Souris

Chirurgie cérébrale d'une heure à une heure trente sous anesthésie générale, pose d'une microlentille et d'une fibre sur l'implant, dix séances d'observation au microscope sous anesthésie, puis dix séances supplémentaires sur animal éveillé. 900 souris vont être utilisées ainsi sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré est de mettre au point des microscopes capables de contrôler des neurones par la lumière et de les imager en profondeur, dans les circuits visuels et moteurs. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leur cerveau et vérifier les données anatomiques.

Objectifs

Ce projet vise à mettre au point des nouvelles technologies d’optique permettant simultanément de contrôler l’activité des neurones avec des protéines sensibles à la lumière et de les imager dans des régions du cerveau en profondeur en utilisant des sondes fluorescentes spécifiques pour détecter l’activité des neurones. Nous concevons et construisons de nouveaux microscopes combinant imagerie et activation des neurones du cerveau avec la lumière en combinaison avec des fibres optiques et des microlentilles. Ces outils constituent des techniques sans précédent pour l’étude du cerveau, permettant de contrôler l’activation de cellules choisies dans des circuits neuronaux, selon des schémas mimant des processus physiologiques. L’objectif est d’utiliser ces nouveaux outils pour l’étude des circuits visuels, sensoriels et moteurs localisés en surface et en profondeur dans le cerveau. . Le projet nous permettra d’obtenir la cartographie des connexion neuronales des régions profondes du cerveau et de pouvoir démontrer le lien entre circuits neuronaux spécifiques de la vision et du comportement moteur.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de développer de nouvelles techniques d’optiques pour la manipulation des neurones avec la lumière et l’imagerie en simultanée à travers de microlentilles. Les circuits neuronaux moteurs et visuels en profondeur pourront être étudiés avec ces nouvelles techniques, plus précises par rapport aux méthodes actuellement utilisées. Cette étude nous permettra aussi de comprendre la structure et l’intégration de circuits moteurs et sensoriels, afin de cibler au mieux les thérapies géniques en cas de pathologie (par exemple visuelle).

Procédures

Chirurgie au niveau cérébrale sous analgésie et anesthésie générale (durée de la chirurgie : 1h-1h30). Tous les animaux. Observation des animaux en microscopie sous anesthésie générale (durée : 1-2h). Les observations seront répétées 10 fois. Une partie des animaux. Pose d'un microlentille et fibre sur l'implant sous microscope et sous anesthésie générale (durée : 1-2h) en préparation des observations sur animal éveillé. Une fois. Une partie des animaux. Observation des animaux éveillés en microscopie (durée : 1-2h). Les observations seront répétées 10 fois. Une partie des animaux.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à ce que certaines chirurgies, comme les implants permanents, puissent causer de la douleur, du stress ou une perte de poids temporaire (1 à 3 jours après l’opération). Un risque de stress cardio-respiratoire est aussi présent lors de l’anesthésie. Des rares effets pourront se produire pendant les chirurgies : mauvaise réaction à l’anesthésie ou légèrs saignements. Des rares effets pourront se produire après les chirurgies : perte de l’implant en post-opératoire ou inflammation. La contention légère de l'animal pour les injections et pour les expériences peut entrainer un léger stress des animaux. Les injections peuvent causer de la douleur légère de courte durée au niveau du site d'injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet pour prélever le cerveau et vérifier les données anatomiques.

Remplacement

Une partie des expériences avec les nouvelles protéines sensibles à la lumière et les indicateurs d’activité neuronale seront faites d’abord dans des modèles cellulaires in vitro, pour identifier les plus efficaces avec les systèmes optiques développés. Des simulations par ordinateur, préalables aux expériences, sont utilisées pour obtenir les paramètres optimaux d’illumination des tissus (température, modèles pour l’activation des protéines sensibles à la lumière…). À l’heure actuelle, ce modèle ne peut pas être entièrement remplacé par une approche alternative in vitro car les circuits neuronaux activés par la stimulation sensorielle et motrice ne sont pas observables in vitro. L’utilisation de l’animal est donc scientifiquement indispensable à notre étude.

Réduction

L’utilisation d’animaux avec implants permanents nous permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires à chaque expérience. Cela nous permettra de travailler sur un plus petit nombre d’échantillons sur lesquels nous répéterons les stimulations avec la lumière tout en respectant leur bien-être. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique de ce projet. Ce nombre sera gardé le plus petit possible et a été estimé grâce aux outils disponibles de calcul de puissance statistique. Pour chacune des mesures à réaliser, nous utiliserons des tests statistiques pour l’interprétation des résultats. Au total, et sur 5 ans, nous utiliserons 900 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes de 5 congénères dans des cages ventilées. Ils seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation (cages de stabulation avec enrichissement, nourriture et boisson à volonté). Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d'acclimatation de 5 jours minimum avant expérimentation. Une signalétique particulière sera utilisée pour les animaux en expérimentation. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis pour chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque type d’expérimentation. Les procédures sont affinées à chaque instant pour garantir le bien-être des animaux (par exemple la mise à disposition dans la cage de gel pour l’alimentation en cas de perte de poids en post-opératoire). L’utilisation d’une grille d’évaluation permettra de définir les points limites précoces et prédictifs à chaque acte expérimental, afin d’éviter toute souffrance de l'animal et permettre l’euthanasie lorsque celle-ci ne peut être prise en charge. Les animaux observés éveillés seront soumis à un entrainement avant les observations au microscope, pour les habituer à leur environnement et réduire le stress.

Choix des espèces

Notre modèle animal est la souris adulte car ce modèle, très utilisé par les laboratoires de recherche, permet d’étudier le fonctionnement de circuits neuronaux complexes dans des conditions physiologiques proches de l’Homme. La taille du cerveau de souris est aussi idéale pour les études sous microscope avec haute précision. Le modèle souris permet aussi de disposer d’animaux ayant des particularités génétiques pertinentes pour notre étude. Nous utiliserons des souris âgées entre 28 jours et 1 an avec circuits neuronaux matures.

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie générale une injection dans les deux chevilles arrière pour déclencher une arthrite, puis une injection de traitement par voie générale et deux injections quotidiennes d'analgésique pendant trois jours. Le porteur indique que l'inflammation de la patte sera potentiellement douloureuse selon son intensité, et qu'une perte de poids modérée peut survenir. L'imagerie photoacoustique au chevet du patient est renvoyée à un futur formulé au conditionnel, tandis que le recours à l'animal est déclaré "incontournable" au motif que la réponse immunitaire serait difficile à modéliser hors de l'organisme.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans l’axe de développement de nano-objets innovants pour la santé . La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune invalidante très répandue qui induit une inflammation chronique des articulations, avec une érosion des cartilages et des os. En Europe, elle touche déjà 3 millions de patients et ce nombre devrait encore augmenter. Les nanoparticules en tant que transporteurs de médicaments devraient modifier profondément les traitements thérapeutiques en permettant une médecine plus personnalisée. Nous souhaitons évaluer par des techniques non invasives d’imagerie l’accumulation in vivo des nanoparticules dans les tissus cibles. Les principales modalités d’imagerie conventionnelles ne permettent pas de détecter des éléments dont la dimension est inférieure au millimètre. L’imagerie photoacoustique est une technologie émergente qui s’appuie sur l’utilisation d’agents de contraste pour améliorer la qualité des images en augmentant l'absorption de la lumière dans les tissus ciblés, permettant une meilleure visualisation et un diagnostic plus précis des structures biologiques. Nos nanoparticules marquées avec un agent de contraste pourront ainsi être détectées au niveau intratissulaire et cellulaire. Nous souhaitons donc développer une nouvelle famille de nanoparticules multifonctionnelles pour i) l’imagerie photoacoustique avec le marquage des nanoparticules avec un agent de contraste et ii) l’administration de médicaments. Une bibliothèque de nanoparticules cliniquement pertinentes ont été greffées avec différents agents de contraste pour générer une réponse photoacoustique permettant d’évaluer leur accumulation dans les tissus et les cellules. L’objectif du projet est d’établir la faisabilité de cette approche au niveau préclinique en évaluant in vivo par imagerie photoacoustique l’accumulation des nanoparticules dans les articulations de souris atteintes d’arthrite, puis de mettre en évidence une corrélation entre l’accumulation des nanoparticules et la réponse thérapeutique.

Bénéfices attendus

L’objectif du projet est de développer une nouvelle famille de nanoparticules multifonctionnelles pour l’imagerie photoacoustique et l’administration de médicaments, dans le but d’une médecine plus personnalisée et efficace. L’échographie est déjà couramment utilisée par les rhumatologues pour le suivi de la PR. L’imagerie photoacoustique au chevet du patient serait un complément pour une imagerie rapide et spatialement résolue pour évaluer l’accumulation des nanomédicaments, à condition qu’ils soient marqués avec un agent de contraste visible en photoacoustique. L’imagerie photoacoustique a des avantages non négligeables en termes de santé et de coût car elle est non invasive, non ionisante et moins cher que l’IRM. Elle permettrait une détection plus fine des nanomédicaments marqués tant au niveau tissulaire que cellulaire. A plus long terme, alors qu’actuellement les applications cliniques de la photoacoustique se concentrent sur la cartographie de l’oxygénation du sang dans les tissus à des fins diagnostiques, elle pourrait contribuer au développement d’une nouvelle gamme d’applications dans le domaine de la thérapie personnalisé par la nanomédecine.

Procédures

TTous les animaux subiront sous anesthésie générale une injection intra-articulaire au niveau des deux chevilles des pattes arrières, une injection du traitement par voie générale et deux injections par jour d’analgésique pendant 3 jours (durée de chaque injection : une minute).

Impact sur les animaux

Les souris développeront une inflammation de la patte arrière injectée qui sera potentiellement douloureuse en fonction de l’intensité de l’inflammation. Une perte modérée de poids peut survenir.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser le prélèvements post-mortem des pattes arrières afin d’analyser finement les tissus des articulations (analyses anatomopathologiques).

Remplacement

Le recours à l’animal est incontournable car cette maladie met en jeu une réponse immunitaire complexe qu’il est difficile de modéliser in vitro ou in silico car elle fait intervenir différents acteurs cellulaires (cellules de l’immunité) et de nombreux médiateurs de l’inflammation (cytokines). Ce modèle d’arthrite chez la souris est un modèle pertinent d’inflammation arthritique aiguë car il partage de nombreuses caractéristiques avec la polyarthrite rhumatoïde humaine au niveau des signes cliniques et de la pathogénie. De plus, le projet vise à étudier une technique d’imagerie et l’étude chez l’animal est nécessaire.

Réduction

L’objectif de l’étude est d’évaluer l’accumulation des nanomédicaments dans la cheville inflammée et de corréler cette accumulation à une efficacité thérapeutique. Les critères de jugment seront donc i) le score clinique attribué à la patte (entre 0 et 4) et ii) l’accumulation des nanomédicaments mesurée via la réponse photoacoustique de l’agent de contraste. L’étude en imagerie permet de suivre dans le temps un même animal et ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé à l’aide d’un logiciel de statistique qui permet de déterminer le nombre juste et minimal d’animaux qui garantira la validité statistique de l’étude.

Raffinement

Les injections se feront sous anesthésie générale gazeuse afin de réduire au maximum la douleur et le stress que pourraient subir les animaux lors du geste technique. La douleur inflammatoire sera prise en charge tout au long de la procédure par un protocole analgésique adapté. Les animaux seront observés quotidiennement selon une grille d’évaluation qui suivra le poids, l’évolution de l’inflammation et permettra de mettre en place des points limites qui seront strictement appliqués en cas de souffrance avérée. Les animaux seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi de tubes en cartons et de matériaux de nidification (type sizzle nest ou cocon) afin de favoriser les comportements naturels tels que l’activité et la fabrication d’un nid. Des biberons à tétine longue seront utilisés pour faciliter l’accès à l’eau des animaux dont la mobilité sera réduite du fait de l’inflammation de la patte et des aliments appétents seront disposés dans la cage. Ces dispositions simples permettront de limiter significativement la perte de poids des souris.

Choix des espèces

Ce modèle est efficace dans de nombreuses souches de souris. Nous utiliserons des souris blanches qui ont l’avantage d’être dépourvues de mélanine qui est un agent endogène de contraste en photoacoustique et qui pourrait gêner nos mesures de photoacoustique. Les souris seront utilisées à l’âge adulte soit à partir de 7-8 semaines car la polyarthrite rhumatoïde met en œuvre une réaction inflammatoire qui nécessite un système immunitaire mature. C’est une maladie qui touche les adultes.

Greffées d'une tumeur sous anesthésie locale, les souris de ce projet reçoivent ensuite 17 à 24 injections sur quatre à six semaines, cinq à sept gavages et cinq prélèvements sanguins sous anesthésie générale. Elles sont 3 888 à être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse de leurs organes. L'objet déclaré est de tester si des médicaments antidiabétiques déjà commercialisés modifient la relation entre microbiote intestinal et efficacité des traitements anticancéreux. Le porteur décrit les atteintes en quelques lignes, mentionnant une gêne et une douleur locale modérée liées à la tumeur, et justifie l'effectif de 3 888 souris par un test statistique dont il ne dit rien.

Objectifs

Dans la littérature, le rôle joué par l’ensemble des micro-organismes vivant au sein de l’intestin (microbiote intestinal) a été démontré dans l’efficacité des traitements immunothérapeutiques contre certains type de cancers. De même, il a été démontré que le cancer avait un impact sur le microbiote intestinal et sa composition, favorisant un déséquilibre intestinal entre les les bactéries dites « bonnes » et « mauvaises ». Ce déséquilibre est appelé dysbiose. Cette dysbiose peut également être due à la prise d’antibiotiques. Il a été montré que le cancer induit un stress au niveau de l’intestin, entrainant une cascade d’évènements dont la diminution de cellules sécrétrices d’hormones. Des études ont montré que des médicaments commercialisés contre le diabète, ayant le même effet qu'une de ces hormones sécrétées par ces cellules inhibées, influencent le système immunitaire, dont des cellules connues pour être impliquées dans la réponse immunitaire contre le cancer. Le but de ce projet est d’étudier l’impact potentiel de ces médicaments dans la relation microbiote intestinal-cancer-traitements contre le cancer.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’explorer le potentiel de médicaments, déjà connus et commercialisés comme traitement contre le diabète, dans un contexte cancéreux. Cela permetrait d’identifier le rôle qu’ils pourraient jouer dans les interactions microbiote intestinal-traitements contre le cancer et ainsi, sur le plus long terme, permettre leur utilisation dans le cadre d’une maladie autre que celui pour lequel ils ont été mis sur le marché.

Procédures

Les animaux auront des greffes de tumeurs, réalisés sous anesthésie locale (durée 2 minutes, une par souris). Les injections des traitements sous anesthésie locale, seront au nombre de 17 à 24 sur 4 à 6 semaines, durée 2 minutes. Nous réaliserons également des gavages, entre 5 et 7, durée 2 minutes. Des prélèvements sanguins seront également effectués sur les animaux, sous anesthésie générale (n=5, durée 5 minutes au maximum).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress lié à la manipulation. Les gavages peuvent provoquer une contrainte transitoire et légère lors du geste en lui-même. La croissance d’une tumeur peut entrainer une gêne locale et une douleur locale modérée. Les traitements et la tumeur peut entraîner une perte de poids.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin d'effectuer des analyses sur divers organes et tissus, ce qui nous permettra de répondre aux hypothèses du projet.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, les différents micro-organismes présent dans l'intestin (bactéries, archées etc...), les différentes cellules du système immunitaire et l’effet des traitements immunothérapeutiques contre le canccer sur la réponse anti-tumorale dans un contexte tumoral, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous regrouperons les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Nous mènerons cette étude de façon séquentielle pour que chaque procédure fasse suite à la validation de l’hypothèse précédente. Dans le cas où la procédure s’avère non concluante, l’expérimentation ne sera pas répétée et la procédure sera arrêtée, ce qui diminuera le nombre de souris. Le calcul du nombre d’animaux par groupe a été réalisé grâce à un test statistique. Les résultats feront également l'objet d'une analyse statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un espace respectant leur bien-être : régime alimentaire normal et une eau stérile correspondant à leurs besoins, ainsi qu’un enrichissement adapté à l’espèce utilisée. A leur arrivée, ils seront mis en quarantaine pendant une semaine avant le début des expérimentations, afin de leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement. Dès le début des procédures, les souris auront un examen clinique quotidien afin de s’assurer de leur bien-être tout au long des procédures, suivant des critères pré-définis (poids, aspect du pelage et de la dentition, comportement social, taille et aspect de la tumeur). Si l’un de ces critères, définis comme point limite, est défaillant, suivant une grille d’évaluation pré-définie, l’animal sera euthanasié. Les injections et prélèvements sanguins se feront sous anesthésie. Lors des gavages, nous utiliserons des sondes de gavages en polypropylène, en s’assurant de l’insérer et la retirer le plus délicatement possible.

Choix des espèces

La génétique de la souris est proche de celle de l’Homme et bien décrite dans la littérature scientifique, ce qui rend comparable les voies de signalisation immunologiques des tumeurs entre l’Homme et la souris. Les modèles de tumeur que nous utiliseront sont issus de lignées cellulaires de souris. Les animaux utilisés seront à maturité sexuelle, entre 7 et 8 semaines, ce qui nous permettra d’étudier le système immunitaire à un stade de développement optimal et fonctionnel.

20 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour contrôle histologique. Une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes leur implante un plot d'enregistrement dans le crâne, dispositif de cinq grammes qui impose un hébergement individuel pendant toute l'étude, soit jusqu'à six mois sans contact avec des congénères. Dix d'entre elles reçoivent trois stimulations électriques aux pattes lors d'un test de conditionnement contextuel, répété jusqu'à trois fois, pour mesurer comment l'activité des cellules de direction de la tête se modifie avec la mémoire à long terme. Le porteur écarte le remplacement en indiquant que ces procédures ne pourraient pas non plus être conduites chez l'humain, du fait de leur caractère invasif.

Objectifs

L’objectif principal est de mieux comprendre comment les circuits neuronaux se réorganisent au cours de la formation de la mémoire déclarative (la mémoire pour des faits et des événements). Un grand nombre d’études chez l’humain et chez l’animal a montré que cette mémoire est initialement dépendante de l’activité d'une structure cérébrale, l’hippocampe. Au cours du temps on assiste à son désengagement progressif et en parallèle à une augmentation de l’activité corticale. Ce processus de réorganisation des circuits neuronaux est appelé consolidation systémique. Cette réorganisation est possible grâce à la communication entre l’hippocampe et le cortex, à travers une troisième structure, le thalamus, dont l’activité augmente au cours de la formation de la mémoire. Toutefois, une étude récente a montré qu’un noyau spécifique du thalamus, le noyau antérodorsal, montre un patron d’activité très différent. Ce noyau présente une très faible activation durant la formation de la mémoire, alors que le reste du thalamus est fortement activé. Ceci a été montré en utilisant des techniques d’imagerie cellulaire permettant d’extraire une photographie de l’état d’activation d’un réseaux neuronale à un instant bien précis, mais ne fournissant aucune information sur la fonctionnalité de ce même réseau. L’objectif de l’étude présent est donc d’obtenir un corrélat fonctionnel de l’inhibition de ce noyau durant la mémoire à long-terme. Pour cela nous proposons d’étudier comment l’activité des neurones du noyau antérodorsal se modifie durant la mémoire à long-terme, chez la souris. En particulier, nous allons nous intéresser à un corrélat bien caractérisé, qui est l’activité directionnelle. En effet, une proportion importante des neurones de ce noyau s’active lorsque la tête de la souris pointe vers une direction précise. Ces cellules, nommées cellules de direction de la tête, permettent à l’animal de s’orienter dans tout environnement en fournissant une information très générale relative à l’orientation de la tête et du corps dans l’espace. Nous nous attendons à une diminution significative de l'activité de ces cellules lorsque les souris durant la mémoire à long-terme.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser les substrats neuronaux de la formation d’une mémoire contextuelle, similaire à la mémoire déclarative chez l’humain. La compréhension fine des processus de modification des circuits neuronaux sous-tendant la formation de cette mémoire est essentielle pour comprendre non seulement son fonctionnement, mais aussi son dysfonctionnement dans le cadre de différentes pathologies neurodégénératives, telles que la Maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les animaux (N=20) sont soumis à deux interventions principales: une procédure chirurgicale et une procédure comportementale couplée à l'enregistrement neuronal. La procédure chirurgicale, d’une durée comprise entre 30 et 45 minutes environ, prévoit d'implantation du plot d'enregistrement. Pour la procédure comportementale, les animaux sont d'abord maintenus doucement par l’expérimentateur pour permettre le branchement du câble d'enregistrement sur le plot. Cette étape a une durée de 30-60 secondes. Afin de minimiser le stress des animaux, ils sont habitués à cette légère contention avant et après la chirurgie, au cours de séances quotidiennes de manipulation. Puis ils sont introduit dans le dispositif comportemental. Le premier dispositif est une arène circulaire de 80-100cm de diamètre; les animaux sont laissés libre d'explorer cet environnement pour une session de 10-15 minutes effectuée une fois par jour pour toute la durée de l’étude. L'ensemble des souris sera également soumis au test de conditionnement contextuel 3 fois au maximum pendant toute la durée de l’étude. Cette tâche comprends 3 sessions d’exploration de 5 minutes dans une arène rectangulaire (31cm * 24cm) ; durant la deuxième de ces sessions, la moitié des animaux (N=10) subira 3 stimulations au niveau des pattes, ce qui entraîne une légère douleur; l'autre moitié des souris (N=10) sera simplement insérée dans le même dispositif en l'absence des stimulations. La durée totale de l'étude est de 6 mois au maximum.

Impact sur les animaux

Nuisance attendues : - la chirurgie, sous anesthésie générale profonde, d'une durée comprise entre 30 et 45 minutes, entraîne une lésion au niveau du crâne et du stress. Cette chirurgie permet d’implanter les électrodes dans le thalamus antérieur (N=20 souris). Toutes les souris seront soumises à l’enregistrement de l’activité neuronale au cours de deux tests comportementaux. - le plot d'enregistrement implanté en chronique entraîne une gêne modérée de par son encombrement et son poids (5 g environs), et impose un hébergement individuel pour préserver sa fonctionnalité. Il y a donc une restriction des interactions sociales durant la totalité de l’étude; un enrichissement supplémentaire dans la cage d'hébergement est mis en place. - la manipulation pour le branchement du câble d'enregistrement nécessite une légère contention de l'animal pendant quelques secondes uniquement. - en fin d'expérimentation, les animaux sont mis à mort par injection d'un agent euthanasiant, sous anesthésie.

Devenir

A la fin des expériences tous les animaux seront mis à mort. Cette décision découle des objectifs de l'expérimentation, à savoir la réalisation des contrôles histologiques.

Remplacement

La nature même des expériences ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, elles reposent sur l'étude du comportement des souris, ce qui ne peut pas être realisé à partir de modèles in vitro ou des modèles artificiels (basés sur des simulations sur ordinateur). Du fait du caractère invasif des procédures (implantation d'électrodes) elles ne peuvent pas non plus être conduites chez l'humain.

Réduction

Le calcul du nombre d’animaux utilisés reflète la recherche d’un juste équilibre entre la nécessité de répliquer les observations pour obtenir des résultats statistiquement valables (les phénomènes étudiés pouvant présenter une variabilité interindividuelle importante, notamment dans l’étude du comportement) et celle de réduire la taille des effectifs. Le nombre d’animaux ici présenté a été estimé sur la base de nos expériences antérieurs à la fois sur le comportement et l'enregistrement de l'activité neuronale, et sur un test de puissance statistique permettant de réduire au maximum le nombre d'animaux tout en ayant suffisamment de données pour une inférence statistique valide. Nous mettrons en place deux stratégies pour réduire le plus possible le nombre d'animaux utilisés. D'une part, nous allons tout d’abord caractériser l’activité neuronale des souris dans une tâche d’exploration libre, et seulement lorsque un nombre significatif de neurones sera isolé (au moins 10 neurones) les animaux seront soumis à la tâche de conditionnement. De l'autre part, nous essayerons de répéter la tâche de conditionnement contextuel 3 fois pour chaque animal (avec un délai d'un mois au moins), en modifiant le plus possible l’apparence du contexte (en changeant la couleur des murs et les repères visuels). Ces deux stratégies permettront de maximiser le nombre de neurones caractérisés, et ainsi reduire le nombre des animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont habitués à la manipulation et à la salle d’expérimentation pendant 10 jours avant le début du protocole afin de diminuer leur stress. La chirurgie est optimisée pour réduire la durée de l’opération (30-45 min). La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie profonde. Les principaux paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire) sont contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique puissant à action prolongée est administré en préopératoire, permettant ainsi de couvrir la phase post-opératoire. En complément, un analgésique anti-inflammatoire et de la solution physiologique sont administrés en début d'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal. Des points limites spécifiques ont été définis et seront appliqués tout le long de l'expérience.

Choix des espèces

Il s’agit d’un étude pilote dont l’hypothèse est basée sur des résultats précédents, chez la souris. Il est donc impératif de maintenir les mêmes conditions expérimentales, ce qui inclus l’utilisation de la même espèce. De plus, un grand nombre d’articles publiés ont étudié les bases neurales de la formation de la mémoire chez la souris. On pourra donc se baser sur des connaissances bien établies pour poursuivre ce projet et ainsi éviter de multiplier les expériences et l'utilisation d'un grand nombre d'animaux. Les animaux seront testés à l'âge adulte (8-12 semaines, 18-28g). Ce temps est nécessaire pour que le système nerveux soit mature et est classiquement utilisé pour mesurer les performances comportementales de souris adultes. Ceci nous permet de comparer les résultats obtenus avec nos données antérieures et celle de la littérature.

Dix-huit injections en neuf semaines, une vingtaine de mesures de l'épaisseur des articulations, neuf tests de répartition du poids sur les pattes et neuf tests de force de préhension : voilà le programme de chacune des 2 700 souris de ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrite leur est induite par deux injections, avec douleurs articulaires, gonflements et raideurs apparaissant entre 21 et 28 jours, une mobilité réduite et des difficultés à s'alimenter. Le projet cherche à savoir si moduler un mécanisme de recyclage cellulaire ralentit la polyarthrite rhumatoïde, toutes les souris étant tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur justifie l'espèce par l'expertise disponible en élevage et manipulation, et conclut qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne reproduit cette complexité.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie inflammatoire chronique qui touche les articulations. Elle concerne environ une personne sur cent, avec une fréquence plus élevée chez les femmes. Cette maladie provoque des douleurs persistantes, une raideur articulaire et des déformations progressives des articulations. À long terme, elle peut aussi entraîner des complications touchant d’autres organes et réduire l’espérance de vie. La maladie apparaît généralement autour de l’âge de 45 ans et sa fréquence augmente avec l’âge. En plus de ses effets sur la qualité de vie, elle a un fort impact professionnel, puisqu’environ la moitié des personnes touchées arrêtent de travailler dans les cinq ans suivant le diagnostic. L’objectif de ce projet est d’étudier si la modulation d’un processus naturel de recyclage des composants cellulaires, impliqué dans la régulation de l’inflammation, pourrait aider à prévenir ou à traiter cette maladie. En agissant sur ce mécanisme, nous espérons diminuer l’inflammation au niveau des articulations, limiter les dommages causés aux os et améliorer les symptômes ressentis par les patients. À terme, ce projet pourrait contribuer à identifier de nouvelles pistes pour mieux prendre en charge cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’explorer l’effet d’un modulateur de l’autophagie dans des modèles murins de polyarthrite rhumatoïde (PR), avec des bénéfices attendus à la fois pour mieux comprendre la maladie et pour développer de nouveaux traitements. Sur le plan fondamental, cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de l’autophagie dans l’évolution de l’inflammation et des lésions articulaires caractéristiques de la PR. Elle analysera comment un déséquilibre de ce processus peut favoriser la survie des cellules inflammatoires et aggraver la maladie. Cette recherche vise à identifier les étapes clés du développement de la PR et à repérer de nouvelles cibles pour de futurs traitements. D’un point de vue thérapeutique, si l’inhibition ciblée de l’autophagie s’avère efficace pour ralentir la progression de la PR, cette approche pourrait déboucher sur de nouvelles solutions médicamenteuses. Ces traitements seraient particulièrement utiles pour les patients qui ne répondent pas bien aux thérapies actuelles ou qui ne les supportent pas, en offrant un meilleur contrôle de la maladie avec moins d’effets secondaires liés à l’immunosuppression. Les retombées de ce projet sont donc doubles : il contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes en jeu dans la PR et ouvrira la voie à des stratégies thérapeutiques innovantes. À terme, ces avancées pourraient améliorer la qualité de vie des patients tout en réduisant l’impact économique et social de la maladie.

Procédures

Certaines souris possédant un fond génétique particulier recevront, en plus des autres actes, 5 injections successives d’un agent chimique destiné à réduire la quantité d’une protéine spécifique. Ces injections seront administrées sur animaux vigiles une fois par jour pendant 5 jours et dureront quelques secondes chacune. Pour induire l’arthrite, les souris recevront deux injections également sur animal vigile, chacune durant environ 15 secondes. Les traitements expérimentaux comprendront un total de 18 injections, d’une durée d’environ 10 secondes chacune (2 injections par semaine) sur une durée de 9 semaines sur animaux vigiles. Afin de surveiller l’évolution de l’inflammation articulaire, des mesures de l’épaisseur des articulations seront réalisées sur animaux vigiles tous les 2 à 3 jours à l’aide d’un instrument de précision. Cette procédure prendra environ une minute par animal, avec un total d’environ 20 mesures par souris. L’état de l’arthrite sera évalué chaque semaine selon une grille d’observation spécifique, une évaluation prenant environ 2 minutes par animal et réalisée 9 fois par souris sur toute la durée de l’étude sur animaux vigiles. Des échographies des articulations seront effectuées toutes les deux semaines sous anesthésie légère. Chaque session durera environ 20 minutes et chaque souris passera 4 séances au total. Un test permettant d’évaluer la répartition du poids entre les pattes avant et arrière sera réalisé une fois par semaine sur animaux vigiles. Cette analyse, qui dure environ 5 minutes par animal, permettra de mesurer l’impact de l’arthrite sur l’appui des pattes. Chaque souris passera ce test 9 fois. Enfin, un test mesurant la force de préhension des pattes sera effectué une fois par semaine sur animaux vigiles, afin d’évaluer d’éventuelles faiblesses musculaires liées à la maladie. Ce test, d’une durée d’environ 5 minutes par animal, sera répété 9 fois par souris.

Impact sur les animaux

Les souris impliquées dans ce projet recevront des injections de molécules. Cette procédure peut provoquer une douleur locale légère et temporaire ainsi qu'une irritation à l'endroit de l'injection. Une inflammation cutanée temporaire peut également apparaître en raison des molécules injectées. Des symptômes d'arthrite, tels que des douleurs articulaires, gonflements et raideurs, surviennent généralement entre 21 et 28 jours après l'injection. Dans certains cas, des changements comportementaux, comme une réduction de l'activité ou un isolement, ainsi qu'une perte de mobilité, peuvent être observés. Certaines souris recevront des injections d'anticorps. Cette procédure peut entraîner une irritation locale temporaire et un stress dû à la manipulation. Dans les 24 à 48 heures suivant l'injection, une inflammation aiguë des articulations peut se développer, accompagnée de douleurs, de gonflements et de raideurs. Ces symptômes peuvent réduire la mobilité, entraîner des difficultés à s'alimenter et causer un inconfort général. Une perte de poids modérée peut également être observée. Les injections administrées au cours du traitement peuvent causer une douleur passagère au site d'injection et un stress lié à la contention. Une manipulation incorrecte pourrait entraîner des effets indésirables, tels qu'une irritation ou une hémorragie mineure. Effets secondaires généraux : La progression de l’arthrite peut entraîner des douleurs chroniques persistantes, provoquant des comportements de retrait, une diminution de la mobilité et un état général altéré. Des troubles alimentaires et un pelage abîmé peuvent également apparaître.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques afin de répondre à la question scientifique.

Remplacement

L’utilisation d'animaux dans les études sur l'arthrite induite est indispensable en raison de l'absence de méthodes alternatives capables de reproduire la complexité du développement et de la progression de ces maladies auto-immunes. Ces études permettent de mieux comprendre les interactions complexes entre les cellules immunitaires, le collagène et les composants du cartilage, ainsi que les réponses inflammatoires spécifiques à l'arthrite rhumatoïde. Les réponses immunitaires, impliquant des interactions entre les cellules T, les cellules B, les anticorps et le collagène de type II, ne peuvent être pleinement explorées que dans un organisme vivant. Actuellement, les alternatives in vitro ou ex vivo ne permettent pas de reproduire l'ensemble des paramètres biologiques observés in vivo, notamment la réponse systémique à l'inflammation auto-immune.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2700 souris, un nombre déterminé à l’aide d’une analyse statistique rigoureuse pour s’assurer qu’il est suffisant pour obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Les expériences seront organisées de manière à optimiser le nombre d’animaux impliqués, en réduisant au maximum le recours à des groupes témoins tout en garantissant la validité scientifique des résultats. Si les premières expériences montrent que l’hypothèse de départ est invalide, l’étude sera immédiatement arrêtée afin d’éviter l’utilisation inutile d’animaux. Lors des prélèvements, plusieurs types d’analyses seront réalisés sur les tissus collectés (études immunologiques, observation des cellules et des tissus, analyses moléculaires), ce qui permettra d’exploiter au maximum les données obtenues à partir de chaque animal. Ces échantillons pourront également être partagés avec d’autres chercheurs pour éviter de multiplier les expériences et ainsi réduire encore l’utilisation d’animaux. Enfin, les résultats obtenus seront analysés à l’aide de méthodes statistiques adaptées afin d’en tirer des conclusions solides et fiables.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respecteront les normes réglementaires en vigueur, en collaboration étroite avec le personnel de l’animalerie. Les souris auront un accès libre à la nourriture et à l’eau, ainsi qu’à un environnement enrichi (matériaux de nidification, tunnels) afin de favoriser leur bien-être et de limiter le stress. Une surveillance quotidienne sera effectuée pour détecter précocement tout signe d’altération de l’état de santé. Une stratégie progressive de prise en charge de la douleur sera mise en place pour chaque modèle. Ce protocole permettra d'adapter l'analgésie à l'état clinique de l'animal. Le recours à des méthodes d'administration non invasives (eau de boisson enrichie en analgésique) sera privilégié chaque fois que possible. En cas de complication (plaie, réaction locale, difficulté alimentaire), des soins de support seront prodigués : application d’antiseptiques locaux, ajout de gel nutritionnel, et adaptation de l’enrichissement. En cas de comportement agressif, notamment chez les mâles, les animaux seront hébergés individuellement pour empêcher l’aggravation de blessures suite à des bagarres (blessures qui seront immédiatement soignées). Le personnel impliqué dans les procédures est formé aux bonnes pratiques en expérimentation animale et veillera à limiter le stress lors des manipulations. Les injections seront réalisées avec des aiguilles fines afin de réduire les traumatismes. Les animaux anesthésiés seront installés sur des tapis chauffants pour prévenir l’hypothermie, et leurs yeux seront protégés par l’application de gel ophtalmique. Les conditions d’hébergement, les soins et les protocoles pourront être ajustés en temps réel en fonction de l’état des animaux, dans une démarche continue de raffinement.

Choix des espèces

Le choix des souris comme modèle animal repose sur des raisons scientifiques solides. Les souris sont les plus utilisées en recherche grâce à une expertise confirmée en élevage, manipulation et suivi vétérinaire. Elles garantissent des résultats fiables et reproductibles, essentiels au développement de nouveaux traitements. Les lignées sélectionnées pour ce projet ont été choisies pour leurs caractéristiques adaptées à l’étude de l’arthrite rhumatoïde : Les souris seront utilisées dès 7 à 8 semaines, âge correspondant à un développement physiologique complet, garantissant des résultats fiables. L’utilisation de ces modèles est indispensable pour comprendre l’arthrite et tester des traitements innovants. Aucun modèle in vitro ou informatique ne permet aujourd’hui de reproduire cette complexité.

Toutes tuées pour analyse de leurs organes, 1 231 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie sous anesthésie générale leur implante des cellules tumorales dans le pancréas, suivie d'échographies hebdomadaires sous anesthésie, d'un à deux traitements par champ électrique pulsé par semaine et d'injections intratumorales ou intrapéritonéales répétées. Le porteur indique que la croissance des tumeurs pancréatiques peut entraîner une perte de poids et des signes de souffrance, et que la chirurgie du pancréas induit une douleur liée au geste. Les essais chez des patients atteints de cancer du pancréas restent une perspective, et le porteur écarte les cultures cellulaires en affirmant qu'elles ne peuvent représenter correctement la physiologie du développement tumoral.

Objectifs

Le cancer du pancréas est une maladie grave avec près de 100% de décès dans les 5 années suivant le diagnostic à cause d’un environnement tumoral dense empêchant la chimiothérapie d’atteindre sa cible, et d’une résistance à l’action du système immunitaire. Ainsi modifier cet environnement tumoral pour le rendre moins dense permettrait à la chimiothérapie et aux autres traitements d’être plus efficace. L’objectif de l’étude est d’observer si l’utilisation d’une thérapie par champ électrique pulsé permet de modifier l'environnement tumoral dans des zones précises, sans impacter les tissus sains, en rendant les cellules tumorales plus perméables à la chimiothérapie et plus sensible à l’action du système immunitaire et ainsi améliorer l’efficacité des traitements existants. Ce projet est multi-site, l'implantation de tumeurs dans le pancréas se faisant dans l'animalerie 1, les examens et la suite du projet sont réalisés dans l'animalerie 2.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de valider le traitement par champ électrique pulsé et réversible ainsi que les conditions de son utilisation pour envisager des essais thérapeutiques ultérieurs chez des patients atteints de cancer du pancréas.

Procédures

Intervention chirurgicale sous anesthésie générale (15 min maximum/souris) pour l’implantation des cellules tumorales. Alternativement, injection sous-cutanée de cellules tumorales (15 sec/souris). Suivi hebdomadaire de croissance tumorale par échographie sous anesthésie (8 min/souris). 1 à 2 traitements par champs électrique pulsé et réversible une fois par semaine (3 min/souris). Pour certains animaux, injection intrapéritonéale de traitement (10 sec/souris, 1 à 2 fois par semaine) ou injection intratumorale de traitement (10 sec/souris, 1 à 2 fois par semaine). Mesures de certains paramètres par injection intra-abdominale ou injection intraveineuse (20 min/souris, sous anesthésie générale), suite à une injection sous-cutanée d’antalgique 30 min avant (10 sec/souris).

Impact sur les animaux

La croissance des tumeurs dans le pancréas peut entrainer une perte de poids et des signes de souffrance. La chirurgie du pancréas induit une douleur liée au geste chirurgical. L’injection sous-cutanée de cellules tumorales cause une douleur modérée et un stress. Le suivi de la croissance tumorale hebdomadaire sous anesthésie peut causer du stress chez la souris. Les traitements par champs électrique peuvent causer un stress chez les animaux et des douleurs modérées. Les injections sous-cutanées pour soulager la douleur ou intrapéritonéales et intratumorales pour le traitement peuvent causer une douleur légère chez la souris. Les injections intrapéritonéales pour la réalisation de mesures invasives peuvent causer des douleurs et un stress pour les animaux. Le transport entre les animaleries 1 et 2 peut provoquer un stress léger. La présence de l'électrode et connecteur peuvent causer un inconfort léger chez la spuris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, pour analyses ex vivo des organes.

Remplacement

Des études in vitro ont été réalisées pour déterminer les réglages à utiliser pour les champs électriques pulsés et réversibles et documenter leur impact couplé à la chimiothérapie dans des modèles de culture cellulaire. Toutefois ces techniques ne peuvent représenter correctement la physiologie du développement tumoral permise par un modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit à ce qui est nécessaire pour être significatif à l'aide de test statistiques adaptés. Des outils d’imagerie non invasive seront utilisés pour suivre le développement tumoral, évitant des mises à mort séquentielles et limitant le degré de souffrance des souris, les tumeurs étant détectées très tôt.

Raffinement

Le suivi de la douleur sera réalisé une fois par semaine et des points limites clairs ont été définis, entrainant la mise à mort de l’animal si nécessaire. Un suivi est prévu toutes les semaines en post opératoire et après injection des traitements. L’échographie sera réalisée sous anesthésie générale, à celle-ci on ajoutera une analgésie adaptée lors de la chirurgie et des traitements et mesures. Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages disposant d’enrichissement. Le transfert des souris de deux établissements est réalisé dans des boites de transport simples car ces deux animaleries étant localisées dans le même bâtiment au même étage. Les animaux ne restent pas plus de 30 minutes en boites de transport et ne sortent pas à l’extérieur.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle permettant de mimer les tumeurs du pancréas humaines. Les souris seront utilisées à partir de l’âge adulte (8 à 10 semaines) afin de documenter l’impact des traitements sur un organisme mature.