Souris
Vulnérabilité au stress et lumière chez le modèle souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Immobilisées deux heures par jour pendant quinze jours, après avoir été placées seules en cage dès l'âge de vingt jours et jusqu'à la fin des expériences, 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Deux prélèvements sanguins sont réalisés dans la veine de la queue, au premier et au quinzième jour du stress. Le projet cherche à savoir si une exposition à la lumière bleue pendant l'adolescence rend les souris plus vulnérables à un stress subi à l'âge adulte. Le porteur annonce aussi une série de tests comportementaux censés évaluer l'anxiété et l'humeur, sans préciser lesquels, et justifie l'isolement prolongé par la mesure continue de l'activité locomotrice, un igloo étant écarté parce qu'il gênerait les capteurs infrarouges.
Objectifs
L’exposition aberrante à la lumière (ALE pour Aberrant Light Exposure), notamment bleue induit des états dépressifs chez l’animal et l’Homme adulte. Cet effet est médié par les cellules ganglionnaires à mélanopsine ou ipRGCs de la rétine, sensibles à la lumière bleue (480 nm). Elles transmettent les signaux lumineux aux régions cérébrales, impliquées dans la régulation de l’humeur. Les adolescents représentent une population à risque car ils sont exposés de manière intensive à l'ALE à laquelle ils présentent une sensibilité accrue. De plus, la majorité des troubles mentaux apparaissent avant 25 ans. L'objectif de ce projet sera d'apporter des éléments supplémentaires à un projet déjà entamé. Il vise à explorer l'hypothèse qu'une exposition à l'ALE bleue durant l'adolescence conduit à un phénotype de vulnérabilité à un nouveau stress présenté à l'âge adulte chez la souris.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de déterminer si l'exposition aberrante à de la lumière bleue durant l’adolescence induit un phénotype de vulnérabilité à un nouveau stress présenté à l'âge adulte et constitue un facteur aggravant l'état d'anxiété. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires mis en jeu, non réalisables chez l'Homme permettra à court-terme d’élaborer de nouvelles stratégies pour limiter les effets délétères d’une telle exposition, omniprésente dans la population et en particulier chez les adolescents.
Procédures
Tout d'abord, les animaux seront isolés dans des cages individuelles à partir de 20 jours d’âge et jusqu’à la fin de l’expérimentation (âge adulte). Ensuite,à l'âge adulte, les souris seront soumises à un stress d'immobilisation d'une durée de 2h chaque jour et pendant 15 jours. Deux préléments sanguins (jours 1 et 15 du stress d'immobilisation) seront réalisés sur la veine caudale chez chaque animal. Enfin, les animaux subiront une série de tests comportementaux pour évaluer l'anxiété et l'humeur.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent être soumis à différentes nuisances listées ci-dessous : 1) Isolement : à partir de 20 jours d'âge (P20) et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés individuellement dans des cages munies d’un capteur infrarouge permettant de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. 2) Stress d'immobilisation : la contention entraîne une réduction de la mobilité et l'absence d'accés à la nourriture et eau durant le stress. Celà peut générer un inconfort temporaire avec augmentation de l'agitation, du stress et une légère perte de poids. 3) Prélevements sanguins : ils seront réalisés dans la veine caudale et pourront générer une douleur temporaire au niveau du site de prélévement.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélévements de tissus post-mortem.
Remplacement
L'objectif de ce projet est d’évaluer si une exposition aberrante à la lumière bleue durant l’adolescence induit un phénotype de vulnérabilité suite à un nouveau stress appliqué à l'âge adulte. A l’heure actuelle, il n’est pas possible de modéliser in vitro et/ou in silico les différentes structures du cerveau sur lesquelles reposent ces fonctions, ce qui nécessite donc d’avoir recours au modèle animal dans son intégrité.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée à l’aide d’un test de calcul de puissance et sur la base de notre connaissance du modèle, des réponses mesurées et de nos expériences à ce sujet, ainsi que sur la littérature scientifique. Ce nombre a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Compte tenu de la variabilité de notre réponse (différence interindividuelle de sensibilité au stress), un minimum de 15 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. De plus, le même animal suivra la batterie complète de tests comportementaux visant à déterminer son état d'anxiété. En outre, plusieurs prélèvements de tissus et certaines mises au point techniques spourront être réalisés chez le même animal.
Raffinement
Des mesures seront mises en oeuvre pour optimiser le bien-être des animaux. 1) Isolement : Les cages contenant les animaux isolés seront placées dans une armoire avec d'autres souris également isolées. Les animaux peuvent donc se voir et ont accès aux odeurs et bruits générés par leurs congénères. De plus, pour pallier à cet isolement, un enrichissement sera apporté dans chaque cage (nid végétal à base de fibres de coton). Un igloo ne peut être mis car il interfère avec le signal enregistré par les capteurs infrarouges. 2) Sevrage : les animaux seront sevrés à P20. Pendant une dizaine de jours, ils feront l’objet d’une attention particulière (observation tous les 2 jours) afin de vérifier le bon déroulement du sevrage. Nous attacherons une grande importance à l'apparence physique (grille de score de la douleur en annexe), poids et comportements des souriceaux (activité locomotrice enregistrée en continue). Si un problème d’alimentation est constaté pendant la 1ere semaine post-sevrage, les animaux auront accès à de la blédine directement dans une coupe dans la cage. 3) Prélévements sanguins sur la veine caudale : pour chaque geste entraînant une douleur potentielle pour l’animal, un anesthésique local sera appliqué (lidocaine 1%) au niveau du site de prélevement. L’observation des animaux sera effectuée tous les 2 jours avec un intérêt particulier à l'apparence physique externe et les changements comportementaux de ceux-ci (grille de score de la douleur). Un traitement analgésique (voir avec le vétérinaire référent) sera administré en cas de signes de douleur légère à modérée. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques seront appliqués (en attaché, grille de score de la douleur). En cas de dépassement du point limite, les animaux seront mis à mort. Les soins et les procédures seront réalisées par du personnel qualifié.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est d'évaluer les conséquences d'une exposition aberrante à de la lumière bleue pendant l'aolescence sur la vulnérabilité des individus à un nouveau stress. Ce projet fait appel à un modèle murin, sélectionné afin de pouvoir comparer les résultats obtenus avec nos précédentes études sur les effets de la lumière sur différentes structures cérébrales. Les souris seront utilisées à partir de 20 jours d'âge jusqu'à 2-4 mois.
Amélioration du vieillissement en bonne santé et de la longévité par reprogrammation cellulaire et élimination de cellules sénescentes.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Gardées le plus longtemps possible, jusqu'à leur mort naturelle ou jusqu'à l'atteinte d'un point limite, 240 souris vieillissantes accompagnent 128 autres qui sont tuées à vingt mois pour analyse des tissus, soit 368 animaux au total dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent dans leur nourriture un produit destiné à éliminer les cellules sénescentes et dans leur eau de boisson un antibiotique censé relancer la régénération cellulaire, avec une mesure mensuelle de la glycémie par incision de l'extrémité de la queue. Les tests de motricité, de force et de mémoire se répètent tous les mois ou tous les deux mois jusqu'à la fin de leur vie. Le porteur qualifie ces procédures de non invasives et écarte de ce fait tout recours aux analgésiques, l'objectif annoncé étant de vieillir en meilleure santé.
Objectifs
L'objectif de cette étude est d'explorer une nouvelle approche pour ralentir le vieillissement et améliorer la santé en agissant directement sur nos cellules. Des recherches ont montré qu'il est possible de "réinitialiser" certaines cellules adultes et de les rendre plus jeunes (reprogrammation). Ce phénomène a été observé chez les souris et les humains, où ces cellules reprogrammées peuvent même contribuer à reconstruire des tissus et des organes. D’autres études ont révélé que lorsqu’on applique ce processus de manière temporaire chez des souris atteintes d'une maladie provoquant un vieillissement accéléré, leur état de santé s’améliore et leur espérance de vie s’allonge. Cependant, nous avons constaté qu’une seule intervention tardive n’a pas d'effet significatif sur la longévité et les organes. Nous pensons que l'accumulation de cellules trop âgées, qui ne fonctionnent plus correctement, pourrait empêcher ce processus de rajeunissement d’être pleinement efficace. C’est pourquoi notre projet vise à associer deux stratégies : Éliminer les cellules trop usées, qui pourraient gêner la régénération. Stimuler le renouvellement des cellules restantes, pour leur redonner une "seconde jeunesse". En testant cette combinaison chez la souris, nous espérons mieux comprendre comment ralentir le vieillissement et, à terme, trouver des pistes pour améliorer la santé au fil des années.
Bénéfices attendus
Nous pensons que le processus de rajeunissement des cellules pourrait être encore plus efficace s'il était associé à un traitement capable d’éliminer les cellules trop vieilles et dégradées. Pour vérifier cette hypothèse, nous allons observer de près les effets de cette approche chez des souris âgées. Nous examinerons leurs tissus au microscope, analyserons les différentes cellules présentes et étudierons certains marqueurs biologiques du vieillissement. Nous espérons ainsi constater non seulement une amélioration de la santé des tissus, mais aussi une augmentation de leur espérance de vie chez les souris recevant ces deux traitements combinés. Ce projet nous aidera à mieux comprendre les transformations qui accompagnent le vieillissement et à explorer une nouvelle approche pour limiter les maladies liées à l’âge. À terme, ces découvertes pourraient ouvrir la voie à des applications pour l’être humain. Si les résultats sont concluants, il pourrait être possible d’activer ce processus de rajeunissement grâce à des méthodes similaires à celles utilisées pour certains vaccins récents, ou encore via des traitements ciblés directement sur les organes ou tissus concernés (comme la peau, les muscles ou les articulations). Ce projet pourrait ainsi poser les bases d’une nouvelle approche pour vieillir en meilleure santé.
Procédures
Les interventions prévues pour les animaux seront les suivantes : - Suivi du poids et de la composition corporelle : Pesée hebdomadaire et mesure de la composition corporelle (méthode non invasive, 2 minutes de contention) tous les mois jusqu’à 18 mois, puis tous les 15 jours jusqu’à la fin de vie. - Surveillance de la glycémie : Une mesure mensuelle jusqu’à 20 mois sur 128 animaux, nécessitant une petite incision à l’extrémité de la queue pour prélever une goutte de sang (3 secondes). - Traitements pharmacologiques : Administrés via l’alimentation pour limiter les interventions – l’un dans les croquettes pour éliminer les cellules vieillissantes (pour 48 animaux, de 18 à 20 mois / pour 90 animaux de 18 mois jusqu'en fin de vie), l’autre dans l’eau de boisson pour stimuler la régénération cellulaire (pour 48 animaux de 2 à 20 mois / pour 32 animaux de 18 à 20 mois / pour 90 animaux de 2 mois jusqu'en fin de vie / pour 60 animaux de 18 mois jusqu'en fin de vie). - Évaluations fonctionnelles et comportementales : Tests de motricité (5 tests de 3 fois 5 minutes pour 128 animaux / 5 tests de 3 fois 5min puis 1 test tous les mois jusqu'en fin de vie pour 240 animaux), force physique (5 tests de 1 min pour 128 animaux / 5 tests de 1 min puis 1 test tous les 2 mois jusqu'en fin de vie pour 240 animaux) et mémoire (4 tests de 2 fois 10 minutes pour 128 animaux / 4 tests de 10 minutes puis 1 test tous les 2 mois jusqu'en fin de vie pour 240 animaux) réalisés à différentes étapes de l’étude.
Impact sur les animaux
Effets indésirables prévus sur les animaux : Vieillisement naturel et effets associé; Stress ponctuel lié aux tests de forces, motricité, comportement et suivi ; Douleurs Légères et ponctuelles (Biopsies, tatouage, mesure de la glycémie, injection d'anesthésique lors de la fin de procédure. Désagréments digestifs mineurs liés à l'utilisation d'un antibiotique dans l'eau de boisson pour stimuler la régénération cellulaire, mais rien de significatif n'a pu être observé dans les expériences passées avec les mêmes concentrations.
Devenir
Au terme des 20 premiers mois, un groupe de 128 animaux sera euthanasié afin de réaliser un large panel d’analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires. Les animaux restants seront gardés aussi longtemps que possible, jusqu'à leur mort naturelle, ou jusqu’à l’atteinte des points limites préalablement définis et enregistrés sur une grille de score.
Remplacement
Bien que la reprogrammation cellulaire ait déjà montré des effets positifs sur la santé et la longévité des souris, nos recherches indiquent qu’elle fonctionne moins bien chez les souris âgées. Cela semble être dû à l’accumulation de cellules usées qui perturbent le bon fonctionnement des tissus et empêchent le processus de rajeunissement d’agir efficacement. Ce projet vise à améliorer cette approche en éliminant ces cellules vieillissantes dans différents organes pour lever cet obstacle. Il permettra aussi d’étudier en détail l’impact de ces traitements sur les cellules et les molécules des organes, notamment sur les cellules responsables de la régénération des tissus. L’utilisation d’animaux est essentielle pour comprendre comment ces traitements influencent le vieillissement et évaluer leur potentiel pour améliorer la santé au fil du temps.
Réduction
Des travaux réalisé au sein de l’équipe ont démontré pour la première fois qu’il existait une différence de la réponse à la reprogrammation cellulaire entre les mâles et les femelles. Afin d’optimiser au mieux l’utilisation de tous les animaux produits, nous allons réaliser nos tests à la fois sur les mâles et les femelles. Le nombre de groupes a été réfléchi de sorte à avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus. Le nombre d’animaux par groupe a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques. Plusieurs tests statistiques seront envisagés afin d'analyser les données.
Raffinement
Afin des limiter au maximum les interventions et les nuisances dues aux différents traitements ces derniers ne seront administrés que par l’alimentation. Les procédures expérimentales étant non invasives, l’utilisation d’analgésiques ne sera pas nécessaire. L’ajout d’éléments d’enrichissement dans les cages sera systématiquement effectué. Un tunnel en plexi rouge permet à la fois de déplacer les animaux sans stress, et de les habituer à la contention pour la mesure de composition corporelle. Les animaux seront préalablement habitués aux tests de motricité. L’examen, hebdomadaire jusqu’à l’âge de vingt mois puis bi-hebdomadaire ensuite, (sauf incident avec un individu nécessitant plus d’attention ou de soins), de l’ensemble des souris sera effectué pour détecter et renseigner dans des fiches de suivi les premiers signes comportementaux de la douleur ou d’éventuelles anomalies. L’état de santé des animaux sera évalué et l’atteinte d’un point limite entrainera la mise à mort de l’animal. Les animaux seront pesés tous les 15 jours jusqu’à 18 mois puis chaque semaine. Dès les premiers signes de difficultés de déplacement ou de nutrition, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages. Enfin, nous avons fixé des points limites qui, lorsqu'ils seront atteints déclencheront l'arrêt du test ou l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
La reprogrammation permet de faire revenir des cellules adultes à un état plus jeune et moins spécialisé. Afin d’étudier l’impact de la sénescence sur la reprogrammation, les expérimentations et analyses seront réalisées sur des souris adultes. Le modèle souris permet d’étudier des animaux génétiquement modifiés et capables d’être reprogrammés lors de l’administration d’un traitement. Ainsi, les traitements (dans la nourriture ou l’eau de boisson) seront réalisés sur des animaux dont les signes de vieillissement commencent à se manifester (à partir 18 mois, équivalent à environ 60 ans en âge humain). La reprogrammation sera faite dès l’âge de 2 mois, ou bien sur des animaux déjà âgés de 18 mois.
Etude du cycle cellulaire dans des lignées de souris modifiées pour des gènes impliqués dans des maladies neurodéveloppementales
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles gestantes reçoivent une ou deux injections sous-cutanées de molécules qui marquent les cellules en division, contention et geste compris en cinq à dix secondes, puis sont tuées entre une heure et vingt-quatre heures plus tard pour récupérer leurs embryons. Ce sont ces embryons qui sont analysés, afin de mesurer si des mutations trouvées chez des patients atteints de troubles du neurodéveloppement modifient le cycle cellulaire des progéniteurs du cortex. Le porteur affirme que la complexité du cortex cérébral interdit toute approche in vitro, et compte parmi ses mesures de réduction le fait de combiner deux injections sur une même portée.
Objectifs
Notre recherche est axée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Des mutations dans un grand nombre de gènes ont été identifiées chez des patients ayant des troubles du neurodéveloppement. Notre objectif est de comprendre les rôles de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes associés à ces maladies, qui présentent aussi bien à des défauts de prolifération, de migration et de différenciation neuronale. Comprendre les mécanismes par lesquels les mutations entrainent la pathologie est crucial pour faciliter le diagnostic d’autres maladies et envisager un traitement. Pour comprendre comment les défauts neuronaux sont établis au cours du développement du cortex cérébral, nous adopterons une approche génétique visant à modifier l’expression ou la fonction des protéines étudiées. Nous utiliserons des souris modifiées pour des gènes trouvés comme mutés chez les patients. Nous garderons ces souris femelles et mâles à l’état hétérozygote, c’est à dire qu’elles auront toujours une copie du gène normale, et une copie portant la mutation. Nous les croiserons entre elles pour produire des embryons d’étude qui seront analysés avant la naissance, et dont nous ne saurons pas si les embryons portant la mutation sur les deux chromosomes auront un développement anormal. Cette étude permettra plus précisément de comprendre si la mutation présente chez les patients engendre des défauts au niveau du cycle cellulaire (s’il y a une différence en termes denombre de divisions ou de vitesse de division). Notre modèle d’étude est l’embryon de souris où la neurogenèse dans le cortex cérébral commence au cours du deuxième tiers de gestation et se poursuit jusqu’à la naissance. Il est connu qu’un dérèglement du cycle cellulaire durant le début de la neurogénèse peut avoir un impact sur le développement du cortex cérébral. Par exemple, un défaut de prolifération peut entrainer un deficit de progéniteurs neuronaux et par conséquent un déficit de neurones ce qui, à la naissance ou l’âge adulte peut entrainer des défauts variables (cerveau plus petit, troubles cognitifs etc…). Notre but est d’étudier si la mutation d’un gène précis étudié affecte le cycle cellulaire. Pour répondre à notre question, les mères gestantes recevront 1 ou 2 injection(s) de molécules qui s’intègrent toutes deux à l’ADN des cellules au moment de la réplication des chromosomes. Cela a pour but une analyse fine du cycle cellulaire.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de comprendre la fonction de gènes impliqués dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquels leur déplétion ou mutation conduit à des troubles du neurodéveloppement. Ce projet aura des retombées pour les patients. En effet, notre collaboration avec des cliniciens nous permet de tester par cette approche des gènes retrouvés chez des patients présentant des maladies du développement du cerveau. Nous pourrons voir si les mutations observées chez les patients atteints de troubles neurodéveloppementaux ont un impact sur le cycle cellulaire des neurones.
Procédures
Les femelles gestantes subiront une ou deux injection(s) sous cutanée(s) de molécule(s) qui vont marquer les cellules qui sont en train de se diviser (contention + injection 5-10 secondes).
Impact sur les animaux
La contention pour procéder à l’injection peut provoquer un stress à l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Les femelles sont mises à mort pour collecter les embryons.
Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement du cortex du cerveau qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération de gènes sur le développement embryonnaire cortical.
Réduction
Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique. Nous utiliserons un test statistique afin d’évaluer différents paramètres du cycle cellulaire des progéniteurs neuronaux portant la mutation par rapport aux contrôles (embryons non porteurs de la mutation et de la même portée). Les experiences seront choisies en fonction de la nature du gène étudié, de son profil d’expression et du phénotype observé chez les patients. Aussi toutes les expériences ne seront pas systèmatiquement éffectuées. Seules celles relevantes seront faites. De plus, nous allons combiner les injections pour étudier la sortie de cycle et la phase S sur une même portée (division par 2 du nombre de femelles utilisées pour ces 2 études).
Raffinement
Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal, notamment avec l’ajout de nid et de tunnel dans les cages d’hébergement. L’injection sera faite par du personnel qualifié. Nous utiliserons des aiguilles de très faible diamètre à usage unique. La mise à mort ayant lieu entre 1h et 24h après l’injection, une infection aura peu de chances de se développer.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris pour étudier les gènes impliqués chez des patients souffrant de troubles neurodéveloppementaux. Les étapes du développement du cerveau et du cycle cellulaire sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neurodéveloppementales chez l’homme. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par portée est couramment modifié génétiquement, ce qui nous permet de mimer les mutations observées chez l’homme. Les femelles gestantes seront utilisées à maturité sexuelle (jeune adulte/adulte) car elles doivent être gravides.
La thérapie génique pour la dystrophie musculaire congénitale dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Porteuses d'une mutation qui provoque une insuffisance cardiaque vers neuf mois chez les hétérozygotes et tue les homozygotes vers dix-neuf jours, les souris de cette lignée servent à tester trois approches de thérapie génique. 309 animaux au maximum sont concernés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 237 d'entre eux et modéré pour 72. Les souriceaux sont anesthésiés sur la glace à deux jours de vie, ce qui peut abaisser leur température corporelle, puis reçoivent une injection intraveineuse unique, la veine n'étant plus visible dès le troisième jour. Les souris reproductrices sont tuées à six mois avant l'apparition des symptômes cardiaques, et les souriceaux injectés à seize jours pour prélever leur cœur, leur foie et trois muscles des pattes.
Objectifs
Le projet a pour but d'évaluer et de comparer l'efficacité de 3 approches de thérapie génique dans des souris porteuses d'une mutation conduisant à une cardiomyopathie dilatée chez les souris hétérozygotes, et à une dystrophie congénitale associée à des problèmes cardiaques chez les souris homozygotes. Chez l'homme, les mutations de ce gène entrainent différentes pathologies, les plus nombreuses conduisant à une cardiomyopathie dilatée, associée ou non à une dystrophie musculaire (prévalence estimée à environ 9 individus sur 100.000). Le présent projet vient compléter un autre projet dans lequel les mêmes approches de thérapie génique ont été évaluées dans ces mêmes souris pour leur capacité à prolonger la survie des animaux et à corriger le phénotype. Suite aux résultats obtenus, de nouveaux prélèvements sont nécessaires afin de réaliser des études moléculaires et permettre de finaliser notre étude.
Bénéfices attendus
Les résultats de cet essai de thérapie génique permettront de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques dans cette maladie grave. D'autre part, si les résultats sont positifs, ils permettront d'avancer vers le développement d'une thérapie pour les patients pour lequels aucun traitement n'existe à l'heure actuelle.
Procédures
Des accouplements seront réalisés afin de générer les lots expérimentaux. En tout 8 accouplements en trio (1 mâle hétérozygote et 2 femelles hétérozygotes) seront réalisés. Afin de limiter l'appartition du phénotype cardiaque, les accouplements seront réalisés avec des animaux qui ont entre 2 et 6 mois (4 portées maximum par femelle). L'anesthésie des souriceaux (réalisée 1 fois à 2 jours de vie, avec une durée de 1 min) est susceptible d'induire une baisse de la thermorégulation. Suite à l'anesthésie, les souriceaux seront soumis à une injection intraveineuse (1 seule injection par souris, durée inférieiur à 1 min) est susceptible d'induire une douleur légère de courte durée.
Impact sur les animaux
A l'état hétérozygote, les souris développent une cardiomyopathie dilatée autour de 9 mois, entrainant une insuffisance cardiaque et à leur mort prématurée autour de l'âge de 1 an. Les souris homozygotes développent un retard de croissance généralisé, associée à une atteinte sévère des muscles squelettiques et cardiaque, conduisant à la mort prématurée des souriceaux autour de 19 jours. L'anesthésie des souriceaux sur la glace est susceptible d'induire une baisse de la thermorégulation. L'injection est susceptible d'induire une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les souris hétérozygotes en croisement seront euthanasiées à 6 mois, avant l'appartition des symptômes cardiaques afin d'éviter la survenue de souffrances non nécessaires. Les souriceaux injectés seront euthanasiées à l'âge de 16 jours afin de récupérer les différents organes nécessaire à tester l'efficacité des différentes approches thérapeutiques (coeur, foie, tibialis anterior, gastrocnemius, quadriceps).
Remplacement
Les outils thérapeutiques ont déjà été validés par des approches in vitro. Le recours à un organisme vivant est nécessaire pour étudier la bonne diffusion des virus thérapeutiques dans l'organisme entier et vérifier si l'expression des molécules thérapeutiques atteint le niveau nécessaire dans les différents organes d'intérêt afin d'empêcher le développement de la maladie. D'autre part, le recours à un organisme vivant est également nécessaire afin d'identifier d'éventuels effets indésirables tels qu'une réponse immunitaire.
Réduction
Ce projet nécessite l'utilisation de 309 animaux maximum. 1) Une partie du projet inclus des croisements afin de générer les souris nouveau-nées modèles de la maladie génétique chez lesquelles les approches thérapeutiques seront évaluées. Les accouplements contrôlés comprendront 21 souris. A l'issue de ces croisements, nous obtenons environ un quart de souris modèles de la maladie génétique. 2) Les 4 groupes de souris seront générés afin d'obtenir au moins 15 souris modèle de la maladie par groupe. Il nous faudra donc environ 60 souris par groupe, soit 240 souriceaux en tout. Etant donné que le nombre de souriceaux par portée et le nombre de souriceaux modèle de la maladie dans ces portées peuvent légèrement dévier des chiffres théroriques (obtenus pour un grand nombre de portée), nous demandons une autorisation pour un plus grand nombre d'animaux que le chiffre théorique, soit 288 souriceaux (au lieu de 240). Les croisements seront arrêtés dès que le nombre de 15 souris modèles de la maladie par groupe aura été atteint.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’isolement est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements de nidification et un bâton à ronger. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. La procédure est réalisée précocement afin d'éviter le développement du phénotype dommageable des animaux, de plus les injections sont réalisées sous anesthésie. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, croquette humidifiée et hydrogel etc.).
Choix des espèces
D'un point de vue génétique, les souris sont extrêmement proches de l'homme, permettant de reproduire les mutations du gène dans ce modèle animal, conduisant à des sympômes très similaires. Le modèle murin utilisé ici, généré par recombinaison homologue, a prouvé sa validité pour étudier le développement de la pathologie par de multiples publications. Les injections sont réalisées à 2 jours de vie car la veine n'est plus visible à 3 jours de vie (pigmentation) et l'injection n'est pas possible à un stade adulte due à la sévérité du phénotype conduisant au décès des souris homozygotes à 19 jours de vie. La procédure sera arrêtée à 16 jours de vie. Les souris hétérozygotes utilisées pour les accouplements permettent de générer les souris homozygotes nécessaire à ce projet. Ces accouplements sont limités dans le temps (entre 2 et 6 mois de vie), afin de limiter l'apparition du phénotype dommageable de ces souris (développement d'une insuffisance cardiaque autour de l'âge de 9 mois).
L’effet de différents types d’alimentation sur une maladie inflammatoire rénale chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
400 souris génétiquement modifiées pour développer une néphropathie à IgA vont être utilisées, toutes tuées à seize semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant douze semaines des croquettes enrichies en algues ou dépourvues de vitamine A, des antibiotiques dans l'eau de boisson trois fois par semaine pendant huit semaines, puis un gavage de bactéries trois fois par semaine pendant quatre semaines. Chaque semaine elles sont isolées cinq minutes dans une cage sans litière pour récupérer leurs urines et leurs fèces, l'opération étant répétée dans la journée si la quantité recueillie ne suffit pas. Le porteur écrit que la maladie ne leur cause aucune nuisance et que l'utilisation de la souris est "indispensable" pour apporter la preuve du concept avant des essais chez les patients.
Objectifs
La néphropathie à IgA (NIgA), une maladie rénale inflammatoire, est la plus courante en France et dans le monde. Elle a été décrite en 1968 par le professeur Berger. À ce jour, il n’existe pas de traitement pour guérir cette maladie, qui est devenue l’une des principales causes de perte de fonction rénale. Cela nécessite des traitements comme la dialyse (qui remplace la fonction des reins en filtrant le sang pour éliminer les déchets et l'excès de liquide) ou la transplantation de rein. La NIgA se produit lorsque le système immunitaire ne fonctionne pas correctement et attaque par erreur certaines protéines du corps. Cela entraîne une accumulation anormale d’une protéine (l'IgA) dans les reins. Avec le temps, cette accumulation provoque une inflammation qui peut endommager les reins et les empêcher de filtrer correctement le sang. Des modèles des souris génétiquement modifiées ont montré qu’elles développent une forme de la NIgA similaire à celle des humains. L'absence d’une protéine spécifique favorise l’accumulation de ces protéines dans les reins, ce qui accélère la progression de la maladie. Les causes exactes de la NIgA ne sont pas encore totalement comprises, mais des facteurs comme l’alimentation et la flore intestinale (l'ensemble des micro-organismes vivant dans notre corps, comme les bactéries) semblent jouer un rôle important. Ce projet de recherche cherche à mieux comprendre l’impact des régimes alimentaires et de la flore intestinale sur l’évolution de la NIgA. Par exemple, il étudie l’effet d’un régime riche en algues, qui modifie la flore intestinale et favorise des bactéries spécifiques. Ces bactéries sont retrouvées en plus grande quantité chez les patients atteints de NIgA. D’autres recherches montrent que l’élimination de la vitamine A de l’alimentation des souris améliore les symptômes de la maladie, en réduisant l’accumulation de protéines du système immunitaire dans les reins. L’objectif global de cette étude est d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques basées sur l’alimentation et la flore intestinale. Ces résultats, encore en phase préclinique, pourraient permettre le développement de nouvelles stratégies pour ralentir ou prévenir la progression de la NIgA, ouvrant ainsi la voie à de futurs essais cliniques chez les patients.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués, tels que l’effet de l’alimentation (riche en algues et déficiente en vitamine A) et de la flore intestinale dans une maladie inflammatoire rénale, la NIgA, afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de la NIgA.
Procédures
Pour étudier l'effet de l'alimentation (riche en algues ou carencée en vitamine A) sur la maladie de la NIgA, les souris seront nourries pendant 12 semaines avec des croquettes contenant des algues ou des croquettes dépourvues de vitamine A, disponibles en libre accès. Le poids des souris sera mesuré une fois par semaine pendant 16 semaines. Des prélèvements seront réalisés toutes les deux semaines pour les urines et chaque semaine pour les fèces pendant 16 semaines. Afin d'étudier l'interaction entre l'alimentation et les bactéries de la flore intestinale dans la maladie de la NIgA, les souris recevront des antibiotiques dans leur eau, trois fois par semaine pendant 8 semaines. A l’âge de 8 semaines, elles seront gavées avec des bactéries, trois fois par semaine pendant 4 semaines. Le poids des souris sera également mesuré chaque semaine dès le début de l'étude pendant 16 semaines. Les prélèvements seront effectués toutes les deux semaines pour les urines et toutes les quatre semaines pour les fèces pendant 16 semaines. Dans les deux cas, les prélèvements d'urine et de fèces seront réalisés sur des souris vigiles. Les souris seront isolées pendant 5 minutes dans des cages sans litière pour effectuer le prélèvement. Les échantillons d'urine seront collectés à l'aide d'une pipette dans la cage, après que les souris aient uriné d'elles-mêmes. Les échantillons de fèces seront également prélevés dans la cage après que les souris aient fait leurs besoins. Si les échantillons sont insuffisants, l'opération sera répétée au cours de la journée. Les prélèvements d'urine et de fèces seront réalisés le même jour. A l’âge de 16 semaines, les animaux seront euthanasiés conformément aux réglementations en vigueur. Un prélèvement sanguin sera effectué directement au niveau du cœur après la mort des animaux, et les reins, le foie, la rate et l’intestin seront récupérés pour analyse.
Impact sur les animaux
Toutes les souris utilisées ne présentent pas de problème de santé lié à la maladie. La NIgA ne cause pas de nuisances pour elles. Les bactéries ne sont pas des bactéries infectieuses. L’administration des antibiotiques n’a pas d’effet négatif sur les souris. Celles-ci ont bien toléré l’alimentation riche en algues. Les seules nuisances possibles pourraient être liées aux gestes du gavage, comme un stress temporaire ou un léger inconfort dû à l’introduction de la sonde gastrique.
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever le sang et différents organes pour réaliser les analyses et répondre à la question scientifique.
Remplacement
Les connaissances issues de cette étude ne peuvent pas être obtenues actuellement par d'autres méthodes de remplacement compte-tenu de la complexité de l’interaction entre le microbiote intestinale et la réponse inflammatoire (L’organisme fabrique des substances chimiques qui produisent une réponse immunitaire pour lutter contre l'infection ou guérir les tissus endommagés), et les effets rénaux qui nécessitent de travailler à l'échelle d'un organisme entier vivant. L'utilisation de modèle murin est donc indispensable pour montrer le rôle du microbiote apportant ainsi la preuve du concept et permettrait d'envisager des essais cliniques chez des patients.
Réduction
Les souris utilisées présentent un faible taux de mortalité. Nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables et statistiquement significatifs. Le nombre de souris par groupe a été fixé en tenant compte des différences possibles dans les effets de la NIgA. Ce calcul a été basé sur des résultats préliminaires et sur un calcul statistique.
Raffinement
Dans le respect de la loi des 3R et dans un souci de bien-être animal, des matériaux comme du coton et du kraft seront ajoutés dans les cages pour permettre aux animaux de faire des nids et éviter les comportements stéréotypés. Nous nous assurerons qu'aucun animal ne soit isolé durant l'expérience afin de préserver leurs groupes sociaux. Des seuils de sécurité, définis de manière précoce, ont été établis pour éviter toute douleur, souffrance ou angoisse chez les animaux. Ces seuils, basés sur des critères comme la variation du poids, l’apparence extérieure et les changements de comportement, permettront d’adapter les mesures prises : augmentation des observations, administration d'antalgiques renouvelables toutes les 12 heures, ou euthanasie anticipée si nécessaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel responsable, et les seuils de sécurité seront vérifiés une fois par semaine (état général et pesée). Lorsqu'un geste comme le gavage est effectué, les souris seront surveillées le lendemain pour vérifier leur état général. À la fin de l’expérience, tous les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Le modèle murin est le meilleur choix pour développer le modèle de néphropathie à IgA, similaire à celle de la NIgA chez l'homme. Cela nous permettra d'analyser et d'étudier les effets de la maladie avec des interactions entre le régime alimentaire et le rôle du microbiote. Cette espèce présente l'avantage d'être un petit mammifère dont la génétique est bien connue ce qui nous permet d'utiliser un modèle génétiquement modifié bien établi. Pour ce faire, nous utiliserons des souris âgées de 4 semaines, car l'alimentation a un impact sur la composition de la flore intestinale comme montré chez l'homme, dès le plus jeune âge.
Evaluation de l’effet neuroprotecteur de la photobiomodulation sur des modèles murins de la maladie de Huntington.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Reçues à trois semaines, dès le sevrage, 366 souris porteuses de mutations de la maladie de Huntington sont maintenues cinq jours par semaine dans une contention de quatre-vingt-dix secondes pour recevoir de la lumière sur la tête, puis soumises à un prélèvement sanguin tous les quinze jours et à des IRM sous anesthésie générale pouvant durer une heure. Si le traitement lumineux donne des résultats, une chirurgie de quatre-vingt-dix minutes implante dans leur cerveau un dispositif d'éclairage, avec une seconde intervention possible pour le retirer. Ces procédures relèvent d'un niveau de souffrance sévère, l'une des souches perdant progressivement la capacité de se déplacer, de se nourrir et de boire, avec une espérance de vie de trois mois. Toutes sont tuées, soit dès que les troubles moteurs dépassent une gêne modérée, soit à la fin, pour ouvrir leur cerveau et vérifier si la lumière a protégé les neurones.
Objectifs
Des études ont démontré que la lumière ralentie la maladie de Parkinson. La maladie de Huntington touche 6000 personnes en France. C’est une maladie génétique rare qui se traduit par la mort de neurones. Les symptômes handicapent grandement le quotidien des patients, et la maladie n’a pas à ce jour de traitement . La maladie de Huntington présente des similarités avec la maladie de Parkinson. Les objectifs de ce projet sont 1. d’évaluer sur des modèles souris de la maladie de Huntington si un traitement par la lumière permet de ralentir le développement de la maladie, au même titre que pour la maladie de Parkinson et 2. de préciser la région du cerveau la plus à même de recevoir le traitement.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra d’évaluer si le traitement par la lumière protège les neurones, comme cela a été observé dans la maladie de Parkinson. Les travaux seront aussi valorisés au travers de publications scientifiques et présentations en congrès. La deuxième partie du projet permettra de préciser les régions du cerveau les plus appropriées pour recevoir le traitement par la lumière. Si l’effet de protection des neurones par la lumière est avéré, comme il l’a précédemment été pour la maladie de Parkinson, des études complémentaires pouvant conduire jusqu’à un essai clinique, porteur d’espoir pour les patients, seront envisagées.
Procédures
Dans la première procédure, les animaux subiront une contention 5 jours par semaine de 90 secondes afin de permettre le traitement. Les animaux sont préalablement habitués à cette contention. Le traitement est indolore, et n’induit pas de gêne ou inconfort. Pour évaluer l’effet du traitement nous mesurerons les mouvements des animaux et leur mémoire (tests n’excédant pas 15 minutes) et feront des IRM réguliers (n’excédant pas 1 heure) : initialement puis pour les plus fréquents tous les mois (pour les animaux dont l’espérance de vie est réduite), et tous les 3-4 mois pour les animaux avec une espérance de vie normale. Les IRM seront réalisées sous anesthésie générale. Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront effectués tous les 15 jours. Si besoin un prélèvement de queue de quelques millimètres pourra être réalisé de facçon unique sur animal anesthésié pour sa caractérisation génétique. Les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale avec administration préalable d’antalgique dès que les symptômes moteurs de la maladie évolueront au delà d’une gêne modérée. Si l’efficacité du traitement est concluante, la deuxième partie du projet nécessitera une chirurgie (maximum 90 minutes) pour placer un implant délivrant de la lumière directement dans le cerveau, pour définir quelle région est la plus appropriée pour recevoir le traitement. En cas de besoin une seconde chirurgie pourra être réalisée pour retirer l'implant (maximum 15 minutes). Le traitement, permis par l’implant ne nécessitera plus de contention car la lumière sera contrôlé à distance. Les animaux seront évalués comme précédemment (même fréquence et durée pour les prélèvements sanguins, l’IRM et les tests comportementaux), et euthanasiés sous anesthésie générale avec administration préalable d’antalgique dès que les symptômes moteurs de la maladie évolueront au-delà d’une gêne modérée.
Impact sur les animaux
Certains modèles animaux Huntington utilisés conduisent naturellement à une perte progressive des possibilités de mouvement de l’animal ; l’animal se nourrit et boit moins facilement et perd du poids progressivement. Certains animaux ont une durée de vie plus courte que la normale, et ne peuvent plus se déplacer correctement en fin de vie. La contention pour illuminer la tête des animaux ainsi que la réalisation des tests comportementaux peut engendrer de façon temporaire, le temps que l’animal s’habitue à l’expérimentateur, à une peur légère. Le traitement en lui-même n’induit ni chaleur, ni douleur. La chirurgie induit de façon temporaire (24-48h) et maitrisée une douleur modérée du fait des points de suture. Par expérience, les animaux tolèrent ensuite bien le dispositif qui est adapté à leur morphologie. Si besoin une chirurgie pour retirer l'implant pourra être réalisée.
Devenir
Les animaux subiront un traitement par la lumière pour évaluer si cela permet de limiter le développement de la maladie de Huntington. Si les animaux de mise au point n’ont pas besoin d’être euthanasiés pour les mises au point sur pièce anatomique, ils seront utilisés dans les mises au point de la procédure 2. A l’issue de ces procédures, et en compléments des évaluations et de l’imagerie, les animaux seront euthanasiés pour récupérer leur cerveau pour évaluer si le traitement a protégé les neurones.
Remplacement
La littérature permet de savoir que le traitement par la lumière est efficace dans la maladie de Parkinson. C’est un élément très encourageant pour espérer obtenir des résultats positifs pour la maladie de Huntington, car ces 2 maladies ont de nombreux points communs. Les études des effets de la lumière sur des modèles cellulaires ont mis en évidence une difficulté de transposition des résultats obtenus sur les modèles physiologiques in vivo (absence d’effet, ou modalités d’illumination complètement différentes de celles effectives in vivo). Les effets du traitement par la lumière impliquent probablement un intermédiaire encore non identifié, et non présent dans les cultures de cellules, empêchant ainsi l’anticipation des effets de la lumière in vitro. L’évaluation des effets neuroprotecteurs du traitement dans le cadre de la maladie de Huntington nécessite donc une évaluation chez l’animal, d’autant plus pour mesurer l’impact sur les performances motrices et cognitives. Les modèles de souris étant bien décrits et facilement manipulables sont adaptés pour une première évaluation. Des souches de souris de même fond génétique sont utilisées pour les mises au point, car il n’est pas nécessaire d’utiliser une souche à phénotype dommageable pour mettre au point les différentes étapes de l’étude. La deuxième partie du projet permettra de limiter le nombre de gros mammifères qui seraient nécessaires dans une étude ultérieure.
Réduction
Les données seront analysées par des tests statistiques. Des animaux au phénotype non dommageable seront utilisés pour les mises au point afin d’optimiser l’utilisation des animaux Huntington. La phase de mise en place sera stoppée dès que toutes les procédures seront maitrisées et reproductibles sur 3 animaux consécutifs. Les animaux n’ayant pas besoin d’être euthanasiés à l’issue des mises au point de la première procédure seront utilisés pour la procédure 2. L’évaluation des effets du traitement nécessite 2 souches complémentaires de souris Huntington, et des contrôles associés au phénotype non dommageable. On estime à 10% le nombre de souris qui seront euthanasiées précocement ne permettant pas de recueillir les données de façon adéquate. Deux types distincts et incompatibles d’analyse des pièces anatomiques sont nécessaires. La deuxième partie du projet ne sera réalisée que si les résultats de la première partie sont concluants. Elle reproduira la première étude en comparant 3 régions du cerveau pouvant recevoir le traitement (traitement localisé). Le total maximal de souris nécessaires pour ce projet sera de 366.
Raffinement
Les animaux seront surveillés de façon journalière. Le traitement, les tests et l’IRM ne sont pas douloureux ; une habituation préalable à la contention et aux expérimentateurs permettra de réduire le stress des animaux. Les IRM seront effectuées sous anesthésie générale. Les animaux réintègreront leurs groupes sociaux dès les tests effectués. Dans la deuxième partie du projet, les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et traitement antalgique. De l’hydrogel sera mis dans la cage et les animaux pesés chaque semaine pour évaluer et limiter la perte de poids naturelle de ces souris (du fait de la maladie). Les euthanasies seront effectuées sous anesthésie générale et antalgie, dès que les points limites sont atteints permettant de limiter la durée pendant laquelle la souffrance due au phénotype dommageable atteint un stade sévère.
Choix des espèces
L’effet d’un traitement et son impact sur les mouvements, la mémoire et l’espérance de vie, ne peut s’évaluer que sur un organisme entier. Les souris sont des modèles bien connus, et une première évaluation ne nécessite pas d’organisme plus évolué. La littérature permet de bien connaitre les modèles d’étude, et d’adapter le protocole pour évaluer l’impact de notre traitement. Les animaux seront réceptionnés à l’âge de 3 semaines afin d’être sevrés, et de démarrer le traitement en phase précoce de développement de la maladie, l’espérance de vie étant assez courte (3 mois) pour l’une des souches, et les symptômes de la maladie apparaissant assez rapidement, comme c’est le cas dans la maladie humaine.
Imagerie cérébrale fonctionnelle dans des modèles souris de modifications de la maturation des protéines
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une biopsie du bout de la queue, des injections, une chirurgie de quarante-cinq minutes et des séances d'imagerie de trente minutes attendent 160 souris, toutes tuées ensuite pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La moitié relève de la souffrance légère, l'autre de la souffrance modérée. L'étude, qualifiée de pilote, porte sur des étapes de maturation des protéines de surface des neurones et prépare des expériences ultérieures sur des modèles de maladies neurologiques. Ni la nature de la chirurgie, ni le nombre de séances d'imagerie, ni le contenu des injections ne sont précisés, et sur les effectifs le porteur écrit seulement qu'ils sont déterminés et analysés avec des tests statistiques adaptés.
Objectifs
Le développement et la fonction des neurones requiert la biogenèse de nombreuses protéines de surface qui permettent aux neurones de percevoir et d’interagir avec leur environnement. Des travaux précédents montrent que des étapes spécifiques de la maturation des protéines ne sont pas nécessaires pour la production de protéines de surface fonctionnelles par les neurones, contrastant avec d’autres types cellulaires où ces étapes sont requises. Ces étapes de maturation régulent la transmission neuronale et la plasticité fonctionnelle du cerveau et sont altérées dans plusieurs maladies neurologiques ou psychiatriques. Les mécanismes cellulaires sous-jaccents sont cependant encore mal caractérisés. Des études entendues de ces processus ont été réalisées dans des modèles de culture cellulaire à l’aide d’agents pharmacologiques. Nous souhaitons maintenant étudier ces processus dans des modèles de souris génétiquement modifiées. Ce projet de recherche fondamentale permettra de mieux comprendre les bases cellulaires de ces variations, contribuant ainsi in fine à l’identification de nouveaux biomarqueurs ou de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les expériences réalisées nous permettront de préciser le rôle d’étapes importantes de la synthèse des protéines de surface des neurones, un mécanisme cellulaire fondamental, apportant des informations manquantes sur les causes responsables des dérégulations de ce processus qui sont observées dans de nombreuses maladies humaines sévères et actuellement non ou difficilement traitables.
Procédures
Biopsie du bout de la queue (quelques secondes), injections (quelques secondes). Chirurgie sous analgésie et anesthésie (45min). Séances d'imagerie (30 min).
Impact sur les animaux
Douleurs de quelques secondes lors des injections IP et SC et de la biopsie de la queue. Douleur post-opératoire modérée minorée par des antalgiques. Stress léger lié au bruit modéré lors des séances d'imagerie ultrasonore minoré par habituation des animaux au dispositif.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvement et préservation de leur cerveau pour analyse post-mortem.
Remplacement
Les études qui seront réalisées font suite à des études étendues de ces processus dans des systèmes de culture cellulaire. Il est maintenant essentiel d’étudier ces mécanismes in vivo dans des neurones intégrés dans leur environnement tissulaire complexe pour étudier plus avant leur rôle physiopathologique.
Réduction
Nous réalisons ici une étude pilote sur un nombre relativement restreint d’animaux qui nous permetterons de tester la faisabilité d’expériences projetées dans des modèles de neuropathologies. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les résultats de cette étude pilote nous permettront d’optimiser nos procédures pour des analyses futures plus étendues. Les souris seront élevées en groupes sociaux dans des cages comprenant du matériel de nidification (enrichissement). Un personnel formé au bien-être animal surveille les animaux tous les jours. L’apparition de signes de stress ou de douleur sera attentivement suivie et la poursuite des expériences déterminées en fonction d’une évaluation régulière de points limites appropriés. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour prévenir la douleur des animaux.
Choix des espèces
La souris a été choisie car c’est un modèle de référence dans notre champs d'étude. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. Une autre raison pour utiliser la souris est la possibilité de manipuler des types précis de cellules chez des animaux transgéniques. Les animaux seront utilisés entre 10 jours et 6 mois de vie, stades les plus appropriés pour l'identification des animaux et l'étude de la plasticité cérébrale.
Restaurer la dynamique des interactions hippocampo-corticales pour réduire les troubles cognitifs au cours du vieillissement normal : vers le développement de nouvelles approches non-invasives
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
182 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune privée d'eau en dehors d'une heure trente par jour pendant trois semaines, et cela à trois reprises au cours de sa vie, à cinq, douze et dix-huit mois. Un second groupe subit en plus une chirurgie stéréotaxique de trois heures sous anesthésie générale, à quatre mois, pour implanter un dispositif d'enregistrement, puis reçoit une heure de stimulation visuelle par jour pendant trente jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les souris s'adaptent bien à la restriction et stabilisent leur poids autour de 92 % du poids initial, et qu'il a retenu cette privation d'eau parce qu'elle stresse moins qu'une privation de nourriture. La stimulation lumineuse est annoncée comme totalement non invasive et transposable rapidement aux personnes âgées, quand l'usage immédiat consiste à ouvrir le crâne de souris pour enregistrer leur activité cérébrale.
Objectifs
Le vieillissement normal s'accompagne souvent de troubles de la mémoire qui affectent la qualité de vie des personnes âgées. Ces troubles touchent particulièrement la mémoire de travail, qui nous permet de maintenir temporairement des informations en mémoire pour guider nos actions. Cette fonction repose sur la communication entre deux régions cérébrales principales : l'hippocampe, impliqué dans la mémoire, et le cortex préfrontal, essentiel à la prise de décision. Des études récentes suggèrent que les troubles de la mémoire liés à l'âge pourraient résulter d'une perturbation de la communication entre ces régions cérébrales. Notre projet vise à comprendre précisément comment cette communication évolue au cours du vieillissement normal et comment ses altérations conduisent aux troubles de la mémoire. De manière innovante, nous testerons si une stimulation visuelle à une fréquence spécifique, dont nous avons démontré qu'elle augmente significativement la dynamique cérébrale, pourrait restaurer une communication normale entre ces régions cérébrales et ainsi améliorer la mémoire. Ce projet est rigoureusement conçu en conformité avec les principes des 3 R (Réduction, Raffinement, Remplacement). Les animaux seront soumis à une surveillance quotidienne et bénéficieront de soins méticuleux dans des conditions expérimentales strictement contrôlées. Une analyse statistique robuste justifie l'utilisation de 182 souris sur une période de 5 ans pour l'exécution complète de l'étude. Les résultats de ce projet pourraient ouvrir la voie au développement de nouvelles approches thérapeutiques non-invasives pour maintenir les capacités cognitives au cours du vieillissement normal.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux responsables du déclin cognitif lié à l'âge, tout en ouvrant de nouvelles perspectives thérapeutiques facilement transposables chez l'humain. En effet, la stimulation visuelle rythmique étant totalement non-invasive, elle pourrait rapidement être adaptée en une intervention thérapeutique pour maintenir les capacités cognitives des personnes âgées. Les résultats de ce projet pourraient donc ouvrir la voie au développement de nouvelles approches thérapeutiques non-invasives pour maintenir les capacités cognitives au cours du vieillissement normal.
Procédures
Le premier groupe sera soumis à des tests comportementaux à trois âges différents (5, 12 et 18 mois). Chaque période de test comprend une restriction hydrique (accès à l'eau 1h30 par jour pendant environ 3 semaines), deux jours d'habituation au dispositif (10 minutes par jour) suivis des sessions d'apprentissage et de test (16 essais par jour). Le second groupe sera soumis à une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale (environ 3h) à l'âge de 4 mois, suivie du même protocole comportemental. À 12 mois pour un premier sous-groupe ou 18 mois pour un second sous-groupe, les animaux recevront une stimulation visuelle quotidienne pendant 30 jours (1h de stimulation encadrée par 1h avant et 1h après dans une pièce calme). Les animaux subissent également une injection pour l’anesthésie
Impact sur les animaux
La chirurgie peut induire de la douleur et une altération temporaire de l'état de santé des animaux. La restriction hydrique nécessaire aux tests comportementaux peut causer un inconfort modéré. Cependant, nos données montrent que les souris s'adaptent bien à ce protocole avec une stabilisation du poids à environ 92% du poids initial. Cette approche a été choisie car elle est moins stressante qu'une restriction alimentaire. L’injection ip d’anesthésique peut induire une douleur aigüe de courte durée
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever le tissu cérébral fixé
Remplacement
Notre projet vise à étudier l'évolution des interactions hippocampo-corticales au cours du vieillissement normal et leur impact sur la mémoire de travail spatiale. Ces processus reposent sur des interactions dynamiques complexes entre structures cérébrales qui ne peuvent être reproduites in vitro ou par des simulations informatiques. De plus, l'étude du vieillissement normal nécessite un suivi longitudinal qui ne peut être réalisé que chez l'animal.
Réduction
Le nombre d'animaux dans chaque groupe représente le minimum nécessaire, déterminé grâce à une analyse statistique rigoureuse. Cette analyse prend en compte plusieurs facteurs importants incluant la variation naturelle du comportement chez la souris ou la mortalité naturelle due au vieillissement. Le nombre d'animaux choisi nous permet donc d'obtenir des résultats scientifiquement valables malgré ces contraintes.
Raffinement
La chirurgie sera opérée sous anesthésie gazeuse supplémentée par une couverture analgésique locale par injection sous-cutanée au niveau de la zone d’incision chirurgicale. Une pommade d’anesthésique local limitera les douleurs aux oreilles dues aux barres d’oreilles, l’ajout de pommade à base de vitamine A limitera le dessèchement oculaire. Pendant la chirurgie une injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien assurera l’analgésie et il sera ajouté au biberon pendant 1 à 3 jours pour assurer l’analgésie post-opératoire. Enfin, la température corporelle sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté. La lutte contre l’hypothermie se poursuit jusqu’au réveil complet de l’animal en plaçant sa cage sous une lampe chauffante. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience par du personnel formé, plus particulièrement avec une observation détaillée la semaine suivant la chirurgie. En amont des expériences, les animaux seront familiarisés à la manipulation par l’expérimentateur afin de diminuer le stress. Ils seront également habitués à l’utilisation d’une boite (plutôt qu’un tunnel qui abimerait le dispositif électrophysiologique) pour le transport de l’animal depuis sa cage d’hébergement au dispositif expérimental et viceversa.
Choix des espèces
Nous utilisons la souris comme modèle car son cerveau présente des similarités importantes avec celui de l'humain, particulièrement pour les régions impliquées dans la mémoire. Nous avons choisi une lignée de souris (CD1) qui, comme les humains, présente une diversité génétique naturelle. Ceci est particulièrement important pour étudier le vieillissement, qui varie d'un individu à l'autre. L'étude suivra les souris de l'âge adulte (4-5 mois) jusqu'à un âge avancé (18 mois). Cette période nous permet d'observer l'évolution complète des capacités cognitives : depuis l'état optimal chez le jeune adulte, en passant par l'apparition des premiers changements (12 mois), jusqu'au vieillissement plus marqué (18 mois).
Rôle des glucocorticoïdes dans la régénération musculaire
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Une injection de cardiotoxine dans chacun des deux tibias détruit le muscle de souris endormies à l'isoflurane, après cinq jours d'injections quotidiennes de tamoxifène et avant jusqu'à sept jours d'injections de glucocorticoïdes. 3 400 souris mâles vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur affirme n'attendre aucun effet secondaire majeur et décrit des procédures qui n'entraînent généralement pas de souffrance, alors que le protocole repose sur la destruction chimique des muscles des pattes et sur un prélèvement sanguin qu'il chiffre à 25 % du volume corporel juste avant la mise à mort. Celle-ci consiste en une perfusion de paraformaldéhyde dans le cœur sous anesthésie à la kétamine, pour fixer d'un coup tous les organes.
Objectifs
Dans le cadre d’une blessure les glucocorticoïdes comme la cortisone peuvent être prescris pour leurs effets anti-inflammatoires efficaces mais dont la prise prolongée peut induire une perte de la masse musculaire. Les études sur les effets des glucocorticoïdes réalisées in vitro sur des cellules en culture montrent des résultats souvent contradictoires. Ainsi, malgré cette utilisation courante le mode d’action précis grâce auquel les glucocorticoïdes produisent leurs effets bénéfiques comme délétères sont encore mal connus. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les glucocorticoïdes sont impliqués dans la dégénérescence et la régénération musculaire via certain type de cellule immunitaire. Cette étude permettra aussi de mieux décrire, in vivo, le lien entre une partie du système immunitaire et les cellules souches du muscle. Enfin, grâce à ce projet nous espérons pouvoir identifier le meilleur moment pour administrer les traitements aux glucocorticoïdes en évitant les effets secondaires indésirables.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle des glucocorticoïdes dans des conditions physiologiques de régénération musculaire. Ce projet permettra aussi de décrire les effets induits par des traitements aux glucocorticoïdes. Nous pourrons ainsi disséquer les conséquences d’un potentiel dysfonctionnement du système immunitaire sur les processus d’inflammation mais aussi les conséquences sur la réparation des fibres musculaires. En comprenant les cibles et le rôle précis des glucocorticoïdes des traitements pourront être développer pour cibler un type cellulaire en particulier et être administrés au moment adéquat.
Procédures
Les animaux vigiles, c’est-à-dire non anesthésiés, seront soumis principalement des injections de différents types ne nécessitant pas de contention de plus de 30 secondes. Une première vague d’injection de tamoxifène, permettant l’invalidation du récepteur des glucocorticoïdes, sera réalisée une fois par jour pendant 5 jours. Ensuite, l’induction de la lésion musculaire se fera sur des animaux endormis à l’aide d’un gaz à savoir l’isoflurane. Les animaux endormis recevront une injection unique de cardiotoxine dans chacun des tibias. Une fois l’animal endormi cette procédure dure environ 1,5 minute. Durant la régénération musculaire, les traitements par glucocorticoïdes seront réalisés grâce à une injection par jour sur une période allant de 1 à 7 jours maximum. L’injection unique d’une molécule, pour visualiser la prolifération cellulaire, sera réalisée par injection sur des animaux vigiles deux heures avant leur mise à mort. Le prélèvement de sang sera réalisé via l’artère temporo-mandibulaire sur des animaux vigiles juste avant leur mise à mort et représentera 25% de leur volume corporel. Enfin, pour l’anesthésie létale les animaux vigiles seront injectés avec un mélange de xylazine/kétamine afin de subir une chirurgie. Cette dernière consiste à réaliser une perfusion de paraformaldéhyde intracardiaque cœur afin que le système circulatoire permette au fixateur d’atteindre tous les organes. Cette technique permet de fixer et préserver les tissus de manière homogène.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant. En effet, 7 jours de traitement aux glucocorticoïdes ne provoquent normalement pas d’atrophie musculaire. Ainsi, nous n’attendons pas d’effets secondaires majeurs causés les molécules injectées. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).
Devenir
A l'issue de la procédure tous le animaux expérimetaux seront mis à mort pour réaliser des analyses moléculaires et histologiques.
Remplacement
Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes endogènes et synthétiques (dexaméthasone) sur la régénération musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, lors de la régénération musculaire, les cellules du système immunitaire provenant de la circulation sanguine sont impliquées mais aussi d’autres facteurs comme les hormones. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un animal entier afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte (exemple : niveaux d’hormones circulantes). Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils nécessaires pour mener à bien cette étude. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production d’un nombre assez important d’individu, contribuant à la production de résultats significatifs.
Réduction
De nombreuses études menées au laboratoire sur la régénération musculaire ont mené à une bonne connaissance du modèle ainsi que des traitements à réalisés. Ainsi, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement et disposons de protocoles précis pour chaque expérimentation. Par ailleurs, les deux pattes des souris seront systématiquement utilisées afin de réduire de moitié le nombre d'animaux requis.
Raffinement
Dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Néanmoins, si l’un des animaux atteint un point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort par afin d'éviter toute souffrance inutile. Par ailleurs, après injection, les souris seront attentivement suivies. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …). De plus, le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’administration du composé induisant un dommage musculaire. Enfin, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement pouvant entrainer des effets secondaires délétères sur les animaux.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude. Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront des mâles entre 10 et 30 semaines. La régénération musculaire se faisant en plusieurs étapes, nous effectuerons une cinétique. Nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la dégénérescence musculaire et l’inflammation en analysant les souris à 1, 3, 5 , 7, 14, 28 et 60 jours après injection de la cardiotoxine. Un groupe d’animaux sera également analysé en l’absence de traitement à la cardiotoxine. Pour la majorité des expérimentations nous utiliserons les souris de la lignée LysM-Cre, cette Recombinase Cre étant constitutive elle ne nécessite pas d’injection au tamoxifène. Néanmoins, si nous observons des phénotypes sur ces souris, nous voudrions exclure une cause développementale c’est pour cela qu’il nous sera indispensable d’utiliser une seconde lignée inductible LysM-CreERT2. Il est difficile à cette étape de prévoir à quel stade nous utiliserons ces souris car cela dépendra du phénotype des souris issues de la lignée LysM-Cre. Amendement Nous voulons ajouter trois modèles. Deux modèles dans lesquels GR est invalidé dans la fibre musculaire de manière constitutive (HSA-Cre) ou inductible (HSA-CreERT2). Le second modèle proviendra d’un fournisseur agrée de souris ayants subies une surrénalectomie. Nos résultats préliminaires montrent la nécessité d'étudier des stades intermédiaires, à savoir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 28, 40, 60 et 80 jours après l’injection de cardiotoxine, sans se limiter aux précédemment stades mentionnés.
Étude des myopathies chez la souris : rôle d’une protéine impliquée dans le métabolisme des cellules souches musculaires
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Dix à quinze minutes d'anesthésie pour mesurer une force musculaire puis provoquer une fatigue du muscle, une seule fois par animal : 700 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles absorbent pendant cinq jours une substance mélangée à un gel alimentaire qui supprime une protéine dans leurs cellules souches musculaires, l'objectif étant de comprendre la régulation de ces cellules dans la dystrophie musculaire de Duchenne. Le porteur attend un vieillissement accéléré des muscles, une perte de masse musculaire et une réduction de la mobilité, conséquences qu'il dit non encore caractérisées. Il précise que ces souris ne présentent pas les symptômes des patients, se déplacent, se reproduisent et vivent normalement, et retient malgré cela ce modèle parce que leurs muscles ressemblent à ceux de l'être humain.
Objectifs
Le muscle se régénère complètement après une lésion grâce aux cellules souches musculaires. A la détection d’une blessure, elles produisent de nouvelles fibres musculaires en s’activant, s’expandant, se différenciant puis en fusionnant entre elles. Les cellules souches musculaires s’adaptent aux différents changements au cours de ces étapes, grâce à leur métabolisme. Cependant, l’activité de ces cellules souches musculaires est défectueuse chez des patients atteints de Dystrophie musculaire de Duchenne. Cette maladie est dégénérative. Elle est causée par l’absence d’une protéine dans le muscle, ce qui le rend extrêmement sensible aux blessures à la moindre contraction. Cela entraîne le recrutement constant des cellules souches musculaires, qui n’arrivent pas à réparer le muscle correctement. En conséquence, les patients atteints de cette maladie perdent la capacité de marcher après une dizaine d’années de vie et meurent par insuffisance cardiaque ou respiratoire. Aucun traitement n’existe actuellement, les thérapies actuelles réduisent les symptômes, mais ont de lourds effets indésirables. Il y a donc une nécessité d’étudier plus profondément cette maladie, pour pouvoir développer d’autres approches thérapeutiques dans le futur. Notre projet consiste donc à étudier le rôle d’une protéine dans la régulation métabolique des cellules souches musculaires dans un modèle de souris mimant la Dystrophie musculaire de Duchenne. Ce modèle de souris est cependant moins impacté que les patients atteints de la maladie. En effet, ces souris se déplacent, se reproduisent et vivent normalement. Cependant, leurs muscles ont une fonction altérée et des signes de lésions. Nous pouvons donc nous servir de ce modèle pour étudier la régulation métabolique des cellules souches musculaires. En enlevant une protéine d’intérêt dans les cellules souches musculaires de ce modèle, nous déterminerons son rôle dans la régulation des cellules souches musculaires dans la Dystrophie musculaire de Duchenne. Ce projet permettra ainsi de mieux comprendre comment sont régulées les cellules souches musculaires dans cette maladie. Ce travail supportera le développement de stratégies thérapeutiques ciblant les cellules souches musculaires, pour améliorer durablement la qualité de vie des patients.
Bénéfices attendus
Le projet vise à améliorer les connaissances sur les régulations métaboliques des cellules souches musculaires dans la dystrophie musculaire de Duchenne. Étant donné qu’il n’existe actuellement pas de traitement pour soigner cette pathologie, apporter de nouvelles connaissances est primordial afin d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques pour la prise en charge de cette pathologie. Nous déterminerons pour la première fois comment les cellules souches musculaires sont métaboliquement altérées dans la DMD. Notre étude permettra ainsi le développement de futures stratégies thérapeutiques ciblant les cellules souches musculaires pour améliorer durablement la qualité de vie des patients.
Procédures
Un groupe de souris sera soumis à une mesure de force et à une stimulation musculaire au cours de leur vie, sous anesthésie générale. L’intervention ne dure que 10 min maximum et la potentielle douleur ressentie lors de la stimulation musculaire sera prise en charge par l’administration d’un anti-douleur en amont.
Impact sur les animaux
Le fait d’enlever une protéine dans les cellules souches musculaires de modèle de souris de la dystrophie musculaire de Duchenne peut avoir des conséquences, qui ne sont pas encore caractérisées. Nous nous attendons à un vieillissement accéléré des muscles, se traduisant par une perte de la masse musculaire et une réduction de la mobilité de l’animal. Nous souhaitons analyser la force musculaire de ces souris. Pour cela, les animaux doivent être anesthésiés pour une durée totale de 10-15min, le temps de mesurer la force musculaire et de réaliser un test de fatigue musculaire. Le test de fatigue musculaire peut entraîner une légère douleur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée du tissu musculaire, qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.
Remplacement
Ce projet découle de précédents résultats montrant l’implication d’une protéine dans l’activité déréglée des CSM dystrophiques. Cependant, l’étude des cellules souches musculaires est complexe, elles interagissent avec d’autres cellules et des molécules au sein du muscle. Ainsi, étudier la régulation métabolique de ces cellules en culture devient vite limité, puisque nous ne pouvons mimer correctement toutes les interactions et signaux présents dans le muscle. Ainsi, l’expérimentation animale est indispensable pour déterminer les fonctions de cette protéine en analysant les tissus, cellules et molécules.
Réduction
L’utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire au projet. Plusieurs échantillons seront prélevés post-mortem sur le même animal pour optimiser le nombre d’animaux utilisés. Certains échantillons post-mortem peuvent être analysés dans différentes procédures, ils seront donc réutilisés pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Des analyses statistiques ont été faites pour estimer le nombre d’animaux nécessaires à différentes expériences. Le nombre d’animaux a également été calculé sur la base de précédents résultats et selon le nombre d’expériences planifiées.
Raffinement
Les souris absorberont pendant 5 jours une substance permettant la suppression de notre protéine d’intérêt au sein des cellules souches musculaires. Cette substance sera mélangée à un gel alimentaire qui remplacera les croquettes habituelles des souris. Cela permet d’éviter les injections de cette substance, cause de stress et d’inflammation chez l’animal. Les souris seront acclimatées à ce changement de nourriture une semaine à l’avance. Les souris seront surveillées et pesées quotidiennement lors de la durée du traitement et hebdomadairement après traitement. Cette surveillance s’effectue grâce à l’établissement de différents critères, se basant sur l’aspect et le comportement de l’animal. Cela permettra de prendre en compte et minimiser le moindre signe de douleur ou de mal-être de l’animal, en adaptant les conditions d’hébergement. Pour suivre les cellules souches musculaires en activité dans le muscle en analyse post-mortem, nous administrerons une autre substance aux souris, qui se fixera sur les cellules en activité. Pour éviter les injections, cette substance sera mélangée à l’eau de boisson des souris, qui contiendra 1% de glucose, pour donner un léger goût sucré. Les souris seront acclimatées à ce changement d’eau de boisson (1% de glucose) une semaine avant traitement. Cette substance n’est pas connue pour entraîner des effets indésirables chez les animaux après un mois d’administration. Lors de l’analyse de la force musculaire, les animaux seront anesthésiés puisque cette procédure nécessite l’immobilisation de l’animal. La mesure de force et le test de fatigue seront réalisés consécutivement sur le même animal, sous une seule anesthésie, grâce à un dispositif permettant de réaliser ces deux mesures, de façon concomitante. Cela réduit ainsi le nombre d’animaux utilisés, et la qualité des résultats en est améliorée. La procédure dure environ 10-15 min et ne sera effectuée qu’une seule fois par animal. Un anti-douleur sera administré lors de l’anesthésie, pour éviter toute légère douleur pouvant être causée par le test de fatigue.
Choix des espèces
Le modèle de souris de la Dystrophie musculaire de Duchenne ne présente pas de symptômes contrairement aux patients atteints de DMD. Toutefois, les muscles de ces souris présentent des signes de régénération et de lésions, plus ou moins importants au cours de leur vie. Cela n’empêche cependant pas les animaux de se déplacer, de se reproduire et de vivre normalement. Nous utilisons un modèle de souris puisque les muscles, par leur structure et leur fonctionnement, ressemblent aux muscles de l’Homme. Pour mieux caractériser le rôle de notre protéine d’intérêt, nous analyserons les conséquences de son absence dans les cellules souches musculaires, à différents âges des souris, correspondant aux différents stades de progression de la maladie. A 3 semaines d’âge, les muscles des souris ne présentent aucun signe de lésion ou de régénération. Enlever notre protéine d’intérêt à ce moment-là, nous permettrait ensuite d’observer comment les cellules souches musculaires se comportent à 8-12 semaines d’âge, période où ces cellules sont normalement fortement sollicitées pour réparer/régénérer le muscle. Une autre stratégie de ce projet consiste à enlever notre protéine d’intérêt à la fin de la période où les cellules souches musculaires sont fortement sollicitées, entre 10 et 12 semaines d’âge. Nous observerons ensuite les conséquences de l’absence de cette protéine sur le long terme, de 5-6 mois à 15-17 mois d’âge, correspondant au début et à la fin de la phase dite de « faible intensité » de la maladie chez ces souris.
Développement d’un modèle syngénique d’hépatoblastome chez la souris et suivi du développement tumoral par IRM (EU2/2). AMENDEMENT1
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, 1 515 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, afin d'établir un modèle d'hépatoblastome, cancer du foie de l'enfant, chez des souris au système immunitaire intact. Une partie subit une chirurgie abdominale ou lombaire pour une injection dans le foie ou la rate, ou la greffe d'un fragment tumoral dans le foie. Toutes subissent jusqu'à dix prélèvements sanguins, vingt échographies sous anesthésie et deux séances d'IRM qui imposent un transport vers un autre établissement, et des vecteurs viraux sont injectés à des souriceaux avant la naissance puis à deux, cinq et quinze jours de vie. Le porteur écrit que le développement des tumeurs hépatiques n'entraîne pas de nuisances en soi, parce que les souris seront tuées avant que ces tumeurs ne dégradent leur état général.
Objectifs
L’hépatoblastome (HB) est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. La survie globale à 5 ans actuellement est de 80 pour cent. Le traitement associe de la chimiothérapie à base de Cisplatine à une résection chirurgicale de la tumeur. Mais 20 pour cent des enfants traités vont développer une résistance au Cisplatine au cours de la chimiothérapie néoadjuvante ou au cours de la récidive de la maladie. Il existe actuellement peu d’alternatives thérapeutiques, avec des données insuffisantes sur les alternatives proposées. Il est donc crucial de pouvoir tester de nouvelles associations de traitement ou de nouveaux traitements. Les modèles pré-cliniques d’hépatoblastome qui existent aujourd’hui sont réalisés sur des souris nude, souris immunodéprimées, chez qui un fragment d’HB humain, ou des suspensions cellulaires issues de culture cellulaires d’HB sont implantés en sous cutané ou en situation orthotopique, c’est-à-dire directement dans le foie. Cependant le système immunitaire a un rôle primordial dans la réponse anti-tumorale. Il est donc très important de développer des modèles syngéniques d’hépatoblastomes chez la souris immunocompétente afin de pouvoir, une fois le modèle établi, étudier l’effet de nouveaux traitements et également étudier la réponse immunitaire impliquée dans la réponse anti-tumorale. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Notre équipe s’intéresse à deux grands types de tumeurs malignes du foie : les carcinomes hépatocellulaires (CHC) principalement développés chez l’adulte et les hépatoblastomes (HB) qui se développent chez l’enfant de moins de 5 ans. L’HB est une maladie rare mais c’est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. L'incidence est de 1 à 1,5 /1000000 d'enfant de moins de 15 ans, et cette incidence est en cours d'augmentation. Il touche 20 enfants par an en France. Dans le cas des HB, bien que la majorité des patients répondent aux traitements conventionnels, environ 20 pour cent sont réfractaires et décèdent. Les modèles de xénogreffes de lignées tumorales ou de greffes orthotopiques de tumeurs dérivées de pièces opératoires de patients représentent les modèles précliniques les plus pertinents actuellement pour étudier la réponse thérapeutique. Mais ces modèles sont développés chez des souris immunodéficientes et ne permettent pas d’étudier le rôle du système immunitaire. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, et notamment les mécanismes immunitaires, et de tester de nouvelles approches thérapeutiques pouvant être bénéfiques aux patients réfractaires aux traitements habituels.
Procédures
Les animaux pourront être soumis, selon les cas, à l’un des gestes suivants : 1) une chirurgie abdominale ou lombaire pour injection dans le foie ou la rate (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (réalisé dans l'établissement utilisateur 1 (EU1), 2) injection percutanée (animal vigile, 1 fois maximum, 15sec) (EU1), ou 3) une chirurgie abdominale pour greffe d’un fragment tumoral dans le foie (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (EU1). L’ensemble des animaux seront amenés à avoir : des prélèvements de sang de faible volume (animal anesthésié, 10 fois maximum avec une intervalle d’une semaine minimum entre chaque, 1min) ; un suivi par échographie abdominale (animal anesthésié, 20 fois maximum, 15 min) (EU1) ; pour certains un transport dans un autre établissement afin d’effectuer une imagerie non invasive par IRM (animal anesthésié, 2 fois, 30 min) (réalisé dans l'établissement utilisateur 2 (EU2)). En fin de période de maintien les animaux seront anesthésiés, un dernier prélèvement sanguin (1 min) sera réalisé et ils seront immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances prévues sont principalement celles engendrées par les procédures chirurgicales réalisées, qui peuvent engendrer une douleur au niveau de l’incision au réveil de l’animal et avoir une incidence sur l‘état général de santé de l‘animal (perte d‘appétit, baisse de l‘activité, infection de la cicatrice, détresse de l’animal dans les cas les plus grave), ainsi qu’entrainer une légère gêne dans la locomotion. Un risque anesthésique est également à prendre compte (détresse respiratoire, réveil intempestif). L’utilisation d’animaux à des âges précoces peut engendrer un abandon de la part de la mère, voir du cannibalisme dans le cas des nouveau-nés. Un stress de l’animal peut aussi être constaté lors des contentions, ainsi qu’un inconfort lors des injections. Le développement des tumeurs hépatiques est généralement asymptomatique et n’entraîne donc pas de nuisances en soit, car les animaux seront euthanasiés avant que les tumeurs entrainent une dégradation de l’état général des animaux. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance du fait du stress lié à la néophobie des rongeurs. Un risque anesthésique est également à prendre compte car l'IRM est effectuée sous anesthésie générale (détresse respiratoire, risque d'hypothermie, réveil intempestif).
Devenir
Le prélèvement des tissus d’intérêt étant nécessaire pour la réalisation de nos analyses, l’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin des procédures grâce à une méthode réglementaire, et dans le respect des bonnes pratiques.
Remplacement
Les modèles in vitro ne miment que partiellement la pathologie humaine car ils ne permettent pas de modéliser certains paramètres biologiques pouvant influencer le développement tumoral ou la réponse thérapeutique, tels que les interactions des cellules tumorales avec leur environnement ou encore l'hétérogénéité intra-tumorale. Il est donc essentiel de disposer de modèles in vivo reproduisant le plus fidèlement possible les caractéristiques de la pathologie humaine. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour mieux comprendre l'histoire naturelle de la maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Les effectifs ont été réduits au maximum et les groupes seront composés de 8 à 12 animaux. Cet effectif a été déterminé grâce à un calcul de puissance, afin d’utiliser le moins d’animaux possibles tout en permettant d’obtenir des résultats suffisamment robustes, et les expériences pourront être réitérées jusqu’à 3 fois si nécessaire. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Afin de limiter au maximum les éventuelles variations entre les expériences, les paramètres d’hébergement et de soin des animaux seront contrôlés. Le suivi tumoral hépatique sera réalisé grâce à une méthode non invasive, l’imagerie par échographie et par IRM, ce qui diminue également le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d'animaux utilisés sur la totalité du projet s'élève à 1515.
Raffinement
Les paramètres d'hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Les cages seront enrichies avec du coton de nidification, des maisonettes en plastique ainsi que des batônnets à ronger. Les femelles gestantes seront regroupées à 2 par cages afin d’éviter leur isolement, et ne seront séparées qu’après avoir mis bas afin d’éviter la surpopulation au sein d’une même cage. Les animaux issus d’établissement fournisseur observeront une durée d’acclimatation de 7 jours minimum avant toute utilisation. Un change sera réalisé par le personnel de l’animalerie une fois par semaine (sauf indication contraire) et une surveillance quotidienne rigoureuse des animaux sera réalisée tout au long de leur vie. Des pesées seront également réalisées à intervalles réguliers et une grille de suivi est utilisée. Les procédures seront raffinées afin de limiter au maximum la douleur et l’inconfort des animaux (personnel formé et compétent, anesthésie et analgésie adéquate suite aux procédures chirurgicales puis surveillance rapprochée des animaux avec étiquetage spécifique des cages concernées), et des points limites précis seront établis. Si un animal présente des signes de douleur ou de détresse, il sera immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire afin d’éviter toute souffrance animale. La Structure chargée du Bien-Etre Animal et/ou le vétérinaire pourront être sollicités pour conseil si besoin. Les transposrts des animaux entre l'EU1 et l'EU2 est assuré par un transporteur agréé, dans des boîtes de transport appropriées, ventilées, sécurisées et suffisament spacieuses. Un apport en nourriture et en eau gélifiée sera fourni durant le transport. Le temps de transport est de moins de 20 minutes entre les 2 EU.
Choix des espèces
La souris est un modèle expérimental de choix pour l'étude des pathologies humaines car c'est un petit mammifère qui se reproduit rapidement, est facile à manipuler, et dont nous avons une bonne connaissance du comportement et de la génétique. De plus, le génome de la souris est identique à plus de 95 pour cent à celui du génome humain, ce qui suggère une bonne homologie des mécanismes observés. On peut également facilement apprécier les modifications physiques et/ou comportementales traduisant une souffrance et/ou douleur, ce qui conduirait à l’euthanasie de l’animal. De nombreux outils moléculaires sont également disponibles chez ce modèle animal. La première procédure sera réalisée sur des femelles gestantes âgées de 2 à 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte et également à l’âge optimal permettant le bon déroulement de la gestation d’une part, et une bonne récupération de l’acte chirurgical d’autre part. Les vecteurs viraux seront injectés à différents âges (prénatal, 2, 5 et 15 jours de vie post natal), présentant un foie encore immature et en prolifération, afin de développer un hépatoblastome.
Caractérisation des défauts cognitifs et sociaux de quatre lignées de souris modèles de troubles du spectre autistique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour quantifier des déficits de mémoire et de motivation sociale dans quatre lignées porteuses de mutations liées à l'autisme, 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent neuf semaines de tests portant sur la mémoire de travail, la mémoire à court et long terme et l'apprentissage, l'insertion sous-cutanée d'une puce à radiofréquence sous anesthésie, un prélèvement vaginal pour certaines, une nuit sans nourriture et une eau de boisson acidifiée destinée à les motiver. Le porteur indique que deux des lignées peuvent présenter des crises d'épilepsie, et qu'un score de suivi supérieur à 8 déclenche la mise à mort au CO2. 284 souris sont tuées pour prélever leurs organes, les 100 autres, utilisées comme "nouveaux arrivants" dans le test d'interaction sociale, étant conservées pour être réutilisées.
Objectifs
Le projet consiste à comprendre les mécanismes des déficiences intellectuelles et des troubles du spectre autistique associées à des mutations génétiques. Nous nous intéressons plus spécifiquement dans cette étude à la caractérisation de déficits cognitifs et sociaux dans quatre modèles animaux portant des mutations génétiques associées aux troubles du spectre autistique. Les tests comportementaux proposés permettront d’identifier et de quantifier les déficits cognitifs et sociaux des modèles de souris. Nous nous intéresserons à la mémoire de travail, à la mémoire à court et long terme, aux capacités d’apprentissage ainsi qu’à la motivation pour les interactions sociales. Cette caractérisation constitue donc la base d’un projet général qui vise à comprendre les mécanismes soujacents aux troubles du spectre autistique. Elle va permettre de sélectionner les tests les plus pertinents pour évaluer les effets de traitements potentiels dans une étude ultérieure. Elle est donc primordiale pour bien identifier les niveaux de référence dans les études futures.
Bénéfices attendus
Cette étude vise à mieux caractériser les défauts comportementaux de quatre modèles animaux de troubles du spectre autistique. Les défauts cognitifs et sociaux seront en particulier étudiés. Elle permettra de sélectionner les tests comportementaux les plus pertinents afin de tester des molécules à effets thérapeutiques visant à réduire ces défauts dans des études futures. Cette étude constitue donc la base pour des études ultérieures pour la recherche de voie d’amélioration pour les patients.
Procédures
Tous les animaux vont être évalués lors d’un ensemble de tests comportementaux visant à observer leurs performances cognitives. Ces tests seront réalisés pendant une durée totale de 9 semaines. Une semaine avant le test d'interactions sociales, les souris subiront une injection d'antidouleur (quelques secondes) avant la micro chirurgie déstinée à l’insertion sous cutanée d’une puce à radiofréquence (RFID) servant à l'analyse automatique des données. Cette intervention sous anesthésie gazeuse est très rapide (3 min). Les souris "nouveaux arrivants" du test d'interaction sociales seront également soumises à un prélèvement vaginal (quelques minutes). Les animaux destinés à des analyses immunohistochimiques seront anesthésiés par une injection (quelques secondes). Ils subiront ensuite une chirurgie terminale.
Impact sur les animaux
Il a été rapporté que deux lignées peuvent présenter des crises d'épilépsie de type cloniques et/ou toniques (PE3). Une partie des souris subira une légère douleur très ponctuelle lors d'une micro-chirurgie déstinée à l’injection sous cutanée d’une puce à radiofréquence (RFID) servant à l'analyse automatique des données. Les souris seront soumises à un stress léger ou modéré lors des tests comportementaux (stimuli lumineux et changement ponctuel du pH de l’eau (acidification de l’eau de boisson en cage d’hébergement, qui rend plus appétent le lait sucré lors des tests d’apprentissage réalisés en dehors de la cage d’hébergement)) afin de favoriser l’apprentissage et ainsi réduire la durée des tests. Cela permet d’optimiser la durée de la procédure globale. Les souris seront privées de nourriture pendant une nuit afin de les motiver à réaliser le test de motricité fine. Les souris "nouveaux arrivants" seront soumises à un stress léger de courte durée lors du prélèvement vaginal.
Devenir
Tous les animaux des lignées transgéniques étudiées seront mis à mort pour faire des prélévements (organes, tissus…) permettant une étude approfondie des tissus et des processus moléculaires. Les animaux utilisés comme nouvel arrivant dans l’interaction sociale ne subissent que l’insertion de puce radiofréquence et l’interaction sociale. Ils seront donc conservés pour une réutilisation dans les mises au point de tests comportementaux non invasifs.
Remplacement
La compréhension des mécanismes de maladies génétiques associées à des déficits intellectuels requiert l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire notamment pour évaluer les processus cognitifs et sociaux. La souris est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser des pathologies humaines.
Réduction
Les effectifs nécessaires ont été calculés par rapport aux études précédentes afin d’obtenir des résultats robustes avec une puissance statistique suffisante en prenant en compte les variations inter-individuelles d'une population. Nous analyserons les résultats de chaque test avec des tests statistiques adaptés. Nous prélèverons un maximum d’échantillons (organes, tissus…) sur chaque animal afin de pouvoir créer une banque pouvant être utilisée dans d’autres études.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes sociaux stables. Pour l’insertion de la puce, la douleur lors de l’injection sous-cutanée de la puce est gérée par une injection sous-cutanée préalable d’un anti-douleur local. Lors du test d’apprentissage, les animaux auront une eau de boisson quotidienne légèrement aversive afin de faciliter l’apprentissage du test par renforcement positif (la récompense dans le test d’apprentissage est constituée par du lait mélangée à du sirop de fraise) sans à avoir subir de privation ou de renforcement négatif. Le lait sucré présenté dans le test devient d’autant plus appétent que l’eau de boisson quotidienne est acide ; cela renforce donc l’apprentissage des animaux, sans les priver. Des études précédentes ont montré que les souris ne perdent pas de poids malgré l’acidité de l’eau quotidienne et que cette acidification n'impacte pas le système gastrique des souris. Cette procédure représente un raffinement car elle permet d'éviter une privation hydrique et/ou alimentaire mais reste nécessaire pour que les souris aient une motivation suffisante pour effectuer la tâche. Pour évaluer l’état des souris, nous observerons le poids, l’apparence, la modification du comportement avant et près manipulation et la douleur. Chacun de ces points pourra être scoré entre 0 (Normal) et 3 (Alteration sévère). Si la somme des scores des 5 catégories est inférieure à 5, aucune mesure n’est prévue. Un score entre 5 et 8 entrainera un suivi quotidien individuel de l’animal. Un score supérieur à 8 entrainera la mise à mort de l’animal par gradient de CO2 avec augmentation progressive.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des animaux transgéniques est liée à l'absence de tout mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la pathologie humaine étudiée (Syndrome DYRK1A). Les souris seront testées une fois adultes (à partir de 8 semaines). Nous avons choisi cet âge car il correspond à une période hors développement. Les patients atteints du Syndrome DYRK1A montrent des défauts dans un large panel de processus cognitifs comparés à la population contrôle à l’âge adulte.