopathologiques permettant ainsi des études translationnelles dont le but est d’améliorer la prise en charge des patients présentant une MRC. L'espèce animale utilisée sera la souris car c’est le modèle le mieux maitrisé pour générer des animaux génétiquement altérés. Les animaux utilisés pour notre projet seront utilisés à partir de 8 semaines car nous souhaitons que la période de la puberté soit révolue (vers 4-6 semaines chez les mâles, 6-7 semaines chez la femelle). Toutes les expérimentations seront réalisées avec des souris au stade adulte. En effet, la maladie rénale chronique est une pathologie qui touche principalement les sujets humains adultes. Il faut donc utiliser un modèle murin adulte pour ce projet. Par ailleurs, il est beaucoup plus aisé de réaliser les procédures chirurgicales sur des souris de taille adulte et ainsi d’effectuer les bons gestes, ce qui justifie également d'utiliser les souris au stade adulte.
Effet des molécules antimicrobiennes du lait maternel sur le diabète chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Biopsie de la pointe de la queue, jusqu'à huit prélèvements sanguins par microcoupure caudale, jusqu'à six injections intrapéritonéales, une mise à jeun de douze heures puis de six heures, et un gavage. 3 840 souris vont être utilisées, dont 2 400 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyses. Elles développent un diabète, immunodépendant ou insulinorésistant selon les groupes, pour tester si des molécules antimicrobiennes du lait maternel protègent du diabète par l'intermédiaire du microbiote. Sur la réduction du nombre d'animaux, une seule phrase, "les groupes ont été dimensionnés par une étude statistique adaptée", sans effectif par groupe ni calcul permettant d'arriver à 3 840.
Objectifs
Le nombre de personnes atteintes de diabète est passé de 108 millions en 1980 à 500 millions en 2021 et ce nombre atteindra 700 millions d'ici 2045 avec 1,5 million de décès directement attribués au diabète chaque année. Il n’existe aucun remède pour aucun type de diabète. Il est donc urgent de mieux comprendre les raisons sur développement du diabète. De nombreux facteurs influencent le développement du diabète dont l'allaitement maternel qui présente un effet protecteur contre le diabète. Cependant, lce rôle est mal connu notamment le rôle du microbiote intestinal. Nous voulons déterminer si des molécules véhiculées par le lait maternel jouent un rôle dans la construction du microbiote et peuvent aider à prévenir le diabète. Nous testerons ces hypothèses dans des souris diabétiques ne produisant pas cette protéine dans le lait.
Bénéfices attendus
Notre étude révélera les mécanismes protecteurs de l'allaitement maternel contre le diabète et ouvrira la voie à des approches thérapeutiques innovantes pour prévenir le diabète chez les enfants à risque.
Procédures
- Biopsie extrême pointe de la queue : 1 fois par animal, 2-3 secondes. - Prélèvement de sang : entre 0 et 8 fois par animal (une seule microcoupure à la queue pour l'ensemble des prélèvements), toutes les deux semaines par microcoupure à la queue, 2-3 secondes. - Régime alimentaire : les animaux vont prendre ou perdre du poids, durée entre 1 et 20 semaines. • Injection intrapéritonéale (IP) : entre 0 et 6 injections, 2-3 secondes. A la fin du régime : • Mise à jeun : une fois 12h et une fois 6h. • Gavage : une fois par animal, 5-10 secondes.
Impact sur les animaux
-Injections intrapéritonéales (douleur de quelques secondes) -Développement du diabéte immuno-dépendant -Développement du diabète insulino-resistant
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses.
Remplacement
Pour étudier le diabéte, seuls les modèles in vivo sont capables de refléter la complexité de la maladie. Mise en place d’une veille bibliographique pour éviter toute répétition d’expérimentations déjà menées.
Réduction
les groupes ont été dimensionnés par une étude statistique adaptée.
Raffinement
-nombre d’individus par cage : 5 souris par cage pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de stress engendrés par une surpopulation; Stratégies d’enrichissement pour assouvir leur besoin ludique (blocs de cotons); Surveillance de leur bien-être quotidien par le personnel de l’animalerie; Selon le plan d’action défini, par les expérimentateurs : Détermination de points limites précoces pour réduire la sévérité des procédures au maximum tout en préservant l’analyse scientifique. Aucune anesthésie ne sera utilisée les tissus étant prélevés post-mortem. Tout animal qui aura une valeur totale de points limites comprise entre 2 et 3 recevra un analgésique (Ketoprofen, dose 5mg/kg, volume 0,012ml/g; SC) sauf pour la perte de poids.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) car il existe des modéles établis de diabète. Les souris seront utilisées à différents stades de développement du diabète.
Biomarqueurs et mécanismes de la fibrose rénale induite par obstruction urétérale unilatérale (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une ligature de l'uretère sous anesthésie, une opération d'environ dix minutes qui bloque l'écoulement de l'urine et provoque en dix jours une fibrose du rein, avec un risque de saignement, de cicatrice mal refermée ou infectée. Une partie des souris est ensuite transportée entre deux établissements utilisateurs, dans des sacs isothermes, pour un trajet de cinq à huit minutes, avant les prélèvements terminaux de reins, de plasma et d'urine. Le porteur qualifie le recours aux animaux d'"indispensable" pour comprendre l'insuffisance rénale chronique et indique tenir une veille bibliographique sur d'éventuelles méthodes alternatives.
Objectifs
L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une maladie multifactorielle qui peut conduire à la dialyse ou la greffe rénale si elle n’est pas correctement prise en charge. L’IRC mettant en jeux l’interaction croisée de plusieurs organes, son étude nécessite des études précliniques sur des modèles animaux adaptés. L’IRC est très fréquemment associé à une fibrose du rein. Alors que la fibrose est une cause majeure de l’altération de la fonction rénale, sa détection précoce et les mécanismes de sa mise en place restent encore mal connus. L’obstruction urétérale unilatérale (UUO) chirurgicale chez la souris consiste en une ligature du canal d'excrétion de l'urine du rein à la vessie. C'est un modèle classique d’induction de la fibrose rénale. L’obstruction de l’uretère bloque l’écoulement de l’urine vers la vessie, entrainant une accumulation d’urine dans le pelvis induisant une fibrose des tubules rénaux et une perte de la fonction rénale. Ce projet a pour but de rechercher les biomarqueurs urinaires et plasmatiques précoces associés à la fibrose rénale induite par une UUO chirurgicale chez la souris. Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs, EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont l’identification de biomarqueurs et une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de l'IRC liée à une obstruction urétérale.
Procédures
- Chirurgie (obstruction urétérale unilatérale): x1 (environ 10 minutes) - prélèvement de sang: x1 (environ 2 minutes) - injection d'un colorant sous contention: x1 (maximum 5 minutes). Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs, EU1 et EU2. Les procédures non-terminales seront réalisées dans l’EU1. Les procédures terminales seront réalisées soit à l’EU1, soit à l’EU2 selon la disponibilité des salles et du matériel nécessaires.
Impact sur les animaux
Effet indésirable lié à l'UUO dans les 10 jours avant la mise à mort. - Chirurgie : peut provoquer de la douleur et du stress et des complications sont possibles (saignement, cicatrice mal refermée ou infectée). - Mesure de la permeabilité vasculaire rénale : légère douleur liée à l’injection dans la veine caudale sous contention - Prise de sang : risque de saignement
Devenir
Tous les animaux sont mise à mort en vue de l'analyse de leurs reins, de leur plasma et de leur urine en post-mortem.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques complexes mis en jeux dans l'installation de l’IRC. Ces mécanismes restent à l’heure acutelle impossibles à modéliser in vitro. Toutefois, une veille bibliographique est réalisée régulièrement par les responsables du projet pour prendre connaissance d’éventuelles nouvelles méthodes alternatives.
Réduction
La chirurgie UUO est bien maitrisée par les expérimentateurs impliqués. Cela limite les étapes de mise au point couteuses en animaux. D’après notre expérience du modèle, le nombre d’animaux est calculé au plus juste pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes interprétables pour chaque paramètre mesuré. Il est prévu d’utiliser 240 souris. La comparaison entre 2 groupes sera réalisée en utilisant un test statistique. La comparaison entre plusieurs groupes sera réalisée en utilisant un autre test statistique.
Raffinement
Les études sont optimisées d’après la littérature et les expériences réalisées au laboratoire. Les animaux seront hébergés par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec libre accès à l'eau et à la nouriture. Ils seront observés quotidiennement (apparence générale, comportement, absence de plaies, apparence des cicatrices après la chirurgie...) afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Une grille de scoring a été établie définissant précisemment les points limites à ne pas dépasser. Si un des points limites est atteint, l'animal concerné sera mis à mort. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Lors de chirurgies, les animaux sont placés sur tapis chauffant, et du gel diet et de l’hydrogel sont placés dans les cages après les chirurgies pour faciliter l’alimentation et l’hydratation des animaux. Si les animaux sont transportés dans l’EU 2/2, il le seront en respectant la charte de transport. Le transport est assuré seulement par les personnes formées à l’expérimentation animale. Les cages sont transportées dans des sacs isothermes (2 cages maximum par sac) de façon à limiter au maximum le stress lié aux variations de température ou aux bruits excessifs. Le trajet du transport se fait selon un plan défini selon la pièce de destination à l’EU2/2. La durée du transport peut varier entre 5 et 8 minutes selon la pièce de destination.
Choix des espèces
L’espèce choisie permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines au début de l'expérience, à ces âges les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes.
Traitements pharmacologiques chez des modèles murins de la myopathie de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Tester deux anxiolytiques déjà connus sur des souris déficientes en dystrophine, modèles de la myopathie de Duchenne, mobilise 1 050 souris dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Biopsie de la queue à sept jours, pose d'un transpondeur et d'une mini-pompe sous anesthésie le même jour, test de conditionnement sur trois jours associé à une douleur légère, tests de peur du vide et de lumière, puis vingt-huit jours en colonie pour apprendre à chercher à boire. Les reproducteurs sont tués après six portées ou vingt-sept semaines, le porteur indiquant qu'au-delà les portées se réduisent et que la gestation devient trop fatigante pour les femelles. Une grille de score et des points limites précoces sont annoncés, tout animal montrant un signe de détresse étant retiré de l'expérience et tué.
Objectifs
La myopathie de Duchenne (DMD) est une maladie génétique affectant environ 1 garçon sur 5000 naissances, causée par des mutations dans le gène des dystrophines. En plus d’une dégradation progressive des muscles squelettiques, des troubles cognitifs, comportementaux et neuropsychiatriques touchent une grande partie des patients DMD. Les avancées récentes dans notre compréhension des mécanismes dépendants des dystrophines et responsables de la myopathie de Duchenne (DMD) ont conduit au développement d’outils innovants en thérapie moléculaire et en thérapie génique. Cependant, leur capacité à corriger toutes les altérations cognitives associées à cette maladie reste limitée. De plus, un sous-groupe de patient n’est pas éligible en raison d’un profil de mutation non corrigeable par thérapie génique. Par contre, plusieurs études et résultats préliminaires montre une mauvaise régulation de certains neurotransmetteurs cérébraux, suggérant que des approches plus traditionnelles utilisant des agents pharmacologiques pourraient être bénéfiques. En particulier, les troubles émotionnels décrits chez le patient et chez les souris modèles de DMD, pourraient être compensés par des interventions pharmacologiques utilisant des anxiolytiques. Ce projet a pour but de tester deux agents pharmacologiques anxiolytiques connus ; le projet est donc important pour le développement de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement des troubles affectant le cerveau dans cette maladie.
Bénéfices attendus
Les troubles émotionnels sont un symptôme commun aux patients atteints de myopathie de Duchenne et aux souris modèles de cette maladie. On suppose qu’ils influencent fortement les troubles du comportement social, ainsi que certaines fonctions intellectuelles et les capacités d'adaptation. Actuellement, aucun traitement pharmacologique de type anxiolytique n’a été étudié dans cette pathologie. Ce projet permettra de déterminer si les troubles cognitifs et sociaux peuvent être améliorés au cours d’un traitement anxiolytique, donc de savoir s’il y a un bénéfice pour ces patients à recevoir un traitement aux anxiolytiques, en particulier pour ceux qui auraient des troubles émotionnels et sociaux importants, ou en cas de stress péri-opératoire. Les découvertes issues de ces études ont un intérêt critique pour l’orientation du traitement d’un nombre important de patients atteints de DMD.
Procédures
Le génotype des animaux vigiles est identifié à partir d'une biopsie de queue (2s) faite à l’âge de 7j, donc avant ossification de la vertèbre caudale. Une anesthésie gazeuse de courte durée (
Impact sur les animaux
Certaines interventions peuvent occasionner une douleur légère, ou un stress de courte durée qui se traduira par une réduction de l’activité exploratoire: (1) la biopsie de queue faite pour le génotypage (2 s) ; (2) l'injection d'un traitement, (3) L’injection du transpondeur (
Devenir
À la suite des tests comportementaux, les souris tests seront euthanasiés pour prélèvements post-mortem de leur cerveau. Les reproducteurs seront euthanasiés après 6 portées ou 27 semaines, ou avant s’ils ne produisent plus de portées ; après cet âge les portées sont de taille très réduite ou inexistantes et la gestation devient trop fatigante pour les femelles.
Remplacement
Les recherches de traitement pour ces pathologies n’ont pas de modèle in silico ou in vitro et sont généralement menées sur des souris modèles déficientes en dystrophine chez lesquelles nous avons préalablement identifié les symptômes qui vont servir ici pour évaluer l’efficacité des traitements. Notre projet implique donc d’effectuer des tests de comportement qui nécessitent l’utilisation d’animaux vivants et pouvant se comporter librement.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration statistique convaincante des objectifs. Sur la base des publications utilisant des méthodes similaires d’analyse du comportement, la réussite des expériences nécessite 15 souris par groupe. Les groupes comprennent des souris recevant un traitement et des groupes contrôles non traités indispensables aux analyses statistiques. Nous avons inclus une étude dans laquelle certains groupes seront soumis à plusieurs tests, ce qui permet de réduire le nombre total d’animaux. Nous utiliserons préférentiellement des tests statistiques adaptés aux petits échantillons, sauf dans le cas d’analyses complexes d’interactions entre facteurs ne pouvant être effectuées avec ces tests.
Raffinement
Les tests comportementaux induisant de l’anxiété sont très courts (
Choix des espèces
D’autres modèles animaux de cette maladie existent (rat, chien, porc), mais seule l’espèce souris permet actuellement de disposer de différents modèles mutants ou transgéniques porteurs de mutations variées et représentatives des sous-groupes de patients montrant des variations dans la sévérité des symptômes. Les troubles émotionnels et sociaux ont uniquement été étudiés chez les souris modèles. Les recherches précliniques pour ces pathologies sont donc généralement menées sur ces souris déficientes en dystrophine, chez lesquelles nous avons préalablement identifié les symptômes qui vont servir ici de marqueur pour évaluer l’efficacité des traitements. Les traitements seront administrés à l’âge de 6 ou 8 semaines et le comportement évalué entre 8 et 10 semaines. En effet, les déficits comportementaux qui serviront pour évaluer l’efficacité des traitements ont été préalablement évalués à cet âge. De plus, ceci est cohérent en cas de translation vers la clinique, où des traitements seront envisagés chez des adolescents et jeunes adultes. Les effets du traitement chronique sont observables au bout de 2 semaines de traitement chez la souris ; le traitement démarrera à l’âge de 6 semaine pour commencer les tests comportementaux à 8 semaines. Par contre, les effets de l'autre traitement sont observables de manière immédiate et ce traitement démarrera donc à 8 semaines.
Caractérisation de vésicules extracellulaires in vivo chez la souris en vue de leur utilisation comme outil thérapeutique dans le cadre de traitement des maladies digestives
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
1 800 souris vont être utilisées, chacune recevant une injection unique puis neuf passages d'imagerie optique sous anesthésie, toutes tuées à l'issue dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. L'objet est de suivre où vont des vésicules extracellulaires dans le corps, première étape avant d'évaluer un jour leur intérêt contre les fistules digestives et l'inflammation intestinale. Le porteur écrit que l'imagerie optique "n'induit aucune douleur ou effet indésirable". Il reconnaît dans le même document qu'il s'agit de la première étude menée chez l'animal et qu'on ne peut exclure ni toxicité ni effets indésirables, crampes abdominales, rougeur, ulcération ou fausse route.
Objectifs
Les vésicules extracellulaires, particules sécrétées par les cellules, agissent comme des messagers intercellulaire en libérant leur contenu dans la cellule cible. Cette capacité fait d’elles une nouvelle voie thérapeutique importante. Les vésicules extracellulaires sont donc présentes dans le corps humain. Ainsi le risque qu'elles entraînent une réaction immunitaire est faible, ce qui facilite leur application en médecine humaine en comparaison de la thérapie cellulaire et génique. Elles offrent ainsi de nouvelles perspectives d’application dans les champs du diagnostic et de la thérapie. Avant d’évaluer leur propriétés anti-inflammatoire et régénérative dans un contexte pathologique de maladies digestives, il est indispensable de déterminer la biodistribution, la cinétique, l’élimination, et la tolérance de ces vésicules. L'objectif de ce projet est donc d'évaluer dans un organisme vivant l'ensemble de ces paramètres.
Bénéfices attendus
Ce projet est la première étape du développement d’un nouveau traitement des fistules digestives et de l'inflammation gastro-intestinale améliorant la prise en charge et la qualité de vie des patients. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes d’intégration des vésicules extracellulaires et d’avoir les premiers éléments permettant par la suite d’évaluer leur propriétés anti-inflammatoires et régénératives ainsi que leur efficacité.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigiles ou geste chirurgical n'est prévu dans ce projet. Les animaux recevront une injection unique de substance sur une durée de deux minutes maximum. Par la suite, chaque animal sera examiné par imagerie optique à 9 intervalles de temps différents après l’injection, dont la durée est environ de 5 minutes chacun. L'imagerie sera réalisée sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
Cette étude sera menée en imagerie optique, non invasive et non irradiante, sous anesthésie. Cette technique n’induit aucun douleur ou effet indésirable. Les produits administrés ont été testés et validés au préalable sur des cellules mais ce sera la première étude menée chez l'animal. De ce fait, on ne peut exclure ni une toxicité ni des effets indésirables potentiels liés à l’injection : crampes abdominales, rougeur, ulcération, ou fausse route dans le cas de l'administration par voie orale.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin de procéder à une étude post-mortem.
Remplacement
Une étude in vitro ne peut se substituer à l’étude in vivo, afin de visualiser la biodistribution des vésicules extracellulaires dans un organisme entier. Des tests in vitro ont été réalisés au préalable, afin d'optimiser la formulation et choisir la plus stable ainsi que pour optimiser certains paramètres d’imagerie.
Réduction
Nous avons fait le choix d’utiliser une technique d’imagerie, non-invasive et non irradiante, permettant le suivi longitudinal et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Afin de réduire le nombre d’animaux inclus dans cette étude, nous n’utiliserons que des groupes pertinents composés d’un nombre d’animaux suffisant pour arriver à une conclusion claire. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
L’environnement des animaux est enrichi pour favoriser le bien-être, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Des méthodes anesthésiques, analgésiques et de confort (gel ophtalmique) sont appliquées. Les animaux sont observés quotidiennement. L’imagerie optique, méthode d’exploration choisi pour notre étude, est reconnue pour n’induire ni douleur ni effets secondaires néfastes.
Choix des espèces
La souris est une espèce communément utilisée pour les études d’imagerie optique du fait de leur petite taille, et représente un modèle pertinent pour évaluer au mieux la biodistribution. L'étude de la biodistribution sera ainsi réalisée sur des souris âgées de 8 semaines, afin de travailler avec des animaux possédant un système immunitaire et un système digestif matures. Cette espèce sera également utilisée dans les études ultérieures car favorable au développement de modèle de maladie inflammatoire de l’intestin.