Souris

Les souris de ce projet sont porteuses de mutations qui détruisent progressivement leur rétine et les rendent aveugles. 80 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit, entre neuf et quinze jours de vie, une injection sous la rétine de chaque œil, cinq minutes par œil, avec un risque de décollement de rétine et de cataracte, puis passe un électrorétinogramme de quinze minutes. Le porteur évalue ainsi une thérapie génique, et les organes sont collectés après la mort pour analyses histologiques et moléculaires.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité d’une thérapie génique dans le traitement de la dégénérescence de la rétine dans deux modèles de souris génétiquement modifiés

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de tester l’efficacité d’une thérapie génique pour traiter la dégénérescence de la rétine liée à des mutations génétiques bien précises.

Procédures

- Contention et anesthésie (injection intrapéritonéale): 5 secondes, 2 fois/animal. - Injection intraoculaire sous-rétinienne : œil droit+œil gauche, 5 minutes/oeil, 1 fois/animal - Electrorétinogramme (ERG) : 15 minutes, 1 fois/animal

Impact sur les animaux

Cécité Contention : peut causer un stress léger de courte durée. Injection intraoculaire sous-rétinienne : risque de décollement rétinien et de cataracte transitoire Injection intra-péritonéale de l’anesthésie : douleur légère

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux sont mis à mort et les organes seront collectés en post-mortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Des recherches préliminaires in vitro ont validé le potentiel thérapeutique de la surexpression du gène d’intérêt, réduisant ainsi le recours à l’expérimentation animale. Cependant, ces travaux sont limités par la spécificité de l’expression du gène aux photorécepteurs, l’absence de protocoles pour leur culture, et la très grande complexité pour produire des organoïdes rétiniens, nécessitant l’utilisation des modèles murins développés pour ce projet thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum nécessaire pour atteindre des résultats statistiquement significatifs en utilisant un test approprié pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.

Raffinement

Les souris seront surveillées par les membres qualifiés de l'animalerie et par les responsables du projet afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, du coton, des maisonnettes en carton et des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger seront ajoutés dans la cage. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Les injections de composé sont réalisées sous anesthésie et analgésie sur une surface chauffante. Les examens ophtalmologiques seront réalisés sur une surface chauffante, sous anesthésie générale. L’application de points limites stricts et spécifiques au projet conduira à prendre en charge la douleur et la souffrance éventuelle des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce privilégiée pour ses facilités d’élevage et de reproduction ainsi que de modifications génétiques à façon permettant de modéliser les défauts génétiques identifiées chez l’homme pour en comprendre les mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, l’œil est un organe facilement accessible et l’organisation structurale de la rétine d’une souris est très proche de celle de l’Homme. La validation thérapeutique du composé sera initiée entre 9 et 15 jours de vie (avant le début de la dégénérescence rétinienne) et sera poursuivie jusqu’à un stade suffisamment évolué de la maladie pour différencier les souris contrôles des souris porteuses de la maladie, mais suffisamment précoce pour observer un effet thérapeutique, soit 4 semaines pour le modèle présentant une atteinte rétinienne précoce et 6 semaines pour celui présentant une atteinte rétinienne progressive.

Jusqu'à une administration par jour pendant dix semaines, par injection ou par gavage : 269 souris, dont des porteuses d'une mutation de la progéria, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à terme. Celles qui portent la mutation sur un seul chromosome perdent du poids à partir de 41 à 42 semaines, avec une baisse de leur force musculaire et de leur rythme cardiaque, et vivent en moyenne 47 semaines. Elles passent aussi des prises de sang et trois électrocardiogrammes sous anesthésie et trois tests d'agrippement, pour évaluer une molécule déjà testée sur des souris porteuses de la mutation sur les deux chromosomes. Le porteur écarte un porc génétiquement modifié, dont l'étude serait "plus complexe". Les souris des expériences sont tuées pour analyser leurs tissus, et celles des croisements, gardées en vie pour la reproduction, sont tuées à six mois au plus.

Objectifs

Ce projet fait suite à une étude qui visait à évaluer l’efficacité in vivo d’une molécule sur un modèle murin de la Progéria (Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS), maladie génétique extrêmement rare qui se déclare dès l’enfance et conduit à un vieillissement prématuré et une mortalité précoce. Nos études ont été réalisées sur un modèle souris portant la mutation responsable de la pathologie sur les 2 chromosomes, récapitulant le tableau moléculaire et clinique de la pathologie humaine, avec notamment un tableau clinique post-natal évoluant en quelques semaines (premiers signes cliniques à 9 semaines d'âge), permettant de tester rapidement l’efficacité d’une molécule sur plusieurs paramètres. Grâce à ce modèle, nous avons pu obtenir des données pré-cliniques dans plusieurs organes d’intérêt et définir les doses minimales permettant d'obtenir un effet thérapeutique. Cela n’aurait pas été possible avec le modèle ne portant la mutation que sur un seul chromosome, qui ne présente les premiers signes cliniques qu'à l'âge de 41-42 semaines. Cependant, la mutation n'est présente que sur un seul chromosome en clinique humaine. Il nous semble donc pertinent d’utiliser le modèle souris avec la mutation sur un seul chromosome pour nous rapprocher davantage des conditions humaines. L’utilisation de ces souris présente plusieurs avantages : 1) La constitution des groupes de souris sera plus simple et rapide; 2) Le tableau clinique est moins sévère en début de vie, réduisant les impacts sur les animaux; 3) Les quantités de protéines toxiques étant moins importantes, il sera possible de comparer plus facilement différentes voies d'administration, tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra : - d’obtenir une preuve de concept in vivo que la nouvelle approche thérapeutique envisagée est efficace sur plusieurs signes cliniques prédictifs du cours de la pathologie humaine, dans un modèle de souris portant la mutation sur un seul chromosome; - d’établir une relation pharmacocinétique/pharmacodynamique de la molécule Prodrug et de comparer les résultats obtenus ceux obtenus dans la modèle portant la mutation sur les 2 chromosomes, étudié précédemment. A plus long terme, ce projet se poursuivra par un développement thérapeutique de cette molécule visant à obtenir une preuve clinique de son efficacité chez l’homme, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de Progéria.

Procédures

Injections ou gavage oral (1X/jour ou 2X/semaine, sur une durée maximale de 10 semaines; durée de chaque administration: environ 1min). Prélèvements sanguins (sous anesthésie, durée 3-5 min par prélèvement). Mesure de la composition corporelle, méthode non-invasive (3 fois; durée 3 min). Test d'agrippement, méthode non-invasive (3 fois; durée 5 min). Analyse cardiaque par électrocardiographie ECG (3 fois, sous anesthésie; durée 5 minutes).

Impact sur les animaux

Le modèle animal utilisé présente de nombreux signes cliniques retrouvés dans la pathologie humaine. Les souris portant la mutation sur un seul chromosome présentent un léger décrochage dans les courbes de poids à partir de 32 semaines, puis une perte de poids plus importante à partir de 41-42 semaines, accompagnée d'une baisse de la force musculaire et d'une diminution de la fréquence cardiaque. La moyenne de survie de ces souris est de 47 semaines environ d'après la littérature. Après raffinement, notamment l'ajout de nourriture en gel, la perte de poids devrait être limitée, sachant que les procédures seront réalisées avec des animaux de moins de 42 semaines, donc avant apparition des signes cliniques sévères (à 45 semaines). Les animaux subiront des injections, induisant une douleur légère de courte durée; ou des gavages, de douleur légère de courte durée liée à la contention et pouvant potentiellement entrainer des irritations; des pesées, sans douleur hormis la préhension pour sortir l'animal de la cage (test non invasif); des prélèvements sanguins, de douleur légère, pouvant potentiellement entrainer une baisse du volume sanguin; des mesures de la composition corporelle, de douleur très légère liée à la contention (test non invasif); des tests d'agrippement, de douleur très légère liée à l'agrippement en soi sur une grille (test non invasif); et des analyses cardiaques par ECG, de douleur légère liée à l'anesthésie.

Devenir

Les animaux expérimentaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses protéiques. Les animaux utilisés pour réaliser les croisements seront gardés en vie, puis euthanasiés à l'age de 6 mois maximum.

Remplacement

Notre projet s’inscrit dans la continuité d’une étude in vitro menée sur des cellules de patients HGPS. Cependant, ce modèle cellulaire ne permet pas d’explorer l’intégralité des mécanismes métaboliques qui peuvent avoir lieu dans un organisme. Le passage au modèle in vivo est donc une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme. Il nous est nécessaire de disposer d'un organisme entier pour pouvoir mieux comprendre la pathologie de la progéria. Le seul mammifère modèle de la maladie qui nous permet de réaliser des essais pré-cliniques en vue d’une mise en œuvre d’essais thérapeutiques chez l’Homme est la souris. Il existe aussi un modèle de porc, cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats d’efficacité et de pharmacocinétique interprétables. Dans ce sens la cohorte destinée à l’analyse de l’efficacité précoce comporte 8 animaux par groupe. L’estimation du nombre d’animaux par groupe nécessaire a été réalisée sur le critère principal suivant : comparaison du niveau moyen de progérine entre chaque groupe de traitement. La deuxième cohorte destinée à l’évaluation de différentes voies d'administration comporte également 8 animaux par groupe. Enfin la dernière cohorte destinée à l’observation plus tardive d’un phénotype clinique mesurable comporte 10 animaux par groupe. Durant cette étude, nous allons générer des données paramétriques (poids, glycémie, paramètres sanguins, paramètres cardiaques), qui seront analysées à l'aide de tests statistiques adéquats (mesures simples ou répétées). Pour l’ensemble des cohortes, le nombre d’animaux utilisés a ainsi été optimisé pour permettre d’observer un effet du traitement.

Raffinement

Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation, l’apparence physique. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas d’inflammation des yeux, les animaux seront traités avec une crème ophtalmique, 1 à 2 fois par jour pendant minimum 5 jours). En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal blessé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux par spray cutané seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés chaque semaine et observés quotidiennement. Afin de maintenir un état nutritionnel correct, nous utiliserons, si nécessaire, une alimentation sous forme de gel, facile à ingérer par les souris afin d’éviter toute malnutrition. Lors des prélèvements sanguins, une compensation du volume prélevé sera effectuée avec du sérum physiologique.

Choix des espèces

Le modèle murin est le seul modèle envisageable pour tester des approches thérapeutiques dans le cadre de la pathologie HGPS, puisqu’il s’agit d’une maladie génétique qui a été modélisée sur la souris. Le modèle que nous utilisons récapitule à la fois la mutation génétique de la maladie, ainsi que la majorité des caractéristiques cliniques et de l’évolution de la pathologie observée chez l’Homme. Une seule autre espèce génétiquement modifiée existe, il s’agit d’un modèle de porc. Cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée. Les animaux seront traités de l’âge de 5 à 7 semaines dans les études de pharmacocinétique et d'évaluation de l'effet du traitement sur la quantité de protéine toxique. Nous utiliserons des animaux de 32-42 semaines pour évaluer l'effet du traitement sur les symptomes cliniques qui commencent à apparaitre à 41-42 semaines environ, hormis un léger décrochage dans la courbe de poids qui peut être noté à partir de 32 semaines. Nous utiliserons des animaux hétérozygotes agés de 8 semaines a minima pour générer les cohortes expérimentales.

Des souris immunodéprimées reçoivent des cellules souches sanguines humaines, pour alimenter environ 720 études précliniques de 50 souris en cinq ans, un volume calé sur le plan commercial de l'entreprise. 45 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et celles jugées inaptes aux études sont tuées, les autres pouvant passer dans d'autres projets de l'établissement. L'agent qui détruit les cellules souches de leur moelle osseuse, injecté sans anesthésie, provoque selon le porteur une "forte douleur abdominale disparaissant en quelques heures", et des nouveau-nés sont greffés sous une anesthésie obtenue en les refroidissant sur la glace jusqu'à dix minutes, au risque d'être rejetés par leur mère. Les souris dont le taux d'humanisation reste sous 25 % peuvent être réutilisées dans une formation interne aux gestes techniques, et un nouveau-né mal humanisé peut être humanisé de nouveau, plus âgé.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de greffer des cellules souches sanguines humaines et leurs dérivées chez des souris immunodéprimées, et ainsi permettre la reconstitution d’un système immunitaire humain fonctionnel (ou représentatif d’une pathologie particulière) et pouvant être modifié par traitement, en vue d’essais préclinique chez la souris.

Bénéfices attendus

En greffant des cellules souches humaines, ou leurs dérivées, à des souris immunodéprimées, nous pouvons reconstituer un système immunitaire humain. Ce faisant, nous apportons un modèle d’étude spécifique qui peut jouer un rôle essentiel dans la compréhension et le traitement de pathologies d’importance, comme certaines infections virales (virus de l’immunodéficience humaine (VIH) ou hépatites), de nombreux cancers ou des maladies inflammatoires (asthme).

Procédures

Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésies. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. L’anesthésie des nouveau-nés sera réalisée par hypothermie avec de la glace pendant maximum 10 minutes. Des prélèvements vaginaux pourront aussi être pratiqués quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caractériser le cycle œstral. L’humanisation inclura l’administration d’un agent, détruisant les cellules souches de la moelle osseuse, sur souris vigile, suivie d’une greffe de cellules souches sanguines sur souris vigiles ou nouveau-nés sous anesthésie sur glace. Ces interventions dureront de quelques secondes à quelques minutes. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. Certaines procédures nécessiteront des actes chirurgicaux pour l’implantation de dispositifs sous-cutanés, réalisés sous anesthésie gazeuse avec une analgésie préopératoire et un suivi post-opératoire rigoureux. L’implantation durera moins de cinq minutes et pourra être répétée selon les besoins de l’étude. À l’issue des études, les animaux non intégrés aux essais précliniques seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

L'injection de l’agent détruisant les cellules souches de la moelle osseuse est une étape induisant une forte douleur abdominale disparaissant en quelques heures. Des nuisances peuvent être induites par la ou les injection(s) de plasmides, l’administrations de traitements, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration. La manipulation chez le nouveau-né pourrait engendrer le rejet de la mère.

Devenir

Le processus d’humanisation pourra être accompagné d’une phase de modulation ou de renforcement in vivo du système immunitaire humain en fonction des objectifs expérimentaux. Cette étape vise à préparer les animaux aux études précliniques envisagées en optimisant la réponse immunitaire du modèle humanisé. Les animaux n’étant pas jugés comme aptes à entrer en étude préclinique en projet de formation ou en projet de recherche interne seront euthanasiés. C’est-à-dire les animaux avec un état de santé jugé moyen et/ou avis vétérinaire défavorable. Dans le cadre d’une utilisation continue, pour réaliser les études précliniques, les animaux pourront être intégrés aux autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Les animaux concernés seront ceux ayant un taux d’humanisation < 25%. Un nouveau-né mal humanisé pourra être nouvellement humanisé en étant plus âgé. La décision est prise par le vétérinaire.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Dans le cadre d’une utilisation continue, les souris humanisées seront impliquées dans des études de recherches précliniques impliquants le système immunitaire. Il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire tout en objectivant les effets potentiellement toxiques d’une molécule en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 45 000 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser environ 720 études précliniques de 50 souris, en se basant sur un taux de succès de l’humanisation de 80%. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.

Raffinement

Les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus à partir du sevrage. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (dietgel). La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Cette couche de litière pourra être supplémentée par un échantillon de litière provenant de cages mâles dans le but de synchroniser le cycle œstral de la souris. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement etc) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération est observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire notamment buprénorphine 0,1 mg/kg (voie IP ou SC), administrée avant intervention chirurgicale ou toute procédure potentiellement douloureuse. Un rappel sera envisagé toutes les 4–6h selon l’évaluation. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8 mL/kg. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée, ou tout score clinique dépassant les seuils définis.

Choix des espèces

Le séquençage complet du génome de la souris a démontré la proximité phylogénétique des souris et des humains : 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes orthologues produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente permet la création de lignées humanisées. Depuis de nombreuses années, l'entreprise développe une expertise dans l’humanisation du système immunitaire de multiples souches de souris, notamment les NCG, NXG, NOG et BRG. Fort de cette expérience, il est pertinent de poursuivre le processus d’humanisation sur cette même espèce. La procédure expérimentale requiert l'utilisation de souriceaux nouveau-nés jusqu'à l'âge de 4-5 semaines, car leur immunité immature favorise la prise de greffe et limite le rejet, garantissant ainsi une reconstitution optimale du système immunitaire humain. À cet âge, le thymus et la moelle osseuse offrent un environnement propice à la maturation des cellules immunitaires humaines, permettant d'obtenir un modèle plus fonctionnel et reproductible.

Anesthésiées au gaz, injectées de cellules tumorales dans la patte arrière droite, puis gavées cinq fois et traitées par chimiothérapie, 924 souris sont mises à mort un, trois, cinq, huit et dix jours après les traitements. Le niveau de souffrance déclaré est modéré. La tumeur dans la patte peut réduire leur mobilité et donc leur accès à la nourriture, une nécrose peut apparaître au point d'injection, et les chimiothérapies provoquent une perte de poids. Le porteur ajoute des croquettes au sol des cages pour compenser, et affirme qu'aucune douleur n'est attendue des injections puisqu'elles se font sous anesthésie gazeuse. Poumons, tumeurs, rates et ganglions sont prélevés après la mort.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé majeur dans le monde. Il est donc important de trouver des traitements afin de le soigner. Le régorafénib est un traitement utilisé dans le traitement de multiples cancers solides. En dépit des conséquences bénéfiques connues contre la tumeur après ce traitement, nous avons observé l’augmentation d’une population de cellules immunosuppressives. Le but de ce projet est d’évaluer si la combinaison du Régorafénib avec un autre traitement couramment utilisé contre, le cancer, la chimiothérapie 5-Fluorouracile (5-Fu), connue pour éliminer ce type de cellules immunosuppressives, permettrait d’obtenir une meilleure efficacité antitumorale et de comprendre pourquoi. Nous regarderons les conséquences de cette combothérapie sur la croissance tumorale et sur l’infiltrat immunitaire au cours du temps avec l’espoir de pouvoir prochainement proposer une nouvelle combinaison thérapeutique à tester en étude clinique.

Bénéfices attendus

Le cancer représente un enjeu majeur de santé publique, nécessitant le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces et mieux tolérées par les patients. Ce projet s'inscrit dans une démarche appliquée visant à évaluer l'intérêt de la combothérapie associant le Régorafénib et le 5-Fu dans le modèle murin de cancer colorectal CT26. L'objectif est de déterminer si cette approche combinée permet d'améliorer l'efficacité du traitement en modulant favorablement l'environnement tumoral et en renforçant la réponse immunitaire antitumorale. En validant cette stratégie thérapeutique dans un modèle préclinique, ce projet pourrait contribuer à l'optimisation des traitements actuels et ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques plus performantes et mieux tolérées en clinique.

Procédures

Les animaux sont injectés en sous-cutané dans la patte inférieure droite sous anesthésie gazeuse avec les cellules tumorales (5 minutes pour l’anesthésie et 30 secondes pour l’injection). Par la suite, un suivi des souris sera réalisé 3 fois par semaine : les souris seront traitées en intra-péritonéale (30 secondes), une seule fois. Le gavage aura lieu 5 fois avec des sondes souples pour limiter le risque de blessures à l’œsophage. 1,3,5,8 et 10 jours après les traitements par chimiothérapie et Régorafénib, les souris sont mises à mort sous anesthésie générale à l’isoflurane (5 minutes pour l’anesthésie et 10 secondes pour la mise à mort). Par la suite, les tumeurs, les ganglions drainants et rates sont récupérés (2 minutes).

Impact sur les animaux

L’injection des cellules tumorales au niveau patte inférieur droite pourrait entrainer une diminution de la mobilité des souris. Cette diminution de mobilité pourrait diminuer la capacité des souris à se nourrir. L’injection des cellules tumorales se fait en sous-cutanée. De ce fait, nous pourrions observer des nécroses au niveau de la tumeur conduisant à une douleur chez l’animal. Les chimiothérapies utilisées peuvent entrainer une perte de poids chez les souris.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les poumons, tumeurs, rates et ganglions.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=7 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 3 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections sous-cutanées (cellules tumorales), intra-péritonéales (traitements) et intra-veineuse (cellules tumorales) seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les modèles expérimentaux pour lesquels on trouve plus facilement et en plus grand nombre des réactifs spécifiques à l’espèce. Les souris sont l’espèce de référence pour les études précliniques en cancérologie, permettant la reproduction et la validation des résultats facilement pas la communauté scientifique. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.

Issues d'un croisement conçu pour cumuler une mutation qui provoque la sclérose latérale amyotrophique et une seconde, supposée protectrice, 241 souris naîtront avec un phénotype dommageable, dont 94 seulement formeront la cohorte expérimentale. Toutes sont tuées en fin de projet pour analyses histologiques et moléculaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles développent une paralysie d'un ou plusieurs membres, perdent du poids après vingt semaines et vivent moins longtemps, la dégénérescence apparaissant en moyenne à 137 jours et durant tout le reste de leur vie. Le porteur annonce trois séries de trois tests comportementaux de dix minutes sans préciser lesquels, et prévoit une marge de 20 % d'animaux au-delà de l'effectif calculé.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie grave qui paralyse progressivement les muscles, entraînant une issue fatale en quelques années. Il n’existe pas encore de traitement curatif. Nos recherches portent sur une connexion clé entre les nerfs et les muscles, appelée jonction neuromusculaire (JNM). Stabiliser cette connexion pourrait ralentir la progression de la maladie. Nous avons identifié un gène impliqué dans la dégradation de la JNM et montré que sa suppression protège les neurones chez la souris. Nous allons maintenant tester cette découverte sur un modèle de SLA pour évaluer son potentiel thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait non seulement améliorer la compréhension des mécanismes de la SLA, mais aussi ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques susceptibles d’améliorer la qualité de vie et la survie des patients.

Procédures

Les animaux subiront un génotypage et des tests de comportement (3 séries de 3 test, chaque test durant 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les souris atteinte de SLA deviennent paralysées d'un ou plusieurs membres et ont une durée de vie raccourcie. Elles présentent une perte de poids après 20 semaines d'âge. L'apparition moyenne de la dégénérescence est de 137,4 jours et dure tout le reste de sa vie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de projet afin de réaliser des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

L'étude de l'effet thérapeutique de candidats médicaments sur des processus complexes tels que les maladies neurodégénératives ne peut se faire sans l'utilisation de modèles animaux. En effet, il n'existe pas actuellement de modèles non animaux permettant de récapituler l'ensemble des mécanismes physiologiques complexes à l'oeuvre dans le développement de la SLA. Le lancement de cette étude à cependant été au préalable validé par des expériences in vitro.

Réduction

L’approche décrite dans ce projet permettra la création d'une ligné trangénique présentant une double mutation : une mutation induisant la SLA et la mutation d'interet potentiellement protectrice. Nous allons produire 241 animaux à phénotype dommageable dont 94 constitueront la cohorte expérimentale. La stratégie de croisement permettant d'obetenir cette nouvelle lignée à été étudié dans le but de générer le moins d'animaux possible. Nous avons prévu une marge de 20% en plus de notre effectif, incluant un potentielle réduction de 20% du nombre d'animaux en fonction du succès reproducteur.

Raffinement

Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe), ce qui permettra de réduire le stress et de limiter au maximum la souffrance animale. Si un animal présente un trouble locomoteur, de la nourriture humide et un biberon à longue tétine seront ajoutés à la cage. Les animaux seront pesés et observés chaque semaine en plus du suivi quotidien habituel. Des soins locaux seront administrés à tout animal blessé. Si une douleur est présente, un antalgique pourra être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

Dans le domaine de recherche sur les maladies neurologiques, la souris est un modèle de choix. Les études réalisées avec ce modèle sont reproductibles et simples d'un point de vue expérimental. Les souris présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l'homme. Enfin, nous possédons une grande expertise avec ces modèles et le matériel chirurgical et médical est adapté à ce modèle. Les animaux seront utilisés entre 2 et 4 mois d'âge.