Souris
Étude et manipulation de l’activité neuronale dans les processus mnésiques en comportement et pendant le sommeil
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Chaque souris subit une ou deux chirurgies cérébrales, dont une implantation d'électrodes pouvant durer six heures, puis un conditionnement par chocs, douze stimulations en moyenne par journée sur trois journées, et jusqu'à 1 500 stimulations intracérébrales. 1 680 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, isolées pour protéger leur implant, ce que le porteur reconnaît susceptible d'avoir des répercussions émotionnelles. Il qualifie pourtant ces chocs de stimulations "désagréables (ou très légèrement douloureuses)", et justifie l'effectif par un taux de réussite technique attendu entre 50 et 75 %. Toutes sont tuées pour vérifier après coup la position des électrodes dans leur cerveau.
Objectifs
La peur est souvent étudiée chez les rongeurs en analysant leur réaction face à une situation menaçante. Jusqu’à présent, les recherches se sont principalement concentrées sur l’immobilité des animaux en réponse au danger, en mesurant le temps qu’ils passent dans cet état. Cependant, cette approche ne reflète pas toute la diversité des stratégies de défense observées dans la nature. Pour mieux comprendre ces comportements, notre laboratoire a mis en place une expérience où une souris explore un environnement composé de deux zones distinctes, dont l’une est associée à une situation aversive. Cette approche permet d’observer une large gamme de réactions en fonction de la distance perçue par l’animal par rapport à la source du danger. Nos premiers résultats suggèrent que l’immobilité adoptée par les rongeurs n’est pas un état unique, mais qu’elle se manifeste sous différentes formes, chacune étant liée à des mécanismes cérébraux et corporels distincts. L’objectif de notre projet est d’identifier les interactions entre le corps et le cerveau qui influencent ces réactions défensives et d’explorer comment elles varient en fonction du contexte et de la proximité du danger.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes électrophysiologiques impliqués dans la mémoire, la panique et l’anxiété. A court terme, le projet permettra d’élucider le rôle des oscillations cérébrales et de la relation corps-cerveau dans les troubles anxieux ou dans le fonctionnement et la formation de la mémoire chez la souris, mais également de façon translationnelle chez l’Humain. A plus long terme, ces connaissances pourront conduire au développement de thérapies plus ciblées et efficaces pour lutter contre divers troubles anxieux ou paniques, et donc avoir un impact clinique concret. Les modèles rongeurs sont des modèles de choix pour l’étude du comportement et de ses bases physiologiques, car ils présentent des mécanismes cognitifs complexes et une cartographie fonctionnelle transposables aux humains. Le modèle souris est en particulier adapté aux études comportementales pour sa rapidité d’adaptation. De plus, il s’agit de l’espèce pour laquelle nous avons le plus de données électrophysiologiques préexistantes et pour laquelle l’outil pharmacologique et les modèles génétiques sont les plus développés ce qui permettra de faire le lien avec les études existantes et réduire in fine le nombre d’animaux.
Procédures
L’ensemble des animaux de ce projet subiront une ou deux chirurgies sous anesthésie générale comprenant une injection cérébrale (30 minutes à 2h) et/ou une implantation d’électrodes (4 à 6h). Les d’animaux subiront un protocole de conditionnement aversif (12 stimulations en moyenne par journée, 3 journées chacune espacées d'au moins une semaine). Pendant ce protocole, les souris recevront également des stimulations intracérabrales (pendant l’éveil ou le sommeil, le nombre dépendant très fortement de la manipulation voulue, allant de 50 à 1500) ou un traitement pharmacologique (une injection par après-midi de conditionnement). La durée maximale des enregistrements sera de 4 mois au total (18 semaines après la chirurgie).
Impact sur les animaux
Les principales nuisances ou effets indésirables attendus concernent essentiellement les méthodes d'implantation d'électrodes, ainsi que l'usage d'implants. Les nuisances qui pourraient apparaître sont les suivantes: - À court terme (de 0 à 24h après la chirurgie), les nuisances potentielles liées aux interventions chirurgicales, comme les risques anesthésiques, l'hypothermie, ou les hémorragies. - À moyen terme (1 à 7 jours) les nuisances seraient liées aux risques d’infections locales du tissu cérébral, ou risques d’ischémie, faisant suite à la procédure d’implantation d’électrodes ou de fibres. - À long terme (au-delà de 15 jours) des nuisances liées à la présence physique de l'implant, telles que des chocs ou des difficultés de mouvement peuvent apparaitre. L'isolement nécessaire à la protection des implants peut conduire à des répercussions émotionnelles. L'usage de câbles connectant l'implant au matériel d'enregistrement, bien que potentiellement restrictif. - Le protocole de conditionnement aversif implique d'utiliser des stimulations désagréables (ou très légèrement douloureuses) pour l'animal (nécessaire afin d’étudier les réactivations associées à la peur) ce qui peut modifier son comportement sur le long terme et occasionner de la prostration.
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront euthanasiés pour permettre la récupération des cerveau et la vérification de la localisation des électrodes et/ou des sites d’injection.
Remplacement
Notre objectif est d’étudier les réactivations en lien avec la mémoire, panique et l’anxiété. Ces études ne peuvent pas, pour le moment, être réalisées in vitro, ex vivo ou in silico. Nous examinons des réponses électrophysiologiques et des paramètres physiologiques essentiels, tels que la respiration et le rythme cardiaque, qui nécessitent un organisme complexe et proche physiologiquement de l’être humain pour des comparaisons pertinentes. La souris est donc indispensable pour notre projet, étant le seul modèle qui satisfait à l'ensemble de ces exigences.
Réduction
Afin de minimiser l’utilisation d’animaux, nous améliorerons l’efficacité des différentes procédures chirurgicales et le suivi longitudinal des animaux. L’utilisation de différents sites d’implantation des électrodes nous permet de récolter un nombre conséquent de données par animal, permettant ainsi de réduire le nombre total d’animaux utilisés pour répondre à différentes questions. Le nombre d'animaux requis pour ces expériences sera réduit au minimum nécessaire pour pouvoir réaliser des tests statistiques à partir de nos résultats avec une puissance suffisante. Étant donné que nos résultats dépendent de la qualité des signaux recueillis par les électrodes implantées, des fois de l’expression du virus, de l’implantation des fibres ou des électrodes de stimulation, et de l’efficacité du conditionnement aversif, nous nous attendons à un taux global de succès situé entre 50 et 75%, soit un nombre total d’animaux de 1680. Ce chiffre prend en compte l’implantation optimale des électrodes, le maintien de l’intégrité du connecteur et la variabilité des expériences comportementales.
Raffinement
Nous veillons à réduire autant que possible l’inconfort, la douleur et la souffrance des animaux tout au long de nos expériences. Avant toute intervention, les animaux bénéficient d’une semaine d’acclimatation incluant des manipulations douces quotidiennes pour diminuer leur stress lié aux interactions avec les chercheurs et améliorer la fiabilité des résultats. Leur environnement est enrichi par des éléments tels que des dômes et des tubes pour favoriser leur bien-être. Les procédures chirurgicales suivent strictement les réglementations en matière d’anesthésie et d’analgésie. Après les interventions, une période de convalescence d’une semaine est prévue, sans aucune manipulation expérimentale, afin de garantir une prise en charge optimale. Pendant cette période, les animaux font l’objet d’un suivi attentif par le personnel animalier et les chercheurs, avec des observations régulières pour détecter tout signe de douleur ou de mal-être. Un système d’évaluation adapté est utilisé pour identifier rapidement les signes de souffrance ou de complications. Cela permet de mettre en place des mesures adaptées, comme des traitements pour soulager la douleur ou, dans les cas les plus sévères, une euthanasie pour éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
Les modèles rongeurs sont des modèles de choix pour l’étude du comportement et de ses bases physiologiques, car ils présentent des mécanismes cognitifs complexes et une cartographie fonctionnelle transposables aux humains. Le modèle souris est en particulier adapté aux études comportementales pour sa rapidité d’adaptation. De plus, il s’agit de l’espèce pour laquelle nous avons le plus de données électrophysiologiques préexistantes et pour laquelle l’outil pharmacologique et les modèles génétiques sont les plus développés ce qui permettra de faire le lien avec les études existantes et réduire in fine le nombre d’animaux. Nous utiliserons donc le modèle souris. La procédure de stéréotaxie nécessite d’utiliser des animaux dont la croissance du crâne est stabilisée. C’est pourquoi, en accord avec la littérature, nous réaliserons les implantations d’électrodes chez des animaux ayant entre 7 et 9 semaines. Les enregistrements seront réalisés jusqu’à 4 mois après l’implantation.
Suivi de l’activité cérébrale pendant le comportement social et cognitif chez la souris
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Pour former des doctorants et de jeunes chercheurs aux techniques d'enregistrement de l'activité neuronale, 36 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une chirurgie cérébrale d'une heure trente, avec injection de vecteurs viraux et pose d'un implant dans le cortex préfrontal, avant d'être soumise à quatre passages de dix minutes dans des tâches de mémoire. Le porteur nomme ces tâches, dont un apprentissage fondé sur l'évitement d'un morceau de scotch adhésif, susceptible selon lui de provoquer stress et anxiété. Chaque étudiant travaille sur un seul animal, et les points limites annoncés pour chaque procédure ne sont pas détaillés.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de former des étudiants en thèse et de jeunes chercheurs post-doctorant français mais également d’universités étrangères partenaires. Cette formation se déroulera dans le cadre d’une école thématique visant à former les jeunes chercheurs sélectionnés aux techniques de suivi de l’activité neuronale au cours d’une tache comportementale chez la souris. Étudier l'activité neuronale chez l’animal libre de ses mouvements et effectuant une tache comportementale est essentiel pour comprendre comment les différents types de mémoire fonctionnent. En observant comment l'activité évolue pendant le comportement, nous pouvons identifier les mécanismes qui permettent au cerveau de retenir, de traiter et d'utiliser des informations, notamment dans des situations sociales ou lorsqu'il faut prendre des décisions. Cette approche est fondamentale dans la recherche en neurosciences afin de mieux comprendre certains troubles cognitifs et psychiatriques, comme la schizophrénie, l'autisme ou les troubles de l'attention, où la mémoire de travail et la mémoire sociale sont souvent touchées.
Bénéfices attendus
Cette école offrira aux étudiants un cadre unique pour approfondir leurs compétences en neurosciences, avec un focus sur l'étude de l’activité neuronale en comportement. En combinant des sessions pratiques et théoriques, ils apprendront les bonnes pratiques en expérimentation animale et seront formés aux tests comportementaux les plus adaptés à leurs recherches. De plus, les étudiants recevront une formation approfondie sur les méthodes d'enregistrement de l'activité neuronale par photométrie par fibre, ainsi que sur les techniques d'analyse des données. Grâce à ces apprentissages, ils seront capables de mettre en pratique leurs nouvelles connaissances dans leurs propres laboratoires, contribuant ainsi à renforcer la rigueur et la qualité de leurs futures recherches. Une fois de retour, ils pourront également appliquer et disséminer la règle des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement) pour une approche plus éthique et responsable en expérimentation animale, un aspect clé abordé lors de l’école.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie permettant l’injection de vecteur viraux et la pose d’un implant pour suivre l’activité neuronale du cortex préfrontal. Cette chirurgie sera effectuée sur animal anesthésié et analgésié et durera environ 1h30. Par la suite, les animaux seront exposés à l’une des trois tâches comportementales suivantes : (i) mise en place d'une mémoire rapide ou en un essai, (ii) mémoire sociale et (iii) mémoire de travail. Chaque test durera 10 minutes et sera répétée 2 fois par jour sur 2 jour soit un total de 4 passages. A l’issue des tâches comportementales, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire sous anesthésie et analgésie en vue de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.
Impact sur les animaux
Les chirurgies au niveau du cerveau (injections de virus) peuvent entraîner une infection localisée et/ou un affaiblissement des animaux pendant les heures suivant celles-ci. Un risque d’inflammation peut aussi être considéré suite aux sutures. Un risque d’hypothermie est possible sous anesthésie tout comme un arrêt cardiorespiratoire. La mise en place de la mémoire en un essai, basé sur l'évitement d'un morceau de scotch adhésif peut entraîner un stress et possiblement une anxiété chez les animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux de cette procédure sera euthanasié à la fin des expérimentations afin de prélever les tissus pour analyses.
Remplacement
Aucun modèle mathématique ou in vitro n'existe actuellement pour décrire les dynamiques des réseaux de neurones impliqués dans la mémoire. Ainsi, l'utilisation d'animaux éveillés s'avère indispensable pour comprendre les mécanismes mis en place, au fur et à mesure de l’apprentissage. Pour ce faire, l'emploi d'un modèle animal mammifère est essentiel afin d'obtenir des résultats pouvant être extrapolés à la compréhension du processus d’apprentissage humain. La souris représente un choix privilégié en raison de la similitude entre le fonctionnement de son cerveau et les tests comportementaux employés, par rapport à ceux observés chez l'Homme. Enfin, les structures étudiées ne sont pas présentes chez les invertébrés.
Réduction
Le projet impliquera au total 36 souris sur 2 ans. Nous limitons au maximum le nombre d'animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Chaque étudiant travaillera avec un seul animal, mais l'ensemble des données de tous les participants sera mis en commun à la fin de l'école. Ainsi 4 à 5 animaux par expérience seront utilisés. Ce regroupement permettra d'analyser en profondeur l'activité du cortex préfrontal à travers les trois procédures expérimentales étudiées, tout en optimisant les ressources animales. Nos recherches bibliographiques n'ont pas mis en évidence de différences significatives entre les mâles et les femelles. Nous utiliserons un nombre équilibré de mâles et de femelles pour toutes les expériences.
Raffinement
Des éléments d'enrichissement supplémentaires, tels que la présence d’un nid et des petites bûches en bois, sont introduits dans la cage d’hébergement des souris. Les conditions chirurgicales (anesthésie, analgésie, asepsie) et les soins post-opératoires appliqués garantissent une prise en charge appropriée pour diminuer toute souffrance de l’animal après chirurgie. L’ensemble des tâches comportementales est associé à de la récompense (alimentaire ou sociale) ou à de l’évitement (scotch) mais pas d’apprentissage par punition. Les stratégies de raffinement mises en place lors de ce projet comprennent l’enrichissement environnemental proposé aux animaux dans leur cage d’élevage, le soin apporté aux animaux tout au long de ces procédures, du choix des procédures afin de garantir une anesthésie et une analgésie optimale quant celles-ci font parties de procédures et d’une surveillance régulière garantie par un personnel formé. La mise en place de points limites pour chaque procédure proposée nous permet de garantir le bien être animal dans l’entièreté de ce projet.
Choix des espèces
Nos travaux nécessitent l’utilisation de rongeurs pour l’étude de phénomènes complexes tels que la mémoire. L’étude d’un système intégré nécessite d’avoir recours à des animaux « entiers ». Cette nécessité est d’autant plus incontournable lorsqu’il s’agit de l’étude des comportements et capacités cognitives telles que la mémoire. Pour l’ensemble de ces raisons, seule l'utilisation d'animaux nous permet de répondre à ces questions. La souris est le modèle privilégié pour pouvoir étudier les corrélats neuronaux des comportements. Les outils nous permettant ce suivi étant disponible pour ce modèle. Les animaux en comportement seront utilisés au premier stade adulte (à partir de 50 jours), ce qui permet d'avoir des taux d'apprentissage élevés, tout en étudiant l'activité des réseaux neuronaux dont le développement post-natal est fini. Les animaux sont injectés avec les vecteurs viraux à 7 ou 8 semaines et commencerons à être utilisés 3 semaines plus tard.
Mise au point d’un modèle permettant l’étude du vieillissement cellulaire.
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une instillation de virus modifié dans le nez, puis huit injections en un mois d'un composé qui déclenche la mort des cellules vieillissantes de leurs poumons. Le projet sert d'abord à vérifier qu'une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiées fonctionne, avant de l'employer dans de futurs travaux. Le porteur indique avoir testé ce modèle en culture cellulaire, et affirme que la validation dans un "organisme complexe, proche de l'Homme" reste nécessaire.
Objectifs
En vieillissant, les cellules de nos tissus accumulent de multiples défauts conduisant à un déclin progressif de la fonction tissulaire. Le vieillissement augmente donc les risques de nombreuses maladies, dont le cancer. En 2013, la sénescence cellulaire a été décrite comme l'une des principales caractéristiques du vieillissement. Ce processus est provoqué par un stress ou des dommages intracellulaires et/ou extracellulaires excessifs, et entraîne un arrêt de la division cellulaire à long terme. La sénescence cellulaire a été décrite comme un mécanisme suppresseur de tumeur limitant la capacité des cellules endommagées à proliférer. Cependant, la sénescence cellulaire peut également avoir divers effets favorisant le développement tumoral, en fonction du contexte cellulaire et de la composition de son phénotype sécrétoire pro-inflammatoire. Enfin, l’élimination de cellules sénescentes chez des souris a permis de retarder l’apparition de caractéristiques liés à l’âge et le dysfonctionnement tissulaire, ainsi que d’augmenter la longévité. Pour pouvoir étudier le rôle de la sénescence cellulaire dans divers contextes pathologiques, nous allons mettre au point un nouveau modèle murin afin de (1) pouvoir tracer et quantifier la sénescence des cellules à quatre âges différents et de (2) permettre l’élimination spécifique de ces cellules sénescentes. Nous serons alors à même de mieux comprendre leur implication dans divers contextes pathologiques.
Bénéfices attendus
La mise en place et la validation de ce nouveau modèle murin nous permettra d’étudier par la suite le rôle des cellules sénescentes dans divers contextes pathologiques. Ainsi, cela permettra potentiellement le développement de diverses stratégies thérapeutiques où la sénescence cellulaire joue un rôle prépondérant.
Procédures
Au cours de ce protocole, les animaux seront soumis à l'instillation intranasale de virus ainsi qu'à de multiples injections. Les cellules sénescentes n'étant pas forcément très nombreuses, nous souhaitons tester notre nouveau modèle murin par activation des systèmes de traçage et d'élimination de toutes cellules sénescentes au niveau pulmonaire. Pour se faire, nous aurons recours à l'instillation intranasale de virus modifié permettant l'activation de ces systèmes dans n'importe quel type de cellules présentes au niveau des poumons. Les animaux seront anesthésiés au préalable et recevront une seule instillation. Puis, nous injecterons un composé synthétique venant induire spécifiquement la mort des cellules sénescentes. Les animaux recevront deux injections du composé synthétique par semaine pendant un mois, soit un total de huit injections.
Impact sur les animaux
Au cours de ce protocole, les animaux pourront ressentir une douleur légère et du stress lors des multiples injections.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin d'être analysés et de déterminer si notre nouveau modèle murin est fonctionnel et peut être utilisé pour de futurs projets de recherche scientifique pour lesquels nous souhaitons étudier le rôle de la sénescence dans divers contextes pathologiques.
Remplacement
Notre nouveau modèle murin étant un modèle génétiquement modifié, nous avons testé sa validité dans un premier temps par culture et traitement de cellules dérivées de divers organes de ces souris. Néanmoins, il est nécessaire de valider nos résultats dans un organisme complexe, proche de l’Homme, où de nombreux facteurs externes difficiles à reproduire en culture cellulaire entrent en jeu.
Réduction
Ce protocole contient deux procédures qui ont pour but de mettre au point notre modèle d’étude. Nous utiliserons tous les contrôles nécessaires tout en prenant le nombre minimum de souris par groupe, incluant à la fois des mâles et des femelles. Les animaux d’une même portée ne comportant pas la modification génétique seront utilisés comme contrôles pour les procédures expérimentales. Puisque nous cherchons à valider le modèle murin, nous nous basons sur des données de la littérature quant à la mise au point de l'instillation intranasale de virus ainsi que des injections du composé synthétique induisant la mort cellulaire. De plus, les procédures de validation se feront en deux temps: si nous ne visualisons pas les cellules sénescentes pulmonaires après instillation de virus, nous ne procèderons pas à l'élimination des cellules.
Raffinement
Dès leur arrivée dans l’animalerie, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 7 jours avant toutes manipulations. Une période d’habituation aux expérimentateurs et à la manipulation sera par la suite mise en place. Les souris seront pesées et observées au moins une fois par semaine dès la mise en place du protocole expérimental. Cette pesée entre dans le cadre du suivi de l’état général des souris. Les animaux seront observés lors du change par le personnel animalier. Une liste de scoring sera mise en place afin de déterminer l’éventuel degré de souffrance/l’atteinte d’un point limite. Les animaux seront hébergés en groupe dans chaque cage. Ces dernières comporteront des enrichissements comme du coton de nidation, des batônnets de bois et des maisons.
Choix des espèces
Une fois mis en place, notre laboratoire prévoit d'utiliser ce modèle murin pour des recherches comportant des analyses d’expression de gènes. Ainsi, la souris apparaît comme un modèle pertinent pour effectuer des études vivo du fait de sa forte homologie avec le génome humain. Les divers contextes pathologiques que nous étudierons par la suite n’étant pas toujours évident à mettre en place de façon représentative in vitro, le modèle murin apparaît alors approprié en termes de complexité et de pertinence par rapports aux questions scientifiques de notre équipe. Par ailleurs, nous travaillerons avec des animaux adultes, de différents âges, puisque la sénescence des cellules est plus fréquente au cours du vieillissement physiologique.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Une partie des 960 souris est rendue colitique par un stimulus inflammatoire, les autres restant indemnes pour la comparaison, toutes reçues à l'âge de trois semaines et en pleine croissance. Elles absorbent un métabolite de fongicide présent dans l'eau potable, seul ou en cocktail avec d'autres polluants, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit des gavages sous anesthésie locale et deux tests d'anxiété au maximum, qui consistent à placer chaque souris seule sur une structure à découvert ou surélevée, et parle d'inconfort plutôt que de douleur. Toutes sont tuées pour des prélèvements terminaux destinés à mesurer la motricité et la perméabilité intestinales.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont : 1) Evaluer l’impact d’une exposition à un polluant (métabolite de fongicide) d’origine hydrique (seul ou en cocktail avec d’autres polluants) sur les fonctions digestives et comportementales dans un modèle murin 2) Savoir si la présence de ce polluant dans l’eau potable peut être un facteur de risque pour le développement de maladies chroniques.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre : 1) de savoir si une exposition in vivo à un polluant d'origine hydrique peut être un facteur de risque pour le développement de maladies chroniques inflammatoires digestives (colite). 2) de définir des doses et durée d’exposition de polluants potentiellement à risque pour la santé. 3) d’évaluer le risque potentiel d’un effet « cocktail » de l’association de plusieurs polluants connus de l’eau potable sur la santé.
Procédures
Dans ce projet, aucune procédure chirurgicale ne sera effectuée. Si les manipulations des animaux sont peu douloureuses, elles peuvent présenter un certain inconfort. Les tests comportementaux d'anxiété (2 maximum) nécessitent de placer les animaux individuellement dans un environnement modérément anxiogène (structures à découvert avec ou non plancher surélevé). Toutefois ces tests sont de très courte durée (< 10 minutes) et après chaque test, les animaux sont rapidement replacés dans leurs cages avec leurs congénères. Pour les études d'explorations digestives, une étape de gavage (1 ou 2 fois selon la procédure) nécessitant la contention de l'animal est appliquée. Cette procédure réalisée par un expert et sous anesthésie locale, ne dure pas plus de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, stress et douleur peuvent être générés par les différentes expérimentations comme le gavage et les prélèvements sanguins pour l’exploration fonctionnelles digestive in vivo ou encore les changements d’environnement dans les tests comportementaux. Ces effets seront limités autant que possible grâce à l’expertise des gestes techniques de l’expérimentateur.
Devenir
Mise à mort de toutes les souris à l’issue des procédures. Des prélèvements terminaux seront réalisés pour des expériences ex vivo de motricités et de perméabilités intestinales ainsi que pour des études transcriptomiques, protéomiques et immunohistochimiques.
Remplacement
Dans ce projet, les effets recherchés de l’exposition aux polluants portent sur plusieurs organes (cerveau, intestin, microbiote) dont les interactions complexes ne peuvent être modélisés in vitro ce qui justifie l’utilisation d’un modèle animal.
Réduction
Sur la base d’expérimentations animales similaires et grâce à l’utilisation d’outil biostatistiques, le nombre minimum d’animaux à utiliser par groupe pour avoir une significativité avec une erreur de 0,05 et une puissance de 80% dans cette étude a été déterminé.
Raffinement
Le bien-être animal (temps d’acclimatation, hébergement, enrichissement, activité, comportement, alimentation, hydratation) sera pris en compte tout au long de l’expérimentation. Pour l’ensemble des procédures, des points limites sont mis en place et décrits dans chacune d’elle.
Choix des espèces
Le modèle C57 bl/6J est utilisé dans de nombreux projets au sein laboratoire. Notre unité possède ainsi une expertise reconnue pour l’étude des fonctions digestives et l’étude du comportement chez cette souche de souris et nous permet de ne pas utiliser trop d’animaux. Les animaux arriveront à l’âge de 3 semaines et seront en pleine croissance. L’utilisation de jeunes animaux permettra de mettre en évidence d’éventuels défauts de croissance / développement dus aux polluants.
Harmonisation collaborative de l’évaluation de la fonction cardiaque par échocardiographie chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rendues hypertendues par un traitement ajouté à l'eau de boisson et nourries d'un régime gras ou salé, 96 souris subissent des échocardiographies sous anesthésie pouvant durer une heure, un test d'effort sur tapis roulant, puis un cathétérisme cardiaque terminal réalisé sans réveil. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger et toutes les souris sont tuées. Le projet vise l'harmonisation méthodologique : cinq laboratoires partenaires veulent standardiser entre eux la mesure échographique et en faire un référentiel international. Le porteur affirme que l'installation de l'insuffisance cardiaque est indolore, et ne justifie l'effectif de 96 souris que par la répartition des mesures entre partenaires.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque (IC) est une situation clinique fréquente dans les pays industrialisés. Elle peut être due à de nombreux facteurs tels que l'infarctus du myocarde, l'hypertension ou le diabète. Son diagnostic est principalement basé sur les symptômes induits par la baisse de perfusion sanguine globale telle que la diminution des capacités physiques ou des troubles respiratoires. L'échocardiographie est l'examen non invasif habituellement utilisé pour confirmer l’origine cardiaque de la pathologie avec une altération dans le cycle mécanique de remplissage puis d’éjection du sang. Cet examen sert également pour le suivi de la prise en charge. Cette modalité d'imagerie a permis d'identifier deux groupes de patients différents : ceux qui présentent des symptômes typiques et une fonction d'éjection cardiaque réduite (ICFEr pour IC à fraction d'éjection réduite), et ceux qui ont une fonction d'éjection cardiaque préservée (ICFEp) mais une altération du remplissage cardiaque. L'atteinte de cette phase spécifique du cycle cardiaque est à l'origine du terme de dysfonction diastolique. Alors que l'ICFEp est le plus souvent due à une atteinte ischémique du coeur, l'infarctus, les patients atteints d'ICFEp présentent un tableau clinique variable. Il s’agit d’individus généralement âgés et présentant un ensemble de comorbidités telles que des antécédents d'hypertension, de diabète de type 2, d'obésité ou de néphropathie chronique. Il est important de noter que l’ICFEp représente aujourd'hui plus de 50 % des patients atteints d'IC et qu'à l'exception des « gliflozines », aucun traitement n'a fait la preuve de son efficacité pour cette pathologie. Les mécanismes physiopathologiques à l'œuvre dans ce type d'IC sont mal identifiés. Leur compréhension nécessite que la communauté scientifique partage les méthodes les plus robustes de l'exploration de cette pathologie dans les modèles précliniques. Nous souhaitons construire et harmoniser une ressource de paramètres d'échographie cardiaque et définir les méthodologies d'acquisition et d'enregistrement approuvées par tous les experts en cardiologie partenaires de ce projet. Ces méthodes et données expérimentales robustes et qualifiées, validées transversalement entre centres experts, établiront ainsi des lignes directrices internationales. Nous nous attacherons ensuite à diffuser la méthodologie validée pour en faire un référentiel pour la recherche préclinique.
Bénéfices attendus
L’harmonisation des procédures et leur diffusion à la communauté scientifique permises dans le cadre de ce projet pourrait conduire à une augmentation du pouvoir de détection des différents dysfonctionnements cardiaques, avec les conséquences suivantes en terme expérimental : 1) Réduction : Détection plus précise afin de réduire la taille des lots d’animaux 2) Raffinement : Détection plus précoce des pathologies pour réduire la dégradation du bien être dans le cadre de modèle plus chronique. Le consensus des membres partenaires, une fois établi, servira à proposer une nouvelle recommandation-cadre à la communauté scientifique en ce qui concerne l'évaluation, chez la souris, de la maladie cardiaque « dysfonction diastolique » (appelée ICFEp). Ces recommandations serviront d'accélérateur à la recherche de traitements innovants pour cette pathologie.
Procédures
Les animaux seront répartis en un groupe contrôle et un groupe recevant un régime inducteur d’ICFEp incluant un traitement ajouté à l’eau de boisson induisant une hypertension artérielle et une alimentation riche en graisses ou en sel. Les différents paramètres de leur fonction cardiaque seront explorés par une méthode d’imagerie non invasive, l’échocardiographie réalisée sous anesthésie générale. Cette exploration sera réalisée avant et après 5 semaines de régime. La durée totale d’anesthésie ne dépassera pas une heure par souris et par temps d’exploration. L’impact global du régime, après 5 semaines de traitement, sera évalué par un unique test d’effort sur tapis roulant pour la mesure des capacités physiques maximales. Les animaux sont habitués aux conditions de l’épreuve, sans course, les 3 jours précédents par session de 10 min d’exploration et marche. Enfin, sous anesthésie générale et analgésie, la fonction cardiaque sera évaluée de manière invasive en positionnant une sonde à l’intérieur du cœur. Ce dernier geste sera réalisé sans réveil des animaux. Pendant toute la durée de l’intervention et des mesures sous anesthésie, les constantes cardiovasculaires (pression, rythme cardiaque) et physiologiques (température) sont suivies et permettent des interventions de maintien d’un état stable des animaux (perfusion de soluté, réglage du tapis chauffant, ventilation).
Impact sur les animaux
La mise en place de l’insuffisance cardiaque est un phénomène non douloureux. L’altération de la fonction cardiaque est compensée longtemps avant que son évolution n’impacte l’organisme. La première complication, pour une pathologie déjà avancée, est la difficulté respiratoire à l’effort. L’anxiété qu’elle pourrait générer est peu susceptible de se produire dans les conditions d’hébergement sédentaire des animaux. Elle est possible lors du test d’effort prévu dans cette DAP mais cette exploration est nécessaire scientifiquement. A noter que les animaux ne subiront cette épreuve qu’une seule fois. L’échographie est une technique non invasive réalisée sous anesthésie générale. En dehors d’une phase d’excitation à l’induction qui est un stress de faible niveau, aucune nuisance n’est provoquée. L’exploration terminale invasive de cathétérisme cardiaque est réalisée sans réveil sous anesthésie générale et dans des conditions maitrisées d’analgésie (combinaison locale par lidocaïne et générale par morphinique).
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Le mécanisme du remodelage cardiaque aboutissant à l'insuffisance cardiaque (IC) en réponse à un stress implique tous les types cellulaires constitutifs du tissu mais aussi le recrutement de cellules, en particulier inflammatoires et l’interaction avec d’autres organes (rein, système nerveux, …). L’IC est donc une pathologie touchant tout l’organisme rendant indispensable une approche in vivo. D’autant que les paramètres altérés lors de la dysfonction diastolique ne sont pas encore tous identifiés et ne sont pas modélisables (in vitro ou in silico) à l’heure actuelle. De plus, le meilleure critère d'évaluation de la fonction cardiaque est la capacité physique à l'instar de ce qui est réalisé chez l'Homme (périmètre de marche, épreuve d'effort).
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux mis en œuvre nous avons décidé de mener ce projet collaboratif sur un seul site. L’ensemble des partenaires (5) feront les mesures sur les mêmes lots d’animaux en se répartissant aléatoirement les animaux pour chaque temps d’observation (pas plus de quatre acquisitions par souris et par temps d’observation). Par ailleurs, le projet vise à proposer une méthode fiable et reproductible qui permettra, à l’avenir, de mettre en œuvre des lots d’animaux de taille réduite pour réaliser l’ensemble des mesures proposées.
Raffinement
Parmi les modèles expérimentaux décrits dans la littérature ou pratiqués par les membres du consortium, nous avons fait le choix d’utiliser une induction de l’ICFEp par un traitement oral et un régime gras ou riche en sel, évitant une approche invasive de type chirurgie. L'imagerie échographique est une modalité non invasive. Elle permet d’explorer la fonction cardiaque et ses différents paramètres avec un stress minimal lié à l’induction de l’anesthésie (isolement et perte de connaissance). L'exploration terminale de cathétérisme cardiaque correspond à une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie à l'issue de laquelle l'animal est euthanasié. Les animaux font l'objet d'une surveillance quotidienne par du personnel qualifié afin de détecter le moindre signe de souffrance chez l’animal (inactivité, isolement social, prostration).
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est de standardiser l'évaluation échocardiographique de l'insuffisance cardiaque diastolique ce qui ne peut se faire que chez l’animal vivant en l’absence de modèles in vitro appropriés. L'utilisation de rongeurs tels que la souris permet de reproduire les pathologies humaines telles que les maladies cardiovasculaires. En effet, les modèles génétiques d'insuffisance cardiaque sont essentiellement constitués par des modèles murins. Ceci justifie que l'effort d'harmonisation des procédures d'exploration doive se faire sur ces animaux. Les expériences seront conduites chez de jeunes adultes de 10 semaines car si l’ICFEp est classiquement une pathologie du sujet âgé, l’induction de l’hypertension artérielle dans notre modèle expérimental reproduira certaines altérations liées à l’âge.
Impact du réchauffement climatique sur le muscle squelettique sain, dystrophique ou en régénération
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une sonde de température sous la peau, subissent la destruction d'un muscle par injection de cardiotoxine ou la ligature d'une artère de la patte, puis sont exposées à une ou trois vagues de chaleur de cinq jours, avec un risque de déshydratation, d'atteinte cardiaque et rénale et une mortalité accrue pour les plus atteintes. Certaines sont dystrophiques, d'autres âgées de seize mois, choisies pour représenter les populations humaines vulnérables à la canicule. Le porteur affirme qu'il est rare d'observer des signes de souffrance passé les vingt-quatre heures suivant la lésion musculaire, et conclut que le recours à la souris reste "essentiel" pour étudier les effets du réchauffement climatique sur le muscle.
Objectifs
Les vagues de chaleur liées au réchauffement climatique affectent de plus en plus notre santé et notre bien-être, notamment des personnes les plus vulnérables. Une vague de chaleur est une période où des températures anormalement élevées s’accumulent localement au cours d’une série de jours et de nuits inhabituellement chauds. La chaleur a un effet immédiat sur l’organisme, dès les premières augmentations de température. Lorsqu’il est exposé à la chaleur, le corps humain active des mécanismes de thermorégulation qui lui permettent de compenser l’augmentation de la température (transpiration, augmentation du débit sanguin au niveau de la peau par dilatation des vaisseaux cutanés, etc.). Il peut cependant arriver que ces mécanismes de thermorégulation soient débordés et provoquent un stress thermique conduisant à des maux de tête, des nausées, des crampes musculaires, de la déshydratation, et pour les formes les plus graves le décès. Des températures élevées entraînent d’autres effets sanitaires indirects, tels que l’aggravation des maladies chroniques sous-jacentes (maladies cardiovasculaires, diabète, asthme et troubles mentaux). Alors que le muscle squelettique joue un rôle majeur dans la thermorégulation par transfert de la chaleur vers la peau, l’impact des vagues de chaleur sur l’homéostasie et la régénération du muscle n’est pas connu.
Bénéfices attendus
Ce travail offrira une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les vagues de chaleur perturbent l’homéostasie du muscle sain ou dystrophique chez des sujets jeunes ou âgés et la régénération du muscle lésé ou ischémié.
Procédures
Les procédures invasives sur animal anesthésié sont au nombre de cinq : 1. Implantation d’une sonde de température en sous-cutané sur animal anesthésié (1 fois, durée : 5 min) 2. Modèle de régénération musculaire par injection de cardiotoxine sur animal anesthésié (1 fois, durée : 10 min) 3. Modèle d’ischémie des membres inférieurs sur animal anesthésié (1 fois, durée : 20 min) 4. Mesure de la force musculaire sur animal anesthésié (Aurora) (1 fois, durée : 30min) et 5. Prélèvement de sang par la veine cave sur animal anesthésié (1 fois, durée : 2 min). Les procédures non ou peu invasives sur animal anesthésié ou vigile sont au nombre de cinq : 1. Exposition à une vague de chaleur isolée ou répétée (1 fois 5 jours, ou 3 fois 5 jours) 2. Échographie cardiaque ou rénale sur animal anesthésié (durée : 20 minutes) 3. Vélocimétrie laser-doppler (évaluation perfusion sanguine) sur animal anesthésié (4 fois, durée : 15 min) 4. Test d’agrippement sur animal vigile (2 fois, durée : 5 min) et 5. Récolte d'urine après miction spontanée sur animal vigile (1 fois, durée : 2 min)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont principalement du stress lié à la contention et aux manipulations sur animal vigile (test d’agrippement). Les effets indésirables sont principalement ceux liés à l’exposition aux fortes chaleurs et à la récupération post-chirurgie (modèle de régénération musculaire) ; pouvant conduire à une déshydratation, et une atteinte cardiaque et rénale avec une mortalité accrue pour les animaux les plus atteints. Les effets indésirables seront la perte de poids (10%), une altération de leur apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilité réduite, agressivité). Dans notre expérience, il est rare d’observer des signes de souffrance chez l’animal ayant subi une lésion musculaire (que ce soit par un agent chimique ou à la suite de la ligature de l’artère fémorale) passer les 24h premières heures post-lésionnelles, suggérant que la période critique sera principalement celle de l’exposition des animaux à la vague de chaleur.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort. Leurs organes seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques et/ou moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.
Remplacement
Afin de tester l’impact direct des températures élevées sur la biologie de la cellules satellites, des expériences de culture cellulaire à température standard (37°C) ou forte température (40°C) seront menées indépendamment. Pour répondre à notre question biologique, le remplacement total par de la culture cellulaire n'est pas envisageable. En effet, les modèles in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des interactions physiopathologiques qui existent entre les populations cellulaires au sein d’un organisme ou d’un tissu entier. L'utilisation de modèles animaux reste essentielle afin d’étudier les effets délétères du réchauffement climatique sur le muscle squelettique. La souris est le modèle de choix en raison des similitudes des systèmes de réparation du muscle squelettique humain. Par ailleurs, les souris âgées ou dystrophiques peuvent fournir des notions importantes sur l’impact des vagues de chaleur sur le muscle squelettique dans les populations vulnérables, avec une grande pertinence pour la santé humaine.
Réduction
Nous allons réduire le nombre d'animaux par l'utilisation des méthodes non invasives (échographies cardiaque et rénale, vélocimétrie laser-doppler, test d’agrippement) permettant de répéter les analyses sur le même animal au cours de la maladie, mais aussi grâce à l'utilisation de tests statistiques appropriés et au fait d’utilisation de la patte controlatérale comme contrôle sans lésion. De précédentes expériences ont démontré que : - des groupes de n=10 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les analyses histologiques et moléculaires compte tenu de la variabilité biologique de la réponse au stress thermique. - des groupes de n=15 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les évaluations fonctionnelles compte tenu de la variabilité inter-individuelle dans nos deux modèles chirurgicaux de régénération musculaire et de la mortalité potentielle des animaux exposés à la canicule.
Raffinement
Les animaux importés pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. Pour raffiner, la souffrance des souris sera réduite en utilisant des sédatifs et analgésiques. Pour les échographies, la vélocimétrie laser-doppler et les modèles chirurgicaux, les souris seront anesthésiées et des injections d’antidouleurs seront faites en pré- et post-opératoire afin de limiter la douleur. Les animaux seront examinés de façon biquotidienne pendant les 5 premières jours suivant la chirurgie et l’exposition aux fortes chaleurs afin de vérifier leur état général de santé. Tout au long de l’étude, nous suivrons la grille d’évaluation proposée tenant compte des changements du poids, de perturbation de l'apparence physique et du comportement. Tout animal auquel aura été attribué un score élevé à cette évaluation recevra des analgésiques. Tout animal auquel aura été attribué un score trop élevé sera immédiatement mis à mort. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix car la physiologie du muscle squelettique est proche de celle de l’Homme. Elle a également l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées. Les souris présentant une délétion du gène de la dystrophine permettent de mimer la myopathie humaine de Duchenne. Des souris transgéniques permettant l’expression d'une protéine fluorescente verte dans les cellules satellites seront utilisées et faciliteront ainsi leur analyse spatiale en histologie et leur tri en cytométrie en flux pour l’analyse ultérieure de leur potentiel myogénique en culture ou de leur expression génique différentielle. La souris offre également l'avantage d'être de petite taille et de facilite l’exposition d’un plus grand nombre d’animaux dans la couveuse thermostatée. Nous maitrisons les modèles chirurgicaux de lésion musculaire pour lesquels nous n’avons aucune mortalité post-opératoire. Enfin, nous maitrisons les outils permettant les évaluations fonctionnelles et structurelles du muscle squelettique et des cellules satellites in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes de 8 semaines. A ce stade, les muscles sont parfaitement formés et les cellules satellites résident en périphérie de la fibre musculaire à l’état de repos. Nous utiliserons également des souris âgées de 16 mois pour évaluer l’influence de l’âge un facteur de vulnérabilité majeure dans l’impact du réchauffement climatique sur la santé humaine.
Etude de l’efficacité d’un candidat-médicament anticancer seul ou en combinaison, sur différents modèles de cancers.
- Recherche appliquée
- Cancers
Une partie des 912 souris est immunodéficiente, pour que des tumeurs d'origine humaine y soient greffées sans rejet, ce qui les expose aux infections. Toutes reçoivent une injection ou une implantation chirurgicale de cellules tumorales, puis une injection hebdomadaire du composé testé dans la veine de la queue ou dans l'abdomen, leurs tumeurs étant mesurées trois fois par semaine, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur mentionne une douleur après la chirurgie et une gêne à la locomotion possible si le volume tumoral atteint le point limite. Toutes sont tuées à la fin de l'étude du fait de l'injection de cellules tumorales, l'objet étant d'établir le mécanisme d'action d'un dérivé bactérien anticancer avant d'envisager des essais chez l'humain.
Objectifs
Depuis quelques décennies, l'immunothérapie s'impose comme une approche thérapeutique innovante contre le cancer, visant à stimuler ou réactiver le système immunitaire. Récemment, la prise en charge de cancers tels que le mélanome ou le cancer du poumon a fait des avancées notables grâce à une catégorie de ces immunothérapies, qui vont empêcher l’épuisement des cellules immunitaires qui détruisent les cellules infectées ou anormales. Depuis le XIXe siècle, on sait que les composants de certaines bactéries déclenchent une réponse immunitaire contre le cancer, mais leurs effets secondaires limitent leur usage clinique. Aujourd’hui, un dérivé moins toxique et plus efficace a été mis au point. Il a montré son efficacité à bloquer la croissance tumorale chez la souris, aussi bien en seul sur un modèle de cancer osseux qu'en association avec des immunothérapies sur d’autres cancers, sans provoquer d’effets secondaires graves. Dans l’optique du lancement futur des essais cliniques chez l’humain, il est important de comprendre et connaitre les mécanismes d’actions de la formule finale de ce composé. Après avoir défini la posologie la plus adaptée, son efficacité sera évaluée dans différents modèles représentant des cancers communément retrouvées chez l’humain, injecté seul et en combinaison avec des traitements déjà utilisés en clinique. Puis, le type de cellules immunitaires activé par le composé et impliqué dans l’efficacité à empêcher la croissance tumorale sera mis en évidence.
Bénéfices attendus
Aujourd’hui encore, beaucoup de cancers ne présentent aucun traitement efficace, ou une résistance au traitement se développe chez certains patients. Ce projet va permettre d’évaluer la portée d’action du composé sur différents modèles de cancers mimant ceux pouvant être retrouvés chez l’humain. Également, cela permettra de voir si, associé au composé, les thérapies disponibles mais inefficaces peuvent retrouver leur efficacité après stimulation de l’immunité. Dans un second temps, cette étude montrera les cellules immunitaires impliquées dans l’efficacité au composé. Cela permettra, pour cette étude ou à plus large portée pour la lutte contre le cancer, de se concentrer précisément sur les mécanismes à cibler.
Procédures
- 1 injection de cellules tumorales sous anesthésie - durée < 1 minute. Ou 1 chirurgie (sous anesthésie) pour implantation de la tumeur (selon le type de tumeur) – durée 5 min - 1 contention + 1 injection/semaine du composé testé dans la veine de la queue (animal vigile) et/ou 1 injection/semaine en intra-péritonéale (sous anesthésie) - durée < 5 minutes. - Mesures de volumes tumoraux et pesée 3x/semaine - durée < 1 minute - Petite incision de la veine de la queue (sous anesthésie) pour prélèvement de sang – durée < 1 min
Impact sur les animaux
Pour toutes les souris - Stress lié à la contention et aux mesures des volumes tumoraux et pesées (durée de quelques minutes, 3 fois/semaine) - Douleur lors d’injection : Lors de l’implantation des cellules tumorales (durée de quelques minutes, une fois), et lors de l’injection du/des traitement(s) (durée de quelques minutes, maximum 4 fois) - Douleur post-chirurgicale après implantation de tumeurs et suture. - Gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral atteint le point limite. Il n’y a pas de métastases attendues avec les modèles tumoraux utilisés. Pour les souris à phénotype dommageable (immunodéficience) : risque d’infection
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude, dû à l'injection de cellules tumorales
Remplacement
Avant le passage sur modèle animal, l’efficacité de ce composé et sa formulation ont été préalablement validées in vitro au laboratoire. Des tests plus poussés doivent être réalisés sur modèle animal pour évaluer l’effet de ce composé sur un organisme entier et plus complexe. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux molécules anticancéreuses dépend fortement du microenvironnement, et également du système immunitaire et de ses interactions complexes. Par ailleurs, plusieurs paramètres jouant sur la diffusion du composé dans le système sanguin et les différents organes, la mise en place de la réponse immunitaire activée par le composé, sa migration, son recrutement et son effet sur la tumeur nécessitent de travailler sur un organisme entier. Pour ces raisons, les études chez le modèle souris s’avèrent essentielles.
Réduction
Selon les précédentes expériences dans les mêmes conditions de traitement et de contrôles avec des souris, le nombre d’animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a pu être déterminé grâce à un logiciel statistique.
Raffinement
Les souris seront observées quotidiennement en surveillant leur état général, leur comportement critères physiques, ou le moindre signe de douleur. L’altération de ces critères éventuels sera annotée sur une fiche de suivi, et comparée à une grille de score pour détecter le moindre signe de souffrance et prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. Elles seront sous anesthésie générale avant injections et pendant la chirurgie. Un coussin chauffant est utilisé lorsque l’animal est endormi pour palier à la baisse de température corporelle lors de l’anesthésie. Les copeaux de litières seront remplacés par de la cellulose afin d’être moins irritants pour les souris présentant des tumeurs et éviter les nécroses. Les souris ont différents types d’enrichissement régulièrement renouvelé : maisons, tunnels, nids de cotons et paillage. Pour les souris présentant un phénotype dommageable (immunodéficience), celles-ci seront manipulée stérilement, et hébergées sous portoirs ventilés. Les gants seront changés avant manipulation.
Choix des espèces
Les souris sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs de par la disponibilité de modèles tumoraux, de réactifs, et permettent de constituer des groupes avec un nombre de souris suffisant, compatibles avec des résultats statistiquement significatifs. L’utilisation de souris immunodéficientes va permettre d’étudier l’effet du composé sur des tumeurs d’origine humaine, sans risque de rejet par le système immunitaire murin. Les souris seront utilisées entre 6 et 12 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte. Cette tranche d’âge permet aux souris d’avoir un système immunitaire mature tout en ayant une prise tumorale optimale.
Etude des propriétés immunitaires des antigènes dérivés du génome non-codant.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 516 souris vont être utilisées, chacune portant une tumeur induite par un carcinogène, greffée sous la peau ou appliquée sur une peau abrasée, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Un quatrième groupe est irradié pour détruire son système immunitaire avant de recevoir une greffe de moelle osseuse, avec des diarrhées, de la prostration et une altération de l'état général possibles pendant trois semaines. Toutes sont tuées pour analyses post-mortem. Le porteur revendique de suivre vingt peptides chez la même souris pour réduire les effectifs, affirme qu'il reste "nécessaire" de valider ses observations dans un "organisme entier", et annonce comme retombée d'accélérer le développement de vaccins anti-tumoraux.
Objectifs
L’essor récent des approches d’immunothérapie a révolutionné la prise en charge de cancers préalablement incurables. Cependant, ces approches ne sont pas efficaces pour les patients et ne s’appliquent pas à tous les cancers. Pour élargir leur champ d’application, il est essentiel d’identifier des stratégies visant à combiner les médicaments d’immunothérapie déjà utilisés avec d’autres molécules ou approches qui augmenteront l’efficacité des traitements. Une piste privilégiée est le développement de vaccins anti-tumoraux. L’objectif de tels vaccins seraient d’induire le développement de cellules immunitaires capables de reconnaître les cellules tumorales. Une étape essentielle est d’identifier les molécules exprimées par les cellules cancéreuses (antigènes) et pas par les cellules saines. Cela est possible car pendant la tumorigénèse, les cellules cancéreuses divergent petit à petit des cellules normales par l’accumulation d’anomalies génétiques ou épigénétiques. On sait depuis longtemps que le système immunitaire peut détecter les anomalies génétiques associées aux cancers. Ces dernières années, de nombreuses équipes ont montré qu’il peut détecter la plupart des anomalies épigénétiques acquises pendant la tumorigénèse. Cependant, il est nécessaire de tester si les cibles dérivant de ces anomalies épigénétiques sont adéquates pour une vaccination anti-tumorale, en déterminant notamment la stabilité de leur expression au cours du temps, leur capacité à induire une réponse immunitaire robuste, etc… L’objectif de ce projet est de fournir une description approfondie des réponses immunitaires contre les anomalies épigénétiques associées aux cancers, pour accélérer le développement de vaccins anti-tumoraux.
Bénéfices attendus
Le développement de l’immunothérapie a révolutionné la prise en charge de nombreux cancers. Cependant, ces protocoles ne sont pas efficaces pour tous les patients et ne s’appliquent pas à toutes les pathologies. Améliorer leur efficacité est un enjeu central en cancérologie. Le développement de vaccins anti-tumoraux thérapeutiques est une piste prometteuse pour améliorer le champ d’application de l’immunothérapie. Ces dernières années, de nombreuses équipes ont identifié de nouvelles sources de molécules exprimées par les cellules tumorales qui peuvent être détectées pour le système immunitaire. Cependant, il est nécessaire de mieux décrire les réponses immunitaires contre ces nouvelles molécules si on veut s’appuyer sur cette découverte pour améliorer la prise en charge clinique des patients. Le projet proposé ici apportera une compréhension approfondie des réponses immunitaires contre les cancers et consolidera les approches visant au développement de vaccins anti-tumoraux.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, une molécule carcinogène (induisant la formation des tumeurs) sera injectée à des souris anesthésiées (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie inf à 5 min). Dès que les tumeurs seront palpables (5-7 jours post-injection), elles seront mesurées deux fois par semaine sur animaux vigiles à l’aide d’un point à coulisse pendant toute la durée de la procédure. Dans un deuxième lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l'expérience – durée du geste inf à 10 sec). Dès que les tumeurs seront palpables (5-7 jours post-injection), elles seront mesurées deux fois par semaine sur animaux vigiles à l’aide d’un point à coulisse et les animaux seront traités 2 fois par semaine par injection pendant toute la durée de la procédure. La mesure de la tumeur et l’injection pour le traitement sont réalisées en même temps (une seule contention inf à 2 min). Dans un troisième lot d’animaux, des cellules tumorales seront appliquées aux animaux anesthésiés après abrasion douce de la peau (1 fois au cours de l’expérience – durée de l’anesthésie env 20 min). Dès que les tumeurs seront palpables (5-7 jours post-injection), elles seront mesurées deux fois par semaine sur animaux vigiles à l’aide d’un point à coulisse pendant toute la durée de la procédure. Dans un quatrième lot d’animaux, les animaux seront irradiés pour éliminer les cellules immunitaires. 4h après irradiation, des cellules de moelle osseuse d’intérêt seront injectées par voie intraveineuse sur animaux vigiles (1 fois au cours de l'expérience – durée du geste inf à 10 sec) pour reconstituer le système immunitaire. 6-8 semaines après injection, un prélèvement de sang sera réalisé sur animaux vigiles (1 fois au cours de l'expérience – durée du geste inf à 10 sec) pour évaluer la reconstitution.
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée ou soumis à une procédure de carcinogenèse chimique développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Pour les expériences d’injections de carcinogènes, de cellules ou des traitements, il est attendu une douleur directe associée à l’utilisation d’une aiguille. Pour le prélèvement de sang, il est également attendu une douleur légère liée à la piqûre elle-même (gène de courte durée ). Suite aux irradiations, certains animaux peuvent présenter des problèmes de diarrhée, prostration, altération de l’état général pendant les 3 premières semaines suivant l’irradiation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Nous avons réalisé des expériences in vitro ainsi que de nombreuses analyses bioinformatiques qui nous ont permis d’identifier des peptides dérivant de gènes, de mutations ou du génome silencieux exprimés par plusieurs lignées tumorales. Cependant, pour analyser si leur expression peut être affectée lors d’une réponse immunitaire efficace, il nous est essentiel de réaliser certaines expériences en utilisant des modèles de souris. En effet, il n’existe pas à l’heure actuelle de système d’activation in vitro permettant de récapituler la complexité des interactions entre cellules tumorales et système immunitaire lors du développement d’un cancer. Par conséquent, pour décrire les propriétés immunologiques des antigènes dérivés du génome non-codant, il nous est essentiel d’avoir recours à un modèle animal. Le modèle murin est particulièrement adapté du fait de la proximité des systèmes immunitaires entre hommes et souris.
Réduction
Nous avons réalisé des approches expérimentales et bioinformatiques en profondeur pour caractériser au mieux l’expression de différents types d’antigènes par nos cellules tumorales d’intérêt et ajuster les expériences à faire in vivo. Cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet. Néanmoins, il est nécessaire de valider ces observations dans le contexte d'un organisme entier où les interactions complexes entre cellules tumorales et système immunitaire seront reproduites. D’autre part, nous utiliserons systématiquement des approches dites de « multiplexage », qui permettront de suivre dans la même souris le comportement d’au moins 20 peptides différents. Ces approches complexes ont déjà été mises en place au laboratoire, ce qui permet de minimiser le nombre d’animaux utilisés dans ce projet . Les nombres d’animaux dans les différentes procédures ont été déterminés sur la base d’expériences similaires au laboratoire et sur la base des données de la littérature
Raffinement
Les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer la souffrance, et des points limites ont été définis. Les animaux seront mis à mort à l’atteinte des points limites. Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés 2 à 3 fois par semaines pour leur état général et pour mesurer la taille de la tumeur afin d'appliquer les points limites décrits dans la grille de score. Les gestes invasifs seront réalisés sous anesthésie générale avec recours aux analgésiques.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. D’autre part, la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris immunodéficientes. Il y a également de nombreux modèles de tumeurs transplantables disponibles, bien décrits et reproductibles, qui permettront de répondre rapidement aux questions posées dans ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte afin qu’elles aient fini leur croissance et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Enfin, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.
Modification de l’expression de gènes dans des cellules souches musculaires à l’aide de vecteurs viraux (adénoviraux AAV) chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Injectées avec des vecteurs viraux dans les jours suivant leur naissance ou à quatre semaines, puis soumises à un régime spécifique et à deux gavages, 136 souris subissent la destruction chimique d'un muscle de la patte par injection de chlorure de baryum sous anesthésie. La régénération dure trente jours. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger à modéré, et le porteur indique que la lésion peut être douloureuse pendant cette phase. L'objectif déclaré est de valider une méthode qui permettrait ensuite de cibler n'importe quel gène sans créer une nouvelle lignée de souris, et toutes sont tuées pour prélever leurs cellules souches musculaires.
Objectifs
Le muscle possède une remarquable capacité de régénération, due en grande partie à la fonction des cellules souches musculaires, également connues sous le nom de cellules satellites. En réponse à une lésion musculaire ou à une maladie affectant le tissu musculaire, les cellules satellites s'activent et génèrent de nouvelles cellules musculaires pour réparer les dommages. Pour maintenir leur capacité de régénération, les cellules satellites doivent rester dans leur niche appropriée, qui leur fournit des éléments optimaux tels que des nutriments, des signaux chimiques et un soutien physique. Lorsqu'elles sont retirées de cette niche spécialisée, les cellules satellites perdent leur capacité de régénération. L'un des principaux défis de la recherche biomédicale est d'identifier les facteurs qui composent cette niche spécialisée, car cette connaissance pourrait aider à préserver les propriétés régénératrices des cellules satellites et éventuellement à les exploiter à des fins thérapeutiques. La matrice extracellulaire, un réseau complexe de protéines comme les collagènes, joue un rôle crucial dans la niche des cellules satellites. Nous avons identifié plusieurs facteurs candidats de la matrice extracellulaire et nous souhaitons étudier leurs fonctions à l'aide de modèles de souris génétiquement modifiées. Ce projet devrait nous permettre de développer une nouvelle méthode pour générer rapidement des souris génétiquement modifiées afin d'étudier le rôle de différents facteurs de la niche dans la fonction des cellules satellites.
Bénéfices attendus
Bénéfice à court terme (scientifique) : La matrice extracellulaire est un environnement riche et dense composé de nombreuses protéines différentes spécialisées en fonction du tissu. Ce projet nous permettra de cribler l'importance des différents composants de la matrice extracellulaire exprimés par les cellules souches musculaires pour leur activité lors de lésions musculaires. Bénéfice à long terme (scientifique + réduction du nombre d'animaux) : Ce projet nous permettra de confirmer la stratégie de ciblage de differentes gènes d’intérêt en utilisant une seul model. Par conséquent, dans une perspective à long terme, la validation de cette stratégie nous permettra, ainsi qu'à d'autres chercheurs-euses, d'utiliser ce protocole comme un modèle rapide et robuste pour cibler n'importe quel gène d'intérêt dans les cellules souches musculaires directement in vivo sans avoir besoin de développer de nouvelles model de souris pour chaque gène d'intérêt. Cela réduira considérablement le nombre de souris utilisées par projet.
Procédures
Les souris incluses dans ce projet recevront en une injection des vecteurs viraux, en un seul geste (rapide (moins d'une minute)) soit après la naissance, soit à l'âge de 4 semaines. Une fois adultes, les souris seront soumises à un régime alimentaire spécifique en granules pendant deux semaines suivi par deux gavages (pendant deux jours consictifs, un par jour, en un seul geste, ce qui prend moins d'une minute). Deux semaines après, un seul muscle d'une seule jambe sera blessé par injection intramusculaire (rapide (moins d'une minute)) sous anesthésie générale. Le processus de régénération musculaire dure 30 jours chez la souris.
Impact sur les animaux
Concernant l'injection des vecteurs viraux chez les souriceaux après la naissance ou chez les souris adultes, ils seront realisées rapidement et à l'aide d'une aiguille adaptée et fine afin de minimiser la douleur chez l'animal. La douleur est donc considérée comme faible. Le gavage est effectué par des chercheurs formés et expérimentés en un seul geste, rapidement, à l'aide de sondes adaptées. La douleur est minimale et l'inconfort pour l'animal est très faible. Enfin, concernant l'induction de lésions musculaires par injection de BaCl2 dans le muscle tibialis antérieur (TA), l'injection est réalisée rapidement, sous anesthésie, en un seul geste et à l'aide d'aiguilles fines adaptées pour minimiser la douleur. Cependant, étant donné que l'induction de la lésion elle-même peut être douloureuse pour les souris pendant la régénération musculaire, des analgésiques ainsi que des adaptations de l'environnement et de la nourriture des animaux dans la cage ont été envisagés et décrites dans les sections adaptées.
Devenir
Toutes les animaux inclut dans ce projet seront utilisées pour effectuer des prélèvements musculaire afin d'avoir accès aux cellules souches musculaire.
Remplacement
Dans ce projet, nous nous intéressons aux cellules souches musculaires et à la structure de leur matrix extra cellulaire in vivo. Bien que plusieurs systèmes de culture cellulaire se soient développés, le comportement de ces cellules change lors de leur mise en culture. Par conséquent, la simulation complète de la matrice extra cellulaire physiologique des cellules souches musculaire n’est pas encore possible in vitro, ce qui nous oblige à passer par des modèles in vivo.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, tous les tests in vitro possibles ont été réalisés. Cependant, pour confirmer notre stratégie de travail nous aurions besoin de 36 souris avant de commencer les expériences principales. Ensuite, pour la phase expérimentale, nous avons décidé de réduire le nombre d'animaux en induisant une lésion musculaire dans un seul muscle d'une seule patte par souris, ce qui nous permettra de comparer le comportement des cellules souches musculaires au repos (muscle controlatéral non lésé = témoin) ou après régénération musculaire. Ainsi, 100 animaux (10 lots de 10 souris, pour avoir par lot, 5 souris controles et 5 souris expérimentales) sont prévus pour la phase expérimentale. Ces groupes représentent le minimum nécessaire pour pouvoir effectuer une analyse statistique et conclure les résultats expérimentaux.
Raffinement
Tout au long du projet, le comportement et le poids des souris seront surveillés par le même manipulateur afin de détecter tout signe de douleur ou d'inconfort chez les souris. Toutefois, l'induction de la blessure musculaire provoque des lésions musculaires et une régénération. De la nourriture et de l’hydrogel seront mis à disposition dans la cage les trois premiers jours au cas où les animaux ne parviendraient pas à atteindre la grille pour se nourrir. Également, des anti-douleurs sont prévus pour réduire la douleur des souris. Un tableau d'évaluation des animaux et des points limites a été préparé, adapté à chaque intervention, et sera consulté tout au long du projet pour évaluer l'état de chaque souris incluse dans chaque procédure
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples : 1. La souris est un mammifère et la structure de son muscle squelettique est très similaire à celle du muscle squelettique humain. 2. La courte durée de gestation et la maturité post natale chez la souris sont compatibles avec la durée de nos expériences. 3. La petite taille des souriceaux nous permet de cibler toutes les cellules avec une petite quantité des vecteurs viraux. 4. Des études similaires sur la délivrance de gènes par des vecteurs viraux chez la souris ont servi de base à la conception de l'expérience. 5. Notre laboratoire possède une expertise dans la manipulation des souris. pour l'injection des vecteurs viraux, les souris seront injectées soit après la naissance, soit à l'âge de 4 semaines. L'objectif est de cibler le plus grand nombre de cellules souches musculaire par l'intermédiaire des vecteurs viraux. Par la suite, les tests de régénération musculaire seront effectués chez des souris adultes, soit à 11-15 semaines d'âge, pour étudier le comportement et la capacité des cellules souches musculaires pendant la régénération des muscles squelettiques.
Utilisation d’animaux dans le cadre de la formation interne du personnel
- Formation professionnelle
Rats : 325
Lapins : 50
Chiens : 35
705 des 735 souris, rats, lapins et chiens vont être réutilisés dans d'autres procédures, et 30 lapins et chiens proposés à l'adoption. Ils sont soumis à des prélèvements de sang, vigiles ou sous anesthésie, et à des injections de sérum physiologique qui peuvent durer dix minutes, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le porteur reconnaît que ces gestes sont exécutés par du personnel qui ne maîtrise pas encore les bons gestes, ce qui peut induire une douleur ou un stress anormal. La finalité est d'entraîner les opérateurs d'un établissement de toxicologie réglementaire, et pour les animaux ayant déjà servi ailleurs le porteur privilégie la réutilisation dans des procédures sans réveil.
Objectifs
L’établissement utilisateur est spécialisé dans la recherche pré-clinique et effectue des études de toxicologie et pharmacologies réglementaires (Bonnes Pratiques de Laboratoire) indispensables à la mise sur le marché de médicaments, vaccins, dispositifs médicaux, thérapies, etc. Ce type d’études requièrent une qualification au poste et aux gestes techniques réalisés, afin de garantir la qualité des résultats et la validité des études, un objectif synergique des exigences 3Rs. Pour que ces études soient menées par du personnel qualifié, la formation initiale et continue du personnel est primordiale. Ce projet a pour objectif de définir l’utilisation des animaux utilisés à des fins de formation afin de garantir la réalisation et la maitrise des gestes techniques dans les études. L’utilisation d’animaux de formation est nécessaire afin de permettre au personnel : - de se former sur les gestes techniques (cas de la formation initiale ou du maintien des compétences), - de s’exercer/s’entrainer à la réalisation de nouveaux gestes pour l’établissement d’un nouveau modèle.
Bénéfices attendus
Ce projet assure la formation pratique du personnel concepteur et/ou réalisateur de procédures expérimentales afin de garantir la maitrise des gestes techniques nécessaires à la qualité des données expérimentales (précision, reproductibilité) et les respects des exigences 3Rs de réduction (liées à la qualité des études) et de raffinement (impact minimum des gestes techniques sur le bien-être des animaux : en particulier stress, anxiété, douleur).
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang vigile et anesthésié dont le nombre et la fréquence suivent les recommandations EFPIA (European Federation of Pharmaceutical Industries Associations), ECVAM (European Center for the Validation of Alternative Methods), et de l’International Consortium for Innovation and Quality in Pharmaceutical Development. Ils seront aussi soumis à des administrations de liquides inertes type sérum physiologique, dans des limites recommandées par, entre autres, les lignes directrices citées ci-dessus. Chaque administration dure de quelques secondes (pour la plupart) à 10 minutes pour des injections intraveineuses dites lentes.
Impact sur les animaux
Les animaux étant utilisés à une fin de formation, leur manipulation ainsi que les actes réalisés sont réalisées par du personnel qui ne maitrise pas encore les bons gestes. Ceci sera susceptible d’induire un niveau de douleur ou un stress anormal aux animaux, lié à la contention ou à l’acte technique, même si celui-ci est considéré a priori comme peu invasif et n'entraine a prirori pas de nuissances. Il n'est pas attendu que ces nuissances persistent plus de quelques heures étant donnés la nature des gestes techniques ainsi que les méthodes de raffinement et d'encadrements mises en place.
Devenir
Les procédures de ce projet sont des procédures légères au cours de laquelle il n’est pas attendu d’effets indésirables particuliers chez les animaux. Ainsi, si un vétérinaire rend un avis favorable, la plupart des animaux de ce projet pourront être réutilisés dans un autre projet autorisé, y compris celui-ci. Le vétérinaire prendra en compte l’effet cumulatif pour chaque animal (ou lot d’animaux pour les rongeurs) dans sa décision. Pour les animaux naïfs avant de commencer ce projet, il sera possible de les réutiliser dans des procédures légères ou modérées. Pour les animaux non naïfs au début de ce projet (c’est-à-dire ayant déjà été inclus dans au moins une autre procédure expérimentale), il sera privilégié la réutilisation dans des procédures sans réveil, bien qu’une utilisation dans des procédures légères ou modérées soient aussi possible.
Remplacement
Le recours à l’utilisation d’animaux de formation est nécessaire afin de maitriser les bons gestes in-vivo avant la manipulation et la réalisation d’actes sur des animaux d’étude. Cela permet également de suivre l’état clinique de l’animal a posteriori de la formation, indiquant la bonne réalisation du geste ou non. De plus, le manque actuel de modèle mimant de manière satisfaisante l'anatomie des animaux implique le recours à l’animal. Pour des gestes techniques impliquant une chirurgie ou techniquement difficiles (ex : injection intratéchale), l’utilisation d’animaux euthanasiées dans le cadre d’autres procédures ou une procédure sans réveil sont privilégiées avant le passage à l’animal vivant.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux à commander spécifiquement en vue d’être utilisé pour de la formation, les animaux non euthanasiés ou non utilisés en fin d’étude et les animaux sentinelles pourront être réutilisés en tant qu’animaux de formation. La commande d’animaux naïfs dans le cadre de ce projet doit répondre à un besoin précis, comme la formation à un nouveau geste, ou l’arrivée de nouveaux collaborateurs nécessitant un besoin d’animaux non couvert par les situations ci-dessus. De plus, afin d’optimiser l’utilisation de chaque animal et de réduire le nombre d’animaux de formation, chaque animal pourra être réutilisé en fonction des actes qu’il a déjà subis, et en cas de procédures terminales, plusieurs actes peuvent être fait sur l’animal anesthésié avant euthanasie afin de ne pas avoir à les effectuer sur plusieurs animaux.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours minimum est respectée pour les rats, souris, hamsters, de 7 jours minimum pour les lapins et cobayes, et de 15 jours pour les chiens. En cas de réutilisation, une période de repos de 7 jours minimum est respectée pour l’ensemble des espèces après la fin de la précédente procédure. Elle peut être allongée sur décision vétérinaire lors de la validation de la réutilisation. Cette validation est faite après un examen clinique individuel pour les chiens et par lot pour les rongeurs ou les lapins. Les animaux sont hébergés collectivement durant toute leur durée de vie (sauf exception en cas de bagarre, blessure, auquel cas un suivi vétérinaire et de la structure en charge du bien-être animal est mis en place), avec des enrichissements appropriés aux besoins physiologiques de chaque espèce (abris, matériel de nidation, plateformes, bois à ronger pour les rongeurs ; copeaux, plateformes, jouets de différentes matières et formes, récompenses alimentaires et périodes de jeux et d’interaction avec le personnel pour les chiens). En cas d’hébergement individuel (bagarre, blessure), les hébergements sont organisés de manière à permettre a minima un contact visuel avec les animaux adjacents et un enrichissement supplémentaire validé par la structure en charge du bien-être animal est apporté. Les animaux sont observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre le plus rapidement possible, les mesures nécessaires : mesure de soutien (désinfection de plaies, isolement, réchauffement, etc…), traitements thérapeutiques (antibiothérapie, antidouleur, etc) ou la mise à mort des animaux ayant un état clinique jugé moribond. Le poids des animaux sera mesuré a minima 1 fois par semaine. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi. En cas de besoins, un traitement approprié sera mis en place (injection de fluides, analgésiques, anti-inflammatoires, etc…) sous prescription et/ou avis vétérinaire. Pour la réalisation des actes techniques, les animaux pourront être anesthésiés et un temps de repos avant réutilisation (entre chaque session de formation) a également été défini.
Choix des espèces
Les études pré-cliniques sont des études réglementaires in vivo qui nécessitent l’utilisation d’au moins deux espèces différentes. Les rongeurs, les lapins et les chiens sont trois types d’espèces fréquemment utilisées, il est donc important que le personnel soit formé sur ce type d’espèces. De plus, l’apprentissage de gestes techniques sur ces espèces permet ensuite de transposer les compétences acquises à d’autres espèces comme les primates non humains qui sont essentiels dans la recherche biomédicale mais dont l’utilisation dans un cadre de formation uniquement n’est pas règlementaire. L’âge des animaux utilisés dans la formation sera proche de l’âge des animaux lors des études. Pour les Rongeurs et Lapins, à partir de 8 semaines, et pour les chiens à partir de 6 mois et jusqu’à 5 ans.
Etude de la biodistribution de nanoparticules pour la délivrance d’ARN chez un modèle murin d’inflammation intestinale aigüe et chronique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Les souris qui servent à l'apprentissage des gestes sont des animaux écartés d'autres projets en raison de leur sexe, dont le porteur indique qu'ils auraient de toute façon été tués. 256 souris vont être utilisées au total, 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 96 un niveau sévère, toutes tuées à l'issue. Elles sont épilées sur le dos, reçoivent jusqu'à six administrations intrarectales sous anesthésie et un gavage, et une inflammation intestinale leur est provoquée par un agent chimique, avec perte de poids, selles modifiées et sang dans les selles. Le porteur annonce un projet qui "pourrait transformer le traitement des maladies inflammatoires", quand l'objet immédiat se limite à suivre où vont des nanoparticules d'ARN dans le corps et à vérifier leur tolérance à court terme.
Objectifs
Les maladies inflammatoires de l’intestin sont des troubles auto-immuns caractérisés par une inflammation sévère et récurrente de la paroi du tube digestif. Ces maladies, en augmentation dans les sociétés modernes, sont graves et les traitements actuels peinent à offrir une efficacité durable, entraînant souvent des effets secondaires pour les patients. Il est donc important de développer des approches thérapeutiques nouvelles et mieux ciblées. Ce projet de recherche a pour but de mettre au point une approche thérapeutique innovante, utilisant un nanosystème capable d’améliorer la prise en charge de ces pathologies inflammatoires. Ce projet d’expérimentation sur un modèle animal vise précisément à étudier la distribution de nanoparticules à base d’ARN, biodégradables et biocompatibles, dans un modèle de maladie intestinale inflammatoire (comme celles de type Crohn et colite ulcéreuse). Le projet s’inscrit dans une démarche scientifique et médicale visant à répondre aux interrogations suivantes : 1. Suivre la distribution et le ciblage des nanoparticules à ARN : Comprendre comment ces nanoparticules se répartissent dans l’organisme après une administration orale, et voir si elles ciblent efficacement les zones inflammatoires de l’intestin. 2. Évaluer la sécurité et la dégradation des nanoparticules : Analyser la tolérance des nanoparticules chez l’animal en vérifiant l’absence d’effets toxiques à court terme, ainsi que leur biodégradation et élimination. Pour atteindre ces objectifs, plusieurs nanosystèmes à base d’ARN ont été conçus et validés. Leur stabilité a été démontrée en conditions simulées (environnements gastriques et intestinaux), et leur compatibilité avec des cellules murines et épithéliales a été testée avec succès en laboratoire. Le passage à des études sur un modèle animal est donc maintenant nécessaire pour confirmer leur potentiel en tant que traitement des inflammations intestinales, ainsi que leur sécurité et leur efficacité. Ainsi, nous évaluerons la biodistribution de ces nanoparticules à partir du système digestif, une donnée cruciale pour l’évaluation future de leur potentiel thérapeutique.
Bénéfices attendus
Les inflammations chroniques, comme la maladie de Crohn ou la colite ulcéreuse, représentent un défi thérapeutique en raison de leur nature chronique et de l’absence de traitements ciblés. Les nanoparticules à base d’ARN offrent un potentiel thérapeutique innovant, avec des applications pour délivrer des agents anti-inflammatoires directement aux zones affectées, réduisant ainsi les effets secondaires systémiques. Ce projet vise à étudier la biodistribution de nanoparticules biodégradables et biocompatibles dans un modèle murin de maladies inflammatoires aigüe et chronique de l’intestin. Bénéfices à court terme : Le projet fournira des données sur la répartition biologique et la biocompatibilité de ces nanoparticules, en évaluant leur capacité à cibler les tissus intestinaux inflammés et leur tolérance chez les animaux. Bénéfices à long terme : À terme, ce projet pourrait conduire au développement de nouvelles thérapies pour les maladies inflammatoires intestinales et d'autres maladies inflammatoires chroniques, offrant des traitements plus ciblés et efficaces. Il pourrait également améliorer les connaissances sur les nanotechnologies, avec des applications potentielles en thérapie génique. En conclusion, le projet pourrait transformer le traitement des maladies inflammatoires, offrant à la fois des bénéfices immédiats en recherche fondamentale et des retombées cliniques à long terme pour les humains et les animaux.
Procédures
Dans les différentes procédures : - les animaux seront épilés sur une petite zone du dos - les animaux recevront une ou plusieurs (6 maximum) administrations intra-rectale (5 minutes maximum pour l’ensemble du geste), sous anesthésie et une seule administration par gavage oral (moins d’une minute pour le geste), sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La manipulation des animaux (contention, pesée et anesthésie) pourra entraîner un état de stress. L’épilation nécessaire à la sensibilisation au produit peut créer une légère irritation. L’injection d’un agent chimique va induire une inflammation au niveau de l’intestin peut se traduire par une perte de poids, une consistance des selles particulière et une présence de sang dans les selles. L’administration par voie orale, lorsqu’il est bien maitrisé, est un geste rapide (moins d’une minute). Toutefois, cela pourrait éventuellement provoquer une légère irritation au niveau de l’œsophage.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort lorsque les gestes sont maîtrisés ou afin de réaliser des études ex-vivo post mortem.
Remplacement
Bien que les tests en laboratoire (in vitro) soient utiles pour des études préliminaires, ils ne peuvent pas simuler toute la complexité des interactions biologiques qui existent dans un organisme complet. Ces études en laboratoire nous ont déjà permis de démontrer que nos nanoparticules sont stables dans des conditions physiologiques variées (milieux qui simulent les fluides gastrique et intestinal) et qu'elles sont compatibles avec des cellules immunitaires et intestinales. Cependant, pour évaluer efficacement notre traitement dans le cadre de l’inflammation intestinale, il est indispensable d’avoir recours à des tests sur organisme vivant (in vivo). 1. Distribution et dégradation dans le corps : En utilisant un modèle in vivo, nous pouvons étudier où les nanoparticules se dirigent dans le corps après administration et comment elles se dégradent. Ces éléments sont cruciaux pour la sécurité du traitement, ce qu’une étude en laboratoire ne permet pas d’évaluer complètement. 2. Tolérance et sécurité globales : Pour garantir que le traitement ne déclenche pas de réactions indésirables ou toxiques dans un organisme entier, un modèle vivant est essentiel. 3. Interaction avec le microbiote intestinal : Le microbiote joue un rôle clé dans l’inflammation intestinale. Un modèle in vivo permet d’examiner comment les nanoparticules interagissent avec cette communauté complexe de micro-organismes, un élément qui ne peut être simulé de manière fiable en laboratoire. 4. Réalité des conditions de maladie : Les organismes vivants reproduisent les conditions pathologiques réelles, permettant ainsi de tester la réponse au traitement dans des conditions proches de celles rencontrées par les patients. 5. Effets dynamiques dans l’intestin : L’inflammation intestinale modifie des processus comme la perméabilité de l’intestin et son activité motrice, qui influencent directement l’efficacité des traitements oraux. Un modèle in vivo est donc nécessaire pour vérifier si nos nanoparticules parviennent à atteindre la cible thérapeutique. En somme, l’utilisation d’un modèle vivant permet de recréer un environnement biologique complet et complexe, essentiel pour confirmer l’efficacité, la biocompatibilité, et la sécurité de notre traitement dans des conditions proches de celles de l’humain.
Réduction
Dans la première étape de notre projet, nous allons apprendre à maîtriser deux techniques spécifiques d’administration de composés aux animaux. Il est essentiel que ces administrations soient effectuées avec précision pour réduire au maximum le stress des animaux et assurer la fiabilité des résultats futurs. Pour cet apprentissage, nous utiliserons des animaux qui ne seraient pas utilisés dans d'autres projets, par exemple en raison de leur sexe, et qui auraient autrement été euthanasiés. Dans la deuxième étape, le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente.
Raffinement
Pour préparer les souris au projet, nous les acclimaterons pendant une semaine pour réduire leur stress. Pendant tout le protocole, nous veillerons à leur bien-être et prendrons des précautions pour minimiser toute souffrance ou stress. Dans leurs cages, elles auront des objets comme des petites maisons et du paillage pour les distraire, et seront placées en groupes de cinq car elles sont sociables. Les souris seront transportées en toute sécurité dans des boîtes fermées et isolées du bruit. Toutes les souris seront observées pendant chaque pesée (tous les jours) afin de détecter une éventuelle apparition de signes de souffrance. Quand cela sera nécessaire, des experts montreront les techniques spécifiques pour minimiser le stress des souris. Si elles perdent trop de poids, nous ajouterons de la nourriture humide et de l'eau gélifiée pour les aider à s'alimenter. Si le rasage provoque une irritation, une crème apaisante sera appliquée, et la litière pourra être adoucie. Avant l’administration intra-rectale, les souris recevront une anesthésie légère, et nous humidifierons leurs yeux pour les protéger. Les points limites seront évalués quotidiennement à partir de l’induction de la pathologie, selon une grille de score : il varie de 0 à 4 (le détail de cette grille est explicité dans les procédures). De plus les critères comportementaux et apparences seront également pris en compte. Un traitement palliatif sera mis en place dès lors que la situation nécessaire et possible laissant une possibilité de rémission et non mise à mort systématique après 24h. Nous suivrons la distribution des nanoparticules dans leur corps en les surveillant étroitement pendant 48 heures, à des intervalles réguliers, tout en vérifiant leur poids et leur bien-être pour s'assurer qu'elles ne souffrent pas.
Choix des espèces
Le développement de nouvelles thérapies types nanosystèmes nécessite une évaluation chez le petit animal en complément des études in vitro pour déterminer leur devenir et leur efficacité in vivo. L’acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. La souris représente un modèle expérimental privilégié pour mimer la physiopathologie des maladies inflammatoires intestinales. Le modèle d’inflammation intestinale induite par l’agent chimique d’intérêt est déjà bien établi et mime la pathologie humaine que nous ciblons. Les Balb/c sont décrites dans la littérature pour être sensibles à l’induction d’une inflammation intestinale, contrairement à d’autres lignées. Ce modèle nous permettra donc d’acquérir les données nécessaires pour démontrer, dans un futur projet, l’efficacité thérapeutique notre nanosystème. Les animaux utilisés auront environ 6 semaines au début des procédures, conformément aux données de la littérature indiquant que les souris de cet âge sont plus réceptives au développement d'une inflammation intestinale après administration de l’agent chimique. Au-delà de cet âge, l'induction d'une inflammation intestinale devient plus difficile.
Rôle des neutrophiles dans le développement de la parodontite: modèle expérimental chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Jusqu'à huit poses de ligature autour des dents, renouvelées tous les trois jours sous anesthésie générale profonde, plus trois radiographies 3D des mâchoires sous anesthésie gazeuse et une dernière anesthésie avant la mise à mort. 128 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à 1, 4, 14 ou 28 jours pour prélever leurs tissus. La moitié des ligatures est imbibée de bactéries agressives pour le parodonte, et le porteur signale des douleurs gingivales postopératoires, des abcès possibles et une baisse de la mastication et de la prise de poids. Il estime, "par nos expériences passées", que huit animaux par groupe suffisent à obtenir une différence statistique, alors que les 128 souris se répartissent en huit groupes de seize.
Objectifs
La parodontite est une maladie fortement prévalente qui entraine une destruction des tissus de soutien des dents, et des édentements précoces. Elle est déclenchée par un déséquilibre de la flore bactérienne. La concentration de certains globules blancs, comme les neutrophiles, dans le tissu conjonctif est en corrélation avec la gravité de la parodontite. Cependant, leur fonction et leur distribution spatio-temporelle dans les tissus de la parodontite restent inconnues. Notre projet vise à étudier le rôle des neutrophiles à plusieurs étapes du développement de la maladie, dans un modèle de parodontite expérimentale chez la souris. La parodontite sera induite sous anesthésie générale profonde pendant 1, 5, 14 ou 28 jours, selon un protocole validé dans la littérature. Nous caractériserons radiographiquement l’évolution de la destruction du parodonte chez des souris au cours du temps, puis analyserons les fonctions des neutrophiles. Le projet se déroulera sur un an et nécessitera 128 souris.
Bénéfices attendus
Les neutrophiles sont les globules blancs les plus abondants et les premiers à intervenir lors d’une inflammation gingivale. L’analyse de l’évolution des fonctions de ces cellules au cours de la parodontite est cruciale pour mieux comprendre la pathologie. Grâce à ce projet, nous espérons découvrir de nouvelles cibles de diagnostic et de traitement de la parodontite.
Procédures
Les souris seront soumises au modèle de parodontite : pose d’une ligature (5 minutes) par souris sous anesthésie générale profonde (maximum 8 anésthésies + 1 anésthésie avant la mise à mort, par animal), renouvelés tous les 3 jours pendant 1, 4, 14 ou 28 jours (maximum 8 poses de ligature). Avant et à la fin de la mise en œuvre de ce modèle, une radiographie 3D (maximum 3 radiographies) des machoires sera réalisée pour toutes les souris sous anesthésie légère gazeuse (maximum 3 anésthésies par animal, durée 5 minutes/souris). Nous aurons alors 8 groupes de souris : (4 groupes avec une ligature simple, 4 goupes avec une ligature imbibée de bactéries agressives pour le parodonte). Les animaux seront mis à mort à 1, 4, 14 ou 28 jours pour évaluer l’évolution des fonctions des neutrophiles dans la parodontite avec ou sans bactérie agressive.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour l’animal pourraient être : - exceptionnellement pour les souris recevant la pose de ligature : des douleurs gingivales post-opératoires, voir des abcès gingivaux, diminuant la mastication et la prise de poids des animaux. - pour tous les animaux : une hypothermie au cours de l’anesthésie. - pour tous les animaux : une résistance à l’anesthésie.
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux sont mis à mort, permettant le prélèvement des tissus nécessaires à nos travaux.
Remplacement
Nous développons une recherche sur modèle expérimental chez le petit animal, car il n’existe pas d’autres méthodes alternatives (in vitro, in silico) pour l’étude de la parodontite dans son ensemble, et la souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour l’étude de cette maladie. Le modèle étudié permet de reproduire certaines caractéristiques de la pathologie humaine telles que l'inflammation et la perte osseuse.
Réduction
Nous utiliserons une lignée consanguine dont le fond génétique est contrôlé et homogène pour minimiser la variabilité des phénotypes et donc le nombre d’animaux à utiliser. Afin de minimiser le nombre d’animaux, une étude de puissance statistique a été réalisée pour le modèle de parodontite. Par nos expériences passées, il est estimé qu’une réponse sur un nombre de 8 animaux est suffisante pour obtenir une différence statistique.
Raffinement
Afin d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur les éléments suivants sont mis en place : (1) Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, en milieu enrichi pour minimiser leur stress (2) Avant chaque examen radiologique, sans intervention chirurgicale, une anesthésie légère mais dont l’efficacité est validée, sera effectuée (3) Avant chaque pose de ligature les souris seront anesthésiées profondément (4) Après chaque anesthésie, les souris seront placées dans un environnement chauffé et surveillées jusqu’à leur réveil (5) Les animaux seront surveillés le lendemain de chaque intervention ainsi que tous les 2 à 3 jours par le personnel dédié de l'animalerie ou/et les responsables de projet (6) Des points limites ont été établis. (7) La mise à mort anticipée sera effectuée selon les méthodes réglementaires, en cas d’atteinte de points limites. (8) Une analgésie est administrée avant la mise à mort
Choix des espèces
Le modèle de parodontite induite par ligature chez la souris est un modèle d’étude pertinent permettant de reproduire plusieurs caractéristiques de la pathologie humaine (inflammation et resorption osseuse). Ce modèle est validé par la littérature scientifique. 3 mois – âge adulte avec croissance des maxillaires achevée