Souris

La douleur est évaluée une fois par semaine, des points limites devant entraîner la mise à mort des souris qui se dégradent. 1 231 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse de leurs organes. Une chirurgie sous anesthésie générale implante des cellules tumorales dans le pancréas, puis viennent des échographies hebdomadaires sous anesthésie, une à deux séances de champs électriques pulsés par semaine et des injections dans la tumeur ou dans l'abdomen, chaque animal portant une électrode et son connecteur. L'objectif déclaré est de rendre l'environnement dense de la tumeur perméable à la chimiothérapie, les essais chez des personnes atteintes d'un cancer du pancréas étant renvoyés à plus tard.

Objectifs

Le cancer du pancréas est une maladie grave avec près de 100% de décès dans les 5 années suivant le diagnostic à cause d’un environnement tumoral dense empêchant la chimiothérapie d’atteindre sa cible, et d’une résistance à l’action du système immunitaire. Ainsi modifier cet environnement tumoral pour le rendre moins dense permettrait à la chimiothérapie et aux autres traitements d’être plus efficace. L’objectif de l’étude est d’observer si l’utilisation d’une thérapie par champ électrique pulsé permet de modifier l'environnement tumoral dans des zones précises, sans impacter les tissus sains, en rendant les cellules tumorales plus perméables à la chimiothérapie et plus sensible à l’action du système immunitaire et ainsi améliorer l’efficacité des traitements existants. Ce projet est multi-site, l'implantation de tumeurs dans le pancréas se faisant dans l'animalerie 1, les examens et la suite du projet sont réalisés dans l'animalerie 2.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de valider le traitement par champ électrique pulsé et réversible ainsi que les conditions de son utilisation pour envisager des essais thérapeutiques ultérieurs chez des patients atteints de cancer du pancréas.

Procédures

Intervention chirurgicale sous anesthésie générale (15 min maximum/souris) pour l’implantation des cellules tumorales. Alternativement, injection sous-cutanée de cellules tumorales (15 sec/souris). Suivi hebdomadaire de croissance tumorale par échographie sous anesthésie (8 min/souris). 1 à 2 traitements par champs électrique pulsé et réversible une fois par semaine (3 min/souris). Pour certains animaux, injection intrapéritonéale de traitement (10 sec/souris, 1 à 2 fois par semaine) ou injection intratumorale de traitement (10 sec/souris, 1 à 2 fois par semaine). Mesures de certains paramètres par injection intra-abdominale ou injection intraveineuse (20 min/souris, sous anesthésie générale), suite à une injection sous-cutanée d’antalgique 30 min avant (10 sec/souris).

Impact sur les animaux

La croissance des tumeurs dans le pancréas peut entrainer une perte de poids et des signes de souffrance. La chirurgie du pancréas induit une douleur liée au geste chirurgical. L’injection sous-cutanée de cellules tumorales cause une douleur modérée et un stress. Le suivi de la croissance tumorale hebdomadaire sous anesthésie peut causer du stress chez la souris. Les traitements par champs électrique peuvent causer un stress chez les animaux et des douleurs modérées. Les injections sous-cutanées pour soulager la douleur ou intrapéritonéales et intratumorales pour le traitement peuvent causer une douleur légère chez la souris. Les injections intrapéritonéales pour la réalisation de mesures invasives peuvent causer des douleurs et un stress pour les animaux. Le transport entre les animaleries 1 et 2 peut provoquer un stress léger. La présence de l'électrode et connecteur peuvent causer un inconfort léger chez la spuris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, pour analyses ex vivo des organes.

Remplacement

Des études in vitro ont été réalisées pour déterminer les réglages à utiliser pour les champs électriques pulsés et réversibles et documenter leur impact couplé à la chimiothérapie dans des modèles de culture cellulaire. Toutefois ces techniques ne peuvent représenter correctement la physiologie du développement tumoral permise par un modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit à ce qui est nécessaire pour être significatif à l'aide de test statistiques adaptés. Des outils d’imagerie non invasive seront utilisés pour suivre le développement tumoral, évitant des mises à mort séquentielles et limitant le degré de souffrance des souris, les tumeurs étant détectées très tôt.

Raffinement

Le suivi de la douleur sera réalisé une fois par semaine et des points limites clairs ont été définis, entrainant la mise à mort de l’animal si nécessaire. Un suivi est prévu toutes les semaines en post opératoire et après injection des traitements. L’échographie sera réalisée sous anesthésie générale, à celle-ci on ajoutera une analgésie adaptée lors de la chirurgie et des traitements et mesures. Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages disposant d’enrichissement. Le transfert des souris de deux établissements est réalisé dans des boites de transport simples car ces deux animaleries étant localisées dans le même bâtiment au même étage. Les animaux ne restent pas plus de 30 minutes en boites de transport et ne sortent pas à l’extérieur.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle permettant de mimer les tumeurs du pancréas humaines. Les souris seront utilisées à partir de l’âge adulte (8 à 10 semaines) afin de documenter l’impact des traitements sur un organisme mature.

Injectées d'un produit conditionnant leur organisme, puis greffées de cellules leucémiques dans la circulation sanguine, 120 souris subissent des prises de sang toutes les deux semaines pendant trois mois. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et la leucémie qui se développe provoque une anémie, un amaigrissement et une augmentation de la rate. Le porteur décrit des cultures en trois dimensions et des organoïdes de moelle osseuse capables selon lui de recréer un environnement proche du corps humain et de donner des résultats plus réalistes sans utiliser d'animaux, et retient malgré tout la greffe chez la souris. Le prélèvement de moelle osseuse et de sang après la mort est qualifié d'"indispensable".

Objectifs

Il s’agit d’étudier l’impact de l’absence d’une enzyme sur le développement des leucémies aiguës myélobastqiues.

Bénéfices attendus

Bénéfices attendus du projet Ce projet vise à améliorer la compréhension et le traitement des leucémies aiguës myéloblastiques (LAM), un type de cancer du sang. 1 - Avancées scientifiques • Mieux comprendre comment l'absence d’une enzyme influence le développement des leucémies. • Étudier l’impact de cette enzyme sur la survie des cellules cancéreuses. • Tester ces découvertes dans un modèle de souris pour confirmer les résultats obtenus en laboratoire. 2 - Développement de nouveaux traitements • Identifier de nouvelles cibles pour des traitements contre la leucémie. • Concevoir des médicaments capables de ralentir la progression de la maladie. 3 - Amélioration du diagnostic et du suivi des patients • Trouver de nouveaux indicateurs permettant de mieux prédire la résistance aux traitements. • Adapter les soins en fonction du profil biologique de chaque patient. 4 - Impact pour les patients • Développer de nouvelles options thérapeutiques pour les patients qui ne répondent pas aux traitements actuels. • Réduire les effets secondaires des chimiothérapies en combinant différents types de traitements. • Mettre en place une meilleure surveillance après le traitement pour éviter les rechutes. • Proposer des soins plus personnalisés et adaptés à chaque patient. 5 - Retombées sociétales et économiques • Faire avancer la recherche sur les leucémies et d'autres cancers. • Réduire les coûts des traitements en diminuant les hospitalisations et en évitant l'utilisation de médicaments inefficaces. Conclusion En résumé, ce projet pourrait permettre de mieux comprendre la leucémie, d'améliorer les traitements actuels et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques plus ciblées.

Procédures

1 – Contention • Les souris seront manipulées avec précaution pour minimiser le stress lors des différentes interventions, en utilisant des techniques adaptées de contention douce. • Une attention particulière sera portée à la durée de la contention afin de limiter son impact sur les animaux. 2 - Injections et conditionnement préalable • Les souris recevront un traitement par injection d’un médicament avant l’injection des cellules leucémiques. Ce traitement vise à préparer leur organisme à recevoir les cellules. • Nombre d’animaux concernés : 120 souris • Durée : une seule injection 24 heures avant la greffe des cellules. 3 - Greffe de cellules leucémiques • Les souris recevront une injection de cellules leucémiques dans la circulation sanguine pour reproduire un modèle de la maladie. • Nombre d’animaux concernés : 120 souris • Durée : une seule injection, environ 1 minute. 4 - Suivi de la maladie • Des prises de sang seront réalisées toutes les deux semaines (jusqu’à 3 mois après l’injection des cellules leucémiques) afin de surveiller l’évolution de la leucémie et d’analyser la réponse immunitaire. • Nombre d’animaux concernés : 120 souris • Durée : environ 1 minute par prise de sang

Impact sur les animaux

Malgré toutes les précautions prises pour assurer leur bien-être, certains effets secondaires sont attendus en raison de la nature de l’étude. Effets liés aux interventions expérimentales • Les traitements administrés avant l’injection des cellules leucémiques peuvent provoquer une fatigue passagère et une légère perte de poids. • Les prises de sang régulières, nécessaires au suivi de la maladie, peuvent entraîner un certain stress. Pour limiter cet inconfort, des techniques adaptées seront utilisées. Effets liés au développement de la maladie • La progression de la leucémie peut causer une anémie (diminution des globules rouges), une perte d’énergie, un amaigrissement et une augmentation de la taille de certains organes comme la rate.

Devenir

Mise à mort des animaux pour analyses scientifiques Toutes les souris seront mises à mort pour des analyses approfondies qui concernent principalement la moelle osseuse et le sang, éléments essentiels pour comprendre l’évolution de la maladie. • Justification : ces examens sont indispensables pour valider les hypothèses scientifiques du projet et pourraient aider à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la leucémie. • Méthode : la mise à mort sera réalisée selon des protocoles stricts garantissant une mort rapide et sans douleur, conformément aux réglementations en vigueur sur le bien-être animal.

Remplacement

Stratégies de remplacement de l’expérimentation animale Afin de limiter autant que possible le recours aux animaux, plusieurs méthodes alternatives seront utilisées pour mener cette étude sur la leucémie. 1. Expériences en laboratoire sur des cellules humaines • Des cultures de cellules leucémiques humaines seront utilisées pour observer comment une enzyme influence leur croissance et leur évolution. • Des modèles plus avancés, appelés cultures 3D et organoïdes de moelle osseuse, seront développés pour recréer un environnement proche de celui du corps humain. Cela permettra d’obtenir des résultats plus réalistes sans utiliser d’animaux. 2. Analyses informatiques et exploitation des données existantes • Des bases de données contenant des informations sur des patients atteints de leucémie seront analysées afin de repérer d’éventuels liens entre l’expression d’une enzyme et la progression de la maladie. • Ces approches bioinformatiques permettront de générer des hypothèses solides avant de tester de nouveaux traitements, réduisant ainsi le besoin d’expériences sur des animaux. 3. Études sur des cellules humaines en dehors du corps (ex vivo) • Des cellules souches du sang seront cultivées dans des conditions spécifiques pour étudier le rôle d’une enzyme sans passer par des tests sur des souris. • Des échantillons de moelle osseuse prélevés chez des patients atteints de leucémie permettront de valider les résultats obtenus en laboratoire. Conclusion L’objectif est d’utiliser autant que possible ces alternatives avant d’envisager l’expérimentation animale. Cependant, certaines questions scientifiques nécessitent encore un modèle biologique complet pour être étudiées, ce qui justifie l’utilisation de souris lorsque les autres méthodes ne suffisent pas.

Réduction

Ce projet met en place plusieurs approches pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant des résultats fiables et exploitables. 1. Optimisation des protocoles expérimentaux • Une planification minutieuse des expériences permettra de réduire le nombre de souris nécessaires tout en obtenant des données statistiquement significatives. • Chaque animal sera utilisé pour plusieurs types d’analyses afin de maximiser les informations obtenues, évitant ainsi d’avoir recours à un plus grand nombre de sujets. 2. Expériences préliminaires avant les tests sur animaux • Des tests seront d’abord réalisés sur des cultures cellulaires (in vitro) et des échantillons biologiques (ex vivo), afin d’identifier les conditions expérimentales les plus pertinentes avant de passer à des essais sur animaux. • Cela permettra d’éviter des expériences inutiles et de limiter le nombre de souris impliquées. 3. Utilisation de méthodes statistiques avancées • Des outils statistiques performants seront employés pour garantir des résultats fiables avec le plus petit nombre d’animaux possible. • Ces méthodes permettent d’optimiser les groupes expérimentaux en veillant à ce que chaque test apporte un maximum d’informations. 4. Partage des ressources et des résultats avec d’autres laboratoires • Une collaboration avec d’autres équipes de recherche permettra d’éviter de répéter des expériences déjà réalisées ailleurs. • L’exploitation de bases de données existantes sur la leucémie permettra d’affiner les hypothèses sans multiplier les tests sur animaux. Conclusion Grâce à ces stratégies, le recours aux animaux sera limité au strict nécessaire. Ces mesures s’inscrivent dans une démarche responsable et éthique, visant à réduire l’impact de l’expérimentation animale tout en poursuivant des avancées scientifiques essentielles pour la lutte contre la leucémie.

Raffinement

Afin de limiter le stress et la souffrance des animaux tout en garantissant des résultats scientifiques fiables, plusieurs mesures seront mises en place. 1. Techniques expérimentales adaptées pour minimiser l’inconfort • Les injections et prélèvements sanguins seront réalisés avec des techniques optimisées pour réduire la douleur et le stress des animaux. • Les expérimentateurs seront spécialement formés pour effectuer ces manipulations rapidement et avec le plus grand soin. 2. Surveillance attentive pour prévenir la souffrance • Les animaux seront observés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de détresse ou de douleur. • Des critères stricts seront appliqués : si un animal montre des signes avancés de souffrance ou de détérioration de son état de santé, il sera mis à mort de manière éthique et sans douleur pour éviter toute souffrance prolongée. 3. Amélioration des conditions de vie • Les souris seront élevées dans un environnement enrichi, comprenant des tunnels, des cachettes et une litière adaptée, afin de favoriser leur bien-être et de réduire leur stress. • Elles seront logées en petits groupes compatibles pour éviter l’isolement et favoriser un comportement naturel. 4. Formation et encadrement des chercheurs • Tous les chercheurs impliqués recevront une formation continue aux meilleures pratiques en expérimentation animale, pour garantir des manipulations respectueuses et éthiques. • Un dialogue constant sera maintenu avec le comité d’éthique et les spécialistes du bien-être animal, afin d’améliorer en permanence les protocoles et de s’assurer qu’ils respectent les dernières recommandations en matière de protection animale. Conclusion Grâce à ces mesures, l’impact des expériences sur les animaux sera réduit au minimum, tout en garantissant des conditions de vie optimales et un suivi rigoureux de leur bien-être.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour cette étude car elle représente un modèle particulièrement adapté à la recherche sur la leucémie humaine. Pourquoi utiliser la souris ? • Une grande similarité avec l’humain : le système de production des cellules sanguines (hématopoïèse) chez la souris fonctionne de manière très proche de celui de l’être humain. Cela permet de reproduire fidèlement les mécanismes impliqués dans le développement de la leucémie. • La possibilité de modifier son patrimoine génétique : grâce à des modèles génétiquement modifiés, les chercheurs peuvent étudier avec précision l’effet de l’absence d’une enzyme sur la maladie. • Une expérimentation contrôlée : la souris permet de tester l’évolution de la leucémie dans un organisme vivant, en réalisant des injections de cellules leucémiques, des traitements et des analyses de sang dans des conditions proches de celles utilisées en milieu clinique. • Un modèle rapide et efficace : les souris ont une durée de vie courte et se reproduisent rapidement, ce qui permet d’obtenir des résultats en un temps relativement réduit et d’évaluer l’évolution de la maladie sur plusieurs générations de cellules. Pourquoi utiliser des souris adultes ? Les études seront débutées sur des souris à un âge compris entre 8 et 12 semaines, car : • À cet âge, leur système sanguin est totalement formé et stable, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et reproductibles. • Leur taille et leur maturité physiologique facilitent les procédures expérimentales, comme les prélèvements et injections.

Une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis jusqu'à quatre injections d'immunothérapie : 1 008 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. La croissance des tumeurs est mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine, et le porteur indique qu'une crevasse ou une nécrose de la peau peut apparaître en fin de croissance tumorale. L'objectif déclaré est de savoir si une masse musculaire augmentée ralentit des tumeurs colorectales, hépatiques ou des mélanomes en modifiant la réponse immunitaire, avec un potentiel de transfert vers la clinique annoncé comme fort. Une partie des animaux est déficiente pour le gène de la myostatine, ce qui décuple leur masse musculaire, et le porteur décrit la souris comme la seule espèce où de telles mutations s'introduisent facilement.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de déterminer si l’augmentation de la masse musculaire permet de réduire la résistance des tumeurs colorectales, hépatiques et du mélanome à l’action antitumorale des cellules immunitaires en réponse à un traitement par immunothérapie dans des modèles murins de cancer colorectal, de carcinome hépatocellulaire ou de mélanome sous-cutanés chez les mâles et les femelles. Il a été mis en évidence qu’une masse musculaire décuplée chez des animaux déficients pour le gène de la myostatine est associée à une croissance tumorale ralentie et à une formation de polypes intestinaux moindre. Cependant, l’implication potentielle du système immunitaire dans ce processus n’a pas été évaluée et l'impact d'une masse musculaire supérieure sur la réponse à l'immunothérapie n'a jamais été étudiée chez ces souris transgéniques. Nous effectuerons des suivis de croissance tumorale et des isolements de cellules immunitaires infiltrant les tumeurs chez des animaux contôles ou déficients en myostatine traités ou pas par immunothérapie. Diverses équipes nationales et internationales étudient l’impact du cancer sur la perte de masse musculaire et la cachexie mais aucune n’a à ce jour exploré l’effet d’une masse musculaire préservée sur la réponse immunitaire antitumorale en utilisant notamment le modèle de souris déficient pour la myostatine. D'autre part les investigations menées à la fois chez les mâles et les femelles permettront d'évaluer l'effet immunorégulateur du sexe dans l'interaction entre le muscle et le système immunitaire dans un contexte de cancer.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'évaluer le rôle immunomodulateur du muscle dans un modèle préclinique afin de fournir un rationnel scientifique pour proposer des stratégies adaptées de maintien de la masse musculaire chez la patiente ou le patient atteint d'un cancer digestif ou d'un mélanome dans le but d'améliorer sa réponse à l'immunothérapie et de favoriser des rémissions à long terme. Le potentiel de transfert des résultats de ce projet vers une application clinique faisable est fort.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection d'une solution saline contenant les cellules tumorales d'une durée d'environ 10 secondes et entre 0 à 4 injections d'immunothérapie d'une durée d'environ 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux concernent: - le stress et la légère douleur lors de l'injection des cellules tumorales et des traitements - la douleur modérée possible en fin de croissance tumorale. En effet, l'apparition d'une crevasse ou d'une nécrose de la peau au niveau de la tumeur peut survenir, ce qui est vérifié au cours du suivi des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses cellulaires, biochimiques et moléculaires ultérieures.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, les évaluations de nouveaux agents thérapeutiques en oncologie doivent être réalisées sur les organismes vivants.

Réduction

Si le génotype n'a aucun effet sur l'efficacité de l'immunothérapie lors de l'expérience 2, les expériences suivantes visant à évaluer les modulations précoces de la réponse immunitaire et les réponses immunitaires mémoires ne seront pas réalisées. Aussi, si le sexe n'impacte pas les expériences 1 et 2, un seul sexe sera choisi pour les expériences 3 et 4. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires basé sur une variable biologique simple (taille de la tumeur) nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.

Raffinement

L'expérimentateur est formé et expert des modèles tumoraux garantissant des gestes techniques maîtrisés et une manipulation adéquate des animaux. La taille des tumeurs sera mesurée 3 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse. Cela permettra de s'assurer qu'elles restent inférieures à la taille classiquement utilisée comme point limite en cancérologie chez la souris. Ce suivi individuel permettra la surveillance du bien-être des animaux qui seront hébergés par groupe de cinq à six dans un établissement agréé. Dans le cas où certaines souris seraient proches d’un point limite, la surveillance deviendra quotidienne. Si un animal présente des signes de souffrance, les mesures nécessaires seront prises pour limiter la souffrance animale et un traitement pourra être administré selon les recommandations d'un vétérinaire.

Choix des espèces

La souris, outre l’avantage lié à ses caractéristiques physiologiques, est la seule espèce animale pour laquelle des mutations génétiques peuvent être relativement facilement introduites et générer ainsi des souris déficientes pour une cible particulière donnée. Ces modèles murins très standardisés permettent une meilleure reproductibilité de nos expériences. Enfin les outils d'évaluation du système immunitaire, notamment les anticorps pour la cytométrie de flux, sont très développés et nombreux chez la souris ce qui permet une investigation approfondie des diverses populations cellulaires d'intérêt. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 12 et 20 semaines d’âge) pour la mise en oeuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et une croissance musculaire stabilisée.

L'expérience s'arrête quand une souris perd 20 % de son poids ou quand sa tumeur cutanée dépasse 17 millimètres de diamètre, s'ulcère ou s'infecte. 936 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse des organes lymphoïdes. Elles reçoivent une à deux injections dans le sinus derrière l'œil, des cellules tumorales sous la peau après rasage, ou une infection par Listeria monocytogenes qui peut provoquer diarrhées et léthargie. Le porteur qualifie ces injections d'actes "ne générant aucun stress", et retient la souris au motif que 99 % de ses gènes sont orthologues à ceux de l'être humain.

Objectifs

Les réponses immunitaires efficaces contre les cellules cancéreuses et les pathogènes sont le résultat de processus cellulaires complexes et hautement coordonnés. Au cours des dernières décennies, d'importants efforts de recherche ont montré que les lymphocytes T jouent un rôle central dans le développement de ces processus. Le développement d'inhibiteurs de points de contrôle immunitaire est apparu comme un mode d'action efficace pour renforcer l'activation des lymphocytes T contre les cellules cancéreuses et à l’inverse pouvant contrôler les réponses auto-immunitaires. Les thérapies basées sur les récepteurs antigéniques chimériques constituent une deuxième approche fructueuse et offrent un moyen unique d'armer les lymphocytes T pour éliminer les tumeurs exprimant des antigènes spécifiques. Cependant, malgré le succès remarquable de l'immunothérapie, tous les patients ne répondent pas aux nouveaux traitements et certains développent des signes cliniques liés à des effets secondaires nocifs. La régulation de l’activation des lymphocytes T implique de nombreux acteurs moléculaires. À cet égard, le ciblage des composants moléculaires impliqués dans la signalisation des cellules T est très prometteur pour contrôler leurs fonctions effectrices. Dernièrement, il a été identifié une molécule appelée Intersectine 2 (ITSN2) qui semble contrôler les niveaux d’expression de récepteurs activateurs présents à la surface des lymphocytes T. L’analyse de la souris déficiente pour l’ITSN2, démontre un phénotype activé des lymphocytes T (mais pas de phénotype dommageable pour la souris). Le but de notre étude est donc d’évaluer dans quelle mesure l’inactivation de l’ITSN2 dans des modèles murins permettent de mieux contrôler le développement de tumeurs, d’infections ou l’apparition de maladies auto-immunes.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôle l’activation des lymphocytes T. Les expériences réalisées avec les modèles murins que nous possédons permettra d’identifier dans quelle mesure l’ITSN2 pourrait être une cible pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses mais aussi dans l’auto-immunité.

Procédures

Les injections intraveineuses en rétro-orbitaire réalisées pour le transfert adoptif seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress. Une à deux injections seront effectuées par souris, la procédure ne durera que quelques minutes. Les injections de cellules tumorales en sous-cutané seront également réalisées sous anesthésie gazeuse ne générant aucun stress et ne prendront que quelques minutes également. La contention pour raser les souris le jour précédant l’injection sous cutanée de cellules tumorales pourra générer un stress de courte durée qui sera minimiser la réalisation du geste par du personnel expérimenté.

Impact sur les animaux

Les injections intraveineuses en rétro-orbitaire réalisées pour le transfert adoptif seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress. Une à deux injections seront effectuée par souris (selon la procédure), la procédure ne durera que quelques minutes. La croissance tumorale pourra conduire à une perte d’appétit, une perte de poids et perte de sociabilité vis-à-vis des congénères. L’infection avec Listeria monocytogenes à des doses sub-léthales, est normalement contrôlé par le système immunitaire des souris de la souche C57BL/6. Les souris pourraient avoir une perte d’appétit, développer des diarrhées et être dans un état léthargique dans les premiers jours suivant l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés, les infiltrats cellulaires aux seins des organes lymphoïdes seront analysés. De manière générale, l'analyse des réponses immunitaires nécessite l'euthanasie des animaux à l'issue des procédures.

Remplacement

L’étude de processus complexes de développement de la réponse immunitaire dans un contexte tumoral ou auto-immunitaire ne peut être réalisée à ce jour qu’à l’aide de modèles in vivo. Afin d’étudier de nouvelles approches d’immunothérapie, l’utilisation de modèles murins est indispensable.

Réduction

Nous souhaitons étudier des populations cellulaires dont certaines sont rares mais dont la distribution suit une loi normale. Sur la base de nos expériences antérieures et des données de littérature, nous savons que des groupes de 6 animaux, analysés avec un test statistique nous permettent d’obtenir des résultats significatifs et doivent être réalisés en triplicat pour être publiables.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales du projet sont réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animale de notre établissement. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subi par les souris afin d'obtenir des données qui soient le moins biaisées possible par le "mal être" de l'animal. Une anesthésie générale sera utilisée durant les procédures expérimentales (transplantation de cellules tumorales, injection intraveineuse, immunisation). Suite à l’injection de cellules tumorales, de L. Monocytogenes ou à une immunisation, nous porterons une attention particulière à la taille de la tumeur (cas des tumeurs), au poids de l’animal mais aussi à leur posture et leur comportement en groupe. Les animaux seront observés quotidiennement post injection par les zootechniciens et un score prenant en compte des paramètres tels que l’apparence physique, la capacité à s’alimenter et à s’abreuver, le comportement et la réponse aux stimuli. Pour une souffrance avérée, un traitement analgésique sera mis en place en plus des mesures précédentes qui seront poursuivis. Dans le cas d'une croissance tumorale, en plus des paramètres suivis, l’aspect de la tumeur sera monitoré et les mesures de raffinement seront adaptés. Une perte de poids supérieure ou égale 20% par rapport au début de l’expérience, une tumeur cutanée de diamètre supérieur à 17mm ou une ulcération et/ou infection de celle-ci sera un critère d’arrêt de l’expérimentation. Pour toute expérience nécessitant une manipulation de l’animal, ceux-ci seront anesthésiés avec les méthodes autorisées. Les animaux sont hébergés dans des cages dont la surface est de 500 cm2.

Choix des espèces

Mus musculus, mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide, bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le système immunitaire adaptatif caractérisé par la présence de lymphocytes B et T en interaction avec les cellules dendritiques est issu de l’hématopoïèse laquelle est observée chez les vertébrés uniquement et sur le plan immunitaire, il existe de nombreuses similarités entre l’homme et le modèle souris. Les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour les études physiopathologiques de gènes. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge des souris adultes de 7 à 12 semaines seront utilisées.

Deux injections dans le cerveau, une heure d'opération chacune, puis une chirurgie terminale deux mois plus tard : 64 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse du cerveau. Seize d'entre elles subissent en plus trois prélèvements sanguins alors qu'elles sont éveillées. Le projet teste un vecteur viral censé apporter une copie fonctionnelle d'un gène défectueux, première étape déclarée vers une thérapie génique de certaines formes d'autisme. Toute souris dépassant un score de 15 sur la grille de surveillance est tuée, ce que le porteur présente comme la garantie qu'aucun animal ne subira de "souffrance prolongée".

Objectifs

Certaines maladies du spectre autistique sont des troubles graves qui affectent le développement et le fonctionnement du cerveau. Ces troubles comprennent des problèmes sociaux, des comportements répétitifs et des crises d'épilepsie, qui apparaissent dès l'enfance et affectent grandement la qualité de vie des individus et de leur famille. Aujourd’hui, les traitements ne font que réduire ces symptômes, mais ne réparent pas la cause du problème. Ce projet cherche une nouvelle solution appelée thérapie génique. L’idée est d’ajouter une “bonne copie” d’un gène défectueux pour aider le cerveau à mieux fonctionner. L’étude a trois objectifs : 1.Vérifier que le traitement atteint les bonnes cellules : Nous allons observer quelles cellules du cerveau peuvent recevoir cette nouvelle copie du gène. 2.Tester si le gène fonctionne bien : Nous vérifierons si les neurones traités produisent correctement la protéine dont ils ont besoin. 3.S’assurer que le traitement est sûr : Nous nous assurerons qu’il n’y a pas d’effets secondaires graves ou de dommages au cerveau, pour qu’un jour ce traitement puisse être utilisé chez l’homme. Ce projet pourrait constituer une étape majeure vers un traitement innovant et personnalisé pour les personnes atteintes de ces troubles.

Bénéfices attendus

1. Un nouveau traitement pour l’autisme : ce projet cherche une nouvelle façon de soigner certaines formes d’autisme causées par un problème dans un gène. Il vise à réparer ce dysfonctionnement dans le cerveau pour aider les neurones à mieux fonctionner. Ce traitement pourrait aussi servir pour d’autres maladies du cerveau. 2. Mieux comprendre l’autisme : en étudiant comment un gène défectueux affecte le cerveau, les chercheurs pourront mieux comprendre pourquoi certaines personnes développent de l’autisme ou de l’épilepsie. Ces découvertes aideront à améliorer les traitements et à mieux soigner d’autres troubles du développement cérébral. 3. Un pas vers un véritable remède : si les résultats sont positifs, ce projet pourrait mener à des tests sur l’homme et, à terme, à des traitements personnalisés. En résumé, cette recherche pourrait changer la vie des personnes atteintes d’autisme d’origine génétique et ouvrir la voie à de nouveaux traitements pour d’autres maladies du cerveau.

Procédures

Toutes les souris recevront deux injections intracérébrales (l'opération dure une heure), et après deux mois, pour le prélèvement du cerveau, une chirurgie terminale sous anesthésie sera réalisée. Une partie des souris, (16 animaux au total), feront l'objet d'une procédure de prélèvement sanguin (avec les animaux éveillés, cette manœuvre dure 30 secondes par animal), trois fois pendant la durée du projet.

Impact sur les animaux

Douleur et inconfort après l'opération. Les animaux peuvent ressentir une légère douleur au niveau de la tête ou de la mâchoire pendant environ 12 heures après l'opération. Stress associé à la manipulation, risque d'infection. Réactions locales à la plaie. La petite plaie à la tête pourrait s'infecter ou s'enflammer. Risque pour les connexions neuronales. Il existe un très faible risque que l'injection perturbe d'importantes connexions cérébrales, ce qui pourrait affecter certains mouvements.

Devenir

Dans cette étude, tous les animaux seront euthanasiés avec un chirugie terminale sous anesthésie à la fin de la procédure. Cette étape est nécessaire pour permettre l’analyse approfondie de leurs organes, notamment du cerveau, afin de mieux comprendre les mécanismes biologiques étudiés. Ces analyses, réalisées selon des techniques histologiques précises, sont indispensables pour obtenir des résultats fiables et avancés, contribuant ainsi à la recherche scientifique et médicale. Cette approche garantit également que les animaux ne subissent aucune souffrance prolongée, en accord avec les principes de bien-être animal et les réglementations en place.

Remplacement

Malgré les efforts continus pour développer des modèles alternatifs, l'utilisation de souris reste indispensable dans les études sur les maladies neurologiques, en raison de la complexité des processus biologiques impliqués et de la nécessité d'examiner ces mécanismes au sein d'un organisme vivant. Bien que les cultures de cellules souches neurales et les organoïdes cérébraux fournissent des informations précieuses sur les réseaux neuronaux, ils ne reproduisent pas entièrement le microenvironnement cérébral complexe, en particulier les interactions cruciales entre les différents types de cellules. Ces interactions sont essentielles pour comprendre les altérations des réseaux neuronaux dans des conditions telles que l'épilepsie ou certains comportements associés aux troubles du spectre autistique. Les progrès de la modélisation informatique permettent des simulations utiles de certains aspects des réseaux neuronaux, mais ces modèles sont limités par des données restreintes et la complexité des mécanismes neuronaux. Les souris, bien qu'elles ne reproduisent que partiellement les comportements et les altérations des réseaux humains, sont particulièrement utiles dans leurs versions génétiquement modifiées pour des gènes spécifiques. Ces modèles constituent une base précieuse pour l'étude du rôle de certaines protéines, permettant aux chercheurs de tester comment moduler ou restaurer l'expression des gènes dans le cadre de pathologies telles que l'épilepsie ou l'autisme, et ainsi de mieux comprendre des mécanismes similaires chez l'homme et de développer des traitements potentiellement plus efficaces. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons d'abord chaque vecteur viral en culture cellulaire pour nous assurer qu'il exprime correctement les protéines. Seuls les vecteurs qui passent ce contrôle de qualité en culture seront ensuite utilisés sur des animaux vivants, ce qui réduira la nécessité d'utiliser des modèles animaux uniquement lors des étapes cruciales de validation.

Réduction

Nous avons analysé les données antérieures de notre laboratoire et examiné la littérature existante afin de déterminer le nombre minimum d'échantillons nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Étant donné que nous incluons des animaux mâles et femelles et que nous comparons trois conditions différentes en utilisant des techniques d'histologie, nous avons soigneusement calculé la taille de l'échantillon nécessaire. Plutôt que de commencer avec un nombre fixe, par exemple 10 par groupe, nous optimisons le nombre d'animaux sur la base de notre expérience antérieure et des études publiées. Cette approche nous permet d'utiliser le moins d'animaux possible tout en maintenant la validité scientifique de nos résultats.

Raffinement

Tout au long du projet, toutes les mesures nécessaires seront mises en œuvre pour éviter tout impact négatif sur le bien-être des animaux. L'expérience respectera les impératifs éthiques, en intégrant des méthodes d'hébergement appropriées, l'enrichissement de l'environnement et la prévention de toute douleur, inconfort, stress ou détresse des animaux. Ils sont placés dans des avec une maison en carton, de la laine de coton et une roue d'exercice, afin de répondre à leurs besoins physiologiques et comportementaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur poids sera vérifié une fois par semaine. Des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés pendant les procédures pour réduire la douleur. Après les procédures, de la nourriture gélifiée et de l'eau seront placées sur le sol pour faciliter l'alimentation. Enfin, des points limites précis ont été établis pour suivre de près les effets des interventions. Les animaux présentant l'un des points limites ou un score supérieur à 15 dans ce tableau seront systématiquement euthanasiés.

Choix des espèces

L’objectif principal de ce projet est de développer un nouveau traitement. Avant d’y parvenir, nous devons d’abord tester la sécurité et l’efficacité de notre vecteur viral chez des souris. Nous utilisons de jeunes souris adultes âgées de 2 à 3 mois, car elles offrent plusieurs avantages. À cet âge, leur cerveau est complètement formé et elles sont en bonne santé, ce qui garantit des résultats fiables. Leur crâne est également suffisamment stable pour permettre des injections précises dans les régions spécifiques du cerveau. Cela nous aide à analyser où le vecteur se distribue et quels neurones il cible, ce qui est crucial pour améliorer la précision et la validité des résultats. Ce travail est une étape essentielle pour développer des solutions thérapeutiques innovantes pour des maladies complexes.

Deux séjours de quarante-huit heures seule en cage d'enregistrement pour 292 souris, une chirurgie d'injection intracérébrale de trente minutes pour 242 d'entre elles, puis une chirurgie terminale sous anesthésie pour prélever le cerveau : 350 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet cherche à relier un gène de l'hypothalamus antérieur au sommeil et à la thermorégulation, en s'appuyant sur les troubles du sommeil observés chez les personnes diabétiques. Les atteintes annoncées restent vagues, avec des "perturbations du rythme de sommeil" envisagées et une sensibilité après chirurgie dont les animaux "récupèrent habituellement en quelques heures". Le régime riche en graisses qui rend ces souris obèses et diabétiques figure dans la liste des effets néfastes, sans apparaître parmi les procédures décrites.

Objectifs

Les variations de glycémie liées à un diabète mal contrôlé sont fréquemment associées à des troubles du sommeil (sommeil fragmenté, cauchemars, apnées du sommeil, fatigue diurne) et à des défauts de thermorégulation (sueurs, hypothermie). L’hypothalamus antérieur contrôle plusieurs fonctions telles que le sommeil et la thermorégulation. Nous avons observé qu’un gène connu pour contrôler la synthèse de l’insuline en réponse au glucose dans le pancréas est également présent dans l’hypothalamus antérieur. Ce projet expérimental a pour but : (1) de caractériser anatomiquement et fonctionnellement les neurones exprimant ce gène dans l’hypothalamus ; (2) d’étudier le rôle de ce gène dans l’hypothalamus antérieur et sa régulation par le glucose; (3) d’établir dans quelle mesure la régulation de ce gène pourrait être responsable des troubles du sommeil et de la thermorégulation.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ce travail apportera une meilleure connaissance des réseaux neuronaux contrôlant le sommeil et la thermorégulation ainsi qu’un éclairage moléculaire nouveau sur le lien entre le diabète et certaines de ses comorbidités dans le système nerveux central. Ces connaissances fondamentales sont susceptibles d'ouvrir des pistes thérapeutiques nouvelles pour le traitement des troubles du sommeil associés au diabète, en ciblant par exemple les modifications post-traductionnelles de ce facteur de transcription.

Procédures

enregistrement de l'activite veille/sommeil en cage individuelle ( 2x 48h, n=292 souris ) procédure chirurgicale injection intracerebrale ( n= 242 animaux , durée de l'intervention : 30 minutes + 1h de reveil) chirurgie terminale sous anesthésie sans réveil en vue du prélèvement du cerveau (n=242 animaux durée analgesie 30 minutes avant +15 minutes)

Impact sur les animaux

En l’absence de stimulation, aucun phénotype dommageable n’a été rapporté les lignées murines utilisées dans ce projet. L’effet de la stimulation de ces quelques neurones de l'hypothalamus antérieur est transitoire (1h) et son effet sur les animaux sera suivi en continu. Des perturbations du rythme de sommeil sont envisagées. Les chirurgies sont susceptibles d’entrainer une sensibilité post chirurgie. Les animaux récupèrent habituellement en quelques heures. Le sommeil des animaux est enregistré en en cages individuelles. Le régime alimentaire riche en graisse induit une obésité et un diabète.

Devenir

les animaux sont mis a mort pour permettre l'analyse post-mortem de leur cerveau (expression de gènes et de protéines d'interêt)

Remplacement

Il n’est pas possible d’étudier une fonction physiologique complexe comme la régulation du sommeil hors d’un organisme vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est optimisé pour permettre de mettre en évidence le résultat de façon statistiquement significative (puissance du test 80% risque alpha 5%) tout en minimisant le nombre d’animaux requis . La taille des groupes est donc calculée dans chacune des procédures en fonction des effets attendus. Dans le cas de l'étude anatomique, uniquement descriptive, le nombre retenu (n=10) est celui généralement mentionné dans les publication anatomiques comparables. La séquence expérimentale est optimisée (ex : étude anatomique suivant les test de sommeil) de façon a minimiser le nombre d’animaux nécessaires à l’étude.

Raffinement

Les modèles conditionnels dans lesquels les modifications génétiques sont restreintes à quelques neurones de l’hypothalamus antérieur permettront d’éviter des phénotypes plus dommageables. Pour les enregistrements (48h), les animaux sont placés avec les memes elements d'enrichissement en cages individuelles où ils gardent un contact visuel entre eux. Les approches non invasives sont systématiquement privilégiées. L’administration par voie orale se fera, après habituation, en proposant le principe actif dans un petit volume de gélatine aromatisé aux fruits rouges. Lorsqu’une expérimentation nécessite une intervention chirurgicale, en plus de l’anesthésie générale, des anesthésiques locaux et des analgésiques seront systématiquement administrés en péri-opératoire.

Choix des espèces

L’existence et la disponibilité de souris génétiquement modifiées qui n’existent dans aucune autre espèce de vertébrés homéothermes (dont la température est régulée) nous permet d’entreprendre l’étude des mécanismes physiologiques complexes du système nerveux central tels que l'alternance veille /sommeil avec une approche causale du rôle d’un gène pour une fonction étudiée. Le rythme de sommeil, initialement très irrégulier avant le sevrage, mature progressivement. Le rythme de sommeil est considéré comme de type adulte 5 à 6 semaines après la naissance. De même, la thermorégulation, absente chez les souriceaux nouveaux-nés, se met en place progressivement. Nous enregistrerons donc le sommeil lorsqu’il est stable, sur des souris adultes, mais pas âgées, entre 2 et 6 mois.

1 660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées sous anesthésie, elles passent trois séances d'imagerie par semaine, subissent une irradiation localisée de la tumeur et, pour certaines, l'ablation chirurgicale de la tumeur primaire. Le porteur reconnaît que la croissance tumorale et les traitements réduisent la mobilité et affaiblissent les animaux, et espère montrer que des modulateurs du système immunitaire rendent le cancer du sein triple négatif sensible à la radiothérapie. Cet effectif de 1 660 souris n'est adossé à aucune donnée publique, le porteur indiquant qu'un "outil informatique" a servi à le calculer.

Objectifs

Le cancer du sein est la principale cause de décès par cancer chez les femmes dans le monde. En raison du manque de cibles thérapeutiques, le cancer du sein triple négatif (TNBC) est le sous-type le plus agressif et résistant aux thérapies standard. L'un des traitements courants du TNBC est la radiothérapie, mais la radiorésistance est un obstacle majeur dans cette malignité. Parmi tous les composants du microenvironnement tumoral, les cellules du système immunitaire sont hautement recrutés lors de la radiothérapie et des données antérieures suggèrent qu'ils sont associés à la résistance des cellules tumorales. Ici, nous prévoyons de comprendre le rôle des cellules du système immunitaire dans la modulation de la radiorésistance du cancer du sein et de valider les mécanismes associés. L'objectif principal de ce projet est donc d'identifier de nouvelles cibles (comme récepteurs sur les cellules) pour le développement de thérapies de sensibilisation à la radiothérapie.

Bénéfices attendus

Dans ce projet et à court terme, nous évaluerons l'efficacité antitumorale des modulateurs du système immunitaire dans la sensibilisation à la radiothérapie. Nous espérons démontrer la bonne efficacité de l'association de modulateurs du système immunitaire et de la radiothérapie pour obtenir des effets antitumoraux. À long terme, cette combinaison représente un modèle original et novateur de coopération thérapeutique dans la lutte contre le cancer du sein.

Procédures

Les animaux auront une injection de cellules tumorales (durée 1 minute, sous anesthésie générale). Les animaux auront 3 séances d'imagerie in vivo sous anesthésie générale (durée 10 minutes) par semaine. Les animaux subiront une irradiation localisée sur la tumeur par animal sous anesthésie générale (durée 10 minutes). Au cours de chaque injection de cellules et radiotherapie, les souris seront anesthésiées (anesthésie générale). Certaines souris auront des injections de médicament (n=2, anesthésie locale, durée 1 minute). Les tumeurs primaires seront retirées de certains animaux sous anesthésie générale (n=1, durée 10 minutes).

Impact sur les animaux

Le traitement ainsi que la façon dont croît la tumeur peuvent réduire la mobilité de la souris et affaiblir la souris, avec des retentissements locaux ou systémiques modérés. Les animaux subiront aussi du stress lors des préhensions pour examen, des injections sous anesthésie générale et des séances d'imagerie, qui leur occasionneront un stress ou une douleur légers et temporaires.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour études et examen sur tissus et sang post-mortem pour étudier les modifications/mécanismes biologiques induits par les différents traitements.

Remplacement

Les modèles animaux sont également necessaires pour étudier les effets des combinaisons thérapeutiques dans un contexte incluant le environnement tumoral, permettant aux cellules tumorales d'interagir avec l'environnement (incluant les cellules immunitaires dépendantes des médiateurs de type cytokine ou les cellules du reste de l'organisme). Ceci est important dans le contexte de la radiothérapie (par exemple, l'effet « bystander » de l'irradiation, c'est-à-dire les effets que les cellules irradiées peuvent exercer sur les cellules non irradiées à proximité ou à distance). Il n'existe pas de modèles de remplacement pour une telle étude.

Réduction

Les effectifs sont ramenés au minimum tout en gardant un effet statistique significatif. Un outil informatique a été utilisé pour calculer le nombre d'animaux nécessaires tout en prenant en compte des données préliminaires.

Raffinement

Toutes les interventions seront menées sous anesthésie locale ou générale. Un suivi quotidien clinique sera effectué. Des points limites précoces et précis ont été définis et seront strictement appliqués. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Leur environnement sera enrichi. De plus, en cas de perte de poids ou de sign d'affaiblissement, les animaux auront un aliment énergétique adapté, plus préhensile.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques: -La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie. -Génétique proche de celle de l’Homme et bien connue -Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. -Les modèles de tumeur étudiés sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité. Les souris seront âgées de 6 à 8 semaines, un âge où la souris est suffisamment mature. En effet, le cancer du sein apparaisse durant l'age adulte, l'utilisation de souris adulte permet donc de mimer au mieux l'environnement dans lequel se développe le cancer.