Souris
Exploration morphologique et fonctionnelle du système cardiaque de souris modèles pour les albinismes oculocutanés de type 3 et 8
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
Anesthésiées pour une échographie cardiaque de dix minutes puis tuées avant tout réveil, 192 souris porteuses de mutations liées à l'albinisme oculocutané entrent dans ce projet. Aucune chirurgie ni traitement autre que l'anesthésie n'est prévu, et le cœur est prélevé ensuite pour analyse moléculaire et tissulaire. Le porteur cherche des anomalies cardiaques qu'il décrit lui-même comme "discrètes" et sans impact sur la viabilité ni la physiologie générale des animaux, la forme d'albinisme la plus rare visée ici comptant moins d'une dizaine de cas recensés dans le monde. Le choix de la souris tient à la présence de mélanocytes dans son cœur, absents chez les vertébrés non mammifères.
Objectifs
Le laboratoire étudie deux nouveaux modèles murins d’une maladie génétique rare, l’albinisme oculocutané. Ces modèles ont été caractérisés principalement sur le plan ophtalmologique. Par ailleurs, des données de la littérature montrent que la souris albinos standard) présente des anomalies cardiaques avec perte d’élasticité des fibres dues à l’absence de pigment au niveau des valves cardiaques. La composition en pigment est altérée chez les patients et les modèles d’OCA3 et OCA8, de telle sorte que des intermédiaires toxiques sont susceptibles de provoquer des anomalies cardiaques spécifiques mais discrètes n’ayant aucun impact sur la viabilité et la physiologie générale. L’objectif de ce projet est de comparer sur le plan morphologique et fonctionnel le cœur des 3 modèles représentant des types distincts d’albinisme par rapport aux individus de référence en estimant la sévérité des phénotypes de chacun des modèles.
Bénéfices attendus
La forme d’albinisme oculocutané de type 8 (OCA8) est très rare. Nous avons identifié les premiers patients OCA8 en 2020 et moins d’une dizaine de cas sont recensés dans le monde depuis. OCA3 est un peu plus représenté, notamment en Afrique. Les modèles murins ont montré des anomalies au niveau cutané et ophtalmologique. Il est attendu que les intermédiaires de pigment accumulés chez ces modèles résultent en une toxicité cellulaire et tissulaire. La mise en évidence d’anomalies cardiaques spécifiques sera une indication pour un suivi cardiaque rapproché des patients souffrant d’une de ces formes rares d’albinisme.
Procédures
Les animaux seront soumis à l’échographie de type Ultrafast sous anesthésie (durée : 10 minutes). Aucune chirurgie ou traitement autre que l’anesthésie n’est prévue.
Impact sur les animaux
Des animaux en bonne santé et dont l’anesthésie ne présente pas de risque seront sélectionnés. Les nuisances pouvant être attendues sont celles que l’on retrouve lors d’une anesthésie générale gazeuse à l'isoflurane. Pas d’effet indésirable reconnu lié à l’utilisation des ultrasons. Les animaux ne présentent pas de phénotype dommageable connu.
Devenir
Après exploration par échographie Ultrafast, les animaux anesthésiés seront euthanasiés. Puis les tissus cardiaques seront échantillonnés pour analyse moléculaire et tissulaire.
Remplacement
Le rôle de la pigmentation des valves sur l’élasticité des fibres doit être exploré sur in vivo. Le modèle animal d’albinisme doit donc présenter un cœur avec des mélanocytes tapissant les valves et 4 cavités : 2 oreillettes, 2 ventricules, ce qui n’est pas le cas des autres animaux modèles potentiels
Réduction
Le nombre nécessaire et suffisant d’animaux pour une validation scientifique a été estimé en prenant en compte l’analyse statistique qui devra être menée pour comparer sur un mode quantitatif l’effet des différents variants
Raffinement
Les mesures de raffinement sont mises en place au cours de l’hébergement (cage collective sur portoir ventilés, 5 animaux maximum, litière et enrichissement adapté). Les animaux photosensibles au niveau de la rétine sont hébergés en éclairage réduit (cages en bas de rack non directement exposées aux néons de la pièce). Un suivi quotidien sera réalisé par des personnes formées, compétentes et soucieuses du bien-être animal, basées notamment sur l’apparence physique externe, la prise de poids et le comportement. Ces contrôles permettent de repérer tout animal en souffrance, d’en avertir le responsable du projet et de prendre les mesures appropriées. Afin d’éviter toute souffrance, les animaux seront anesthésiés et analgésiés quand nécessaire et des points limites seront déterminés afin de réduire la souffrance et/ou d’interrompre le protocole en cas d’apparition de signes de détresse. La réalisation de l’échographie sera réalisée sous anesthésie générale.
Choix des espèces
La souris présente des mélanocytes au niveau cardiaque au contraire des vertébrés non mammifères. Des données récentes de la littérature montre que ce modèle est approprié pour le projet. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 2 mois et 6 mois.
Caractérisation d’ un modèle de souris knock in pour le gène de la titine
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
Une perte de 20 pour cent du poids en une semaine met fin au protocole. 54 souris porteuses d'une mutation du gène de la titine vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la mutation provoquant chez elles faiblesse musculaire et troubles respiratoires ou cardiaques. Elles passent une vingtaine de minutes sous anesthésie gazeuse pour une mesure de pression artérielle et un test respiratoire, puis une trentaine de minutes sous anesthésie générale pour un test de force, à l'âge d'un an. La cohorte de quarante animaux sera tuée pour prélever organes et tissus, et le porteur précise que les animaux qui les ont engendrés le seront aussi, la lignée n'étant pas maintenue.
Objectifs
Au cours de ce projet, nous allons caractériser un modèle souris qui développe une myopathie avec des problèmes respiratoires graves. Cette myopathie représente 65% des cas mondiaux de myopaythies héréditaires avec insuffisance respiratoire précoce. L’étude de ce modèle souris permettra de mieux comprendre les causes de la maladie et pourra ainsi servir pour des essais de traitement de la maladie.
Bénéfices attendus
L étude de ce nouveau modèle de souris myopathe nous permettra de mieux comprendre cette maladie et en particulier d 'étudier l 'importance de l 'activité respiratoire et cardiaque. Toutes ces nouvelles connaissances nous permettront d 'envisager de nouveaux traitements mieux ciblés qui seront d 'un grand bénéfice pour les patients atteints de cette myopathie.
Procédures
Les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse d' une vingtaine de minutes dans un premier temps et à une mesure de la pression artérielle (phénotypage cardiaque) puis à un test respiratoire (plethysmographe). Ensuite ils subiront une anesthésie générale d 'une trentaine de minutes pour le test de la force musculaire.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle animal, les mâles et les femelles sont affectés avec une sévérité modérée (faiblesse musculaire, problèmes respiratoires et /ou cardiaques) ce qui peut générer un inconfort. Tous les animaux expérimentaux seront isolés temporairement ce qui peut générer un stress. L’induction de l’anesthésie nécessite la contention de l’animal peut générer un stress et/ou un inconfort. L’injection d’anesthésique peut induire une douleur ou un inconfort.
Devenir
Après la mesure de la force musculaire , les animaux de la cohorte (40) seront euthanasiés en vue de prélèvements d 'organes et de différents tissus. Les animaux ayant servi à la production de la cohorte seront également euthanasiés ( pas de maintien de la lignée).
Remplacement
Pour caractériser cette maladie ( myopaythie héréditaire avec insuffisance respiratoire précoce) et évaluer l’impact de cette mutation, nous souhaitons étudier le modéle souris porteur de cette mutation. Ce modèle étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permet d’étudier d’une part la physiopathologie et les conséquences de cette mutation. D’autre part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, respiratoire et cardiaque seraient impossible à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développerait pas et le bénéfice de la force musculaire, la fonction respiratoire et cardiaque ne pourraient pas être mesurées (REMPLACEMENT).
Réduction
Plusieurs tests seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle et en générant plusieurs portées par femelle. Pour la partie expérimentale, les tests cardiaques et respiratoires, peu invasifs, offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en utilisant les mêmes animaux au cours du temps. Ce point est essentiel car il permet de réduire de manière drastique le nombre d’animaux. Nos connaissances sur ces modèles animaux mutants et les études réalisées auparavant montrent que 10 souris par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante et statistiquement valable. Nous prévoyons 54 animaux pour cette étude (REDUCTION).
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des faiblesses musculaires modérées apparaissaient, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage (interaction sociale). Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage pour faciliter l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration ou problèmes de déplacements. Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront observés et pesés une fois par semaine; une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Afin de diminuer le stress lié à aux diférents tests, une session de familiarisation sera effectuée. Pour les tests nécessitant une anesthésie générale de l’animal, la respiration sera contrôlée visuellement, la température de l’animal sera régulée et maintenue à sa valeur basale à l’aide d’une lampe chauffante et un gel ophtalmique sera appliquée sur les yeux de l’animal afin de limiter l´assèchement des cornées. La phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères.(RAFFINEMENT).
Choix des espèces
La souris est une des seules espèces assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir un modèle de HMERF, une pathologie humaine. D'autre part, les souris ont des caractéristiques biologiques très utiles pour la recherche comme leur petite taille, une durée de vie plutôt courte et une durée de gestation courte. De plus, les souris sont couramment utilisées dans un grand nombre de recherches dans ce domaine, ainsi que dans notre équipe, ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec d'autres études et de mieux comprendre le pathomécanisme de cette maladie. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées in vitro car nous souhaitons étudier la fonction cardiaque, la fonction respiratoire et la fonction musculaire. Pour caractériser le phénotype de ces souris, les animaux seront étudiés à l âge d 'un an, ce qui correspond environ à la moité de la vie d 'une souris, sachant que chez l homme la pathologie se déclare vers 35/40 ans (envion demi- vie également)
Analyse du potentiel de biomatériaux innovants pour la régénération du muscle squelettique dans un modèle souris de perte volumétrique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 708 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie développe un diabète de type 2 sous régime riche en glucides et en lipides, avant de subir une chirurgie de trente minutes qui retire un volume de muscle et y implante un biomatériau, la plaie étant refermée par des sutures. Après cicatrisation viennent un test de course sur tapis de vingt minutes et une mesure de force musculaire sous anesthésie, le porteur signalant que la perte de mobilité postopératoire rend l'accès à la nourriture et à l'eau difficile. Les biomatériaux ont déjà passé des preuves de concept in vitro et ex vivo, ce que le porteur reconnaît avant de conclure qu'un "modèle physiologique complexe" reste nécessaire.
Objectifs
La perte musculaire volumétrique (VML) peut résulter de traumatismes ou de chirurgies (tumeurs, infections), affectant aussi bien les civils que les militaires. Elle entraîne des déficits fonctionnels et esthétiques permanents. Lorsque la fibre musculaire est endommagée ou lorsque la VML dépasse 20% de la masse musculaire, le tissu perd sa capacité à se régénérer, et une fibrose se développe, réduisant la fonctionnalité musculaire. La régénération musculaire repose sur l’action des cellules souches musculaires activées par l’inflammation pour reconstruire les fibres musculaires endommagées. Cependant, chez les diabétiques, la cicatrisation musculaire est ralentie par des mécanismes comme l’hyperglycémie, qui altère la microcirculation et diminue l’apport en oxygène. Il n’existe actuellement aucune solution clinique permettant de restaurer la fonctionnalité des tissus lésés. Pour traiter ces lésions, l’ingénierie tissulaire utilise des biomatériaux qui imitent la matrice extracellulaire naturelle pour soutenir les cellules et favoriser la formation de nouveaux tissus, tout en limitant la fibrose. Ce projet se concentre sur la régénération structurelle et fonctionnelle du muscle squelettique en utilisant des biomatériaux innovants.
Bénéfices attendus
Actuellement les lésions musculaires dues à des traumatismes, infections ou tumeurs sont mal tolérées par le muscle et entrainent des douleurs et une perte de fonctionnalité. Cette étude nous permettra d’identifier des biomatériaux à utiliser à des fins biomédicales afin de réparer ces lésions musculaires chez le patinent non diabétique et diabétique.
Procédures
Les souris subiront au maximum un prélèvement de sang à la queue pour une glycémie, une chirurgie musculaire sous anesthésie générale de 30 minutes, un test de performance de course sur tapis après cicatrisation de 20 minutes maximum, un test de mesure de force musculaire sous anesthésie générale + analgésie de 30 minutes.
Impact sur les animaux
Ci-dessous sont listés les étapes induisant des nuisances sur les souris lors des procédures. Douleur : chirurgie musculaire et implantation du biomatériau. Faim/soif : Mise à jeun de 4h, perte de mobilité après la chirurgie, difficulté à atteindre la nourriture et le biberon. Stress physique : Anesthésies médicamenteuse et gazeuse, plaies (présence de points de sutures sur la peau), réalisation des tests de fonctionnalité musculaire (test de performance de course sur tapis), diabète.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés car le prélèvement des muscles opérés (pour l'histologie) ne permet pas de garder les souris en vie.
Remplacement
Aucune autre méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation d’animaux pour la réalisation de ce projet car la régénération du muscle repose sur des interactions complexes entres les tissus lésés et les systèmes immunitaires et vasculaires ainsi que sur la coordination efficace de multiples types cellulaires. Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo de la biocompatibilité des hydrogels pour les cellules musculaires ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle physiologique complexe est nécessaire pour permettre de caractériser la cicatrisation histologique et la récupération de la fonctionnalité musculaire.
Réduction
Dans un premier temps la réalisation du geste chirurgical sera validée sur un groupe restreint de souris. Ensuite le projet a été conçu de manière à ne pas répéter les groupes témoins. Les effectifs ont été déterminés à l’aide d’outils statistiques. En nous appuyant à chaque fois sur les résultats précédents, nous pourrons identifier les conditions optimales de manipulation, ce qui permettra de limiter le nombre de groupes et de variations expérimentales. Cela contribuera à réduire le nombre de souris utilisées tout en garantissant la pertinence des résultats.
Raffinement
Afin de gérer la douleur des souris, elles recevront une dose d’analgésique avant la chirurgie musculaire et l’implantation du biomatériau, puis une deuxième injection après l’acte chirurgical et une fois par jour pendant 2 jours. La chirurgie musculaire sera réalisée sous anesthésie générale et une anesthésie locale sera appliquée sur la plaie. Les souris seront suivies et pesées tous les jours après la chirurgie avec ajout de nourriture humide et d’hydrogel dans la cage.
Choix des espèces
Au cours de ce protocole, nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes à proportion égale âgées d’au moins 8 semaines, connues pour développer un diabète de type 2 à la suite d’un régime riche en glucides et en lipides. La cicatrisation musculaire chez la souris présente des similitudes notables avec celle chez l'humain ce qui fait de cette espèce un modèle pertinent pour ce projet.
Etude de la réponse immunitaire spécifique du stade hépatique du paludisme dans un modèle de souris humanisée pour le foie
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Rendues immunodéficientes puis humanisées pour le foie dans le laboratoire de collaborateurs, 50 souris arrivent déjà porteuses d'hépatocytes humains avant le début du projet. Elles vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance légère, toutes tuées entre vingt-quatre heures et cinq jours après avoir reçu par voie intraveineuse le parasite du paludisme et des cellules immunitaires. Les effectifs reposent sur trois animaux par groupe expérimental et deux témoins, sans calcul de puissance, le porteur invoquant le coût du modèle. Il conclut à l'impossibilité de remplacer ces souris, tout en indiquant que des expériences in vitro menées en parallèle pourraient "peut-être à terme" justifier de s'en passer.
Objectifs
Le paludisme est encore aujourd’hui la première maladie parasitaire en terme de mortalité dans le monde avec 600 000 décès par an pour environ 250 millions de cas cliniques. Le paludisme est causé par le parasite Plasmodium et Plasmodium falciparum (P. falciparum) est l’espèce responsable de la majorité des décès concernant principalement des enfants de moins de 5 ans. A ce jour, aucun vaccin efficace n’est encore disponible. Durant son développement chez l'homme, le parasite se développe dans le foie et, il a été montré chez la souris, que ce développement dans le foie, appelé stade hépatique, peut être la cible de cellules du système immunitaire capables d’éliminer les cellules infectées. Cependant, aucune protéine parasitaire n’a encore été identifiée chez P. falciparum comme étant la cible de cette réponse immunitaire protectrice au stade hépatique chez l'homme. P. falciparum est strictement spécifique de l'homme, et nous avons récemment mis en place un modèle de souris humanisée permettant l’étude du stade hépatique de ce parasite in vivo. Ce modèle repose sur le remplacement de certaines cellules du foie de souris par des cellules humaines pour obtenir des souris humanisées. Pour ce projet, les souris seront humanisées dans le laboratoire de nos collaborateurs. Nous souhaiterions aujourd’hui évaluer la pertinence biologique de ce modèle humanisé, le plus proche à ce jour de la situation chez l’homme infecté par P. falciparum, pour la validation in vivo de cibles vaccinales pré-sélectionnées in vitro. Nous disposons pour cela de cellules immunitaires humaines spécifiques de protéines de P. falciparum. Les souris humanisées seront infectées avec le parasite P. falciparum puis recevront ces cellules du système immunitaire spécifiques de P. falciparum. Au maximum cinq jours après l'injection des cellules immunitaires les souris seront euthanasiées afin d’évaluer l’effet protecteur in vivo de ces cellules vis-à-vis du stade hépatique de P. falciparum. Ce travail représente l’étape ultime dans la validation de nouvelles cibles parasitaires en vue d’un développement vaccinal.
Bénéfices attendus
Ces expériences permettront de valider, in vivo, dans un modèle pré-clinique qui est le plus proche aujourd'hui de la situation in vivo chez l'homme, de nouvelles cibles vaccinales (des protéines parasitaires) pour le développement d'un vaccin antipaludique chez l'homme.
Procédures
Les souris seront anesthésiées entre une et deux fois pour procéder aux injections intraveineuses des parasites et celle des cellules du système immunitaire (geste de quelques minutes). Entre 24h et 5 jours plus tard, elles seront euthanasiées en vue des différents prélèvements et analyses nécessaires.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées sont immunodéficientes et présentent donc une sensibilité accrue aux infections. Les principales nuisances sont liées aux administration d'anesthésique et l'anesthésie, préalable à l'injection des parasites et des cellules. Les animaux pourront ressentir un stress lors des manipulations. L’anesthésie pourrait induire un stress thermique et dans de rares cas des complications (arrêt cardio-respiratoire, etc.). Une douleur/irritation est possible au site d’injection après réveil des animaux.
Devenir
Aucun animal n'est maintenu en vie à la fin du projet, ils sont tous euthanasiés pour l'analyse des résultats qui est faite sur les organes prélevés (foie et rate). En effet, l'analyse des résultats est faite sur des coupes des tissus et par analyse de biologie moléculaire sur des morceaux des tissus congelés.
Remplacement
Le parasite Plasmodium falciparum, agent du paludisme chez l'homme, étant un parasite strictement spécifique de son hôte humain il n'y a à ce jour pas de possibilité de remplacer ce modèle de souris humanisée. Néanmoins, en terme de prédiction de protection, la réalisation de ces expériences in vivo en parallèle d'expériences menées au laboratoire in vitro, nous permettra de déterminer si le modèle in vitro que nous développons est aussi puissant en terme de prédiction de protection que le modèle in vivo et dans ce sens, la réalisation de ces expériences nous permettra peut-être à terme de justifier de nous passer des souris humanisées dans ce cas précis.
Réduction
Sur la base d'autres études réalisées avec le même type de modèle de souris humanisées, nous avons estimé que des groupes expérimentaux de 3 souris et des groupes témoins de 2 souris sont suffisants pour répondre aux questions posées. Ainsi, 5 expériences impliquant chacune 10 souris humanisées (2 antigènes candidats et 2 antigènes témoins irrelevant testés par expérience) sont prévues, soit un total de 50 souris sur les 3 ans. Ces souris étant un modèle très exigeant et couteux, il n'est pas possible de les utiliser en grand nombre pour les expériences. La détermination des effectifs ne se base donc pas sur un calcul de puissance mais sur des travaux similaires publiés par d'autres équipes.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l'ensemble des procédures a été réfléchi pour permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant le stress et la douleur (anesthésie). Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique, en conditions de température et hygrométrie contrôlées et suivies, avec une vérification quotidienne des animaux. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères (l'hébergement individuel sera limité au maximum), en portoirs ventilés avec accès ad libitum à la nourriture et l'eau. L' environnement sera enrichi avec des carrés de lanière kraft, carrés de coton, batonnets en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Si un animal est hébergé individuellement (en raison d'agression entre congénères, dernier animal dans la cage..) alors il bénéficiera de deux enrichissements et sera suivi pour valider ce type d'hébergement. Les injections intraveineuses et l'euthanasie (seules étapes de manipulation des animaux dans ce projet) seront réalisées sous anesthésie afin de diminuer le stress et la douleur. Suite à l'anesthésie, l'absence de réflexe de retrait au pincement des coussinets plantaires sera vérifiée avant de poursuivre et la procédure sera poursuivie uniquement quand la souris sera sous narcose profonde. Pour palier à l'hypothermie due à l'anesthésie les souris seront placées sur un tapis chauffant jusqu'au réveil. Un suivi journalier post-anesthésie et injection des cellules du système immunitaire sera réalisé pour détecter le moindre signe de souffrance animale. Le poids des animaux sera évalué tous les 5 jours et plusieurs paramètres d’apparence et de comportement seront évalués journalièrement pendant l'expérimentation. Si besoin, les animaux seront anesthésiés et euthanasiés avant la fin de l'expérience.
Choix des espèces
Le choix de la souris a été dicté par le fait qu’elle est le modèle le mieux développé et connu pour les greffes de cellules hétérologues, et les lignées immunodéficientes et transgéniques pour les gènes d’intérêt permettant la greffe d’hépatocytes et de globules rouges hétérologues n’existent que chez la souris. Les animaux seront des animaux adultes qui seront utilisés entre 3 et 4 mois d'âge car la transplantation des hépatocytes humains se fait à environ 2 mois et nécessite d'attendre 4 à 6 semaines pour que l'humanisation des souris soit maximale.
ROLE DU CANAL TRPV6 DANS LES METASTASES DONT LES METASTASES OSSEUSES DU CANCER DE LA PROSTATE
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Injectées de cellules cancéreuses humaines sous la peau, dans le cœur, dans une veine ou directement dans le tibia, 832 souris immunodéficientes entrent dans un protocole pouvant durer trois mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent ensuite des anticorps deux fois par semaine par voie intrapéritonéale, et passent une à deux fois par semaine sous anesthésie pour que leurs tumeurs soient photographiées. Le porteur décrit prostration, perte de poids, pelage dégradé, morsures entre animaux et, en cas de métastases osseuses, une lyse de l'os suivie aux rayons X. Toutes sont tuées à la fin de chaque protocole, mise à mort que le porteur présente comme un moyen "de mettre fin à la souffrance des animaux".
Objectifs
Un vaste ensemble de preuves suggèrent que l'expression de la protéine TRPV6 est un événement commun dans le développement du cancer de la prostate. En effet, cette protéine qui constitue un canal calcique est totalement absente dans la prostate saine mais devient de plus en plus exprimé au cours du développement du cancer jusqu'à être présente chez 100% des patients ayant des stades tardifs du cancer. Pourtant, le rôle de cette protéine dans le développement des métastases et notamment les métastases osseuses (apparaissant majoritairement chez les patients atteint du cancer de la prostate) reste entièrement méconnu. Pour cela, notre projet vise à étudier la possibilité de cibler et supprimer des tumeurs et des métastases exprimant TRPV6 en utilisant un modèle de xénogreffe de cellules cancéreuses humaines dans des souris immunodéficientes afin de déterminer la faisabilité du traitement par notre anticorps TRPV6 ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués. Afin de préciser le rôle du canal TRPV6 dans la formation de métastases in vivo, dont les métastases osseuses, il est nécessaire d’utiliser plusieurs modèles d’injection qui reflètent divers mécanismes/étapes de cancérogénèse.
Bénéfices attendus
Retombées scientifiques et économiques attendues : Comme partie fondamentale du projet, nous allons d’abord démontrer le rôle du canal TRPV6 dans l’acquisition du phénotype agressif/métastatique tels que la migration, l’invasion et, et ainsi évaluer son implication dans le guidage et l’installation des cellules cancéreuses dans l’os. Ces données nous permettront de corréler la présence/expression de ce canal à sa fonction pathophysiologique particulière et le proposer comme outil de diagnostique en clinique. Ce dernier point est crucial pour le diagnostic du cancer de la prostate pour éviter un sur-traitement inutile et possiblement nocif pour le patient. L’application la plus importante de ce projet sera la preuve de concept de la stratégie thérapeutique en utilisant l’anticorps mabTRPV6 afin de cibler spécifiquement et de stopper les tumeurs exprimant TRPV6. Finalement, nos outils pour cibler TRPV6 in vivo comme mabTRPV6 seront validés pour être humanisés et utilisés chez l’humain. Les perspectives quant à la possibilité d’empêcher l’apparition de métastases et/ou leur expansion, notamment, les métastases osseuses, seront également considérées afin de les mettre sur l’échelle des essais cliniques.
Procédures
Tous les animaux seront soumis une fois à l'injection de cellules cancéreuses sous anesthesie par isoflurane : soit par la voie souscutanée: 260 animaux, soit par la voie intracardiaque: 221 animaux, soit par la voie intraveineuse: 130 animaux, soit par la voie intratibiale : 221 animaux. Les injections des cellules cancéreuses réalisées sont faites sur un temps relativement court (30 secondes maximum par souris). Les animaux seront ensuite traités quotidiennement par injection intrapéritoneale avec des anticorps monoclonaux anti-TRPV6 (2 fois par semaine) pour suivre le développement des tumeurs (acte rapide nécessitant seulement quelques secondes par souris pour le traitement et environ 30 secondes pour mesurer la taille tumorale à l'aide du pied à coulisse). La durée de l'expérience peut s'étaler jusq'à 3 mois (temps maximal nécessaire pour avoir un développement tumoral complet). Les tumeurs seront photographiées une à deux fois par semaine sous anesthésie par isoflurane pour suivre le développement des métastases et cela nécessitera de les garder sous anesthésie environ 5min sous isoflurane le temps de l'endormissement et de l'acquisition (2 minutes). Chaque acte réalisé est effectué sur un temps le plus court possible afin de limiter le stress des animaux tout en effectuant des gestes sûrs et précis. Au maximum, cela représentera 832 animaux.
Impact sur les animaux
L’injection de cellules cancéreuses entraînera l’apparition de tumeur qui constituera la nuisance principale attendue. Des signes de stress peuvent apparaître à la suite du développement de la tumeur : prostration, perte de poids, pelage dégradé ou encore des comportements agressifs avec morsures qui seront suivis quotidiennement. Dans le cas où des métastases osseuses apparaissent, il peut également y avoir une lyse osseuse (qui sera suivie par rayons X). L’anesthésie par isoflurane ne constitue qu’une nuisance légère, les souris se réveillant extrêmement rapidement (quelques secondes).
Devenir
Afin de mettre fin à la souffrance des animaux, à la fin de chaque protocole, les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Les caractéristiques morphologiques, physiologiques et immunologiques de la souris ne sont pas reproductibles in vitro. L’utilisation d’animaux d‘expérimentation est particulièrement pertinente dans le cadre de recherche en cancérologie reflétant ce qui se produit en pathologie humaine. De plus, le trafficking/guidage et l’installation dans l’os au niveau d’un organisme entier n’est pas reproductible in vitro.
Réduction
Réduction : Des analyses statistiques ont été utilisées afin de déterminer la taille des groupes nécessaires à la génération de données fiables. Afin d’observer une différence statistiquement significative entre deux groupes, 10 souris par groupe expérimental (nombre de groupes: 13) seront nécessaires pour réaliser un test de Wilcoxon requis pour ce type d’étude. Nous ferons donc 3 protocoles de 130 souris chacun. Des expériences préalables ont été effectuées dans le but de déterminer la dose optimale de mAbs, ne permettant pas de réduire le nombre d’animaux. Pour les procédures concernant les injections intracardiaques et intratibiales, 17 souris par groupe expérimental (13 groupes) seront nécessaires. Pour réduire au maximum le nombre de souris utilisées, nous nous entraînerons avant chaque début d'expérience sur des souris ayant été préalablement euthanasiées issues de récupération d'autres expériences au sein de l'animalerie pour optimiser notre taux de réussite (qualité d'injection) et de prise de la xénogreffe et ainsi réduire au maximum le nombre de souris nécessaires dans nos groupes.
Raffinement
Raffinement : Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans un environnement enrichi (tunnel en papier, batôn à ronger, coton) pour réduire le stress des animaux et aucun nouvel animal ne sera introduit dans des groupes déjà formés. L'environnement des animaux, l'équipement, système d’abreuvoir, la qualité de l’eau, la nourriture et la litière seront révisés régulièrement. L’état de bien être des souris sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (perte de poids, aspects du pelage, morsures, etc). Les expérimentations se feront dans un environnement confiné. Lors de chaque anesthésie, la température des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de coussins chauffants. En cas de plaies causées par les souris (lutte entre animaux), des soins seront immédiatement prodigués afin de réduire la douleur. En cas de signes graves de stress associé à un des points limites, les animaux correspondant seront mis à mort afin de mettre fin à leur souffrance.
Choix des espèces
Les souris swiss nude sont couramment utilisées en oncologie. Elles sont immuno-déficientes, ce qui permet l’injection de cellules tumorales humaines et reproduire les tumeurs humaines in vivo. Elles ne possèdent pas de lymphocytes T, mais les autres cellules du système immunitaire (lymphocytes B, macrophages, cellules dendritiques, cellules NK) sont présentes et ne sont pas affectées dans leurs fonctions. Les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 5 semaines. L’incidence, et le développement des tumeurs humaines est très faible chez les animaux plus âgés.
Effets de l’IL-1 sur la réponse à la chimio-immunothérapie dans des modèles de cancers du poumon murins
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une injection de cellules cancéreuses dans le flanc droit, sous anesthésie gazeuse, ouvre le protocole pour 1 840 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La masse tumorale peut gêner leurs déplacements, et le porteur décrit une altération possible de l'état général, perte de poids, posture douloureuse, léthargie, arrêt du toilettage. L'objectif est de mesurer l'effet d'une cytokine inflammatoire sur l'efficacité de chimio-immunothérapies déjà utilisées en clinique contre le cancer du poumon. Les effectifs annoncés geste par geste, 920 souris pour la chimiothérapie, 2 080 pour un traitement répété trois fois par semaine et 640 pour un autre, dépassent le total de 1 840 déclaré.
Objectifs
Le cancer du poumon fait partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Son traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies et/ou d’immunothérapies, qui malheureusement ne conduisent pas systématiquement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de la résistance aux traitements. L’IL-1β est une cytokine inflammatoire ayant un rôle ambigu dans le cancer et dans la réponse aux traitements. Le but de ce projet est d’évaluer les effets de l’IL-1β sur l’efficacité antitumorale des chimio-immunothérapies utilisées en clinique, dans différents modèles de cancers du poumon chez la souris. Nous étudierons également les cellules immunitaires dans les tumeurs. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est d’évaluer les effets de l’IL-1β, sur l’efficacité anti-tumorale des chimio-immunothérapies, utilisées en clinique dans 2 modèles de cancers murins. Ce projet permettra également de déterminer son mécanisme d’action. Dans ce projet, nous évaluerons l’efficacité des traitements sur la croissance tumorale. Etant donné que certaines cellules du système immunitaire peuvent contribuer à l’élimination des cancers, nous étudierons leur présence et leur état d’activation au niveau des tumeurs, chez les souris traitées ou non par chimio-immunothérapie. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux tumeurs et de rechercher des moyens de potentialiser les effets de la chimio-immunothérapie, jusqu’alors peu efficaces dans le traitement du cancer. L’identification d’un rôle de l’IL-1 dans la sensibilisation aux traitements aura des avantages à court terme, comme la validation (ou non) de nos résultats précédents in vitro et à long terme en confirmant l’intérêt de trouver et tester des molécules induisant cette voie chez la souris (futur projet) puis chez l’Homme.
Procédures
- Injection des cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 5 minutes - Nombre de souris : 1840. - Traitements par chimiothérapie : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 920 - Traitements : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 2080 - Traitements: - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 640
Impact sur les animaux
L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite (perte de poids, posture douloureuse, léthargie, absence de toilettage).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. afin de prélever la tumeur et l’analyser.
Remplacement
Le cancer du poumon est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.
Réduction
Les groupes seront constitués de 10 animaux (suivis de croissance) ou de 5 animaux (immunomonitoring) afin de considérer les variabilités inter-individuelles. Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude tout en en conservant la puissance statistique nécessaire. Les expériences de croissances tumorales seront réalisées en premier. Ce projet est divisé en 3 sous-parties. Si aucun effet thérapeutique n’est observé dans la première partie, le projet sera stoppé. Si aucun effet n’est observé en partie II, le projet sera stoppé à ce stade.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (en groupes, dans un environnement enrichi avec mise à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids). Les animaux seront habitués aux techniques de préhension de contention et de pesées. Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe et pour les traitements intra-tumoraux. Durant toute l’expérience, suivi du poids au minimum trois fois par semaine. L’apparition d’éventuels points limites sera recherchée. Le volume tumoral sera déterminé trois fois par semaine, afin d’appréhender au plus tôt d’éventuels signes de souffrance.
Choix des espèces
Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.
Développement de modèles d’études précliniques de la résistance thérapeutique dans les leucémies aiguës myéloïdes et validation de nouvelles cibles thérapeutiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris utilisées ont un système immunitaire déficient, condition posée pour qu'elles acceptent la greffe de cellules leucémiques humaines. 8 100 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une injection intrapéritonéale puis une injection intraveineuse quarante-huit heures plus tard, elles reçoivent des injections quotidiennes sur animal vigile pendant une à trois semaines, certaines subissant en plus des séances d'imagerie ou des ponctions de moelle osseuse sous anesthésie. Toutes seront tuées, le porteur indiquant que la souche immunodéprimée et la greffe humaine interdisent de les garder en vie.
Objectifs
Les Leucémies Aigües Myéloïdes (LAM) sont un cancer du sang et de la moelle osseuse pour lequel la majorité des patients rechutent à cause de la présence de cellules leucémiques qui ont résisté à la thérapie. L’objectif de l’équipe est d’explorer les pistes pouvant être impliquées dans ce processus de résistance et de trouver des stratégies thérapeutiques ciblées. En effet, nous avons découvert que le métabolisme des cellules joue un rôle important dans la résistance, tout comme les mutations génétiques. L’hôte est également un environnement intéressant puisque les cellules leucémiques interagissent directement avec les autres cellules du microenvironnement pour survivre aux différentes thérapies. Notre objectif est d'utiliser nos modèles précliniques pour mimer les différents paramètres cliniques observés à la suite d'une prise en charge thérapeutique : quantification de la charge tumorale post-traitement, mesure de la survie globale des patients selon leur prise en charge, mesure du risque de récidive (apparition des rechutes). A l'issue de nos études, le but est de comparer les différents schémas de traitement et d'étudier les mécanismes de résistance associés pour trouver des combinaisons thérapeutiques efficaces.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à la découverte de nouvelles combinaisons thérapeutiques avec des thérapies existantes, ou bien de nouvelles molécules en ciblant de manière différente les cellules chimiorésistantes (types inhibiteurs). Nous pourrions également établir différents groupes de patients selon les caractéristiques moléculaires de la maladie, et ainsi prédire la réponse à la chimiothérapie puis orienter les types de patients vers un autre type de thérapie ciblée.
Procédures
Au début de chaque protocole, tous les animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale puis intraveineuse 48h après. Ils recevront ensuite des injections vigiles d’une minute pour permettre l’administration du traitement pendant une durée de 1 à 3 semaines. Certains animaux recevront en plus une injection de moins d’une minute pour imagerie (acquisitions de 30 secondes après une anesthésie de 15 minutes). D’autres seront anesthésiés pendant 10 à 15 minutes pour supporter un prélèvement de sang ou de moelle osseuse.
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient être confrontés à des effets indésirables tels que du stress, des symptômes liés à l'apparition de la maladie, une gêne physique en cas d'administration thérapeutique prolongée. La fréquence d'administration, la dose et les volumes de traitement seront choisis optimiser le confort des animaux et tous les traitements utilisés auront pour but de réduire la charge tumorale. En revanche, tout signe de douleur observé mettra fin à l'expérimentation pour l'animal concerné.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasiés pour étudier les échantillons biologiques issus des animaux. Dans chaque cas, la souche étant immunodéprimée et les animaux ayant reçu une greffe de cellules humaines, ils ne peuvent être gardés en vie.
Remplacement
Les modèles in vitro existants de Leucémie Aiguë Myéloïde seront utilisés en première intention pour connaître la sensibilité des cellules leucémiques seules aux différentes traitements. En revanche l'utilisation des modèles in vivo reste nécessaire pour pouvoir étudier le développement tumoral au sein du microenvironnement, et le comportement/mécanisme de résistance des cellules leucémiques dans l’organisme vivant auquel elles s’adaptent.
Réduction
Les effectifs des cohortes seront calculés et limités par un logiciel de simulation et l’outil statistique. Les études antérieurement effectuées permettront d’optimiser le nombre d’animaux et le nombre d’échantillons issu de l’animal.
Raffinement
L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l’animal, en optimisant la voie et le volume d'injection, et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée s'il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à la procédure.
Choix des espèces
Le modèle murin est caractérisé dans la compréhension des pathologies cancéreuses et la recherche biomédicale. Il est très utilisé dans le criblage de nouvelles molécules du fait de sa similitude de nombreux gènes avec ceux de l’humain, ce qui permet d’étudier la résistance des cellules aux traitements. Il présente aussi des avantages pratiques tels qu’une reproduction et une croissance rapide, et une facilité de manipulation et d’adaptation aux conditions expérimentales ainsi qu’un coût moindre. Nous utilisons des souris avec un système immunitaire déficient qui permet d'étudier la leucémie aiguë myéloïde humaine in vivo. Nous pourrons aussi utiliser d'autres souches immunodéprimées développées par des laboratoires de production afin d'optimiser nos modèles. La procédure utilise des animaux âgés de 6 minimum à 10 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent ainsi une meilleure prise de greffe leucémique. Nous n'utiliserons pas d'animaux âgés de moins de 6 semaines car leur développement est encore en cours et le microenvironnement de la moelle osseuse pas totalement formé.
Evaluation chez la souris d’une nouvelle immunothérapie pour lutter contre les cancers
- Recherche appliquée
- Cancers
1 980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales puis une à trois injections de traitement, la tumeur qui pousse sous la peau étant mesurée au pied à coulisse jusqu'à gêner les déplacements de l'animal. Ulcérations, baisse de température, perte de poids et difficultés respiratoires figurent aussi parmi les effets possibles de la croissance tumorale. L'objectif est de documenter une protéine immunomodulatrice déjà repérée par criblage in vitro, le porteur indiquant que ces études chez l'animal sont "requises" pour que le candidat médicament soit autorisé à passer en clinique.
Objectifs
Au cours de la dernière décennie, les approches immunothérapeutiques ont révolutionné le traitement des cancers et constituent un domaine de recherche en plein essor. Les immunothérapies visent à rendre le système immunitaire plus à même de détruire les cellules tumorales. Cependant, la proportion de patients répondant à ce type de médicaments est pour l’instant trop faible. De plus, ces traitements s’avèrent inefficaces pour certains types de cancers (pancréas, glioblastome, etc.). Pour pallier ces limites, nous tentons de créer de nouveaux médicaments immunothérapeutiques. Nous avons développé une technologie permettant de produire une grande variété de protéines immunomodulatrices, c’est-à-dire capables de moduler l’activité du système immunitaire. Sur la base de tests (cribles) d’activité immunologique réalisés in vitro, nous avons identifié et sélectionné une protéine immunomodulatrice capable de limiter, chez un modèle souris, la croissance tumorale de deux cancers différents. Ce composé pourrait représenter un médicament pertinent pour lutter contre les cancers. Ces premiers résultats prometteurs doivent maintenant être complétés par des études approfondies d’efficacité thérapeutique, de mode d’action et d’innocuité, réalisées chez l’animal. En effet, il est requis de fournir ces études pour que le candidat médicament soit ensuite autorisé par les autorités règlementaires à être évalué en clinique, chez des patients atteints d’un cancer. L’objectif de notre projet est de réaliser ces études précliniques approfondies. Nous évaluerons le candidat médicament pour sa capacité à induire les défenses immunitaires et le contrôle d’un large panel de cancers afin de déterminer ceux pour lesquels il pourrait constituer un traitement pertinent. Nous l’évaluerons aussi en association avec d’autres immunothérapies actuellement utilisées chez le patient afin de déterminer le bénéfice de traitements combinés.
Bénéfices attendus
La proportion de patients répondant aux immunothérapies anticancéreuses actuelles est pour l’instant trop faible et l’efficacité de ces traitements varie en fonction du cancer dont le patient est atteint. La caractérisation approfondie de l’efficacité thérapeutique et du mode d’action de notre candidat médicament permettra de progresser dans : i) l’identification des types de cancers pour lesquels il peut s’avérer efficace, ii) l’évaluation du bénéfice procuré par son association avec d’autres immunothérapies déjà commercialisées, iii) la définition d’un dosage optimal pour une efficacité maximale et une toxicité minimale. Les études précliniques réalisées dans ce projet ouvriront la voie à l’évaluation clinique de l’innocuité et de l’efficacité du candidat médicament chez le patient.
Procédures
Les animaux subiront une injection de cellules tumorales, puis une à trois injection(s) des traitements sera(ont) réalisée(s). Deux prélèvements de sang seront réalisés avec un intervalle de six jours. Les injections et prélèvements de sang seront réalisés en quelques minutes. La croissance de la tumeur sous-cutanée sera suivie par mesure au pied à coulisse. Pour éviter tout stress, les animaux seront anesthésiés avant chaque intervention. Les 1980 animaux mentionnés dans la saisine seront soumis à l’injection des cellules tumorales et aux traitements.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent subir une douleur locale liée aux injections et aux prélèvements. La croissance tumorale peut engendrer différents effets chez l’animal. L’effet le plus fréquent consiste en une gêne dans la mobilité liée à l’encombrement de la tumeur. D’autres effets, plus rares, peuvent être rencontrés. Ainsi, les animaux peuvent présenter une température diminuée, iune ulcération des tissus. De plus, de façon encore moins fréquente, les rongeurs peuvent subir une perte de poids, des difficultés respiratoires.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de prélever différents tissus ou organes. Ces organes serviront à des analyses précise des tissus et des cellules permettant d’étudier l’état des défenses immunitaire. Ces données permettront de déterminer ainsi l’effet du traitement sur le système immunitaire en lien avec son impact sur la croissance tumorale.
Remplacement
Notre objectif est de développer de nouveaux médicaments immunothérapeutiques pour lutter contre les cancers. Pour cela, nous avons développé une technologie permettant de produire une très grande variété de protéines immunomodulatrices. Nous avons également mis en place des cribles d’activité immunologique réalisés in vitro permettant de se passer d’animaux dans les premières étapes de sélection de protéines présentant les activités immunomodulatrices les plus adéquates. Ces cribles ont notamment permis de sélectionner le candidat médicament qui fait l’objet de ce projet et qui s’est montré capable de contrôler la croissance tumorale chez la souris lors de travaux préliminaires. Ces résultats prometteurs doivent maintenant être complétés par des études approfondies d’efficacité thérapeutique, de mode d’action et d’innocuité, réalisées chez l’animal. En effet, il est requis de fournir ces études pour que le candidat médicament soit ensuite autorisé par les autorités règlementaires à être évalué en clinique, chez le patient atteint d’un cancer. L’évaluation approfondie de l’efficacité immunothérapeutique de ce candidat médicament doit être faite chez l’animal car aucune technique in vitro ne permet de reproduire le lien complexe entre la croissance d’une tumeur et son contrôle par les défenses immunitaires, ces dernières s’établissant dans un premier temps à distance, au sein d’organes immunitaires, pour migrer ensuite vers le site à protéger.
Réduction
Le nombre d’animaux à utiliser pour le bon déroulement du projet a été réduit au minimum de deux manières. Premièrement, par la réduction du nombre d’animaux dans chacun des groupes d’étude. Pour cela, une étude statistique préalable a permis de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour la mesure d’un effet thérapeutique significatif. Deuxièmement, par la réduction du nombre de groupes dans les études d’efficacité du candidat médicament en association avec d’autres traitements actuellement utilisés chez le patient. Pour réduire ce nombre, uniquement deux traitements, chacun représentatif d’un type d’immunothérapie, seront évalués.
Raffinement
Les protocoles que nous utiliserons sont classiquement employés chez l’animal. Pour préserver le bien-être des animaux, ceux-ci seront hébergés au calme en respectant des cycles diurne/nocturne. De plus, ils seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi. Pour limiter le stress des animaux, permettre une manipulation aisée et douce, ceux-ci seront anesthésiés avant l’injection des cellules tumorales, des traitements et des prélèvements. Leur état de santé et l’apparition de signes de souffrance liés au développement d’une tumeur seront surveillés tout au long de l’expérience de façon à intervenir de manière appropriée, notamment via l’utilisation d’analgésiques ou d’antiseptiques. Une grille de score qui permet d’évaluer précisément le bien-être de l’animal, des points limites et critères d’arrêt seront utilisés pour décider de l’euthanasie des animaux.
Choix des espèces
Pour évaluer l’efficacité anti-tumorale du traitement ainsi que son mode d’action, nous travaillerons chez la souris. Pour ce type d’étude, elle représente en effet une référence utilisée par la plupart des chercheurs académiques ou de l’industrie pharmaceutique pour étudier l’efficacité de traitements contre le cancer. Les rongeurs auront entre 8 et 12 semaines car ils présentent un système immunitaire et une physiologie pleinement mature qui s’avère cruciale pour évaluer l’effet de l’immunothérapie sur le système immunitaire ainsi que sur la croissance tumorale.
Conséquences neurobiologiques des dérégulations liées au stress sur la barrière-hémato-encéphalique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
Pour reproduire chez le rongeur des défauts de mémoire proches de ceux du trouble de stress post-traumatique, 1 200 souris vont être utilisées, dont 850 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever des échantillons. Elles reçoivent une injection quotidienne pendant cinq jours, une injection d'hormone du stress, puis une injection intraveineuse de traceur. Viennent ensuite trois tests comportementaux d'environ trois heures étalés sur trois jours, que le RNT ne nomme pas, tandis que les injections intrapéritonéales et la contention sont reconnues comme sources de douleur et de stress. Le porteur justifie le recours à la souris par sa proximité phylogénétique avec l'espèce humaine et par le fait que la plupart des données sur les comportements liés au stress reposent déjà sur elle.
Objectifs
Ce projet s’intéresse aux effets négatifs du stress lorsqu’il est intense et explore les conséquences biologiques associées. Cette recherche s’inscrit dans l’étude des maladies liées au stress telles que le trouble de stress post-traumatique (TSPT). Plus spécifiquement, notre objectif est de mieux comprendre les changements biologiques qui surviennent dans les situations de stress élevé. Pour ce faire, nous utilisons un modèle animal qui mime des défauts de mémoire similaires à ceux observés chez les patients souffrant de TSPT. De plus, nous souhaitons étudier les effets de ces changements biologiques sur la barrière hémato-encéphalique (BHE), qui représente la porte d’entrée du sang vers le cerveau. La qualité de cette barrière dépend de plusieurs types de cellules qui protègent le cerveau des pathogènes et des molécules toxiques présents dans le sang. Ce projet s’intéressera donc également au lien qui existe entre ces différents types de cellules et les défauts de mémoire observés dans notre modèle animal. Ainsi, cette étude, en lien avec des résultats récents obtenus chez l’humain, permettra de définir de nouvelles cibles biologiques afin d’offrir des solutions thérapeutiques innovantes aux patients souffrant de TSPT.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les effets du stress via des changements biologiques dans différentes populations de cellules sur la qualité de la barrière hémato-encéphalique. Si nous observons un mécanisme d’action précis sur la qualité de cette barrière, le développement de traitement visant à réparer la barrière pourrait être envisagé comme traitement lors de l’exposition à un stress intense. De plus, une meilleure compréhension des maladies liées au stress est nécessaire afin de faire évoluer les méthodes de prévention, de diagnostique et de traitement de ces maladies de plus en plus prévalentes
Procédures
Seront effectués une injection par jour pendant 5 jours de solution permettant d'inactiver une protéine, une injection d'hormone du stress, 3 tests de comportements d’une durée d’environs 3h étalé sur une période de 3 jours et 1 injection intra-veineuse
Impact sur les animaux
L’administration des substances par voie intra-péritonéale ainsi que la contention nécessaire à la réalisation des administrations entrainent des douleurs et du stress. Les injections de traceurs en intra-veineux peuvent induire un hématome et de la douleur, et l’anesthésie une hypothermie. Des nuisances pourraient survenir à la suite des procédures pour cela des fiches de suivi adaptées permettant d’estimer la souffrance des animaux seront utilisées.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de récupérer les échantillons nécessaires pour les analyses proposées dans ce projet.
Remplacement
Il est possible en amont de tester nos hypothèses moléculaires sur des modèles in vitro (cellule en cultures), malgré leurs limitations : 1) ce n’est pas un organisme vivant mais un ensemble de cellules et 2) il n’y a pas de comportements observables et comparables aux conditions humaines. Nous avons utilisé ces méthodes in vitro afin de pré-valider nos hypothèses dans ce projet. L’utilisation d’animaux se justifie par l’impossibilité de remplacer pour plusieurs raisons. 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier des comportements liés au stress. 2) L’organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l’Homme, ce qui permet une extrapolation acceptable des résultats obtenus chez ces espèces à l’espèce humaine.
Réduction
Dans le cadre de la stratégie de réduction, notre expérience au sein du laboratoire nous a permis de déterminer qu’un nombre de 10 souris par groupe expérimental est nécessaires pour les prélèvements et analyses ex vivo et qu’un nombre de 15 souris par groupe expérimental et par sexe est nécessaires pour les analyses comportementales, afin d’obtenir des données représentatives de l’échantillon de population. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles afin de déterminer d’éventuelles différences liées au sexe. Le cas contraire, les données des mâles et des femelles seront regroupées de sorte à augmenter le nombre d’individu par groupe pour étudier les effets du test. Les tests statistiques consisteront au préalable en un test de normalité, puis en un test d’analyse de variance à deux facteurs, suivi si besoin de tests post-hoc. Dans le cas où les données ne suivraient pas une distribution normale, des alternatives non-paramètriques aux tests cités ci-avant seront réalisées.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne. La manipulation des animaux et les soins éventuels seront prodigués par des personnes habilitées à l’expérimentation animale et compétentes, en accord avec la grille de score des points limites. De plus, une personne habilitée sera en charge de vérifier quotidiennement, weekend inclus, le pourcentage d’humidité dans l’air et la température, ainsi que le niveau sonore (si un bruit anormal survient) dans les pièces d’hébergement et d’expérimentation afin de détecter d’éventuelles nuisances et alerter les personnes compétentes pour pallier à celles-ci. A leur arrivé dans l’animalerie, les souris seront maintenues en cages d’hébergement collectives en présence d’enrichissement (carrés de cellulose, sizzle, tunnels en carton), et ce jusqu’à une semaine avant le début des expériences. Durant le déroulement des expériences les animaux seront gardés au minimum deux par deux, dans des cages transparentes et rapprochées les unes des autres afin de maintenir des contacts olfactifs et visuels entre les animaux et en présence du même enrichissement. De plus, les animaux seront manipulés par un expérimentateur habilité à l’aide des tunnels en carton, afin de réduire le stress lié à cette manipulation. Les expériences seront réalisées dans une pièce dédiée dans l’animalerie.
Choix des espèces
- La grande majorité des données relatives aux comportements liés au stress sont basées sur l’utilisation de la souris. - La validation des tests en termes de conditions comportementales et pharmacologiques étant déjà réalisées chez la souris, ceci permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. - La souris est un mammifère qui présente une bonne proximité phylogénétique avec l'espèce humaine et certains de ses comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. - La souris offre de nombreuses possibilités d’animaux transgéniques permettant d’étudier l’effet de molécules/facteurs sur le système nerveux central via l’étude du comportement. Tous les animaux utilisés seront de jeunes adultes (âgés de 10 à 16 semaines environ) car les systèmes étudiés ne subissent pas à cet âge de modifications, comme celles survenant au cours du développement ou au cours du vieillissement, ce qui limite la variabilité intrinsèque des mécanismes étudiés dans ce projet.
Evaluation de composés contre le développement d’arthrite rhumatoïde induite chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
500 souris vont être utilisées pour déclencher chez elles une polyarthrite, chacune pouvant subir jusqu'à sept prélèvements de sang et sept prélèvements d'urine sur animal vigile, en plus des injections de traitement. 350 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 50 d'un niveau modéré, et toutes seront tuées puis autopsiées pour prélever les pièces osseuses. Deux injections à la queue espacées de trois semaines déclenchent la maladie, avec gonflement des articulations, œdème articulaire et boiterie parmi les effets surveillés. Les bénéfices annoncés pour les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde restent au conditionnel et au long terme, alors que les effets indésirables seront "abordés avec le client" avant la mise en œuvre du projet.
Objectifs
Les affections ostéoarticulaires chroniques touchent plus de 20% de la population mondiale et tout particulièrement les adultes de plus de 50 ans. En raison de la croissance démographique et du vieillissement, le nombre de personnes atteintes d’affections ostéo-articulaires augmente constamment. La polyarthrite rhumatoïde est une maladie inflammatoire chronique et auto-immune qui affecte principalement les articulations. Cette pathologie invalidante est caractérisée par la déformation et la destruction progressive des articulations accompagnée d’inflammation, de douleur et de raideurs. Les traitements actuels visent à soulager les symptômes et ralentir la progression de la maladie, mais ne la guérissent pas et sont associés à d’importants effets secondaires, mal tolérés par les patients. Il y a donc un besoin urgent d’apporter de nouveaux traitements pour améliorer la prise en charge des patients afin de freiner l’inflammation, de soulager les symptômes, de prévenir les dommages aux articulations et d’améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de polyarthrite rhumatoïde. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer l’efficacité de différents principes actifs dans un modèle d'arthrite induite par le collagène (CIA - Collagen Induced Arthritis) chez la souris, qui est un modèle expérimental largement utilisé dans la littérature pour étudier l'arthrite rhumatoïde. L’efficacité des composés testés sera évaluée sur les signes clinique d'arthrite, comme le gonflement des articulations et la boiterie ; sur les paramètres inflammatoires à partir de prélèvements de sang et/ou d’urine réalisés chez l’animal au cours de l’étude ; ainsi que sur les modifications histopathologiques (analyse microscopique) ou biomoléculaires (analyse de gènes) à partir des tissus et d’organes prélevés à la fin de l’étude.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à générer des informations cruciales sur l'efficacité des nouveaux traitements dans le contexte de la polyarthrite rhumatoïde. Les protocoles mis en œuvre permettront d'évaluer : 1) L'impact sur l'inflammation ; 2) Les effets sur la dégradation de l’os et du cartilage ; 3) Les modifications physiologiques potentielles induites par ces traitements. À plus long terme, ce projet contribuera de manière significative au développement de nouveaux médicaments pour la polyarthrite rhumatoïde. Les données obtenues seront en effet essentielles pour : 1) Affiner la compréhension des mécanismes d'action de nouveaux composés ; 2) Guider la sélection des molécules les plus prometteuses pour les essais cliniques ; 3) Optimiser les stratégies thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients. En fournissant une base solide de connaissances précliniques, ce projet accélérera potentiellement le processus de développement de médicaments innovants, offrant ainsi de nouvelles options thérapeutiques aux patients souffrant de polyarthrite rhumatoïde.
Procédures
Les souris recevront deux injections au niveau de la queue de l’animal, espacées de 21 jours, de composés induisant une réponse immunitaire, pour induire le développement de l’arthrite, protocole expérimental largement utilisé dans la littérature pour étudier cette pathologie. Pour cela, les souris recevront des antidouleurs, puis seront anesthésiées avant l’injection. Chaque injection dure 1 à 2 minutes par animal. Les traitements à tester seront appliqués quelques jours avant et/ou après l’induction du modèle et répétés tout au long de la durée de l’étude, 4 semaines maximum après l’induction. Chaque administration dure 1 à 2 min. La fréquence d’administration des traitements sera définie selon le mode d’administration ainsi que selon le ou les principes actifs utilisés pour chaque étude. Une analyse de marqueurs liés au développement de la pathologie pourra être réalisé sur des prélèvements de sang et/ou d’urine au cours de l’étude. Les prélèvements de sang pourront être effectués sur animal vigile et dureront moins de 5 min par animal. Une période minimum d’une semaine de récupération sera nécessaire à l’animal avant de procéder à un nouveau prélèvement, avec au maximum 1 prélèvement par semaine sur la durée de l’étude (soit 7 prélèvements). Les urines pourront être prélevées en cours de protocole sur animaux vigiles, cette manipulation durera moins de 5 min par animal et pourront être répétés au maximum une fois par semaine tout au long du protocole (soit 7 fois). En point final, sur animaux euthanasiés, l’urine peut être prélevée directement en ponctionnant la vessie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront abordés avec le client avant toute mise en œuvre du projet. Ils seront anticipés au plus juste en fonction des informations obtenues au cours de protocoles préalablement réalisés et appuyées d’une veille bibliographique inhérente au(x) principe(s) actif(s) à administrer. Plus précisément, nous surveillerons l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un traumatisme et une inflammation transitoire au niveau du site d’injection, ou encore un aspect ou comportement anormal de l’animal, e.g., une perte de poids, un œdème articulaire ou une boiterie.
Devenir
A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires seront utilisés pour doser le composé et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les composés et / ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.
Remplacement
De manière générale, les principes actifs que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, dans le cadre des pathologies rhumatismale, il est pour le moment impossible de reproduire in vitro les mécanismes la complexité de la pathologie. De la même façon, les interactions entre les différentes cellules et tissus composants l’articulation ne peuvent être mimées par un modèle simple de culture in vitro. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable pour l’évaluation des composés à testés, tout en prenant en compte le bien-être animal.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons des traitements antalgiques dès l’apparition de premiers signes cliniques Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué au moins deux fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de mesures).
Choix des espèces
La souris a été choisie pour ce projet car cette espèce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. La souris, étant fréquemment utilisée à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, un volume suffisant et analysable de liquides biologiques peut parfaitement être récupéré à partir de cet animal de laboratoire. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Bien que les pathologies rhumatismales puissent toucher des patients à n’importe quel âge, chez les rongeurs, la modélisation des maladies rhumatismales donne des résultats plus homogènes avec des souris adultes au début du protocole.
Evaluation de l’efficacité de vaccins ARNm anti-cancer ciblant les cellules dendritiques chez la souris – Amendement
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
L'observation d'un point limite entraîne la mise à mort anticipée, décidée par le responsable du projet. 1 020 souris vont être utilisées, 828 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 192 dans des procédures modérées, toutes tuées pour prélever leurs organes. Elles reçoivent des vaccins à ARN messager par voie intraveineuse, intramusculaire ou intranasale, portent des tumeurs greffées dans la joue ou le poumon, et subissent un lavage broncho-alvéolaire de cinq fois un millilitre sous anesthésie. Le porteur signale des difficultés respiratoires pour les tumeurs du poumon, une nécrose ou une ulcération pour celles de la joue, et annonce que ces vaccins pourront à terme être utilisés chez l'être humain.
Objectifs
Le cancer demeure la principale cause de mortalité au monde malgré de réels progrès dans les traitements médicaux. Actuellement les traitements les plus prometteurs reposent sur l’immunothérapie, qui consiste à stimuler et/ou réactiver le système immunitaire afin d’induire des réponses anti-tumorales efficaces et spécifiques. Une des stratégies d’immunothérapie consiste à vacciner avec des antigènes tumoraux. L’efficacité de ces vaccins anti-cancer peut être optimisée en travaillant sur leur composition afin de diminuer la dose injectée et sur la voie d’immunisation la plus adéquate. En effet, la majorité des vaccins est administré par voie systémique (sous-cutanée, intramusculaire ou intradermique). Mais dans le cas de cancers localisés dans les muqueuses comme le cancer du poumon ou de la sphère ORL, des travaux ont montré que la vaccination par voie muqueuse (ex :intranasale) est plus efficace pour d’induire localement une réponse immune plus importante. Dernièrement, le succès des vaccins ARNm dans la lutte contre la Covid-19, a suscité un nouvel engouement pour ce type de vaccin. Et une des premières applications cliniques des vaccins ARNm a été pour traiter le cancer. L’objectif de ce projet est d’optimiser des vaccins à ARNm contre des antigènes tumoraux et d’évaluer leur efficacité chez la souris. Pour cela, les souris seront vaccinées avec différentes formulations de vaccins ARNm et différentes voies d’immunisation et nous analyserons la réponse immune. La meilleure formulation sera ensuite testée chez des souris porteuses de tumeurs du poumon ou de localisées dans la sphère ORL afin de voir si le vaccin peut inhiber la croissance tumorale. Ce projet permettra de développer de nouvelles thérapies innovantes pour traiter le cancer.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de développer et de valider un nouvel outil thérapeutique dans le traitement contre le cancer basé sur la technologie innovante des vaccin ARNm avec une optimisation de : - la formulation de l’’encapsulation de l’ARNm - la voie d’immunisation - la vectorisation de l’antigène Ces vaccins pourront être administré en association avec des traitements actuellement utilisés en clinique ( ex : les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires négatifs comme anti-PD-1) pour en maximiser les effets. Ces vaccins pourront à terme être utilisés chez l’homme pour le traitement des tumeurs localisés dans les voies muqueuses (cancer du poumon, de la sphère ORL).
Procédures
raffInjection par voie intraveineuse sur animaux sous anesthésie gazeuse : 2 injections à 2 semaines d’intervalle ou 3 injections à 1 semaine d’intervalle; durée totale environ 5 min. Injection par voie intramusculaire sur animaux vigiles : 2 injections à 2 ou 1 semaines d’intervalle; durée totale du geste 1-2 min. Injection par voie intranasale sur animaux sous anesthésie générale : 2 injections à 2 ou 1 semaines d’intervalle; durée totale environ 30 min. Injection de cellules tumorales dans la joue sur animaux sous anesthésie générale : 1 injection; durée totale environ 30 min. Injection par voir intrapéritonéale de traitement sur souris vigiles : 4 injections (2 fois/semaine sur 15 jours);durée totale du geste 1-2 min. Sur animaux sous anesthésie générale : Prélèvement de sang ( 500μl), Lavage broncho alvéolaire (5x 1ml), perfusion intracardiaque;durée totale environ 30 min. AMENDEMENT :Injection des cellules tumorales par voie sous-cutanée sous anesthésie gazeuse : 1 injection; durée totale environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
La vaccination par voie intranasale peut induire une gêne respiratoire transitoire de courte durée pendant la durée de l’administration. Les injections par voie intraveineuse, intramusculaire et intrapéritonéale ne sont pas connus pour engendrer des nuisances ou douleurs. Sur la durée entière de l’expérience (soit environ 3 semaines), les souris avec les tumeurs peuvent perdre du poids pu présenter des signes évocateurs de souffrances tels que des troubles du comportement (immobilité, isolement...) et de l’aspect physique (dos vouté, apparence du poil...). Pour les tumeurs du poumon les souris peuvent présenter des difficultés à respirer ( bien que dans la littérature ces signes sont généralement décrit à partir de 4 semaines). Pour les tumeurs de la joue, une nécrose, ulcération de la tumeur peuvent apparaitre.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes pour l'étude des réponses immunes
Remplacement
Le microenvironnement tumoral est complexe, de même que les réponses immunitaires impliquées dans la réponse immune antitumorale. L’efficacité d’un vaccin ne peut être évalué que dans des organismes entiers et les modèles in vitro ne permettent pas de mimer fidèlement les réponses immunitaires ni le microenvironnement tumoral. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de conditions observées chez l’homme.
Réduction
Les paramètres expérimentaux ont été déterminées selon des données déjà publiées (cinétique de vaccination, doses, nombre de cellules tumorales à injecter). Nous avons pu déterminer un nombre d’animaux minimum pour avoir assez de matériel pour garantir une analyse statistique fiable. Des groupes de 10 animaux pour tester l’efficacité des vaccins, et pour le groupe vacciné avec notre vaccin de référence le nombre est réduit à 6. Pour les souris porteuses de tumeurs des groupes de 12 sont nécessaires puisqu’il existe une certaine hétérogénéité de la croissance tumorale. Pour chaque expérience, le maximum de tissus est prélevé afin de maximiser les analyses biologiques possibles.
Raffinement
Les injections intranasales et les injections de tumeurs dans la joue sont réalisées sous anesthésie générale pour le confort de l’animal. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout le long de la procédure, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillées jusqu’à leur réveil. Les injections par voie intraveineuse, via la veine de la queue, sont réalisées sur animaux sous anesthésie gazeuse placés sur tapis chauffant. Les injections par voie intramusculaire et intrapéritonéales ne sont pas connus pour engendrer de douleurs particulières et sont réalisées sur animaux vigiles après désinfection à l’éthanol 70% de la surface d’injection. Tous les vaccins et traitements sont préparés dans des formulations déjà utilisés en clinique ou pré-clinique. Les animaux sont élevés en cages enrichies, et regroupés en groupes sociaux afin d’éviter leur isolement ( 5 souris maximum/cage). Les animaux seront acclimatés au minimum 1 semaine avant le début de toute expérimentation. Pour les animaux le nécessitant, la prise alimentaire et l’hydratation seront facilités avec un enrichissement dans la cage de croquettes humidifiées et de gelée hydratante. La croissance tumorale est mesurée 2 fois/semaine à l'aide d'un pied à coulisse par les expérimentateurs. Une évaluation quotidienne de l’état général de l’animal basée sur des points limites sont établis. Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie, en cas de comportement anormal le responsable du projet est alors averti. L’observation de point limite induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.
Choix des espèces
Cette étude sera réalisée avec des souris. Ce modèle est parfaitement maitrisé dans l’équipe qui dispose de nombreux outils (lignées tumorales syngéniques, vaccins) Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 8 semaines. Cela permet d’avoir un système immunitaire entièrement développé et à cet âge les souris tolèrent bien une anesthésie générale.
Impact des lipides plasmalogènes et de leur synthèse sur le développement de l’athérosclérose chez un modèle de souris susceptible à l’athérosclérose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Génétiquement modifiées pour développer une athérosclérose, 132 souris sont irradiées pendant trente minutes, ce qui détruit les cellules de leur moelle osseuse avant une greffe qui les repeuple. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et associent l'immunodépression, quatre semaines d'antibiotiques dans l'eau de boisson, une perte de poids, des troubles digestifs, un grisonnement des poils et seize semaines de régime riche en cholestérol. Le porteur qualifie l'irradiation d'indolore et les plaques formées dans les vaisseaux d'"indolores et asymptomatiques". Toutes sont tuées par ponction du cœur sous anesthésie, pour prélever ces plaques et les valves aortiques.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires, comme l’athérosclérose, sont la principale cause de mortalité dans le monde. L’athérosclérose se produit lorsque des plaques graisseuses (issues des lipides) se forment dans les artères, bloquant le flux sanguin et augmentant le risque de crise cardiaque ou d’AVC. En réponse à cette accumulation de graisses, la paroi artérielle devient inflammée, activant des cellules immunitaires appelées macrophages, qui sont responsables de l’élimination des particules nocives dans l’organisme. Cependant, dans les plaques, les macrophages eux-mêmes absorbent trop de graisses, contribuant ainsi à l’emballement de la croissance de la plaque. Les traitements actuels ne réduisent que partiellement le risque cardiovasculaire, il est donc urgent de trouver de nouvelles approches. Récemment, des chercheurs ont identifié des lipides complexes, appelées plasmalogènes, qui sont associées au risque cardiovasculaire. Les niveaux de plasmalogènes dans le sang pourraient être un bon indicateur du risque de maladie cardiovasculaire. Cependant, on ne sait pas encore avec certitude si les plasmalogènes jouent un rôle direct dans l’athérosclérose et l’inflammation qui l’accompagne, ni leur rôle dans les cellules immunitaires que sont les macrophages. Ce projet nous aidera à comprendre comment les plasmalogènes, qui sont très présents dans les macrophages, pourraient contribuer au développement de l’athérosclérose en modulant des étapes clés de la maladie. Le développement de l’athérosclérose sera examiné dans un modèle de souris génétiquement modifiées prédisposées à la maladie, et dont le système immunitaire uniquement verra sa quantité de plasmalogène soit inchangée, soit partiellement réduite, soit totalement. Ces souris seront nourries avec un régime riche en cholestérol, nécessaire au déclenchement de la maladie. Ce modèle d’athérosclérose est similaire au développement de la maladie chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Chez l’homme, l’athérosclérose est un facteur de risque majeur dans les maladies cardiovasculaires, qui est la première cause de mortalité. Les moyens thérapeutiques actuels ne permettent de réduire le risque cardiovasculaire que partiellement. Il est donc crucial de trouver de nouvelles de pistes thérapeutiques. Ce projet permettra de connaître davantage la composition en lipides des plaques, de comprendre les interactions complexes des plasmalogènes au niveau du système immunitaire sur le développement de la maladie, et de confirmer leur importance dans les maladies cardiovasculaires. Ces éléments permettraient une meilleure compréhension du développement de l’athérosclérose, et pourrait mettre en lumière de nouvelles pistes ou cibles thérapeutiques pour le développement d’éventuels traitements, qui restent à ce jour encore relativement limités.
Procédures
- Prise de sang (2 prélèvements ponctuels, de moins de 5 min chacun, espacés de 5 semaines) - Transport (1h, 1 aller-retour) - Irradiation (30 min) - Injection intraveineuse caudale unique et ponctuelle (greffe, 1 injection bolus,
Impact sur les animaux
De faibles douleurs, de courte durée, peuvent être occasionnées lors des prises de sang par voie caudale et de l’injection intra-veineuse. Un tube de contention sera utilisé pour l’injection intra-veineuse afin d’éviter tout mouvement indésirés de l’animal, minimiser le temps de contention et favoriser le bon déroulement de l’injection. Cette contention entraine une gêne provisoire de quelques minutes et peut être stressante pour l’animal. Les animaux seront manipulés de manière hebdomadaire pour effectuer les pesées. L’irradiation entraine les effets suivants : - Immunodépression : destruction des cellules de la moelle osseuse entrainant un risque infectieux augmenté. Cet effet disparaitra lorsque la prise de greffe de moëlle osseuse sera effective. Afin d’éviter les infections lors cette phase d’immunodépression transitoire, les souris recevront une antibiothérapie durant 4 semaines. Ce traitement peut entrainer certains effets secondaires propres à l’antibiotique (principalement des réactions allergiques, cependant rares). - Affaiblissement général se traduisant par une perte de poids et de la fatigue. - Atteintes intestinales : L'irradiation peut endommager les cellules épithéliales du tractus gastro-intestinal, pouvant entrainer des troubles digestifs et une absorption réduite des nutriments (contrôlé par une pesée régulière). De nouveau cet effet est transitoire grâce au renouvellement naturel et constant des cellules épithéliales. - Altération de la peau et des poils : Grisonnement localisé des poils possible et ralentissement de la repousse. Le transport aller-retour vers la plateforme d’irradiation (moins de 20 minutes) est stressant pour les souris.
Devenir
La mise à mort des animaux est nécessaire pour la détermination des lésions. Les plaques dans les vaisseaux sanguins seront prélevées post-mortem pour en déterminer la composition. Les valves aortiques situées au niveau du cœur seront prélevées afin de déterminer l’étendues des plaques.
Remplacement
L’athérosclérose est une maladie complexe qui ne peut pas être mimée in vitro. Elle implique des interactions entre l’inflammation, les lipides, le cholestérol, le flux sanguin, mais également entre différents tissus comme le foie ou le tissu adipeux. Il est possible in vitro d’étudier ces différents acteurs impliqués dans cette maladie séparément, mais seule l’utilisation de modèles animaux présentant une athérosclérose proche de celle de l’Homme peut permettre de tenir compte de tous ces éléments ensembles, et ainsi permettre une meilleure compréhension globale de cette maladie. Le modèle de souris prédisposées à l’athérosclérose utilisé dans ce projet est un modèle bien décrit dans la littérature pour l’étude du développement de l’athérosclérose, et est transposable au développement de la maladie telle qu’elle est observée chez l’homme. De plus, le métabolisme des lipides entre l’homme et la souris est bien connu et fortement similaire chez les deux espèces.
Réduction
Un modèle mathématique, tenant compte de nos variables d’intérêts ainsi que les différences nécessaires afin de pouvoir conclure à de réelles différences entre nos groupes, nous a permis de réduire le nombre d’animaux à 11 par groupe, ce chiffre correspondant au nombre minimum nécessaire pour avoir des données exploitables par la suite. Les différences attendues sont des différences dans la formation des plaques dans les vaisseaux sanguins ainsi que des paramètres qui lui sont associées. Les expériences seront réalisées chez des souris mâles et femelles afin de tenir compte du dimorphisme sexuel. Enfin les expériences seront répétées une deuxième fois afin de confirmer la reproductibilité des résultats obtenus.
Raffinement
Le transport est stressant pour les souris. Tout sera fait pour limiter l’inconfort et le stress des animaux pendant cette étape (Enrichissement, gel diet, voiture climatisée). L’irradiation est quand-a-elle indolore. Les souris seront transférées dans de nouvelles cages propres à leur retour et un temps de repos de 2h minimum sera respecté pour limiter un stress trop important. Ce délai est nécessairement court puisque la greffe doit être rapidement effectuée. L’irradiation supprime le système immunitaire. 2 à 4 semaines sont nécessaire à la greffe pour fournir de nouveau un système immunitaire entièrement fonctionnel. Ceci sera pallié par 4 semaines d’antibiotiques, dilués dans l’eau de boisson et renouvelés quotidiennement, pour limiter le risque infectieux. Durant cette période, et pendant l’injection de la greffe, tout sera fait pour garder les souris dans un environnement propre et exempt de pathogènes. L’injection et les différentes prises de sang se feront après application d’un anesthésique local. Un tube de contention conçu pour restreindre le temps de confinement et le risque de mouvement indésirable de la souris pendant l’injection sera utilisé afin de réduire le temps de manipulation des souris. Le prélèvement sanguin terminal par ponction intracardiaque se fera sous anesthésie gazeuse, la souris sera maintenue à 37°C via un plateau chauffant le temps de la ponction, de la lidocaïne sera appliquée localement sur le site d’insertion de l’aiguille. L’animal sera ensuite euthanasié pour effectuer les différents prélèvements. Le milieu d’hébergement sera enrichi (objet pour se cacher, nid). Les animaux seront hébergés en groupe de 5 à 10. La mise sous régime riche en cholestérol entrainera la formation de plaque dans les vaisseaux sanguins des souris, celles-ci sont indolores et asymptomatiques.
Choix des espèces
Le modèle de souris prédisposées à l’athérosclérose utilisé dans ce projet est un modèle bien décrit dans la littérature pour l’étude du développement de l’athérosclérose, et est transposable au développement de la maladie telle qu’elle est observée chez l’homme. De plus, le métabolisme des lipides entre l’homme et la souris est bien connu et fortement similaire chez les deux espèces. Des animaux adultes (8 semaines) seront utilisés, l’athérosclérose étant une maladie s’installant sur le temps et touchant la population adulte.