Souris

Les souris dont la prise de poids finit par gêner la locomotion sont retirées du projet et mises à mort. 88 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes, la moitié après un transfert vers un second établissement. Chacune est pesée quinze ou seize fois, mise à jeun quatre ou quinze heures, gavée deux à trois fois, saignée à la queue trois ou quatre fois, injectée dans l'abdomen puis dans le sinus derrière l'œil, et passe quarante-huit heures seule en cage de mesure. Le porteur décrit ses lignées génétiquement modifiées comme des souris qui "se portent bien", et retient l'espèce pour la ressemblance de son métabolisme oro-intestinal avec celui de l'être humain.

Objectifs

L’excès de lipides alimentaires est associé à l’obésité via un apport énergétique et une inflammation élevés. CD36 est un récepteur présent notamment au niveau des membranes des cellules intestinales qui contrôle la formation des lipoprotéines synthétisées par l’intestin au cours de la digestion. Ces lipoprotéines véhiculent les lipides alimentaires mais aussi des molécules pro-inflammatoires issues du microbiote intestinal. Le premier objectif de ce projet sera donc d’évaluer la contribution du CD36 intestinal sur la régulation de la dépense énergétique de souris rendues obèses par un régime de type occidental (riche en graisses et en sucres). Nos précédents travaux de recherche laissent envisager que le CD36 intestinal pourrait constituer une cible thérapeutique dans le traitement des pathologies telles que l’obésité. Pour ce faire nous utiliserons des souris déficientes en CD36 spécifiquement au niveau des cellules intestinales comparées à des souris contrôles. 32 souris contrôles et 32 souris déficientes en CD36 seront nourries soit avec un régime standard, soit avec un régime occidental durant 15 semaines (temps nécessaire pour observer des effets). Le deuxième objectif de ce projet consiste à évaluer les conséquences d’une sur-activation de CD36 intestinal dans la mise en place de l’obésité. De précédents travaux ont permis de montrer que des leurres lipidiques, c’est-à-dire des molécules mimant les lipides mais n’apportant pas de calorie, diminuaient la consommation de lipides chez la souris obèse, en activant CD36 au niveau des papilles gustatives. Dans ce projet, nous étudierons à présent l’effet d’un leurre lipidique au niveau intestinal sur la mise en place de l’obésité induite par une régime occidental chez la souris. Pour cela, 24 souris contrôles seront nourries avec ce régime durant 8 semaines (temps nécessaire pour observer des effets dans ce cas). 12 souris recevront chaque jour le leurre lipidique en complément de leur alimentation et seront comparées à 12 souris recevant un placebo. Au total, 88 souris seront utilisées dans ce projet, qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : 1. Le CD36 intestinal modifie-t-il la dépense énergétique en régimes standard et de type Western Diet (riche en acides gras saturés et en sucres) ? 2. Le CD36 intestinal modifie-t-il les capacités d’absorption intestinale des lipides alimentaires et la perméabilité intestinale lors d’un régime riche en acides gras saturés ? 3. La suractivation de CD36 intestinal par des leurres lipidiques affecte t-elle la mise en place de l’obésité ? En fonction des résultats obtenus dans ce projet, CD36 intestinal pourrait constituer une cible thérapeutique en cas de surconsommation de lipides alimentaires.

Procédures

L’ensemble de l’effectif du projet recevra un régime alimentaire spécifique (standard ou obésogène) et sera soumis à un suivi de masse corporelle hebdomadaire pour la procédure 1 (15 pesées sur 15 semaines de régime) et bi-hebdomadaire pour la procédure 2 (16 pesées sur 8 semaines de régime), ainsi qu’un suivi de masse grasse et masse maigre par une technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 3 minutes) en semaines 0, 2, 4 , 9 ou 10, et 15 pour la procédure 1(5 mesures par souris au cours du régime), et en semaines 0, 2, 4, et 8 (4 mesures par souris au cours du régime) Dans la procédure 1, 2 gavages seront réalisés : en S12 avec de l’huile et une molécule fluorescente en solution aqueuse, et en S14 avec une solution aqueuse contenant la molécule fluorescente. Dans la procédure 2, 3 gavages seront réalisés (durée de moins de 10 secondes à chaque fois) : en S5 avec du glucose, en S7 avec une solution aqueuse contenant une molécule fluorescente et en S8 avec de l’huile. Dans la procédure 2 uniquement, une injection intrapéritonale sera réalisée en S4 avec de l’insuline. L’injection intrapéritonéale est un geste rapide (moins de 10 secondes) et effectué par du personnel formé et habitué à le réaliser. Une injection intraveineuse au sinus retro-orbital sous anesthésie générale sera réalisée avec une molécule bloquant temporairement l’action d’une enzyme (en S14 dans la procédure 1 et en S8 dans la procédure 2). Cette injection rapide (moins de 10 secondes) est effectuée sous anesthésie par du personnel formé. Des prélèvements sanguins au niveau caudal par simple pression après une légère incision du bout de la queue (0,5mm) et sous anesthésie locale seront également réalisés en semaines 11, 12, et 14 pour la procédure 1 et en semaines 5, 6, 7 et 8(environ 1min par souris par prélèvement). Dans la procédure 1, une mesure de la dépense énergétique est réalisée en semaine 9 ou 10. Cette mesure indolore et non invasive s’effectue dans des cages spécifiques. Elle nécessite 2 jours d’isolement dans cette cage. Dans la procédure 1, toutes les interventions se dérouleront dans l’EU1 jusqu’à la semaine 15. En semaine 16, la moitié de l’effectif (32 souris) sera transféré dans l’EU2 dans des boites de transports adaptées et y restera 48H. Les animaux seront alors soumis à un jeûne court de 4H avant mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale. La procédure 2 se déroulera exclusivement dans l’EU1.

Impact sur les animaux

Les animaux en régime WD peuvent avoir des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Toutefois, cela n’est jamais observé après 3 mois de régime. Le projet requiert d’individualiser les souris lors des mesures de dépense énergétique pendant 48h, ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Les tests de tolérance orale au glucose et à l’insuline, et l’étude de l’hypertriglycéridémie nécessitent des mises à jeun de 4 ou 15h. Les mises à jeun de 4h se font sur la matinée en dehors de leur phase de nourriture nocturne et n’a donc que peu d’impact. La mise à jeun nécessaire de 15h se fait sur la nuit lors de leur phase de nourriture nocturne et s’avère donc plus stressante pour les animaux qui auront toutefois un accès ad libitum au biberon d’eau pendant cette période. Le test de tolérance orale au glucose et l’étude de l’hypertriglycéridémie nécessitent une préhension des animaux afin de les gaver ce qui peut être stressant pour les souris. Le test de tolérance à l’insuline nécessite une préhension des souris et une injection intrapéritonéale qui peut également être invasive. L’analyse de la composition corporelle nécessite de faire entrer les souris dans un tube plastique dans lequel elles doivent rester 3 minutes, ce qui peut être anxiogène. L’injection de la molécule bloquant temporairement l’action d’une enzyme sera réalisée par voie intra-veineuse sous anesthésie à l’isoflurane par un personnel formé maitrisant ce geste.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, la moitié de l’effectif (32 souris) sera mis à mort dans l’EU1 sous anesthésie générale pour prélèvements d’organes afin de réaliser des études post mortem. L’autre moitié (32 souris) sera transféré dans l’EU2 puis mis à mort sous anesthésie générale pour prélèvements d’organes afin de réaliser des études post mortem. A l’issue de la procédure 2, tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale pour prélèvements d’organes afin de réaliser des études post mortem.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience sachant qu’il y a des variations individuelles dans la réponse intestinale aux lipides.

Raffinement

Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés soit sous anesthésie locale (application au bout de la queue pour les prélèvements sanguins à la queue), soit sous anesthésie générale (pour le prélèvement sanguin intracardiaque, par des personnes expérimentées. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis (signes généraux de souffrance, perte de poids, prise de poids pouvant gêner la locomotion). En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet (mise à mort sous anesthésie générale). Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet. Le transport des animaux dans l’EU2 sera effectué au moyen de boites opaques spécifiquement prévues pour les rongeurs, dans lesquelles seront disposées de la nourriture et de l’eau gélifiée, ainsi qu’un enrichissement supplémentaire afin de limiter le stress lié au transport. De plus, les 2 EU étant très proches, le temps de transport sera très court (environ 15minutes).

Choix des espèces

La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau oro-intestinal. Elle exprime les mêmes protéines clés de la détection des lipides et de la synthèse des lipoprotéines par l’intestin qui sont régulées de la même manière. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifiquement au niveau intestinal. Ces souris n’ont pas un phénotype dommageable, elles se portent bien, se comportent bien et ont un état de santé général identique à des souris non génétiquement modifiées. Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus.

1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection et un prélèvement de sang sous anesthésie locale, puis une irradiation sous anesthésie générale, à des doses variables, pour comparer la radiothérapie flash à la radiothérapie conventionnelle sur trois tissus sains : poumon, intestin, peau. Les atteintes annoncées vont de la perte d'appétit à une perte de poids "légère à sévère", avec difficultés respiratoires, isolement, diarrhée et lésions cutanées inflammées. Le porteur présente la technique testée comme "l'une des avancées les plus prometteuses en radio-oncologie" et une "véritable révolution", et juge "urgent" de lancer ces programmes précliniques.

Objectifs

Les traitements par radiothérapie conventionnelle ont la difficulté d'arriver à délivrer une irradiation localisée avec une dose suffisante pour l’éradication de la tumeur tout en préservant les tissus sains environnants. Actuellement, les techniques d’irradiation médicale permettent de limiter l’atteinte des tissus sains sans toutefois l’éviter et les combinaisons de r&diothérapie avec les médicaments de chimiothérapie tendent à exacerber les effets secondaires. La raduithérapie flash est une nouvelle technique qui consiste à délivrer une forte dose à un très haut débit de dose (4500 à 9000 fois plus élevé, et beaucoup plus rapide) permettant une réponse anti-tumorale efficace tout en épargnant les tissus sains, limitant ainsi les toxicités liées à l’irradiation. À l'heure actuelle, elle est reconnue comme l'une des avancées les plus prometteuses en radio-oncologie, à la croisée des chemins entre technologie, physique, chimie et biologie, et considérée comme une véritable révolution dans le domaine de l’oncologie. Cette nouvelle modalité d’irradiation prévoit de remplacer d’ici à 4-5 ans les séances de radiothérapieconventionnelles par un ou quelques séances d’irradiations flashs de moins d’une seconde, beaucoup plus précises et efficaces mais surtout avec une moindre toxicité sur le tissu sain. Cependant, les mécanismes biologiques restent mal compris et les limites de l’effet flash (en dose par séance, en débit de dose…) mal définis et il devient donc urgent de lancer des programmes de recherche pré-clinique et translationnelle visant à mieux comprendre et optimiser le transfert en clinique de cette nouvelle technique. Dans ce projet nous avons fixé deux objectifs: 1-Valider l'effet flash sur plusieurs modèles de toxicité radio-induite, à savoir, la toxicité pulmonaire, la toxicités intestinale et la toxicité cutanée. 2-Etudier les mécanismes biologiques impliqués dans cet effet flash.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme consistent à fournir un rationnel préclinique et une preuve de concept pour la validation de l'utilisation de la radiothérapie flash en clinique. A travers ce projet nous visons à assurer un meilleur transfert en clinique de la radiothérapie flash et en toute sécurité pour les patients.

Procédures

Les animaux auront une injection (durée 1 minute, anesthésie locale) et un prélèvement de sang (durée 1 minutes, anesthésie locale). Ils auront aussi des irradiations à des doses différentes (une fois par animal, durée de 1 à 10 minutes, sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir un inconfort et ou un stress léger lié à la manipulation des animaux pour les préparer au traitement de radiothérapie. En raison des effets secondaires de la radiothérapie, les animaux peuvent présenter des changements de comportement modérés, tels qu'une diminution de l'appétit, une réduction de l'activité ou des modifications du comportement social. De plus une perte de poids légère à sévère peut être observée chez les animaux ayant reçu le traitement de radiothérapie. Les nuisances induites peuvent être différentes en fonction de l’organe/tissu irradié. Certains animaux pourront perdre présenter une perte de poids modérée après irradiation. De plus, une difficulté respiratoire peut être observée chez ces animaux, associée à un comportement d’isolement. Une diarrhée peut (rarement) survenir chez les animaux irradiés. Certains animaux pourront développer une toxicité cutanée qui se manifeste sous forme de lésions inflammées de garde léger à modéré comme celles observées chez les patients.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour analyses des effets de la radiothérapie flash sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer les effets de la radiothérapie flash sur les tumeurs et sur les tissus sains, en comparaison avec la radiothérapie conventionnelle. Ceci exige donc un système biologique dynamique complet en interaction direct avec le microenvironnement de la tumeur. L’étude du recrutement des cellules immunitaires dans le site irradié ainsi que leurs interactions complexes nécessitent le recours à un modèle animal vivant entier et ne peut pas être modélisé in vitro ni in silico

Réduction

Afin de pouvoir observer des différences qui soient statistiquement interprétables entre les différents groupes de traitements, nous avons besoin d’utiliser des tests statistiques solides et adéquats. Ces tests exigent l’utilisation d’un nombre minimum d’animaux par groupe. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique a priori, afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. De plus, notre expertise dans le domaine de la radiobiologie ainsi que les données de la littérature nous permettent de réduire les conditions expérimentales et donc de réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire et suffisant.

Raffinement

Toutes les manipulations expérimentales seront menées en veillant à adhérer aux principes éthiques les plus stricts pour minimiser la douleur, l'angoisse et le stress chez les animaux. Une anesthésie locale ou générale adéquate sera utilisée pendant les expériences pour soulager ou éliminer la douleur des animaux. Les conditions d'hébergement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaire. Leur environnement sera enrichi avec du coton ou des maisons en carton. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Une pesée sera effectuée régulièrement, au minimum de façon hebdomadaire. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et des réponses immunitaires pendant le développement tumoral. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront utilisées à un âge de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont adultes. Les études des mécanismes biologiques, impliquant des voies de signalisation moléculaires et cellulaires différentes, nécessite d’avoir recours à un organisme adulte présentant des tissus/organes matures.

Une pompe diffusant un agent hypertenseur est implantée sous la peau et des constricteurs sont posés pour réduire le flux sanguin cérébral. 45 souris vont être utilisées de cette façon dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des examens IRM sous anesthésie répétés toutes les deux semaines pendant trois mois, puis une ponction de liquide céphalorachidien avant leur mise à mort. Parmi les complications possibles, le porteur énumère des accidents vasculaires cérébraux, des infarctus, un globe oculaire percé, une hémorragie non contrôlée et des lésions du cerveau ou de la moelle épinière. Il rappelle par ailleurs que l'IRM "ne génère aucun signe de souffrance visible".

Objectifs

La maladie des petits vaisseaux (SVD en anglais) est particulièrement fréquente chez les personnes âgées, même sans accident vasculaire cérébral ni démence, et peut représenter les stades précoces de ces affections. L’objectif du projet est de mettre au point un protocole d’imagerie non-invasive, par Imagerie par Résonance Magnétique, similaire à celui appliqué chez l’homme pour détecter les anomalies cérébrales induites par la SVD chez le petit animal, et ainsi pouvoir évaluer l’efficacité de traitements.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies neurodégenératives présentant des démences vasculaires augmente constamment avec le vieillissement de la population. L’utilisation de modèles murins pathologiques permet de valider le protocole IRM similaire à celui appliqué chez l’homme pour détecter les anomalies cérébrales. Ce projet permettra d’évaluer la sensibilité de détection de ces anomalies pour tester ensuite des traitements innovants contre les troubles neurologiques associés à la SVD.

Procédures

Pour créer une hypertension, une pompe diffusant un agent hypertenseur sera posé en sous-cutané des souris (durée 10 min). Pour créer une hypoperfusion cérébrale, les animaux auront une implan-tation de constricteurs sous anesthésie générale gazeuse (durée 10 min). Trois semaines après, tous les animaux subiront des examens IRM sous anesthésie générale. Ces examens seront répétés 2 semaines plus tard, jusqu’à 3 mois d’observation. Après le dernier examen IRM, un traceur fluorescent sera injecté dans la circulation sanguine (geste réalisé en 1 min), puis du liquide céphalo rachidien sera prélevé (5 minutes) avant leur euthanasie. Toutes les actes seront effectués sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

L'hypertension artérielle générée et la baisse de flux sanguin (hypoperfusion ) sont des pathologies asymptomatiques. Les complications aigues seront des accidents cérébro-vasculaires (l'animal montre des changements de mobilité, souvent un déplacement en cercle) ou des infarctus cardiaques (animal reste prostré peu vigile). Les injections peuvent entrainer les événements suivants: globe oculaire percé, hémorragie importante non contrôlée. Le prélèvement du liquide céphalorachidien peut provoquer des saignements au niveau du site de ponction, en particulier si les vaisseaux sanguins sont endommagés pendant l'intervention. Un prélèvement excessif peut perturber l'équilibre du liquide, pouvant affecter la fonction cérébrale ou induire une pression intracrânienne anormale. Le prélèvement peut potentiellement provoquer des dommages aux structures cérébrales sous-jacentes ou à la moelle épinière, pouvant entraîner des troubles neurologiques transitoires.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, pour vérifier que les anomalies détectées par IRM sont réellement présentes sur les coupes histologiques.

Remplacement

Ce projet sera réalisé en utilisant des modèles murins qui reproduisent des lésions neurologiques du cerveau décrites dans les maladies neurovasculaires, ainsi que des signes cliniques associés à ces maladies. Il est nécessaire de visualiser par imagerie non-invasive les altérations du cerveau de l’animal vivant, afin de limiter les analyses post-mortem qui nécessitent l’emploi de nombreux animaux. Le recours à un être vivant, mammifère, présentant des caractéristiques partagées avec l'homme est donc nécessaire et les rongeurs représentent un modèle de choix pour réaliser des modèles pathologioques.

Réduction

Il y aura 2 groupes de souris : hypertendues ou avec une perfusion sanguine cérébrale diminuée. Nous pensons que les anomalies crérébrales induites vont être détectées facilement sur les images IRM. L’avantage de l’IRM est son caractère non-invasif, permettant de suivre les animaux de façon longitudinale. Ainsi, chaque animal est son propre contrôle, ce qui réduit le nombre d’animaux à utiliser. Ceci devrait permettre d’avoir un nombre suffisant par groupe pour déterminer la sensibilité de détection des différentes anomalies par IRM et obtenir des résultats statistiques.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupe dans des cages avec libre accès à l’eau et à la nourriture. De l’enrichissement sera placé dans la cage : maisonnette, coton, batônnets de bois à ronger. Tous les actes sur les animaux seront réalisés sous anesthésie générale gazeuse. Les animaux sont surveillés par la visite quotidienne du zootechnicien. En cas de problème de santé des animaux, l'expérimentateur est immédiatement alerté. L’administration de l’hypertenseur sera réalisée grâce à l’implantation de pompes en sous-cutané, permettant de limiter au maximum les injections répétées. L'utilisation d'anesthésies gazeuse, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux, et un ballonnet pour le contrôle de la respiration lors des examens IRM permettent d'assurer un réveil rapide des animaux et donc de pratiquer plusieurs anesthésies par animal. De plus, une réhydratation des animaux après les sessions d’imagerie sera réalisée. Du gel ophtalmologique sera appliqué à chaque anesthésie pour compenser la sécheresse oculaire. Il est à rappeler que l’expérience d’IRM en elle-même ne génère aucun signe de souffrance visible et est classée légère en degré de gravité. Une grille de scorage a été établie pour permettre de suivre l’état des animaux tant au niveau de l’apparence physique, du comportement, du poids de corps et de signes cliniques généraux.

Choix des espèces

La souris est est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire à de forte ressemblance avec celui décrit chez l'homme. Les modèles d'hypertension artérielle et de modification de flux sanguin cérébral ont été développés et validés pour cet espèce. Nous utiliserons des souris adultes (10 semaines minimum) c'est à dire, lorsque la maturation du réseau vasculaire cérébral est atteinte.

Vérifier que des molécules injectées dans le sang atteignent bien le cerveau : c'est le seul objet de ce projet, pour lequel 20 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection intraveineuse alors qu'elle est éveillée, maintenue à la main quinze à trente secondes, avec un risque de lésion et d'hématome au point d'injection. Trente à cent vingt minutes plus tard, elles sont anesthésiées puis tuées pour que leur cerveau soit analysé. Le porteur indique que la complexité d'un "organisme entier" ne se reproduit pas in vitro, après avoir pourtant sélectionné ces molécules sur des cultures de neurones.

Objectifs

La maladie de Huntington (MH) est une maladie génétique neurodégénérative. Les principales manifestations cliniques de cette maladie sont les mouvements choréiques, un déficit cognitif et des troubles psychiatriques. La neuropathologie de la MH affecte préférentiellement une région du cerveau impliqué dans le contrôle des mouvements volontaires. Il n’existe aucun traitement curatif de la MH si bien que la maladie progresse inexorablement vers la mort. Nous nous intéressons aux mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués à la fois dans les symptômes moteurs et psychiatriques afin de proposer des cibles thérapeutiques que nous testons chez la souris. Nous avons plusieurs cibles thérapeutiques associées à des stratégies thérapeutiques que nous avons déjà étudiées dans un précédent projet et qui montrent des effets bénéfiques sur le comportement cognitif et moteur. L'objectif du projet proposé ici est de confirmer le passage des molécules thérapeutiques dans le cerveau suite à une administration intra-veineuse.

Bénéfices attendus

Les résultats générés par cette étude permettront de compléter et de publier une étude prometteuse sur de nouvelles cibles thérapeutiques dans la maladie de Huntington (MH). La stratégie adoptée au cours de ce projet est un point de départ important dans l’optique d’une thérapie efficace et durable chez les patients atteints de la MH qui concerne 18 000 cas répertoriés en France.

Procédures

Au cours du projet, les animaux seront soumis à une injection unique en intra-veineuse sur animal vigile, immobilisé par contention manuelle (15-30 secondes maximum). Après un temps de maintien compris entre 30 et 120 minutes, une anesthésie est effectuée suivi d’une euthanasie par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

L’administration intraveineuse pourra entrainer un stress lors de la contention nécessaire à l’administration ainsi qu’une douleur de courte durée au site d’injection. Une lésion au site d’injection est possible ainsi que la formation d’un hématome. En fin de période de maintien (30 à 120 minutes après l’injection des molécules), les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés. L’anesthésie peut induire un stress thermique et dans de rare cas une détresse respiratoire.

Devenir

Les souris utilisées dans cette procédure seront toutes euthanasiées à la fin de la période de maintien prévue, en vue des analyses biochimiques nécessaires pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Un organisme vivant est nécessaire pour étudier le passage de la barrière hémato-encéphalique (BHE) par nos petites molécules. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Les molécules testées ont été au préalable sélectionné pour leurs effets bénéfiques sur des cultures primaires de neurones modélisant la pathologie cellulaire de la Maladie de Huntington. Ces tests concernaient la régulation des gènes et aussi la formation d’agrégats et la survie neuronale

Réduction

Le projet impliquera 20 animaux au maximum. Ce projet sera réalisé uniquement sur des souris commerciales de façon à réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet. Les résultats observés chez les souris disposant d’une barrière hémato-encéphalique intègre et fonctionnelle devrait permettre de démontrer le passage de nos petites molécules de la circulation sanguine jusqu’au cerveau. Nous limitons également au maximum le nombre d’animaux par groupe avec seulement 2 animaux/groupe soit 10 animaux par expérience. Nous incluons toutefois la possibilité de réaliser une seconde expérience pour pallier aux éventuels problèmes méthodologiques et/ou pour confirmer les résultats obtenus soit un total maximal de 20 animaux pour l’ensemble du projet. Les molécules seront quantifiées dans les cerveaux des souris contrôles et traitées. Il s’agira de détecter ou non la présence de ces molécules (pas de test statistique).

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress tout en permettant d’atteindre les objectifs scientifiques. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie local/générale, analgésie). Les animaux seront habitués à être manipulés afin de limite le stress lors de l’administration intra-veineuse du composé. L’injection sera effectuée après anesthésie locale par un personnel très expérimenté et ne devrait pas prendre plus de quelques instants. Les animaux seront étroitement surveillés durant les minutes suivants l’injection.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Le projet sera mené sur un modèle de rongeur mus musculus reconnu comme modèle animal idéal pour la translation vers les thérapies. La structure de la barrière hémato-encéphalique, les régions cérébrales, les types de neurones et les circuits neuronaux sont largement conservés entre le rongeur et l'être humain. Justification des stades de développement : Les animaux seront utilisés à l’âge de 10 semaines, après une période d’acclimatation d’une semaine minimum. Cet âge permet d’avoir une barrière hémato-encéphalique parfaitement intègre et fonctionnelle de manière à optimiser nos résultats.

L'abdomen de chaque souris est ouvert sous anesthésie pour implanter des cellules tumorales dans la paroi du cæcum ou dans le foie, en quinze minutes. 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des traitements injectés trois fois par semaine pendant trois semaines et deux séances d'imagerie hebdomadaires. Toutes sont tuées à la fin, y compris celles dont la tumeur régresse totalement et qui sont alors gardées deux mois de plus sous surveillance par imagerie. Le porteur range ces injections répétées et les anesthésies parmi les nuisances "fugaces" et "passagères", tout en reconnaissant que la croissance des tumeurs et l'apparition des métastases sont elles-mêmes sources de souffrance.

Objectifs

Les cellules cancéreuses mettent en place des systèmes de blocage pour inactiver la réponse immunitaire anti-tumorale (ex : anti-PD1). Des thérapies ciblant l’inactivation de PD1 ont été développées pour rétablir une réponse immunitaire efficace contre le cancer. Même si ces thérapies montrent une certaine efficacité, certains patients ne répondent pas à ces traitements. Notre projet a pour but de démontrer que la déplétion des cellules CD4 de la souris permet à cette thérapie anti-PD1 d’être efficace contre les tumeurs implantés dans leur organe d’origine. En effet, la déplétion des cellules CD4 associée à la thérapie anti-PD1 a déjà été montrée efficace dans des tumeurs implantées en sous-cutanée dans la souris. Le microenvironnement jouant un rôle important dans la réponse anti-tumorale, nous nous proposons ici d’évaluer l’efficacité thérapeutique de la déplétion des cellules CD4 associée à la thérapie anti-PD1 dans un modèle de cancer du côlon et dans un modèle de métastase hépatique d’origine colique.

Bénéfices attendus

La réactivation des réponses anti-tumorales grâce au blocage des « immune checkpoints » a démontré des effets notables sur le traitement du cancer, mais son taux de réponse doit encore être amélioré dû à la présence de résistances à ces thérapies. Ce projet permettra donc de montrer l’implication des lymphocytes T CD4 dans la résistance aux traitements anti-PD1 et ainsi de confirmer l’intérêt de trouver et de tester des molécules bloquant ces cellules chez l’Homme afin d’améliorer les thérapies anti-cancéreuses.

Procédures

Les modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (15 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2 pour réaliser les traitements en intrapéritonéale 3 fois par semaine 7 jours après la chirurgie et pendant 3 semaines. La progression tumorale sera alors suivie par imagerie (sous anesthésie gazeuse) après injection intrapéritonéale de l’agent imageant (1-2 min/souris) deux fois par semaine. Les souris seront conservées encore 2 mois si régression totale de la tumeur qui sera vérifiée 1X par semaine par imagerie.

Impact sur les animaux

Les modèles animaux mimant la formation de tumeurs primaires coliques et métastatiques d’origine colique nécessitent un acte chirurgical. L’ouverture de la cavité abdominale des souris, l’injection des cellules tumorales dans la paroi du caecum et dans le foie sont des interventions pouvant entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. Le développement des tumeurs primaires, ainsi que l’apparition des métastases peuvent également être à l’origine de souffrance et de gênes. Les injections intrapéritonéales de traitements, de luciférase et d’antibiotiques, ainsi que les injections sous-cutanées de buprénoprhines sont une source de nuisances fugaces La manipulation des souris lors des injections des traitements et lors des imageries est une nuisance. Les infections liées à la chirurgie sont un risque de fréquence rare vue les mesures mises en place (stérilité, antibiothérapie). Les anesthésies mises en place lors de la chirurgie et des imageries sont également une source de nuisance passagère.

Devenir

Les souris ayant été porteuses de tumeurs, elles seront toutes mises à mort à la fin de l’expérience

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictif, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant.

Réduction

Pour chaque traitement à tester Control, a-CD4, a-PD1 et a-CD4+ a-PD1 (4), 4 groupes de 5 souris seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer l’efficacité du traitement tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées (formation de niveau concepteur de projet avec soit une formation chirurgie du petit animal soit être chirurgien) afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 4 fois de manière indépendante. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon en raison de la taille des groupes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Toutes les séances d’imagerie seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Les souris recevant une chirurgie nécessitant l’ouverture de la cavité abdominale, recevront une antibiothérapie préventive avant chaque chirurgie. Les procédures telles que l’imagerie et la chirurgie abdominale sont réalisées sous anesthésie à l’isoflurane suivie d’un réveil sous lampe chauffante (EU2) ou couveuse (EU1), réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Tout au long des opérations, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être en permanence contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation. Les animaux bénéficieront d’une réhydratation per- et post-opératoire ainsi qu’une prise en charge antalgique adaptée : 0.1 mg/kg de buprénorphine en pré-opératoire, de la lidocaïne en application locale sous forme de gel lors de la chirurgie et 0.1 mg/kg de buprénorphine seront injectées en sous-cutanée 2X par jour pendant 3 jours. Un système facilitant la prise alimentaire ainsi que la prise de boisson sera mis en place (nourriture gélifiée). Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie de la bioluminescence après injection de luciférine. Les animaux seront transférés de l’EU1 à l’E2 (bâtiments situés proches l’un de l’autre) dans un sac de transport et le plus rapidement possible pour ne pas engendrer de stress.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour faire de la chirurgie. Nous utiliserons des souris immunocompétentes C57Bl/6, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines possédant le même fond génétique. Ces souris sont largement utilisées lors de la greffe sous-cutanée ou orthotopique de ces cellules cancéreuses. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

Toutes mises à mort sous anesthésie pour que leurs organes soient prélevés, 65 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est mise à jeun six heures, reçoit une injection d'analgésique puis d'anesthésique, subit une laparotomie, une ligature de l'œsophage, un cathétérisme du canal biliaire et un prélèvement sanguin intracardiaque. L'objet du projet est de mesurer les sécrétions digestives de souris privées du récepteur des lipides dans les papilles gustatives, pour préciser le rôle de la langue dans le goût du gras. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne peut se substituer à l'animal vivant, décrit sa lignée comme "indispensable", et annonce une étude pilote sur cinq mâles reproducteurs pour vérifier que la chirurgie est faisable à quatre mois.

Objectifs

Il a été rapporté que le goût du gras représente une sixième modalité gustative aux côtés du sucré, du salé, de l'amer, de l'acide et de l'umami. C’est plus précisément les récepteurs gustatifs, exprimés par les cellules des bourgeons du goût (de type 1, 2, et 3) qui permettent la détection des saveurs. Les récepteurs de lipides exprimés dans les papilles gustatives sont responsables non seulement de la perception lipidique mais également du renforcement de la préférence alimentaire pour les repas riches en gras. Le signal gustatif est transmis au cerveau par les nerfs gustatifs, conduisant à une augmentation des sécrétions digestives préparant le corps à l'arrivée des aliments. On parle alors de l’axe langue – cerveau – intestin. Les études réalisées chez les souris n’exprimant pas le récepteur principal des lipides ont démontré qu’elles perdent la perception du goût du gras, due à une altération de l’axe langue – cerveau – intestin, avec notamment une diminution des sécrétions digestives déclenchées lors d’une application linguale de lipides. Comme ce récepteur est exprimé dans plusieurs tissus et organes, il a été difficile de déterminer chez ces souris, le rôle oral dans les effets observés. Ainsi, des souris génétiquement modifiées qui n’expriment pas le récepteur principal des lipides uniquement dans les papilles gustatives ont été générées. Le but de ce projet est de continuer d’étudier le rôle du récepteur principal aux lipidessur la langue dans l’activation des sécrétions digestives chez les souris qui n’expriment pas ce récepteur dans les papilles gustatives.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra la description d’une nouvelle souche de souris génétiquement modifiées qui n’exprime pas le récepteur principal des lipides dans les papilles gustatives et qui pourra donc servir de modèle animal pour de nouvelles questions sur le « gout du gras ».

Procédures

L’ensemble des souris sera nourri avec un régime standard et sera pesé de façon hebdomadaire. Six heures avant la manipulation, les souris seront mises à jeun (de nourriture seulement). Lors de la manipulation, une injection sous-cutanée d’analgésiant puis une injection intrapéritonéale d’anesthésiant seront effectuées. Un anesthésique local sera également appliqué. Les souris endormies seront tondues au niveau de l’abdomen. Une laparotomie, une ligature de l’œsophage et cathétérisation du canal biliaire seront réalisés sous anesthésie générale. Un prélèvement sanguin intracardiaque (sous anesthésie toujours) sera réalisé puis les souris seront mises à mort (toujours anesthésiées). Après euthanasie, les organes d’intérêt seront prélevés.

Impact sur les animaux

Le projet requiert de mettre à jeun les souris pendant 6 heures (phase diurne) avant la procédure chirurgicale sous anesthésie, ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Ils auront toutefois un accès ad libitum au biberon d’eau pendant cette période. Les souris peuvent subir des douleurs causées par la chirurgie d’où l’utilisation d’analgésiques (buprénorphine + carprofene) en amont de l’anesthésie. Les animaux peuvent subir une peur des suites de la contention nécessaire pour les injections sous-cutanées (analgésiques) et intrapéritonéales (anesthésiques). Une douleur est également à prévoir lors de cette injection sous-cutanée et lors de cette injection intrapéritonéale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes.

Remplacement

La sécrétion pancréato-biliaire est une étude faisant intervenir une communication inter-organes ainsi qu’une sécrétion pancréatique in vivo. C’est un paramètre métabolique qui ne peut s’étudier que sur des animaux vivants, ceci expliquant la nécessité de toute la partie expérimentation in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer l’utilisation de modèles animaux

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable . Ainsi, après estimation confirmée, la taille des groupes minimale est de 15 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. De plus, habituer les souris à la contention permettra de diminuer le stress induit par le geste. Pour maximiser l’asepsie, plusieurs précautions seront prises, notamment la tenue du manipulateur, la désinfection des surfaces, l’utilisation d'un champ stérile, la stérilisation des outils de dissection, la tonte de la zone d’incision et la désinfection de la peau.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix qui est assez documenté sur la phase post-ingestive et le comportement alimentaire. Bien que techniquement plus difficile que l’utilisation du rat, notre modèle animal génétiquement modifié est réalisé seulement chez la souris, c’est pourquoi ce modèle est indispensable. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et l’induction de la modification génétique étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude. Les souris mâles utilisées auront minimum 4 mois car avant 8 semaines, les souris sont trop petites pour effectuer une chirurgie. Dans le DAP précédent, l’âge minimum était 2 mois. Cela concorde avec les expériences précédemment réalisées (avec l’utilisation de ces animaux et avec les différents articles qui mentionnent cette chirurgie) mais les souris étaient toujours trop petites. Pour maximiser les chances de succès des chirurgies, nous choisissons des souris de 4 mois minimum. Tout de même, une étude pilote sera réalisée en amont sur 5 males reproducteurs pour s’assurer de la faisabilité de la chirurgie sur des animaux de 4 mois.

Seize semaines d'un régime riche en sucres, en graisses et en cholestérol rendent des souris diabétiques, avant qu'un régime cétogène, un régime sans glucides ou un supplément de bêta-hydroxybutyrate ne leur soit imposé pendant trois à neuf jours. 1 010 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur répète qu'aucun effet dommageable majeur n'est attendu, tout en indiquant une perte de poids de 10 à 15 % dans les trois premiers jours du régime cétogène et une prise de poids allant jusqu'à 45 grammes sous régime riche en graisses. La mise à mort sert à prélever des cellules rares du foie pour trois techniques d'analyse qu'il juge "indispensables", dont le séquençage de l'ARN cellule par cellule.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie caractérisée par une sensibilité à l'insuline altérée, dont la prévalence augmente à l'échelle mondiale, constituant ainsi une nouvelle forme de pandémie. De nombreuses interventions alimentaires ont été proposées pour améliorer le contrôle glycémique, le régime cétogène émergeant comme l'une des approches les plus répandues. Cependant, malgré les preuves solides soutenant l'efficacité du régime cétogène dans l'atténuation du diabète, son impact sur l'immunité innée, en particulier sur les macrophages hépatiques, reste mal compris. Ce projet vise à étudier l'effet du régime cétogène chez les souris rendues diabétiques sur une période de 16 semaines de régime occidental riche en sucres et en graisses. Dans une première phase de l'étude, nous chercherons à comprendre l'effet de la cétogenèse précoce sur les populations de macrophages hépatiques. Nous utiliserons ensuite ces informations pour explorer comment cette vague de cétogenèse peut remodeler le profil des macrophages hépatiques afin de les rendre plus résilients face au diabète.

Bénéfices attendus

Ce projet fournira de nouvelles perspectives sur les cellules et/ou les voies métaboliques que nous devons activer pour déclencher la cétogenèse et inverser le diabète. Les résultats auront donc potentiellement des conséquences pour le traitement du diabète de type II.

Procédures

Suivant les groupes, les animaux pourront avoir 9 jours de régime alimentaire standard (groupe contrôle), 3 jours de régime cétogène, 6 jours de régime cétogène, 9 jours de régime cétogène, 6 jours de régime riche en matières grasses (66 % de graisses, 30 % de glucides), 6 jours de régime sans glucides (30 % de graisses, 0 % de glucides), 6 jours de régime alimentaire standard avec supplément de beta-hydroxybutyrate, 16 semaines de régime alimentaire standard, 16 semaines de régime alimentaire standard suivies de 6 jours de régime cétogène, 16 semaines de régime riche en glucides/lipides/cholestérol avec saccharose/fructose, 16 semaines de régime riche en glucides/lipides/cholestérol avec saccharose/fructose suivies de 6 jours de régime cétogène. Certains animaux auront un prélèvement de sang (sous anesthésie locale (ponction rapide (durée 5 secondes d'une veine de la queue).

Impact sur les animaux

Régime cétogène : Aucun effet dommageable majeur pour les animaux. Les souris peuvent perdre un peu de poids corporel (jusqu’à 10-15% de perte de poids au cours des 3 premiers jours du régime). Il est à noter que des effets modérés sur l'activité physique peuvent être observés en raison de la transition métabolique vers la cétose. Régime riche en graisses : Pas d’effet dommageable majeur pour les animaux. Les souris peuvent prendre du poids progressivement (jusqu'à 45 g) au fur et à mesure des semaines, mais restent globalement en bonne santé. Régime sans glucides : Aucun effet indésirable significatif. Aucune perte de poids. Régime standard avec supplément de BHB : Pas d’effet dommageable notable. Aucune différence significative par rapport aux souris du groupe contrôle. Prélèvement sanguin: Aucune conséquence grave, mais les souris peuvent ressentir un léger stress ou inconfort dû à la contrainte et au prélèvement. La perte de 50 μL de sang ne devrait pas entraîner d'effets indésirables graves, mais un suivi des signes de stress ou d’inconfort sera réalisé. Les souris seront surveillées de près tout au long de l’étude pour s’assurer qu’elles ne subissent pas de souffrances sévères ou prolongées.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en oeuvre les trois grandes techniques (cytométrie en flux, imagerie, transcriptomique) qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement cellulaire dans le foie dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux régimes et traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste donx indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le comportement des macrophages du foie soumis à différentes conditions en interaction avec le microenvironnement. Enfin, notre projet offre des perspectives thérapeutiques qui justifient aussi la nécessité du modèle animal pour valider les expériences in vivo avant leur application chez l'homme. Pour réaliser les tests métaboliques et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables.

Réduction

Nous utilisons le moins de souris possible pour cette étude. Après leur euthanasie, nous collecterons différents types de tissus et cellules, y compris des cellules rares comme les macrophages du foie, pour des analyses approfondies (par exemple, single-cell RNA-seq). Chaque souris nous permettra d'obtenir une grande quantité d'informations. Le nombre de souris nécessaires a été soigneusement déterminé pour chaque groupe, soit à partir des données disponibles dans la littérature, soit à l’aide d’outils statistiques (calcul de puissance) pour garantir un effectif juste et nécessaire.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l’équipe de recherche pour évaluation clinique adaptée. Des point limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des pathologies humaines. En effet, de nombreuses publications mettent en avant le rôle essentiel des modèles murins dans les études précliniques de la cétogenèse, du diabète de type 2 et de la résistance à l'insuline. Les souris utilisées pour les procédures expérimentales seront adultes / sexuellement matures (âgées de 8 à 10 semaines) au début de la procédure.

Jusqu'à quarante séances d'imagerie de deux heures sous anesthésie générale et quarante injections par animal : 500 souris et 100 rats vont être utilisés ainsi, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré tient à la mise au point de protocoles d'imagerie par bioluminescence et par fluorescence, et à la formation de nouveaux utilisateurs de ces machines, en amont des projets scientifiques des équipes. Le porteur signale des phénotypes dommageables possibles, perte de motricité empêchant l'animal de s'alimenter, crises convulsives, amaigrissement, tumeur de plus d'un centimètre cube gênant l'alimentation ou provoquant une douleur permanente. Il présente ce projet de plateforme comme un moyen de réduire le nombre d'animaux utilisés ailleurs, en évitant de lancer de grandes études dont les résultats ne seraient pas satisfaisants.

Objectifs

L’imagerie par bioluminescence ou par fluorescence du petit animal sont des techniques non invasives qui permettent de suivre des cellules spécifiques en temps réel et au cours de plusieurs sessions (suivi longitudinal). Ce suivi longitudinal est notamment utilisé pour le suivi de la progression d'une maladie ou d'un traitement thérapeutique, la validation de nouveaux biomarqueurs, l’étude du trafic cellulaire, la surveillance des cellules transplantées et les modèles d’expression génique. L’objectif de ce projet consistera d’une part à mettre au point différents protocoles d’imagerie pour répondre par la suite aux besoins des équipes de recherche, et d’autre part à la formation des nouveaux utilisateurs à cette technique. Pour atteindre cet objectif, des expériences en conditions réelles sur animaux anesthésiés doivent être menées.

Bénéfices attendus

Du point de vue scientifique, ce projet permettra de proposer des techniques à la pointe de la technologie pour répondre à des questions scientifiques diverses (suivi au cours du temps de la progression d'une maladie ou d'un traitement, la validation de nouveaux marqueurs, la surveillance des cellules transplantées). Ce projet permettra de mettre en place ou d’optimiser des protocoles d’imagerie par bioluminescence ou par fluorescence sur des lots d’animaux pilotes. A la fin de chaque étude, nous pourrons estimer sa faisabilité avec la méthode choisie et l’équipement disponible, ce qui permettra de ne pas initier d’études impliquant un grand nombre d’animaux lorsque les résultats obtenus ne seront pas satisfaisants. Au contraire, l’acquisition de ces données préliminaires lorsqu’elles sont robustes et pertinentes pourraient être utilisées pour justifier les futures demandes d’autorisation de projets à portée scientifique.

Procédures

Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale. Nous réaliserons 40 séances maximum par animal (2h maximum par séance) avec minimum 48h entre chaque imagerie. Les injections de molécule pour détecter la bioluminescence seront réalisées sur animal éveillé ou endormi en fonction des nécessités : 40 injections maximum (durée inférieure à 1 minute), avec minimum 48h entre chaque injection. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire

Impact sur les animaux

L’anesthésie générale nécessaire pour les examens d’imagerie sera associée à une hypothermie, un risque de difficultés cardiorespiratoires, et un risque rare de non-récupération de la vigilance suite à l’anesthésie. Les injections seront associées à une brève et légère douleur au point d’injection, avec un risque d’hématome possible très localement. En ce qui concerne les phénotypes dommageables, nous pourrons observer une perte de motricité empêchant l'alimentation, des crises convulsives, un amaigrissement, un développement d'une tumeur supérieur à1cm3 gênant l'alimentation et/ou l'hydratation et/ou entraînant une douleur permanente.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever puis analyser des tissus d’intérêt

Remplacement

Les développements méthodologiques et optimisations des protocoles existants seront réalisés dans un premier temps sur des échantillons de tissu ou de cellule. Seules les études nécessitant un organisme vivant complexe seront intégralement développées sur l'animal. En effet, les premières étapes permettent de valider des cibles d’intérêt puis l’utilisation d’un organisme vivant dans sa globalité permet d'étudier la complexité des échanges que ce soit au niveau cellulaire, structurel ou entres organes.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisé (600) est réduit au maximum. Selon les études, entre 5 et 10 animaux par lots pourront être utilisés pour valider les protocoles. Cinq animaux est le minimum nécessaire pour obtenir une preuve de concept en validant la faisabilité de la méthode. Un maximum de 10 animaux par lots sera utilisé pour avoir un échantillon suffisant et plus représentatif. L’imagerie par bioluminescence ou par fluorescence est de fait une méthode non invasive pouvant être répétée pour un suivi au cours du temps, évitant ainsi certaines euthanasies à des temps d’intérêt en récoltant les données par ce moyen. De plus afin de limiter le nombre d’animaux, les équipes seront formés avec les animaux utilisés pour les études pilotes quand cela sera possible. Ce projet permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisés à une échelle plus globale en réalisant des études pilotes pour des projets scientifiques, ce qui permettra de n’engager qu’un faible effectif d’animaux pour la mise au point des imageries. Ainsi si les résultats ne s’avéraient pas concluants un plus nombre d’animaux ne seraient pas engagés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions contrôlées de température, hygrométrie et éclairage. Les cages sont enrichies (nids, bâtonnets de bois à ronger). Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine à leur arrivée. Ils sont laissés au calme pendant une demi-heure dans la salle d’expérimentation pour qu’ils s’habituent à ce nouvel environnement. Lors de l’anesthésie générale nécessaire pour réaliser l’imagerie, du gel oculaire sera appliqué sur les yeux des animaux pour éviter tout dessèchement oculaire. De plus, leur température corporelle sera maintenue durant toute la durée de l’anesthésie à l’aide d’une chambre d’induction et de réveil chauffées et d’un plateau chauffant intégré au système d’imagerie. Les animaux seront remis dans leur cage d’origine une fois qu’ils seront parfaitement réveillés. Ils seront à nouveau examinés sous 24 heures pour vérifier leur récupération et plus si le besoin s’en fait ressentir. Nous limiterons le nombre d’imagerie dans la vie de l’animal et nous assurerons d’un délai de récupération de 48h minimum entre chaque session tout en vérifiant au préalable son bon état de récupération. Les animaux seront observés quotidiennement par la zootechnie et une fois par semaine par un membre de l’équipe.

Choix des espèces

Les rongeurs (souris et rat) sont les seules espèces utilisées dans ce type de machine pour acquérir des images capables de donner des détails anatomiques et fonctionnels qui contribuent à répondre aux questions scientifiques posées. Dans notre contexte, les projets de recherche porteront sur l’étude des maladies neurodégénératives, les cancers ou les maladies du foie ou du poumon, pathologies pour lesquelles il existe de nombreux modèles de rongeurs déjà développés. Les animaux pourront être imagés entre 3 semaines et 18 mois, en fonction du protocole des équipes utilisatrices ou de la réutilisation au cours du temps des animaux. Nous essaierons donc de nous placer dans un stade physiologique similaire aux pathologies étudiées afin d’obtenir les meilleures chances de réussite de la transposition de nos résultats à l’Homme. Néanmoins, en l’absence de besoin spécifique pour le développement de la méthode, les animaux utilisés seront de jeunes adultes (âgés de 2 à 6 mois) afin d'avoir des conditions physiologiques les plus courantes possibles pour nos tests.

Faire pousser sur un animal vivant des cellules tumorales de patientes, pour ensuite les cultiver en laboratoire : 75 souris immunodéficientes sont utilisées à cette fin, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau un fragment de tumeur mammaire triple négative au cours d'une intervention de dix minutes sous anesthésie générale, puis sa tumeur est mesurée deux fois par semaine. Le porteur indique que la greffe peut devenir assez volumineuse pour limiter les déplacements de la souris, réduire son appétit et lui faire perdre du poids. Il affirme que l'établissement d'une lignée cellulaire à partir de tumeurs de patientes passe nécessairement par cette amplification sur des animaux "réceptifs", c'est-à-dire dépourvus de défenses immunitaires.

Objectifs

Parmi les différents types de cancer du sein, les tumeurs triple négatives ne peuvent bénéficier de thérapie ciblée et ont le plus mauvais pronostic, de plus la chimiothérapie a une efficacité limitée. Les dérèglements d'une voie de signalisation sont fréquents mais les thérapies ciblant cette voie sont peu efficaces et donc peu utilisées. Nous proposons de dériver des organoïdes à partir de tumeurs de patients déjà établies afin de mener des recherches in vitro. Dans une étude déjà publiée, il a été mis en évidence que certaines tumeurs triple négatives hébergent des mutations provoquant une perte de fonction dans un gène suppresseur de tumeurs . Cette découverte suggère que ce sous-ensemble de patients pourrait potentiellement bénéficier d'une thérapie ciblée sur cette voie.

Bénéfices attendus

Il existe plusieurs options thérapeutiques permettant d’inhiber l’activation aberrante d'une voie de signalisation et certaines sont déjà utilisées en clinique. Cela ouvre donc de nouvelles pistes pour le traitement des patientes atteintes d’un cancer ayant une mutation dans cette voie. La création et l’étude de ces modèles aideront à la compréhension du rôle de de la voie impliquée dans le cancer du sein triple-négatif et à l’identification de thérapie ciblant sa fonction aberrante.

Procédures

Implantation d'un petit morceau de tumeur de patiente, une fois par animal, sous anesthésie générale, durée 10 minutes.

Impact sur les animaux

La greffe de tumeurs de patients nécessite la réalisation de procédures qui peuvent entraîner des nuisances pour les souris. Implantation de la tumeur : La greffe, peut engendrer du stress et de une douleur légère et temporaire chez l'animal. La mesure de la croissance tumorale s'effectue deux fois par semaine, lors desquels nous examinons individuellement les souris (observation du comportement et mesure de la taille tumorale). Cette observation peut entraîner un stress lors de l'intervention, mais celui-ci diminue avec le temps à mesure que nous observons une habituation chez nos souris. Si la tumeur greffée en sous-cutanée devient trop volumineuse, elle peut limiter la mobilité de la souris, affectant ainsi son comportement et son bien-être général, ceci peut aboutir à une diminution de l'appétit pouvant aller jusqu'à une perte de poids modéré.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

L’objectif de ce projet étant la mise en place de modèles cellulaires permettant par la suite d’évaluer l’effet de nouvelles stratégies thérapeutiques, cela ne peut pas être remplacé par des modèles in vitro ou in silico. En effet, l'établissement d'une nouvelle lignée cellulaire tumorale à partir de cellules de cancer de patientes passe nécessairement, au moins dans un premier temps, par une amplification des cellules tumorales sur animaux réceptifs (immunodéficients). Ceci permet de conserver les interactions entre cellules, l’architecture tissulaire de la tumeur d'origine, et d'approcher au mieux microenvironnement de la tumeur. La complexité biologique des organismes vivants est extrêmement élevée, et les interactions entre différents systèmes biologiques peuvent être difficiles à reproduire en dehors d'un organisme vivant. Les modèles animaux peuvent fournir des informations cruciales sur la physiologie, la pathologie et les mécanismes de la maladie qui ne peuvent pas être obtenues par d'autres moyens. De plus, ils peuvent souvent mieux représenter les processus biologiques humains que les modèles cellulaires ou informatiques.

Réduction

Le nombre de souris par lot expérimental a été déterminé par calcul de puissance de manière à en utiliser le moins possible tout en conservant une puissance statistique satisfaisante. Les résultats obtenus seront exploités par des études statistiques.

Raffinement

Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Les animaux seront surveillés quotidiennement et font l’objet d’une observation clinique individuelle afin d’évaluer leur état de santé. Cette observation permettra de vérifier si l’animal se nourrit et s’hydrate bien mais aussi permet de voir l’aspect général de l’animal, sa posture, son comportement afin de déceler tout signe de détresse. En cas de besoin, ils reçoivent une médication contre la douleur et une surveillance renforcée afin de vérifier sa bonne alimentation et hydratation. Les animaux bénéficient d’enrichissement environnemental dans les cages d’hébergement des animaux avec la mise place de jouets, de cachettes et de matériaux pour construire un nid. Cette optimisation des conditions de vie permet aux animaux de s’exprimer, de se sociabiliser, de s’adapter à leur nouvel environnement mais aussi d’être moins stressés en restant occupés durant leur période de captivité. Ce projet fait l'objet de procédures rigoureuses réalisées par un personnel formé et vigilant quant au suivi régulier de l’état de santé des animaux. Des points limites précoes ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris qui sont le meilleur modèle en oncologie préclnique. Des souches immunodéficientes existe dans cette espèce et peuvent être greffées avec des tumeurs humaines. Des souris âgées de 5 à 9 semaines, jeunes adultes, seront utilisées pour standardiser la procédure et ainsi réduire la variabilité intra-expérience. Par ailleurs, l’utilisation de souris âgées de 5 à 9 semaines permet d’améliorer le taux de prise des greffes.

Pour décrire la maturation des mitochondries des astrocytes qui bordent les vaisseaux sanguins du cerveau, 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois injections intrapéritonéales consécutives leur sont administrées dès le premier jour après la naissance, sans anesthésie, le porteur les décrivant comme sans douleur tout en signalant une irritation possible au point d'injection. Toutes sont ensuite tuées sous anesthésie générale à cinq, quinze, trente et soixante jours de vie pour prélever leur cerveau. L'effectif ne repose sur aucun calcul de puissance, le porteur reconnaissant ne pas disposer d'assez de données et retenant cinq animaux par expérimentation d'après ses résultats antérieurs et la littérature.

Objectifs

Le système nerveux central, dont fait partie le cerveau, est composé de plusieurs types cellulaires : les neurones mais également les cellules gliales dont les astrocytes. Ces derniers sont reconnus comme des acteurs essentiels à la physiologie cérébrale. Ces cellules possèdent deux interfaces, une communicante avec les neurones et une autre avec les vaisseaux sanguins. Des études récentes ont montré que les mitochondries astrocytaires sont importantes pour la mise en place des synapses au cours du développement post-natal. Cependant aucune étude ne s'est intéressée à l'interface avec les vaisseaux sanguins. Dans ce projet nous souhaitons caractériser la maturation de ces mitochondries dans les astrocytes bordant les vaisseaux. Toutes nos analyses seront réalisées à plusieurs stades de la naissance jusque chez l'adulte.

Bénéfices attendus

Aucune étude à ce jour n'a étudié l'importance des mitochondries astrocytaires sur le développement du réseau vasculaire. Or les mitochondries jouent un rôle important dans le métabolisme des cellules et permettent leur bon développement. Cette étude permettra d'identifier de nouvelles cibles spécifiques de ces mitochondries astrocytaires et ainsi apporter de nouvelles connaissances sur le développement cérébral et vasculaire.

Procédures

Deux interventions seront utilisés dans ce projet. 1) Trois injections intrapéritonéale consécutives chez des nouveau-nés à partir du 1er jour post-natal, ce geste dure 1 minute au maximum (temps d'injection et délai avant de retirer l'aiguille pour que la solution ne sorte pas). Il est sans douleur et ne nécessite pas d'anesthésie. 2) Les animaux inclus dans la procédure 1 seront ensuite mis à mort sous anesthésie générale à des stades de développpements différents. Le temps de procédure comprend à la fois l'induction (analgésie/anesthésie) et la perfusion, cette procédure n'excède pas 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront trois injections intra-péritonéales pouvant entraîner une lègère irritation au point d'injection. La manipulation des animaux sera minimisée afin d'éviter tout rejet par la mère.

Devenir

Les animaux utilisés pour les différentes études (histologiques, biochimiques, biomléculaires) seront mis à mort afin de prélever les cerveaux et de faire nos analyses.

Remplacement

L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux par expérimentation : 5) a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible.

Raffinement

Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des analgésiques seront coadministrés pour limiter toute souffrance à l’animal. En plus de l'anesthésie, une analgésie sera mise en place. Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux (gestion optimale de l’élevage, injection intrapéritonéale, gestion de l’anesthésie/analgésie). Les animaux subiront trois injections intrapéritonéale pouvant entraîner une lègère irritation au point d'injection. Une observation particulière des animaux les jours suivants sera réalisée. La manipulation des animaux sera minimisée afin d'éviter tout rejet par la mère. Pour vérifier la bonne tolérance des animaux à l'injection répétée du produit chimique, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place adaptée à l'âge étudié (Annexe 1). Elle est bassée sur l'apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé), la mobilité des animaux (prostataion), l'absence de lésion ou saignement, la présence d'un nid dans la cage. Ces points limites intermédiaires permettent la mise en place de soins des animaux évitant la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

La souris est un mammifère où les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'Homme. Les animaux seront utilisés à 4 stades de développement post-nataux à 5, 15, 30 et 60 jours après la naissance. Ces stades correspondent à des moments clés du développement cérébral et en particulier des astrocytes et de leurs interactions avec les vaisseaux sanguins.