Souris
Étude du syndrome métabolique et l’immunosuppression associés au cancer dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
3 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune manipulée moins d'une minute tous les deux à trois jours pendant trois à trente jours de traitement. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et comprennent une injection de cellules tumorales sous la peau, entre les côtes ou dans une veine, un suivi de la croissance tumorale au pied à coulisse ou par bioluminescence sous vingt minutes d'anesthésie, des injections intrapéritonéales trois fois par semaine et des gavages de solutions médicamenteuses ou bactériennes. Le porteur indique que la croissance tumorale et les traitements peuvent faire perdre du poids aux souris, et que les sites d'injection peuvent s'infecter. L'objet du projet est de relier la composition du microbiote intestinal à la réponse aux immunothérapies, et le porteur conclut à la "nécessité d'utiliser un organisme entier" dans lequel les cellules immunitaires circulent.
Objectifs
La dysbiose du microbiote intestinal a été reconnue comme une des caractéristiques du cancer impliquée dans le dialogue cancer-immunité au niveau clinique. Pour cette raison, nous souhaitons identifier les produits microbiens (tels que les métabolites) présents dans l’intestin afin d’étudier leur impact sur le cancer. L’objectif de ce projet est d’évaluer si la dysbiose du microbiote intestinal induit des changements métaboliques et immunitaires, à la fois dans l'intestin et au niveau systémique, qui peuvent être pertinents pour améliorer la prise en charge du cancer. Il s’agit d’un nouveau concept qui mérite une recherche approfondie.
Bénéfices attendus
Le cancer du poumon est le deuxième cancer le plus fréquent chez l’homme, le troisième chez la femme, ce qui en fait un problème majeur de santé public. Ainsi il est important d’étudier les mécanismes de réponse aux traitements dans ce type de cancer. Dans cette étude, nous espérons que la dysbiose intestinale identifiée pourra être utilisée en tant que biomarqueur prédictif de la réponse au traitement dans le cancer L’ensemble de ce projet de recherche a pour finalité essentielle d’améliorer la prise en charge des patients et les effets des immunothérapies.
Procédures
Tous les animaux seront manipulés brièvement (moins d’une 1 minute) tous les 2 à 3 jours pour mesurer les tumeurs ou les co-traitements. Deux tiers des souris recevront des traitements dans l’eau de boisson qui seront changés tous les 2 à 3 jours. La durée des traitements variera entre 3 à 30 jours. Certaines souris seront soumises à une expérience de croissance tumorale : 1 injection en sous-cutanée ou en intercostale sous anesthésie (3 à 5 minutes pour chaque souris) ou 1 injection en intraveineuse sur animal vigile (environ 3 minutes par souris). Une heure avant et huit heures après l’injection des cellules en intercostale, les souris recevront un analgésique. La croissance tumorale sera suivie par mesure manuelle (pied à coulisse) ou par bioluminescence. Cette dernière méthode nécessitera d’endormir pendant 20 minutes la souris qui sera placée sur un tapis chauffant. D’autres souris seront soumises à une administration de molécules thérapeutiques par voie intra-péritonéale sur animal vigile. Un tiers des souris recevront 3 injections par semaine et le reste des souris recevront 4 injections au total pendant l’expérience. Certaines souris seront soumises à l’administration d’une solution médicamenteuse ou bactérienne, par gavage sur animal vigile (3 administrations par semaine). Du sang sera prélevé une fois sur l’animal vigile (3 à 5 minutes) pour certaines expériences afin d’évaluer les changements métaboliques face aux traitements.
Impact sur les animaux
Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent engendrer un stress. De plus, lors des injections une légère douleur (équivalente à une piqure) peut survenir, éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection. Les sites d’injections peuvent s’infecter. L’anesthésie peut induire un stress thermique. Les gavages répétés peuvent entrainer une certaine contrainte. Un prélèvement sanguin sur animal vigile effectué pourrait engendrer une légère douleur et la formation d’un hématome. Par ailleurs, la croissance tumorale et l’administration de traitements peuvent entrainer une baisse ou perte d’appétit qui peut causer une perte de poids des animaux.
Devenir
Tous les animaux à la fin des procédures seront euthanasiés. Chaque procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus, sang et organes post-mortem.
Remplacement
Cette étude peut exclusivement être conduite in vivo, car il n’y a pas de modèles alternatifs permettant d’étudier l’efficacité des traitements anticancéreux et de confirmer leur action via l’activation du système immunitaire. Il est donc essentiel d’utiliser un modèle reproduisant au mieux l’environnement tumoral et le fonctionnement du système immunitaire. Cela se traduit par la nécessité d’utiliser un organisme entier dans lequel les cellules et les molécules du système immunitaire peuvent circuler, permettant ainsi une représentation plus fidèle des interactions biologiques complexes à l’intérieur du corps.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, des groupes de 10, 20 ou 40 souris (selon les procédures) seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés, soit au total 3360 souris. Nous appliquerons des tests statistiques appropriées à notre modèle d’étude pour comparer les effets étudiés entre les groupes. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. L’étude sera interrompue si les expériences initiales ne confirment pas l’hypothèse de travail. Les échantillons seront partagés avec des collaborateurs.
Raffinement
Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress. Pour minimiser leur stress, plusieurs souris seront logées dans la même cage, offrant un environnement social au calme et un espace vital suffisant. Les conditions d’hébergement respecteront les normes conventionnelles, comprenant un régime alimentaire normal disponible en permanence et un accès libre à l’eau. Un milieu enrichi adapté est prévu: dans les cages il y aura des nids et des tunnels en carton. Le comportement général des animaux sera surveillé régulièrement et leur poids sera mesuré avant le début des traitements, ainsi qu’une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés. L’anesthésie sera effectuée lors des injections des cellules tumorales. Une heure avant et huit heures après l’injection des cellules en intercostale, les souris recevront un analgésique. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte des points limites préétablis.
Choix des espèces
Le choix d’utiliser la souris dans cette étude est justifié par des considérations scientifiques et éthiques. Tout d’abord, la souris est un organisme complet et fonctionnel dont le système immunitaire peut être comparé à celui de l’homme, ce qui en fait un modèle pertinent. De plus, sa génétique est bien caractérisée, ce qui facilite les études génétiques et moléculaires. La souris est largement reconnue et utilisée comme modèle animal standard dans la recherche scientifique, notamment dans les études précliniques. Sa large utilisation au sein de la communauté scientifique internationale permet une meilleure comparabilité des résultats et une meilleure validation des observations entre différentes études. L’utilisation de la souris présente plusieurs avantages: nous disposons d’installations adaptées pour les souris, ainsi que d’une expertise solide en matière de techniques d’expérimentation animale et de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Nous utiliserons des animaux témoins et transgéniques avec un phénotype normal. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire actif.
Identification des effets de la 5G sur les mécanismes de régulation thermique
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 360
Tous tués à l'issue pour prélever sang, organes et tissus, 360 rats et 64 souris vont être utilisés pour mesurer ce que fait l'exposition aux fréquences de la 5G à leur régulation thermique. Les rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les souris un niveau léger. Chaque rat reçoit un capteur télémétrique implanté dans la cavité abdominale au cours d'une chirurgie de trente minutes, puis passe deux heures par jour, pendant une ou quatre semaines, dans une cage d'exposition chauffée à 31 °C, avec un test de préférence thermique de quinze minutes. Le porteur reconnaît qu'aux plus fortes intensités la température interne des rats peut monter de 0,5 à 1 °C, et rattache le projet à un programme européen destiné à revoir les valeurs limites réglementaires d'exposition.
Objectifs
Actuellement, la 5G est diffusée par l’intermédiaire d’une bande de fréquence de 3,5 GHz et pourra par la suite être accompagnée d’une nouvelle bande dite millimétrique à 26 GHz. L’éventuel impact sanitaire des champs électromagnétiques (CEM) à ces fréquences, est peu étudié. De précédents travaux avaient montré une modification de la régulation thermique à une température d’air de 31°C après une exposition de 5 semaines à 900 MHz chez des rats. Des souris exposées une semaine à 900 MHz semblaient avoir une expression plus importante de certaines protéines dans différents tissus. Ainsi, les rongeurs exposés aux CEM de 900 MHz activent des réponses observées lors d’exposition au froid. Dans ce projet, nous étudierons si une exposition aux fréquences de 3,5 GHz et 26 GHz à différentes intensités couplée à une température d’air élevée (31°C) modifie les paramètres physiologiques impliqués dans la régulation thermique (mesure in vivo de la température interne, du poids corporel et de la préférence thermique) chez des rats. Le second objectif du projet est de vérifier si la fréquence de 3,5 GHz influe sur un récepteur sensible au froid chez des souris après une exposition subaiguë. Pour cela, des rats seront exposés deux heures par jour à une température d’air de 31°C et à différents débits d’absorption spécifique (DAS) pour la fréquence de 3,5 GHz et différentes densités surfaciques de puissance (DSP) pour la fréquence de 26 GHz. Les paramètres physiologiques seront analysés lors ou après une exposition à des DAS de 0,08 W/kg, 0,4 W/kg et 4 W/kg pour la fréquence de 3,5 GHz, et des DSP de 10W/ m2, 50W/ m2 et 100W/ m2. Ces différents groupes d'exposition seront comparés aux groupes non exposés aux CEM (antenne éteintes) mais exposés à 31°C, en fonction du temps d’exposition (1 ou 4 semaine(s)) et en fonction du sexe (mâle et femelle). Deux autres groupes (contrôles négatifs) seront maintenus dans les cages d’hébergement sans être exposés ni aux CEM ni à 31°C. Cette procédure sera composée de 360 rats répartis en 30 groupes de 12 animaux chacun. Pour étudier l’implication des récepteurs au froid lors d’une exposition, des souris seront exposés deux heures par jour à des DAS de 0,08 W/kg, 0,4 W/kg et 4 W/kg à la fréquence de 3,5 GHz à 24°C pendant 4 semaines. Ces groupes seront comparés à un groupe non exposé. Cette procédure sera composée de 64 souris réparties en 4 groupes de 16 animaux chacun. Au total, le projet sera effectué sur 424 rongeurs.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un projet européen qui a pour objectif d’évaluer les niveaux d’exposition de la population à la technologie 5G et les éventuels effets sanitaires (études expérimentales et clinique chez l’homme ou l’animal). Ainsi, ce projet permettra d’évaluer les risques d’une exposition 5G pour donner d’éventuelles recommandations ou revoir les valeurs limites d’exposition réglementaires concernant les fréquences liées à la 5G.
Procédures
Des animaux seront exposés à des champs électromagnétiques et à une température ambiante de 31°C deux heures par jour durant une ou quatre semaines. Une chirurgie sera effectuée afin d'implanter un capteur télémétrique pour enregistrer la température interne dans la cavité abdominale. Celle-ci durera maximum 30 minutes par animal. Les animaux seront transportés et manipulés pour les déplacer de leur cage d'hébergement à leur cage d'exposition. Un test comportemental sera réalisé pour mesurer la préférence thermique. Celui-ci durera 15 minutes avec une habituation de 5 minutes tous les jours 3 jours avant le test.
Impact sur les animaux
Les groupes d’animaux exposés à 3,5 GHz à un DAS de 4 W/kg peuvent avoir une augmentation de leur température interne, comprise entre 0,5 et 1°C. Cette augmentation est liée à une absorption trop importante de l’énergie émise qui n’est pas assez dissipée par le système thermorégulateur des organismes (effet qui est à l’origine des valeurs limites d’exposition aux CEM chez l’homme). Cette augmentation, si elle est présente, durera le temps de l’exposition soit maximum 2 heures par jour. Pour les intensités inférieures, aucune nuisance ou effet indésirable n’est attendu. Pour la fréquence de 26 GHz, aucune nuisance ou effet indésirable n’est connu actuellement. Un potentiel effet stress peut être observé lors de la manipulation des animaux pour les déplacer de leur cage d’hébergement aux cages d’exposition.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de collecter le sang, des organes et des tissus pour effectuer des analyses post-mortem.
Remplacement
Le modèle in vivo est indispensable pour étudier les effets des CEM. En effet, l'énergie émise par les CEM est absorbée par l'organisme. Cette énergie peut induire une élévation de température qui est généralement dissipée par la thermorégulation. Les modèles in vitro actuels ne permettent pas de reproduire cette thermorégulation ce qui entraîne très souvent une élévation de température des cultures cellulaires. Ainsi, les résultats observés sont forcément liés à cette élévation de température. De plus, il n’existe pas de modèle in silico et in vitro reproduisant la régulation thermique qui implique des variations hormonales et comportementales ce qui nécessite le recours aux études in vivo. Le modèle rongeur (souris et rat) a été choisi car son système thermorégulateur est relativement similaire à celui de l’homme au niveau génétique, hormonal, comportemental et tissulaire. Les effets observés chez le rongeur peuvent contribuer à définir des valeurs limites d’exposition aux CEM.
Réduction
Plusieurs paramètres physiologiques seront analysés sur chaque rat. Afin de s’assurer d’avoir des résultats exploitables pour la température et le comportement et d’une puissance statistique forte pour réaliser des tests robustes combinant plusieurs facteurs, le nombre de 12 animaux par groupe a été choisi. En effet, de précédentes études ont montré des résultats robustes et significatifs à partir de 10 animaux. Cependant, l'enregistrement de la température interne avec le capteur télémétrique pouvant être parfois défaillant et la chirurgie pouvant amener des effets secondaires non désirables, nous avons choisi d'ajouter 2 animaux supplémentaires pour nous assurer d'obtenir assez de données exploitables. Il a été choisi de réaliser les expérimentations sur 16 animaux par groupe de souris. Les analyses ex vivo seront réalisées sur des tissus parfois présents en faible quantité chez la souris. Ainsi, ce nombre permettra d’avoir une puissante statistique suffisamment forte pour réaliser des tests robustes car les réponses individuelles peuvent être faibles et non exploitables. Nous utiliserons que des individus mâles car les effets sur les récepteurs au froid sont normalement similaires (pas d'effet sexe observé lors de précédentes études). Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel spécifique. Les effets testés au cours de ce projet seront les fréquences d’exposition (3,5 GHz/26 GHz), les niveaux d’exposition (DAS et DSP), la durée d’exposition (1 et 4 semaines), le sexe (mâle et femelle) et la cage (hébergement et exposition). En effet, le groupe contrôle négatif permettra de déterminer un éventuel effet stress lié à la manipulation et au transport entre la cage d’hébergement et la cage d’exposition.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement afin de vérifier leur bien-être grâce à des critères précis, permettant de déterminer un score et de prendre en charge précocement les signes de détresse, stress ou douleur. Cette grille prendra en compte l’apparence, le comportement et certains signes cliniques. Pour des scores supérieurs à 3, des mesures seront prises afin de soulager l’animal. Un score inférieur à 3 est un bon indicateur du bien-être de l’animal au sein du protocole. Un enrichissement sera mis en place pour les animaux afin de limiter le stress lié à leur hébergement (cylindres en carton, lanières de papier kraft, bâtons de bois à ronger). Les animaux seront hébergés à plusieurs dans les cages d’hébergements en prenant en compte la taille de la cage ainsi que le poids des animaux. Dans les cages d’exposition, les rats seront deux par cage et les souris deux ou trois par cage. Les rats qui seront opérés sous anesthésie pour implanter le capteur Anipill auront un traitement pré-opératoire avec l'administration d'un antalgique et l'application d'un anesthésique sur la zone à inciser. Pendant la chirurgie, les animaux seront sur un tapis chauffant pour éviter l'hypothermie et des mesures d'aseptie seront mises en place (stérilisation des instruments, utilisation de matériel stérile et à usage unique). Un traitement post-opératoire avec l'administration d'un antalgique sera effectué pour éviter la douleur liée à l’incision abdominale. Cette dernière sera la plus petite possible (maximum 1,5 cm de long). Après la chirurgie, les rats seront hébergés à plusieurs par cage avec les mêmes congénères qu'avant l'opération. Ils seront également étroitement surveillés pendant une semaine afin de s’assurer de la bonne récupération des animaux avant de réaliser les expositions aux CEM. Un test comportemental de préférence thermique sera réalisé chez les rats. Pour limiter le stress lié à un nouvel environnement, les animaux seront habitués 5 minutes au dispositif 3 jours avant le test pour limiter le comportement exploratoire et ainsi d’avoir rapidement la préférence thermique. La mise à mort des animaux se fera sous anesthésie avec l'injection préalable d'un analgésique.
Choix des espèces
Le modèle rongeur (rat et souris) est un excellent modèle in vivo pour étudier les effets des CEM. En effet, l'énergie émise par les CEM est absorbée par l'organisme. Cette énergie peut induire une élévation de température qui est généralement dissipée par la thermorégulation. Ce système est relativement similaire à celui de l'homme. Le rat est un modèle pertinent pour son comportement thermorégulateur et les réponses physiologiques mis en place. De plus, les systèmes physiologiques sont largement décrits dans la littérature. La souris est un bon modèle pour les études génomiques qui seront réalisées pour étudier l'implication de récepteurs au froid, leurs génomes étant entièrement séquencés et ayant une forte similitude avec le génome humain. Les rats utilisés seront des adultes d'environ 3 mois afin d'avoir une quantité de sang suffisante pour réaliser tous les dosages hormonaux. De plus, de précédentes études dans le laboratoire ont déjà été réalisées avec des rats à différents âges sans observer de différence. Les souris seront juvéniles avec un âge de 5 semaines au début de l'exposition afin de voir si les effets observés lors d'une précédente étude chez le rat juvénile sont également observés chez la souris.
Production de larves de Toxocara pour l’amélioration du dépistage lors des contrôles sanitaires
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Produire des larves de Toxocara dans des muscles de souris, pour que les analystes des services sanitaires apprennent à les reconnaître dans les carcasses de sangliers : 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune avale une fois 20 microlitres d'eau contenant des œufs embryonnés du parasite, déposés au coin de la bouche à la micropipette, puis vit quatre à huit semaines le temps que les larves migrent dans ses muscles. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur invoquant le caractère zoonotique du parasite et la collecte des muscles post mortem. Il affirme que l'infestation reste asymptomatique chez la souris et n'induit ni douleur ni stress, et justifie l'effectif par les "données de la littérature" et les besoins de collecte de larves, sans avancer d'autre chiffre.
Objectifs
Toxocara est un parasite nématode cosmopolite qui infeste les mammifères et les oiseaux. Les espèces zoonotiques sont T. canis (dont l'hôte définitif est le chien) et T. cati (dont l'hôte définitif est le chat). La contamination de l'environnement par des oeufs embryonnés a pour conséquence la contamination des autres animaux et des humains, qui sont ainsi des hôtes intermédiaires non essentiel au cycle parasitaire. Toxocara survit alors sous forme de larva migrans chez ces hôtes. Les animaux se contaminent également par la consommation de carcasses infectées par des larva migrans. L’homme se contamine lui aussi par la consommation d’une viande crue ou peu cuite, voire des produits charcutiers puisque ni la fumaison, ni la salaison ne sont des méthodes assainissantes. Chez l'humain, la toxocarose peut être bénigne, voire asymptomatique, mais elle peut aussi présenter des manifestations cliniques sérieuses liées aux larva migrans viscérales, occulaires ou neurologiques. Des analyses sur les carcasses de sangliers sauvages inspectées dans les établissements français de traitement de gibiers sauvages ont révélé depuis deux ans la présence régulière de larves de Toxocara spp. Dans ce contexte, la formation des analystes des services sanitaires permettra d'améliorer la détection de ces larva migrans dans les carcasses et de mieux protéger les consommateurs. Cette formation nécessite l'apprentissage de la reconnaissance des larves de Toxocara présentes dans les matrices carnées. Elle sera ensuite validée par la mise en place d'essais inter-laboratoires d'aptitude par l'autorité compétente afin d'améliorer la performance du réseau de laboratoires d'analyses vétérinaires. L'objectif est donc de pouvoir préparer du matériel de référence (matrice carnée) contenant des larva migrans de Toxocara canis.
Bénéfices attendus
Le projet permettra des bénéfices immédiats avec l'amélioration de la détection du parasite et ainsi la protection des consommateurs par le suivi d’un plan assurance qualité visant la vérfication de la performance des contrôles sanitaires des viandes issues d’espèces animales sensibles à Toxocara spp., principalement les sangliers.
Procédures
La seule intervention qui sera faite sur les animaux consistera en une infestation par voie orale du parasite Toxocara. Les animaux seront infectés par voie orale avec un volume de 20 uL d’eau contenant les oeufs embryonnés. Cela se réalise une seule fois sur chaque animal en plaçant le cône d'une micropipette au coin de la bouche de la souris. Celle-ci par reflexe avale le liquide contenant les larves. Le geste d'inoculation dure en moyenne 20 secondes. Les animaux infectés seront gardés sur une période de 4 semaines (minimum pour que le cycle se fasse dans l'hôte avec migration des larves dans les muscles) à 8 semaines maximum (la préparation des échantillons pour le matériel de référence est souvent étalées sur 4 semaines).
Impact sur les animaux
L’infestation par Toxocara spp. est asymptomatique chez l’animal (contrairement à l’humain) et n’induit pas d’inconfort ou de stress chez l’animal. Les souris infectées ne sont pas contagieuses entre-elles et peuvent de fait rester en groupe de 5 ou 10 individus dans une cage. Le gavage des souris se fait une seule fois en posant au coin de la bouche de la souris le cône d'une micropipette contenant les 20 uL d'eau avec les oeufs de Toxocara. Par reflexe, la souris avale le liquide. La contention est légère et se fait dans la main de l'expérimentateur.
Devenir
Les animaux étant infestés par un parasite zoonotique, ils doivent être mis à mort en fin d’expérimentation d’autant plus que nous aurons besoin de collecter les tissus : muscles en post mortem. Les souris seront donc toutes mises à mort.
Remplacement
Il est impossible à l’heure actuelle de réaliser un cycle parasitaire de Toxocara sans recours à l’animal. Nous ne nous pouvons donc pas nous affranchir des modèles souris.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au maximum pour les différentes expérimentations prévues sans risquer de compromettre les résultats. Le nombre est estimé par rapport aux données de la littérature et aux besoins en terme de collecte de nombre de larva migrans.
Raffinement
L’infection par Toxocara ne provoque pas de symptômes chez l’animal aux doses que nous utilisons, ni douleur, ni stress. L’infection se fait par voie orale sous un volume de 20 uL pour la souris. Néanmoins, lors de la surveillance quotidienne des animaux si une souffrance était constatée l’animal serait mis à mort. Les souris sont hébergées par groupe de 5 ou 10 dans une même cage. L'hébergement se fera en présence d'enrichissement classique (carré de coton, abri en plastique, balcon, roue).
Choix des espèces
L’espèce souris est particulièrement sensible à Toxocara et constitue l’espèce animale privilégiée pour l'obtention de larva migrans. Elles seront commandés à un poids (20 à 30g ) permettant une infection avec une charge parasitaire optimale pour obtenir le meilleur rendement par animal tout en restant asymptomatique et limiter ainsi le nombre d’animaux.
Effets d’une supplémentation en glutamine chez des souris mâles et femelles rendues obèses par l’alimentation.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Les souris dont le score de grimace dépasse 7 sont mises à mort, celles dont le score reste entre 5 et 7 reçoivent un analgésique. 1 088 souris rendues obèses par un régime riche en graisses vont être utilisées, 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 480 un niveau modéré et 128 sous anesthésie sans réveil. La gravité sévère vient des distensions colorectales par ballonnet, qui peuvent provoquer des lésions du rectum, auxquelles s'ajoutent des tests de tolérance au glucose et à l'insuline de deux heures répétés jusqu'à quatre fois, des gavages, des antibiothérapies et des permutations de litières entre cages de mâles qui augmentent leur agressivité. Toutes sont tuées pour prélever iléon, côlon, cæcum, foie, tissu adipeux et cerveau, afin de mesurer ce qu'une supplémentation en glutamine change à l'insulino-résistance et aux troubles digestifs.
Objectifs
L’obésité est un problème de santé publique majeur, dont la prévalence dans la population adulte atteint 17% en France. C’est une pathologie multifactorielle qui est associée à de nombreuses co-morbidités dont des troubles du contrôle glycémique et des troubles fonctionnels digestifs. En effet, l’apparition d’un diabète de type 2 est fréquemment observée chez les patients atteints d’obésité, stade précédé par une période où il existe une insulino-résistance et une intolérance au glucose. Par ailleurs, les sujets obèses de grade III ont une prévalence du syndrome de l’intestin irritable (SII) fortement augmentée (30% vs 5%), ce qui se traduit par des symptômes digestifs importants : douleurs abdominales chroniques, troubles du transit et ballonnements. Des données récentes chez l’animal et chez l’Homme suggèrent qu’une supplémentation orale en glutamine (acide aminé non essentiel) pourrait limiter la résistance à l’insuline, ainsi que les symptômes intestinaux, en améliorant la fonction de barrière intestinale. Dans une étude pilote réalisée sur 6 patients, la glutamine montrait une tendance à favoriser une perte de poids chez des femmes obèses et à améliorer l’insulino-résistance. Chez des souris soumises au stress d’évitement de l’eau (modèle WAS), il a été récemment démontré qu’une supplémentation en glutamine prévenait l’hyperperméabilité colique et réduisait la production de cytokines pro-inflammatoires. Des chercheurs américains ont quant à eux rapporté des effets bénéfiques d’un apport oral de glutamine sur les symptômes digestifs des patients SII-D. Elle limitait l’hyperperméabilité intestinale et diminuait les douleurs abdominales de 50 à 60%. La glutamine semble donc être un bon candidat pour cibler la fonction de barrière intestinale, impliquée dans les complications métaboliques et intestinales observées chez les patients obèses avec troubles fonctionnels digestifs. Ce projet a donc pour objectifs d’évaluer les effets sexe-dépendants d’une alimentation riche en graisse chez la souris et d’évaluer la capacité d’une supplémentation orale en glutamine, (i) à limiter l’insulino-résistance, (ii) à améliorer la fonction de barrière intestinale, et (iii) à moduler la composition de microbiote intestinal selon le sexe de l’animal.
Bénéfices attendus
Nous nous attendons à ce que la supplémentation orale en Glutamine ait des effets bénéfiques chez les souris obèses avec une amélioration de l’insulino-résistance et de leurs troubles fonctionnels digestifs qui pourraient s'expliquer par une amélioration de la fonction de barrière intestinale et une modulation de la composition du microbiote intestinal. Ce travail sera valorisé sous forme de publications, et éventuellement de brevets sur certains aspects mécanistiques. Ce projet fait partie intégrante d’un projet ANR retenu à l’appel d’offre 2020. Dans le cadre de ce projet ANR, une étude clinique pilote portant sur 110 patients obèses est en cours de réalisation. Si les résultats escomptés sont atteints, le projet sera étendu à un programme hospitalier de recherche clinique (PHRC) interrégional ou National. Les perspectives du projet sont de développer des interventions nutritionnelles sexe-dépendantes à faible coût pour les patients obèses afin de réduire les comorbidités telles que les complications métaboliques et les symptômes digestifs. L’ampleur de la population adulte française touchée par cette maladie demande des actions fortes et immédiates en matière de recherche et de développement. Le développement d’interventions nutritionnelles ciblées avec de la glutamine bénéficierait en priorité aux patients obèses dont le faible coût et l’innocuité ne restent plus à démontrer.
Procédures
- Procédure 1. Les souris subiront : test de composition corporelle sur animal vigile (3 tests/souris, 5 min/test), test de tolérance au glucose (OGTT) sur animal vigile (3 tests/souris, 2h/test), test de résistance à l’insuline (ITT, 3 tests/souris, 2h/test), et gavage d’une molécule fluorescente (1 procédure/souris, 1 min/souris). - Procédure 2 : identique à la procédure 2 avec en plus 1 test de viscéro-sensibilité (animal vigile, 30min/test). - Procédure 3. Les souris subiront : permutation de litière, test de composition corporelle sur animal vigile (4 tests/souris, 5 min/test), test de tolérance au glucose (OGTT) sur animal vigile (4 tests/souris, 2h/test), test de résistance à l’insuline (ITT, 4 tests/souris, 2h/test), et gavage d’une molécule fluorescente (1 procédure/souris, 1 min/souris). - Procédure 4 : identique à la procédure 4 avec en plus 1 test de viscéro-sensibilité (animal vigile, 30min/test). - Procédure 5. Les souris subiront : traitement d’antibiotiques dans l’eau de boisson (animal vigile, 7 jours de protocole, 1 fois/souris), gavage oral d’une solution de microbiote caecal (animal vigile, 2 fois/souris, 2min/souris), test de composition corporelle sur animal vigile (4 tests/souris, 5 min/test), test de tolérance au glucose (OGTT) sur animal vigile (4 tests/souris, 2h/test), test de résistance à l’insuline (ITT, 4 tests/souris, 2h/test), et gavage d’une molécule fluorescente (1 procédure/souris, 1 min/souris). - Procédure 6 : identique à la procédure 6 avec en plus 1 test de viscéro-sensibilité (animal vigile, 30min/test). - Procédure 7 : chaque souris subira un prélèvement du contenu caecal.
Impact sur les animaux
- Des administrations par gavage et des prélèvements de gouttes de sang dans la veine caudale seront réalisées au cours de ce projet. Les gavages oraux peuvent engendrer un stress de quelques secondes (nuisance légère). Quant aux prélèvements sanguins, ils peuvent engendrer une légère douleur au niveau de la queue (nuisance légère). - Une partie des souris développeront une obésité modérée après absorption d’une alimentation riche en graisses. Elles pourront ainsi développer des perturbations du contrôle glycémique, des troubles digestifs et des troubles du système cardio-vasculaire (nuisance modérée). - Des distensions colorectales seront réalisées pour certaines souris au cours de projet. La distension colorectale peut (i) engendrer un stress et une douleur chez l’animal, (ii) conduire à quelques lésions tissulaires au moment de l’introduction du ballonnet dans le rectum (nuisance sévère). - Des permutations de litières entre des cages de souris mâles seront réalisées au cours de ce projet. Elles peuvent entraîner un stress supplémentaire et une plus grande agressivité chez certaines souris mâles (nuisance modérée). - Des antibiothérapies par voie orale seront réalisées au cours de ce projet. Elles peuvent engendrer des comportements anxieux et sociaux altérés, et une augmentation de l’agressivité des animaux (nuisance modérée).
Devenir
Etant donné que l'obésité présente de nombreuses comorbidités et atteints de nombreux organes, le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour mieux comprendre cette pathologie et améliorer in fine les conditions de vie des patients. A chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort car nous avons besoin d’étudier de nombreux organes cibles tels que l’iléon, le côlon, le caecum, le foie ou encore le tissu adipeux. Nous étudierons aussi le cerveau des souris (amygdales, hypothalamus, hippocampes). Il s’agira d’évaluer les effets d’une supplémentation orale en glutamine sur (i) les réseaux neuropeptidergiques impliqués dans la régulation du comportement alimentaire, et (ii) sur la neuro-inflammation qui intervient dans l’axe microbiote-intestin-cerveau.
Remplacement
Etant donné les nombreuses comorbidités touchant différents organes au cours de l’obésité, le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour mieux comprendre cette pathologie et améliorer in fine les conditions de vie des patients. Au regard de la règle des 3R, pour limiter le nombre d'animaux, certaines approches très mécanistiques seront menées sur des modèles cellulaires comme par exemple l'étude des voies de signalisation intracellulaires régulant la fonction de barrière intestinale. Nous maitrisons au laboratoire diverses lignées cellulaires intestinales humaines mais aussi la technique d’inserts transwell qui permet d’évaluer le passage des molécules à travers la monocouche cellulaire (systèmes compartimentés avec le compartiment basolatéral et le compartiment apical).
Réduction
Pour limiter le nombre d'animaux et en accord avec les résultats obtenus lors de nos études antérieures, chaque paramètre sera évalué sur un effectif de 12 animaux par lot. Les résultats seront comparés par des tests statistiques appropriés. On s'intéressera principalement aux effets des paramètres "Diète", "Glutamine" et "sexe" sur divers paramètres biologiques (insulinémie, adipokines, perméabilité intestinale…). La taille d'effet est calculée pour un niveau de risque fixé à 5% et une puissance fixée à 80%. La procédure expérimentale sera répétée 1 fois. Lors de la réalisation de l’expérimentation nous prévoyons une perte en animaux de 0%. Les animaux seront répartis en lots de 4 individus par cage (hors procédure 1). Le plan expérimental mis en oeuvre est emboîté. Le problème de dépendance statistique des individus appartenant à une même cage sera minimisé lors de l’analyse des données en ayant recours à des modèles statistiques à effets mixtes. Enfin, nous prélèverons de nombreux tissus de façon à mener des travaux supplémentaires sur d’autres structures d’intérêt comme le cerveau ou encore le foie, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux in fine.
Raffinement
D'une façon générale, les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs pour tendre à une habituation, et hébergées au nombre maximum de 4 animaux par cage avec de l’enrichissement (tunnel, papier kraft). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera maintenue avant tout début de protocole. Pour prendre en charge la douleur, une évaluation de la souffrance sera réalisée une fois par jour à l’aide de la « Mouse Grimace Scale » développée par Langford et ses collaborateurs. Cette méthode sera tout particulièrement utilisée lors du test du viscéro-sensibilité. Lorsque la somme des scores sera comprise entre 5 et 7 (douleur modérée), les animaux recevront une injection d’un analgésique. L’animal sera surveillé et remis dans sa cage d’origine. Si la douleur persiste plus de deux jours, les animaux seront mis à mort. Lorsque la somme des scores sera supérieure à 7 (douleur sévère), les animaux seront mis à mort. Lors d’un gavage de l’animal, si par inadvertance, l’expérimentateur devait noyer les poumons de l’animal, celui-ci sera mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie. Dans le cadre du test de tolérance au glucose (OGTT), la glycémie de l’animal sera contrôlée régulièrement de façon à éviter toute hyperglycémie sévère, qui pourrait avoir des effets délétères sur l’animal. Dans le cadre du test de la tolérance à l’insuline (ITT), la glycémie de l’animal sera contrôlée régulièrement de façon à éviter toute hypoglycémie durant le test (inactivité, yeux fermés, posture prostrée, tremblements, froid au toucher). Pour diminuer l’agressivité et les comportements anxieux des animaux après échanges de litières ou antibiothérapie, il y aura un enrichissement du milieu, avec en particulier la mise à disposition d’abris.
Choix des espèces
Ce projet est un projet de recherche en physiologie intégrée permettant d’étudier des relations inter-organes importantes durant l’obésité, et tout spécialement l’axe microbiote-intestin-cerveau. Le recours à des modèles animaux est donc nécessaire pour mieux comprendre (i) l’influence bénéfique que pourrait avoir une supplémentation orale en glutamine sur les animaux obèses mâles ou femelles, et (ii) d’évaluer si les effets sexe-dépendants observés chez les souris HFD en réponse à la glutamine passent au moins en partie par le microbiote intestinal. La souris est communément utilisée dans les modèles soumis à un régime riche en lipides. De plus, certaines lignées ont un taux de réponse élevée au régime riche en lipides par rapport à d'autres espèces animales. Le choix de la souris par rapport au rat se justifie par une meilleure réponse au régime riche en lipides et par le coût de l'alimentation riche en lipides. Les souris seront livrées à l'animalerie centrale à leur quatrième semaine de vie pour un début de protocole à 7 semaines. Les souris auront ainsi une semaine d’acclimatation minimum. A ce stade, nos études antérieures montrent une bonne réponse des animaux au régime riche en lipides.
Étude de la migration des cellules métastatiques du cancer du poumon à petites cellules dans le cerveau
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
1 455 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, dont 675 recevront une fenêtre de verre de 3 millimètres implantée dans le crâne au cours d'une chirurgie d'environ une heure. Toutes subissent une injection de cellules cancéreuses directement dans le cerveau sous anesthésie, pour suivre la migration des métastases d'un cancer du poumon à petites cellules. Le porteur indique que la chirurgie entraîne de la douleur et modifie le comportement, et que la tumeur intracérébrale peut provoquer une perte de poids et une hausse de la pression intracrânienne. Les souris, pesées chaque jour week-ends et jours fériés compris, sont tuées dès qu'elles perdent plus de 20 % de leur poids de référence ou montrent un comportement stéréotypé.
Objectifs
Ce projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs EU1 et EU2. Chez l’Homme, le cancer du poumon, le plus malin et le plus fréquent à l'échelle mondiale, inclut un sous-type particulièrement agressive appelé cancer du poumon à petites cellules (CPPC), représentant 14 % des cas de cancer pulmonaire. Environ 20 % des patients atteints de CPPC présentent des métastases cérébrales au moment du diagnostic, constituant la principale cause de décès dans cette population. En raison de sa nature agressive et de son potentiel métastatique élevé, le CPPC est utilisé par notre équipe comme modèle cliniquement pertinent pour comprendre les mécanismes responsables de la migration des cellules métastatiques, en particulier les métastases cérébrales, qui demeurent mal compris malgré son impact clinique majeur. Ce projet est une collaboration avec des chercheurs Américains, spécialiste mondial de ce type de cancer, qui nous donne accès à des lignées cellulaires dérivées de modèles murins et de tumeurs humaines. Les cellules détectent la nature physique et biochimique de leur environnement pour contrôler des fonctions cellulaires (adhésion, migration, prolifération, apoptose, différenciation) impliquées dans le développement du cancer. Notre hypothèse de travail est que le potentiel métastatique des cellules est associé à l’acquisition de nouvelles structures adhésives et de nouvelles structures du cytosquelette de l'actine.
Bénéfices attendus
Le projet vise à approfondir notre compréhension des mécanismes de dissémination métastatique du cancer du poumon à petites cellules (CPPC) dans le cerveau. En étudiant les interactions entre les cellules de CPPC et leur microenvironnement cérébral, il cherche à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter le CPPC métastatique. En comparant ces mécanismes avec ceux d'autres types de cancer cérébral comme le glioblastome, le projet offre une perspective élargie sur les approches thérapeutiques possibles. En utilisant des modèles murins, il contribue à améliorer la fiabilité des tests précliniques de nouveaux traitements. De plus, en caractérisant le microenvironnement tumoral, il ouvre la voie à une meilleure compréhension de son rôle dans la progression de la maladie et à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. En résumé, ce projet offre une opportunité précieuse d'avancer dans la lutte contre le cancer du poumon en fournissant des données pertinentes pour le développement de traitements plus efficaces et ciblés.
Procédures
675 souris auront la pose d'un dispositif d'imagerie. Pour avoir ce dispositif il faut procéder à une chirugie (dans l'EU1) sur animal endormi qui dure environ 1h avec utilisation de produits anti douleur. Un dispositif d'imagerie (fenetre en verre) de 3mm de diamètre sera implanté dans le crâne de la souris (dans l'EU1) . Toutes les souris auront une injection directe dans le cerveau pendant qu'elles seront endormies (dans l'EU1 et 2) . Les souris auront une préparation des tissus pour l'étude des propriétés cellulaires après une ou plusieurs injections (si la souris a un dispositif d'injection ou non)(dans l'EU1 et 2) . Cette préparation des tissus se fera sur animal endormi très profondement avec utilisation d'anti douleur. L'animal sera ensuite euthanasié et le cerveau sera récupéré(dans l'EU2) .
Impact sur les animaux
Les étapes de la chirurgie entrainent de la douleur chez les animaux et modifient leur comportement. Le développement tumoral intracérébral peut entraîner une perte de poids et/ou une augmentation de la pression intracranienne.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement du cerveau et etude histologique
Remplacement
La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux et leurs interactions avec les cellules tumorales sont modifiées dans ces préparations.
Réduction
Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés
Raffinement
A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au coeur de nos préoccupations. Nos animaux naîtront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter leurs points limites post injection de cellule tumorale (week-ends, vacances et jours fériés inclus) : poids (pesés quotidienne), si plusieurs pertes de poids consécutives, avec une perte >20% par rapport à la pesée de référence à raison d’une pesée par jour, les animaux seront euthanasiés. Si l’animal présente un comportement stéréotypé ou à des comportements anormaux (agressivité, cachexie, stéréotypie, prostration) il sera dans un premier temps isolé et surveillé, l’animal est euthanasié si pas d’amélioration après 48h. Les animaux seront euthanasiés, dès les premiers signes neurologiques détectés (tremblements, problème de mobilité) Trasport entre les deux EU: Le transfert entre les 2 animaleries est effectué par les utilisateurs. Ils ramènent les cages sur un chariot du PIV-EXPE au quatiréme étage (EU B33063940) vers la salle d’hébergement du CHRONIC au deuxiéme étage (EU B33063943) en utilisant un montecharge adapté. Ils suivront une acclimatation de 4 jours minimum avant de commencer le protocole expérimental.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux à l'age adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.
Evaluation de l’effet thérapeutique des analogues de la curcumine dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
640 souris porteuses d'une accumulation de protéines toxiques mimant la maladie d'Alzheimer vont être utilisées, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, l'autre moitié un niveau modéré, toutes tuées pour prélever cerveau et sang. Elles reçoivent de la curcumine ou ses analogues dans l'eau de boisson, sont isolées en cage individuelle avec une roue pour mesurer leur activité, et doivent nager pour retrouver une plateforme immergée. Ce test de mémoire spatiale et l'anesthésie sans réveil final comptent parmi les quatre interventions au plus que subit chaque souris. Le porteur écrit que l'accumulation de protéines "n'engendre pas nuisance affectant l'état physiologique des animaux", tout en décrivant un déficit cognitif et des défauts de mémorisation qui s'aggravent avec l'âge.
Objectifs
Les patients atteints de la maladie d'Alzheimer (MA) présentent dans leur cerveau des agrégats protéiques toxiques participant à l’aggravation de la maladie. Des travaux de l’équipe ont rapporté le rôle toxique de protéine s’accumulant de façon précoce et contribuant au développement de la MA. D’autres travaux publiés ont démontré que la curcumine exerce un effet neuroprotecteur dans un modèle murin mimant les formes sporadiques majoritaires de MA. Cependant, la curcumine présente une faible biodisponibilité dans le cerveau. C'est pourquoi nous avons synthétisé deux analogues de la curcumine, non toxiques, qui montrent un effet anti-inflammatoire et antioxydant sur des cultures cellulaires traitées avec des protéines toxiques impliqués dans le développement de la MA. L'objectif de ce projet est donc de déterminer l'effet de la curcumine et de ses analogues à des stades précoces et avancés de la MA en utilisant un modèle murin de la MA mimant la pathologie chez l’homme.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de valider l’effet de ces molécules dans un modèle murin de la MA, qui intègre à la fois l’accumulation des protéines toxiques observés chez les patients Alzheimer et chez qui il est possible d’évaluer l’impact préventif (administration au début du développement de la pathologie) et aussi thérapeutique (administration après l’apparition des symptômes de la pathologie). De plus, il vise à examiner spécifiquement le rôle de l’accumulation de protéines toxiques et aussi de la neuroinflammation dans le développement et la progression de la MA. Cette recherche fondamentale devrait fournir des informations précieuses sur les mécanismes cellulaires et moléculaires que ces molécules pourraient cibler et déterminer si elles sont capables de restaurer les phénotypes pathologiques caractéristiques de la MA. En outre, elle pourrait offrir des perspectives essentielles pour l'utilisation future de ces molécules dans la prévention ou le traitement de la MA chez l’homme.
Procédures
Les animaux subiront au plus 4 interventions : 1-Le traitement par une administration des molécules dans l'eau de boisson . 2-Les mesures d'activité spontanée et l’exercice dans des cages expérimentales contenant une roue. 3-Le test de la mémoire spatiale qui consiste en l’apprentissage de la localisation d’une plateforme submergée dans l’eau. 4- l’anesthésie sans réveil final.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans ce projet ont un phénotype potentiellement dommageable avec un déficit cognitif, des défauts d’apprentissage et de mémorisation qui s’aggravent avec l’âge et sont liés à l'accumulation de protéines toxiques. Cette accumulation de protéines n'engendre pas nuisance affectant l'état physiologique des animaux puisqu'ils conservent un poids stable, une consommation d'eau et de nourriture stable et un comportement normal dans la cage. La curcumine, la molécule mère, utilisée dans ce projet a déjà été administrée à des rats sans effet indésirable visible sur l'état physiologique des animaux conservant un poids stable, une consommation d'eau et de nourriture stable et un comportement normal dans la cage. Dans le cadre de ce projet, les souris sont contraintes à nager dans l’eau qui est un environnement stressant pour les souris, mais la durée du test n'est pas suffisamment longue pour avoir une quelconque conséquence pour le bien-être des animaux. Les mesures d'activité dans les cages expérimentales consistent à isoler les souris dans des cages individuelles. Ce test peut éventuellement générer un léger état d’anxiété lié à l’isolement social mais nous estimons que la durée n'est pas suffisamment longue pour avoir une quelconque conséquence pour le bien-être des animaux. De plus cet isolement est compensé par la présence d'une roue dans la cage considérée comme un enrichissement de l'environnement. Pour les analyses histologiques, certaines souris seront profondément anesthésiées et pour éviter toute douleur à l'animal, avant toute intervention, la profondeur de l'anesthésie sera vérifiée au préalable par l'absence de réaction de l'animal au pincement de la membrane interdigitale.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer leur cerveau et effectuer les analyses biochimiques et histologiques et le sang pour récupérer le sérum. Ces prélèvements sont nécessaires pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Remplacement
Les expériences de comportement sur les souris telles que le test d’apprentissage dans une piscine ou d’évaluation de l’exercice dans des cages expérimentales ne peuvent malheureusement pas être remplacées par des expériences in vitro. Cependant toutes nos expériences biochimiques, immunohistologiques et nos analyses des mécanismes moléculaires sont étudiées en parallèle sur des modèles cellulaires qui reproduisent l’accumulation des protéines toxiques liées à la Maladie d'Alzheimer.
Réduction
Nous utiliserons des tailles d’échantillons garantissant une puissance statistique suffisante tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans le respect éthique de la règle des 3R (remplacement, réduction et raffinement). Le nombre de souris pour chaque procédure est déterminé avec un logiciel de statistique et sont également basés sur notre expertise et travaux déjà publiés. Les tests de comportement que nous utilisons ont déjà été testés sur nos modèles de souris et nous avons déjà établi un protocole bien déterminé ce qui évitera de réaliser des expériences préliminaires de mise au point. Notre étude comportementale requière des groupes de 20 animaux maximum. Cependant, pour réduire le nombre d’animaux, quand cela est possible, les mêmes groupes de souris seront utilisés pour plusieurs tests comportementaux et pour les analyses biochimiques et immunohistochimiques.
Raffinement
Nos modèles de souris sont utilisés en routine dans notre laboratoire et sont désormais très bien caractérisés. L'accumulation des protéines toxiques n'engendre pas de nuisance apparentes. Nous avons prévu les conditions d'hébergement assurant un bien être aux souris. Les procédures proposées prévoient des tests d’activité et d’apprentissage pouvant potentiellement engendrer un stress aux animaux. Pour définir le plus objectivement possible le bien être des souris et assurer au mieux leur surveillance tout au long de chaque procédure, nous utiliserons une grille de scores et nous nous référons aux points limites. Nous avons prévu des procédures de raffinement adaptés à chaque procédure permettant de réduire les nuisances au maximum.
Choix des espèces
La validation de nos résultats obtenus dans des modèles cellulaires nécessite l’application dans un modèle animal mimant la maladie d’Alzheimer. En effet, le modèle de souris que nous avons au laboratoire développe à la fois les pathologies liées à l'accumulation de protéines toxiques et un déficit de type apathie et un déficit de mémoire spatiale. Dans cette optique, nous comptons déterminer l’effet thérapeutique des nouvelles molécules dans ce modèle soit en préventif à 4 mois souris montrent une accumulation de protéines toxiques localisée dans une région du cerveau et comportement d’apathie) ou en curatif à 12mois (les souris montrent une aggravation de l’accumulation des protéines toxiques dans différentes régions du cerveau et comportement d’apathie et de déficit de la mémoire).
Implication du Récepteur « Inducible T-cell costimulator » et de son ligand dans les neuropathies périphériques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Test de suspension, marche sur poutre, réflexe sensitif, test de force, couloir de marche, sensibilité à la chaleur : six épreuves motrices et sensorielles étalées sur trois jours, et pour d'autres souris un électromyogramme du nerf sciatique de trente minutes sous anesthésie profonde. 190 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs nerfs périphériques. Elles développent une neuropathie auto-immune qui peut provoquer des sensations douloureuses et une paralysie. Le porteur retient des femelles tuées à 20 semaines, avant que les atteintes nerveuses soient détectables, d'autres à 35 semaines quand ces atteintes sont assez avancées pour être caractérisées, et 36 mâles pour le maintien des colonies.
Objectifs
Les nerfs périphériques sont les cibles de complications auto-immunes majeures : les neuropathies périphériques. Aucune piste thérapeutique n'est pour l'instant envisagée pour tenter de soigner cette pathologie nerveuse très invalidante pour les malades. L'identification des gènes qui interviennent dans le développement de cette maladie est un premier pas pour la découverte d'un traitement qui permettrait de protéger voire réparer les nerfs atteints.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension de l'implication des facteurs qui régulent l'activité des lymphocytes dans la survenue de la neuropathie périphérique ouvre la voie à de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de la complication la plus commune et la plus invalidante qui touche les nerfs périphériques.
Procédures
Les animaux adultes seront soumis à une série de test pour étudier leur démarche, leur équilibre et leur coordination motrice : 1) test de suspension : 20s par animal, 2) marche sur poutre : 3 x 1 min avec 10 min d'attente entre chaque passage, 3) reflexe sensitif : moins de 10 s par animal, 4) test de force : 2 x 20s par animal avec 10 minutes d'attente entre les deux mesures, 5) couloir de marche : 3 x 30s par animal avec 30 minutes d'attente entre chaque passage, 6) sensibilité à la chaleur : 30s maximum par animal. Les animaux ne subiront ces tests qu'une seule fois et étalés sur 3 jours pour limiter leur fatigue. D'autres animaux seront profondément endormis pour analyser le fonctionnement de leurs nerfs sicatiques par électromyogramme. Il faut compter 30 min par animal pour ce test.
Impact sur les animaux
La survenue de la neuropathie occasionne des atteintes neurologiques qui peuvent être délétères pour le confort de l'animal (sensations douloureuses, paralysie...).
Devenir
tous les animaux utilisés pour cette étude seront sacrifiés et leurs nerfs périphériques seront prélevés pour mener à bien les études tissulaires et cellulaires nécessaires à une meilleure compréhension des atteintes nerveuses constatées
Remplacement
Les complications neurologiques font intervenir de multiples acteurs cellulaires et systémiques qui ne peuvent être modélisés in vitro. Le fonctionnement des nerfs et les conséquences fonctionnelles de leurs altérations nécessitent l’analyse de composantes sensori-motrices propres aux animaux vivants.
Réduction
Nous avons limité au minimum le nombre d'animaux nécessaire pour atteindre la puissance statistique suffisante pour l'analyse des altérations comportementales induites par la perturbation du système sensori-moteur. Nous soumettrons les données au test satistique le plus adapté pour que nos analyses soient pertinentes avec un minimum d'animaux utilisés.
Raffinement
Un suivi spécifique de la douleur due à la survenue de la neuropathie sera mis en place tout au long du projet pour limiter au maximum la souffrance des animaux. Une grille spécifique d'évaluation de la douleur a par ailleurs été mise en place pour prendre en charge l'éventuelle souffrance des animaux chez qui l'intégrité des nerfs périphériques peut être compromise. Les animaux seront quotidiennement surveillés et des dispositions seront prises pour palier les possibles altérations de la locomotion qui compromettraient la capacité des animaux à se nourrir et s'hydrater (mise à disposition de gel d'hydratation et de croquettes au fond de la cage, pesée régulière...).
Choix des espèces
Les souris sont des mammifères au systême métabolique et physiologique suffisamment proche de l’Homme pour servir à une meilleure compréhension de la neuropathie périphérique et à l’évaluation de l’importance d'un réceptur spécifique des celluels immunitaires et leur ligand sur l'apparition et le développement de la pathologie. De plus, les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’implication de ces gènes sont très bien adaptées chez la souris. L’analyse comportementale ainsi que les techniques biochimiques et histologiques envisagées pour étudier l'étendue de la neuropathie nous permettront d’apporter des réponses claires quant à l’implication des lymphocytes et de l'auto-immunité sur la neuropathie périphérique. - 3 lots de souris femelles (30 individus/lot) sont sacrifiés à l'âge de 20 semaines, lorsque le diabète spontané est censé se déclarer mais que les atteintes neurologiques ne sont pas détectables. - 3 lots de souris femelles (30 individus/lot) sont sacrifiés à l'âge de 35 semaines, lorsque les atteintes nerveuses déclarées sont suffisemment avancées pour que l'on puisse les caractériser le mieux possible. - Seuls 36 mâles seront utilisés pour assurer le maintien des colonies d'animaux.
Etude du rôle bénéfique du régime cétogène et/ou de le composé X dans la cicatrisation chez la souris OXCT1 KO dans les macrophages
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Deux plaies cutanées sont ouvertes dans le dos de chaque souris jusqu'au muscle de la peau, puis maintenues par des disques de silicone suturés, les pansements étant changés chaque jour sous anesthésie. 760 souris vont être utilisées de cette façon, 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 560 un niveau modéré, avec des injections intrapéritonéales quotidiennes d'un composé issu du régime cétogène. Le point limite retenu est la présence simultanée de trois signes de douleur parmi la fermeture des yeux, l'immobilité, les poils piqués et le suintement de la plaie. Le porteur annonce la mise à mort de 740 animaux à l'issue, quand le tableau de gravité du même résumé en déclare 760.
Objectifs
Le composé X est produit naturellement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses et pauvre en sucre (régime cétogène). Il a sur les cellules immunitaires des propriétés bénéfiques démontrées in vitro mais également in vivo lors de leurs infiltrations sur des zones lésées durant la réparation tissulaire. Ainsi le changement de régime alimentaire, l’injection ou l’application topique de ce composé lors d’une pathologie nécessitant une réparation tissulaire importante (brûlures, plaies…) pourrait être bénéfique à un patient.
Bénéfices attendus
Au-delà des informations fondamentales les observations ouvrent des perspectives thérapeutiques pour le traitement de pathologies/situations nécessitant une réparation tissulaire. Le composé X est produit naturallement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses et pauvre en sucre (régime cétogène). Il a sur les cellules immunitaires des propriétés bénéfiques démontrées in vitro mais restent à être validées in vivo lors de leurs infiltrations sur des zones lésées durant la réparation tissulaire. Ainsi le changement de régime alimentaire, l’injection ou l’application topique de ce composé lors d’une pathologie nécessitant une réparation tissulaire importante (brûlures, plaies…) pourrait être bénéfique à un patient.
Procédures
Les animaux seront soumis à un régime spécifique ou seront traités par des injections intrapéritonéales du composé X ou seront traités directement en topique avec le composé X. Les 3 traitements seront réalisés sur des souris ayant subi une chirurgie afin d’induire deux lésions cutanées sur le dos de l’animal (modèle de cicatrisation). Les injections intrapéritonéales sont rapides et n’excèdent pas quelques secondes de manipulation. Elles seront réalisées alternativement à droite et à gauche d’un jour à l’autre afin de réduire la douleur. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et antidouleur local. Le temps de raser les animaux, de réaliser la plaie, d’appliquer et de fixer les disques de silicones avec des points de suture, une vingtaine de minutes sont nécessaires par souris. Les pansements des plaies des animaux seront changés chaque jour sous anesthésie. Le temps de changer les pansements, de faire l’acquisition d’images afin de suivre l’évolution de la cicatrisation et d’appliquer le composé X sur les plaies environ 5 minutes sont nécessaires par souris..
Impact sur les animaux
Les animaux subiront des injections quotidiennes en intrapéritonéales alternativement à droite et à gauche. Ces injections répétées pourraient induire une réponse inflammatoire. Les animaux subiront également une procédure expérimentale appelée modèle de cicatrisation consistant en l’induction de deux lésions cutanées (tissus sous cutanés incluant la couche de muscle de la peau panniculus carnosus) sur le dos de l’animal qui pourrait causer de l’inconfort et de la douleur. Les souris pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La souris pourra présenter une fermeture plus prononcée des yeux (fatigue), une modification de comportement par l’absence de mobilité, un suintement de la plaie et une ouverture plus importante de la plaie, un aspect général de son pelage présentant des pics (poils piqué), en présence d’un de ces signes, un analgésique sera donné. La présence de 3 signes simultanés constituera le point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante.
Devenir
La totalité des animaux (740) sera mis à mort à la fin des 2 procédures pour prélèvement d’organes post mortem.
Remplacement
Les procédures seront réalisées sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux (740 souris avec 180 souris dans une procédure et 560 dans l’autre. Ce nombre a été défini afin d’exploiter des résultats statistiquement fiables. Chaque lot dans chacune des procédures expérimentales a été prévu en fonction des résultats attendus afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Ainsi, l’analyse statistique du modèle cicatrisation des plaies et le recrutement des cellules immunitaires dans les modèles d’inflammation sera faite en utilisant le test statistique le plus approprié.
Réduction
Les procédures seront réalisées sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux (740 souris avec 180 souris dans une procédure et 560 dans l’autre. Ce nombre a été défini afin d’exploiter des résultats statistiquement fiables. Chaque lot dans chacune des procédures expérimentales a été prévu en fonction des résultats attendus afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Ainsi, l’analyse statistique du modèle cicatrisation des plaies et le recrutement des cellules immunitaires dans les modèles d’inflammation sera faite en utilisant le test statistique le plus approprié.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort afin d’éliminer ou réduire au minimum toute douleur, souffrance, ou angoisse et tout dommage durable susceptible d’être infligé à ceux-ci. Ainsi, les souris seront hébergées en cages collectives (5 animaux par cage), dans des locaux aux paramètres environnementaux contrôlés où leur entretien sera pris en charge par un personnel formé et compétent qui évaluera quotidiennement leur état général Des points limites précoces et adaptés ont également été envisagés avec des procédures d’antalgie (= permettant de gérer la douleur) utilisant le paracétamol et la buprénorphine. Les cages seront enrichies par des tunnels, abris et os en nylon autoclavés, permettant aux animaux d’explorer, de se cacher ou de ronger pour rétablir le répertoire comportemental des souris Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique d’expérimentation animale et est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.
Choix des espèces
Les souris sont les espèces les plus couramment utilisées dans la recherche préclinique. Ceci est dû à la facilité d'introduire une modification génétique chez ces espèces, à la grande taille des portées, au temps de génération court et à la relative facilité d'hébergement et de soins. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines et jusqu'à 12 semaines car la cicatrisation est plus longue et peut devenir pathologique avec l’âge. Nous voulons donc tester si notre composé X est capable de favoriser la cicatrisation indépendamment des difficultés de cicatrisation liée à l’âge.
Effet de l’activité de régulateurs du cholesterol sur la réponse dà l’immunothérapie dans un modèle de carcinogenèse prostatique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris de ce projet portent une inactivation génétique de l'épithélium prostatique qui leur fait développer un cancer de la prostate. 288 d'entre elles vont être utilisées, 216 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 72 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces dernières reçoivent des injections intrapéritonéales trois fois par semaine pendant quatre semaines, le porteur précisant qu'elles seront utilisées avant l'apparition des douleurs et des difficultés à uriner, attendues vers quatorze mois. Toutes sont mises à mort trois puis dix-huit jours après traitement, pour prélever la tumeur, les organes lymphoïdes et le foie.
Objectifs
Les régulateurs du cholestérol étudiés sont des récepteurs nucléaires qui agissent sur de nombreux gènes et sont impliqués dans le fonctionnement des cellules immunitaires. Le cancer de la prostate (CaP) est le plus souvent traité par hormonothérapie (blocage des actions androgéniques) avec des réponses positives pendant les premières années. Cependant des rechutes apparaissent systématiquement qui restent dans l’immédiat sans possibilité de thérapie. Le CaP est considéré comme une tumeur résistante à l'immunothérapie, dans laquelle le système immunitaire antitumoral est peu activé. Nous avons montré, dans un modèle murin de tumeur de la prostate que l’absence de ces récepteurs accroit la croissance tumorale et modifie le profil immunitaire des tumeurs. Nous faisons l’hypothèse que la modulation de leur activité peut modifier la réponse immune antitumorale. Nous associerons ainsi des approches pharmacologiques qui régulent leur activité et des inhibiteurs de points de contrôle immunitaire pour déterminer l’impact de la modulation des senseurs de cholestérol sur la réponse à l’immunothérapie.
Bénéfices attendus
Cette étude est partie intégrante d’un projet visant à caractériser la pertinence d’un ciblage pharmacologique de régulateurs du cholestérol dans le cancer de la prostate (CaP). Plusieurs études montrent que ces régulateurs du cholestérol sont capables de moduler le paysage immunitaire d’autres types tumoraux. Ils sont donc des candidats pertinents pour améliorer la réponse immune et/ou l’efficacité des immunothérapies dans la prise en charge thérapeutique du CaP. Ce projet documentera la relation entre la régulation du cholestérol et la réponse immune antitumorale chez la souris, et la possibilité d’améliorer l‘immunothérapie du CaP.
Procédures
Les animaux seront soumis à l’injection en intra-péritonéal des différents traitements. La durée de la procédure sera de maximum 30 secondes répétée trois fois par semaine pendant 4 semaines .
Impact sur les animaux
Les nuisances liées au phénotype dommageable (développement d’un cancer de la prostate suite à une inactivation génétique dans l’épithélium prostatique) apparaissent tardivement dans le modèle (14 mois). Nous utiliserons les souris avant l’apparition des effets indésirables (douleurs, difficulté à uriner). L’injection intra-péritonéale et la contention peuvent engendrer un stress. Ce geste technique sera réalisé par des personnes formées . En revanche nous vérifierons l’innocuité des traitements en suivant le poids des animaux ainsi que leur comportement. Les scores seront évalués selon la grille de score mise en annexe.
Devenir
Les souris seront mises à mort pour effectuer les prélèvements (tumeur, organes lymphoïdes, foie) nécessaires aux analyses cellulaires et moléculaires à deux temps différents post traitements (J3 et J 18).
Remplacement
Ces études sont complémentées par des études in vitro de co-cultures de milieu tumoral obtenu à partir de lignées cellulaires et de cellules immunitaires. Nous évaluerons notamment l’effet de l’activation et/ou de l’inhibition des LXRs sur les mécansimes cellulaires impliquant les cellules immunitaires (phagocytose et migration). Cependant l’utilisation de modèles tumoraux syngéniques permettra d’avoir une cartographie de l’ensemble des cellules immunitaires en fonction de l’état d’activation des LXRs, dans le cadre d’un organisme complet.
Réduction
Ce projet fait suite à des travaux publiés, ayant permis de caractériser les doses d'utilisation prévisible in vivo pour les ligands et l’immunothérapie . Le nombre d’animaux de 6 par groupe a été réduit à trois dans une étude préalable afin d’objectiver des effets significatifs. Si des associations synergiques entre les ligands et l’immunothérapie sont observés, ces résultats seront confortés par une série supplémentaire de 3 souris et un point supplémentaire de suivi plus tardif.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe de 4 souris par cage avec un milieu enrichi renforcé (cabane plastique, tube carton, pad-fibre) et un suivi sera réalisé lors des injections avec une feuille des scores personnalisés (2 visites hebdomadaires). Les observations quotidiennes sont effectuées par des zootechniciens formés.
Choix des espèces
La réponse immunitaire anti-tumorale est un processus complexe impliquant le dialogue entre de nombreux types cellulaires notamment les cellules de la tumeur et les cellules immunes. L’utilisation d‘animaux immunocompétents permet d’étudier les mécanismes mis en jeu dans un organisme complet, ce qui est majeur pour le developpment de nouvelles stratégies anti-cancéreuses. L’utilisation du modèle souris permet aussi d’utiliser des organismes modifiés génétiquement et d’étudier des régulateurs spécifiques. Nous avons ainsi montré dans le modèle d’invalidation des récepteurs nucléaires LXR des modifications de l’infiltrat immunitaire dans les tissus prostatiques normaux et tumoraux chez la souris. Notre projet consitera dans le modèle tumoral à étudier l’effet de regulateurs de ces récepteurs nuléaires sur les populations immunes présentes sur des individus de 4 à 5 mois ce qui correspond à un stade de carcinome.
Effet d’une exposition à une alimentation déséquilibrée, obésogène-diabétogène, associée à des perturbateurs endocriniens environementaux sur la fonction cérébrovasculaire chez la souris femelle adulte
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Ovariectomisées puis pourvues d'un implant sous-cutané d'œstradiol, 256 souris femelles reçoivent pendant douze semaines une alimentation riche en graisses et en fructose associée à un mélange de phtalates. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées pour prélever leurs micro-vaisseaux cérébraux. La treizième semaine, elles reçoivent une injection de progestérone, parfois une injection intrapéritonéale de colorant, puis sont mises à mort dix minutes ou trois heures après. Le porteur qualifie les effets du régime de "très limités voire inexistants", tout en listant la douleur post-chirurgicale, les irritations et infections de sutures et une prise de poids qui nuirait à la mobilité.
Objectifs
Le projet a pour but d’étudier l’effet d’une co-exposition à un régime alimentaire riche en graisses et en fructose, mimant une alimentation déséquilibrée à l’origine de désordres métaboliques (régime obésogène et diabétogène), associée à l’exposition chronique à des doses environnementales de phtalates, composés chimiques utilisés comme plastifiants et reconnus comme perturbateurs endocriniens susceptibles de modifier le fonctionnement du système hormonal, sur les micro-vaisseaux cérébraux chez la souris femelle adulte : intégrité de la paroi des capillaires cérébraux, inflammation du tissu cérébral et dégénérescence neuronale. Ce travail permettra d’évaluer les effets sur les micro-vaisseaux cérébraux des inter-relations possibles entre alimentation obésogène-diabétogène, et contamination chimique environnementale par les perturbateurs endocriniens de type phtalates, qui pourraient être une des causes d’une altération de la santé reproductive chez la femelle.
Bénéfices attendus
Le projet se place dans le contexte de la transition alimentaire, des changements des comportements de consommation et de l'exposition environnementale aux perturbateurs endocriniens. Le projet analyse les altérations générées sur la fonction cérébrovasculaire et les positionne dans une perspective intégrative, permettant de progresser sur la notion de vulnérabilité des populations sensibles. A terme, les résultats obtenus sur ce modèle expérimental mimant un mode de vie occidental pourront participer à l'évaluation du risque pour la santé humaine vis-à-vis de l'exposition environnementale aux phtalates. Ce projet servira de support aux recommandations pour la nutrition humaine, en termes de sécurité alimentaire, de toxicité des emballages, mais aussi pour les changements de comportement des consommateurs.
Procédures
Les animaux sont exposées pendant 12 semaines à un régime alimentaire riche en graisses et en sucre ou contôle, associé ou non à un mélange de phtalates mimant l’exposition environementale à des phtalates, composés chimiques perturbateurs endocriniens largement utilisés comme plastifiants, entre autres, dans les contenants alimentaires. Les études publiées précédemment indiquent que les souris supportent assez bien ces troubles métaboliques lorsqu’elles sont nourries et abreuvées ad libitum, ce qui sera le cas tout au long des expérimentations. Pour cette étude, toutes les souris femelles doivent avoir le même statut homonal. Pour ce faire, après la semaine d'habituation à l'animalerie, les animaux subissent sous analgésie et anesthésie préalables, une ovariectomie (10 min) associée à une supplémentation en oestradiol à l'aide d'un implant sous-cutané (3 min). Une semaine après rétablissement, les souris sont exposées au régime alimentaire pendant 12 semaines. Au début de la 13ème semaine, les souris vigiles reçoivent une supplémentation en progesterone par injection sous-cutanée (2 min), 4 à 5 heures avant leur euthanasie. Enfin, toujours à l’issue de ces 12 semaines et après l'injection de progesterone, une partie des animaux à l’état vigile reçoivent en plus une injection unique par voie intrapéritonéale (durée 1 min) d'une solution de colorant puis sont euthanasiés 10 min ou 3 h après. Tous les animaux sont euthanasiés par différentes méthodes réglementaires selon les analyses à réaliser.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables liés au régime alimentaire sont, à priori, très limités voire inexistants. Ce régime alimentaire décrit dans la littérature n'est pas connu pour causer des troubles digestifs et la surveillance quotidienne des animaux et des cages (litière) permet de prévenir tout inconfort (diurèse augmentée). Les nuisances qui pourraient survenir sont celles liées 1) aux injections intra-péritonéale et sous-cutanée : inconfort passager dû à la manipulation et à la contention et douleur légère passagère au point d’injection ; 2) à l’ovariectomie et à la pose d’implant sous-cutané : douleur post-chirurgicale, problèmes liés aux sutures (irritations, infection); 3) une prise de poids qui nuirait à la mobilité; 4) effets indésirables de l'anesthésie inhérents à toute chirurgie et risques/contraintes opératoires (hypothermie, réveil/arrêt cardiorespiratoire (peu probable).
Devenir
L’euthanasie des animaux est nécessaire pour effectuer les analyses post-mortem à l’échelle tissulaire, cellulaire et moléculaire dans les régions cérébrales concernées par l’impact d’un régime alimentaire obésogène-diabétogène associé à une exposition à des doses environementales de phtalates.
Remplacement
La modélisation ou les études in vitro (lignées cellulaires, co-cultures, organoïdes, …) ou sur les invertébrés ne permettent pas l’étude de l’impact d’un régime alimentaire obésogène-diabétogène (mimant le régime alimentaire occidental actuel) associé à l’exposition aux perturbateurs endocriniens environementaux, sur les micro-vaisseaux du cerveau et leur environnement. Les modèles in vitro de micro-vaisseaux cérébraux existant actuellement ne permettent pas encore ce type d’étude intégrée demandant de s’intéresser non seuleument aux vaisseaux cérébraux mais également à leur environnement, en lien avec les organes périphériques tels que les ovaires chez la femelles. Les invertébrés ne présentent pas de capillaires cérébraux de structure et de fonction semblables à ceux des mammifères. La modélisation nécessite des données cellulaires pour permettre d’apporter des informations sur le fonctionnement du cerveau et des micro-vaisseaux en particulier. De plus, les résultats obtenus sur ce modèle expérimental mimant un mode de vie occidental doivent pouvoir participer à l'évaluation du risque pour la santé humaine vis-à-vis de l'exposition environnementale aux phtalates. Ils serviront de support aux recommandations pour la nutrition humaine, en termes de sécurité alimentaire, de toxicité des emballages, mais aussi pour les changements de comportement des consommateurs. La souris est le modèle animal le plus approprié pour ce type d’étude physio-physiopathologique.
Réduction
Un total de 256 souris est nécessaire pour ce projet. Le dimensionnement des groupes expérimentaux pour chaque cohorte est déterminé au plus juste pour obtenir des données quantitatives permettant une analyse statistique robuste, recevable pour publication scientifique dans des journaux internationaux à comité de lecture, et en prenant en compte l’hétérogénéité inter-individuelle et les besoins et nécessités des protocoles expérimentaux, selon la règle des 3R. Ce projet est un projet de recherche original et ne bénéficie pas de résultats déjà existants sur lesquels s’appuyer. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été confirmé par un calcul de puissance et des tests statistiques pertinents seront faits pour une interprétation fiable des résultats. Les protocoles utilisés sont adaptés pour limiter le nombre d'animaux.
Raffinement
Les souris proviennent d’un fournisseur extérieur agréé, sont réparties par 5 maximum dans chaque cage pour éviter l’isolement et hébergées dans une pièce dédiée de notre animalerie dans des conditions contrôlées. Dès leur arrivée, les animaux sont manipulés régulièrement afin de réduire le stress lors des expérimentations. Les cages sont en portoirs ventilés et contiennent de la sciure enrichies avec du nid végétal ; elles sont transparentes, placées les unes à côté des autres. Les animaux ont libre accès à la nourriture et à la boisson. Aucune procédure expérimentale ne nécessite l’isolement d’animaux. La surveillance quotidienne des animaux et des cages (litière) par au moins une personne formée et compétente permet de prévenir tout inconfort (diurèse augmentée). Les données relatives à ces contrôles sont enregistrées et validées par la structure bien-être animal (SBEA) locale et des points limites définis pour permettre de repérer rapidement tout animal malade, blessé ou en souffrance (inconfort, stress, angoisse) et de prendre les mesures appropriées en interagissant avec la SBEA locale et le vétérinaire référent. Pour les actes chirurgicaux, les animaux sont anesthésiés et la douleur est prise en charge en pré- et post-opératoire par l’administration d’antalgiques. La surveillance post-opératoire est assurée 2 fois par jour pendant 3 jours lors de l’administration des antalgiques. Les animaux sont euthanasiés par différentes méthodes réglementaires selon les analyses à réaliser.
Choix des espèces
La souris est un des modèles les mieux caractérisés pour les études métaboliques et il existe de nombreux outils biotechniques disponibles pour ce modèle animal (anticorps, lignées transgéniques...). Cela permet également de comparer les résultats obtenus avec ceux de la littérature et avec nos résultats précédents pour affiner nos hypothèses de travail. Le projet vise à étudier les effets d'une exposition à une alimentation déséquilibrée, associée à des perturbateurs endocriniens environementaux sur la fonction cérébrovasculaire chez la souris femelle adulte: l'exposition au régime est donc faite chez l'adulte, il convient d'utiliser des animaux au stade adulte, âgés de 8 semaines au début du traitement. Les animaux sont commandés chez le fournisseur à l’âge 7 semaines pour éviter les effets du transport sur les derniers stades de maturation du système nerveux central. Les animaux sont acclimatés pendant 1 semaine dans notre animalerie (nouvel environnement).
Étude de la migration des cellules métastatiques du cancer du poumon à petites cellules dans le cerveau
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
1 455 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, dont 675 recevront une fenêtre de verre de trois millimètres implantée dans le crâne au cours d'une chirurgie d'une heure. Toutes reçoivent une injection de cellules tumorales directement dans le cerveau, puis sont tuées pour prélèvement et étude histologique du cerveau. Le développement de la tumeur peut entraîner une perte de poids et une hausse de la pression intracrânienne, l'enjeu déclaré étant de comprendre comment les cellules du cancer du poumon à petites cellules migrent vers le cerveau. Une perte de poids supérieure à 20 %, une prostration, une agressivité persistant plus de 48 heures ou les premiers tremblements déclenchent la mise à mort.
Objectifs
Ce projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs EU1 et EU2. Chez l’Homme, le cancer du poumon, le plus malin et le plus fréquent à l'échelle mondiale, inclut un sous-type particulièrement agressive appelé cancer du poumon à petites cellules (CPPC), représentant 14 % des cas de cancer pulmonaire. Environ 20 % des patients atteints de CPPC présentent des métastases cérébrales au moment du diagnostic, constituant la principale cause de décès dans cette population. En raison de sa nature agressive et de son potentiel métastatique élevé, le CPPC est utilisé par notre équipe comme modèle cliniquement pertinent pour comprendre les mécanismes responsables de la migration des cellules métastatiques, en particulier les métastases cérébrales, qui demeurent mal compris malgré son impact clinique majeur. Ce projet est une collaboration avec des chercheurs Américains, spécialiste mondial de ce type de cancer, qui nous donne accès à des lignées cellulaires dérivées de modèles murins et de tumeurs humaines. Les cellules détectent la nature physique et biochimique de leur environnement pour contrôler des fonctions cellulaires (adhésion, migration, prolifération, apoptose, différenciation) impliquées dans le développement du cancer. Notre hypothèse de travail est que le potentiel métastatique des cellules est associé à l’acquisition de nouvelles structures adhésives et de nouvelles structures du cytosquelette de l'actine.
Bénéfices attendus
Le projet vise à approfondir notre compréhension des mécanismes de dissémination métastatique du cancer du poumon à petites cellules (CPPC) dans le cerveau. En étudiant les interactions entre les cellules de CPPC et leur microenvironnement cérébral, il cherche à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter le CPPC métastatique. En comparant ces mécanismes avec ceux d'autres types de cancer cérébral comme le glioblastome, le projet offre une perspective élargie sur les approches thérapeutiques possibles. En utilisant des modèles murins, il contribue à améliorer la fiabilité des tests précliniques de nouveaux traitements. De plus, en caractérisant le microenvironnement tumoral, il ouvre la voie à une meilleure compréhension de son rôle dans la progression de la maladie et à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. En résumé, ce projet offre une opportunité précieuse d'avancer dans la lutte contre le cancer du poumon en fournissant des données pertinentes pour le développement de traitements plus efficaces et ciblés.
Procédures
675 souris auront la pose d'un dispositif d'imagerie. Pour avoir ce dispositif il faut procéder à une chirugie (dans l'EU1) sur animal endormi qui dure environ 1h avec utilisation de produits anti douleur. Un dispositif d'imagerie (fenetre en verre) de 3mm de diamètre sera implanté dans le crâne de la souris (dans l'EU1) . Toutes les souris auront une injection directe dans le cerveau pendant qu'elles seront endormies (dans l'EU1 et 2) . Les souris auront une préparation des tissus pour l'étude des propriétés cellulaires après une ou plusieurs injections (si la souris a un dispositif d'injection ou non)(dans l'EU1 et 2) . Cette préparation des tissus se fera sur animal endormi très profondement avec utilisation d'anti douleur. L'animal sera ensuite euthanasié et le cerveau sera récupéré(dans l'EU2) .
Impact sur les animaux
Les étapes de la chirurgie entrainent de la douleur chez les animaux et modifient leur comportement. Le développement tumoral intracérébral peut entraîner une perte de poids et/ou une augmentation de la pression intracranienne.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement du cerveau et etude histologique
Remplacement
La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux et leurs interactions avec les cellules tumorales sont modifiées dans ces préparations.
Réduction
Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés
Raffinement
A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au coeur de nos préoccupations. Nos animaux naîtront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter leurs points limites post injection de cellule tumorale (week-ends, vacances et jours fériés inclus) : poids (pesés quotidienne), si plusieurs pertes de poids consécutives, avec une perte >20% par rapport à la pesée de référence à raison d’une pesée par jour, les animaux seront euthanasiés. Si l’animal présente un comportement stéréotypé ou à des comportements anormaux (agressivité, cachexie, stéréotypie, prostration) il sera dans un premier temps isolé et surveillé, l’animal est euthanasié si pas d’amélioration après 48h. Les animaux seront euthanasiés, dès les premiers signes neurologiques détectés (tremblements, problème de mobilité) Trasport entre les deux EU: Le transfert entre les 2 animaleries est effectué par les utilisateurs. Ils ramènent les cages sur un chariot du PIV-EXPE au quatiréme étage (EU B33063940) vers la salle d’hébergement du CHRONIC au deuxiéme étage (EU B33063943) en utilisant un montecharge adapté. Ils suivront une acclimatation de 4 jours minimum avant de commencer le protocole expérimental.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux à l'age adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.
Rôle du système endocannabinoïde dans les effets d’une alimentation obésogène sur la mémoire : différences entre mâles et femelles
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Placées dès le sevrage, à trois semaines, sous régime hyperlipidique ou standard pendant douze semaines, 1 300 souris mâles et femelles enchaînent ensuite quatre tests comportementaux espacés d'au moins 48 heures. Une partie subit une chirurgie stéréotaxique d'une heure, une partie des femelles une ovariectomie, et 52 d'entre elles un jeûne de cinq heures suivi de sept prélèvements sanguins en deux heures. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, le conditionnement de peur pouvant provoquer un stress aigu durant 24 heures et la chirurgie une perte de poids limitée à 13 %. Toutes finissent par une mesure de masse grasse de deux minutes, un dernier prélèvement de sang, puis la mise à mort pour récupérer les cerveaux.
Objectifs
Si l’obésité est un réel problème de santé publique, générant une diminution de l’espérance de vie en raison des maladies qu’elle entraîne (hypertension, cancers, diabètes …), elle est également associée des déficits de mémoire. Ceci est d’autant plus problématique pendant l’enfance et l’adolescence qui représentent des périodes de maturation de certaines structures du cerveau indispensables pour la mémoire, comme l’hippocampe. Notre équipe a récemment mis en évidence chez la souris que la consommation d'une nourriture hyperlipidique (HL) pendant l'adolescence, en plus d'entrainer l’obésité, perturbe la mémoire et ceci implique un important système neuromodulateur, le système endocannabinoïde (SEC), au sein d’une structure particulière du cerveau (l'hippocampe). Nos études, tout comme la quasi-totalité des études de la littérature, ont utilisé des souris mâles comme modèle de l'obésité. Cependant chez l'humain, l'obésité affecte hommes et femmes de façon équivalente. Ainsi, pour élargir l'étendue de ces découvertes chez l'Homme, l’équipe s’est récemment intéressée aux deux sexes en incluant l'utilisation de souris femelles. Il a pu être démontrer que la nourriture HL consommée à l’adolescence a bien des effets délétères sur la mémoire des souris femelles, semblable à ceux observés ultérieurement chez les mâles. Bien que le SEC soit également impliqué chez la femelle, les types cellulaires et/ou les structures cérébrales mis en jeu semblent différentes de celles des mâles. L'objectif du présent projet est d'identifier les mécanismes neurobiologiques impliqués dans les déficits de mémoire induit par la consommation d'un régime obésogène hyperlipidique à l’adolescence chez les deux sexes, afin de mieux considérer l'effet genre. Pour cela, des souris mâles et femelles seront exposées pendant 12 semaines à un régime hyperlipidique (HL) ou standard (Cont) avant de réaliser des tests comportementaux simples permettant d’évaluer la mémoire. L’ensemble des procédures proposées est en conformité avec les directives européennes 2010/63/UE et françaises, dans le respect des nouveaux standards de soin et de bien-être des animaux (règle des 3Rs).
Bénéfices attendus
Ces expériences devraient permettre une meilleure compréhension des effets d'une nourriture HL sur le cerveau et la mémoire en identifiant certains mécanismes afin d'envisager potentiellement à plus long terme des stratégies thérapeutiques.
Procédures
Tous les animaux subiront, à au moins 48h d’intervalle, quatre tests comportementaux. Chaque étape de ces tests dure entre 6 et 10 minutes. Une partie des animaux (52) subira une fois un jeune de 5h préalablement aux mesures métaboliques (7 prélèvements sanguins sur une durée de 2 h). Une partie des animaux subira une intervention chirurgicale. La chirurgie stéréotaxique, réalisée sous anestésie gazeuse et en présence d'antalgique et d'anti-inflammatoire, dure 1h avec une phase de réveil de 20 minutes. Une partie de femelles subira également une ovariectomie, réalisée sous anesthésie gazeuse et en présence d'antalgique et d'anti-inflammatoire. Cette intervention dure 15 minutes avec une phase de réveil de 5 minutes. Tous les animaux subiront en fin d’expérimentation, une seule analyse en imagerie d’une durée de 2 min afin d’évaluer la répartition de leur masse grasse/masse maigre et un seul prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
L’alimentation obésogène donnée pendant 12 à 15 semaines entraîne un surpoids qui reste non délétère chez des animaux jeunes, comme ceux utilisés dans notre étude. Les tests de comportement, ainsi que les injections intra-péritonéales peuvent induire un stress qui sera limité par une habituation à la manipulation et à l'injection avant expérimentation. Les prélèvements de sang à la queue durant le test de tolérance au glucose (GTT) pourront engendrer une légère douleur aux animaux. La chirurgie stéréotaxique pourra entraîner dans les 48h suivant l’opération une douleur et un stress se traduisant par une perte de poids qui doit se limiter à 13% du poids initial. La phase d'acquisition du conditionnement de peur pourrait induire une gêne passagère des animaux et entraîner un stress aigu qui pourrait se poursuivre pendant 24h, mais nos précédents tests n’ont pas montré d’effet sur l’état général ou le poids des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en vue de récupérer leurs cerveaux pour des analyses biochimiques ou des contrôles histologiques.
Remplacement
L’étude intégrée des effets de la nutrition sur des aspects comportementaux et du fonctionnement cérébral est permise grâce à l’utilisation du modèle de rongeur soumis à de la nourriture obésogène et il n’est pas possible de le remplacer par des approches cellulaires sur des modèles in vitro ou in silico. Les tests comportementaux utilisés font appels à des comportements spontanées chez les rongeurs. Les chirurgies sont courtes mais nécessaires pour réaliser des manipulations chémogénétiques dans le cerveau et restent peu invasives dans la vie de l'animal. Les recherches seront réalisées en accord avec les recommandations institutionnelles pour le bon traitement des animaux de laboratoire.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire les souffrances inutiles et réduire le nombre d'animaux en effectuant plusieurs tests comportementaux chez les mêmes individus plutôt que des groupes différents. De plus, le nombre d’animaux sera réduit au mieux grâce à l’utilisation de tests statistiques minimisant le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats concluants et permettre des comparaisons statistiques fiables. Cela représente un total de 1300 (702 femelles et 598 mâles) sur 5 ans. Ces expériences devraient permettre une meilleure compréhension des effets d'une nourriture HL sur le cerveau et la mémoire en identifiant certains mécanismes afin d'envisager potentiellement à plus long terme des stratégies thérapeutiques.
Raffinement
Un soin particulier sera porté au bien-être de l'animal tout au long de sa vie. Les souris recevront de l’eau et de la nourriture à volonté et seront surveillées régulièrement. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec administration d’antalgiques en pré- et post-opératoire pour limiter la douleur. Toutes les précautions d'asepsie et de confort seront prises pour limiter l'inconfort des animaux (application d'un gel ophtalmique, opération sur tapis chauffant, ré-hydratation post-chirurgie). Les jours suivant la chirurgie, les animaux sont surveillés attentivement une fois par jour pour s’assurer de leur bon rétablissement. Avec la mise en place de points limites, si un animal présente une anomalie, il sera immédiatement isolé, surveillé et soigné par la prise d’un anti-inflammatoire pendant 3 jours jusqu’à amélioration. Durant les mois suivant la chirurgie, les animaux seront surveillés tous les jours de la semaine et pesés 1 fois par semaine par un personnel qualifié. S’il n’y a aucun signe de mal-être chez l’animal, il passera en phase comportementale qui sera optimisée pour durer le moins de temps possible. L’expérimentateur prendra le plus grand soin en manipulant l’animal et les tests comportementaux seront le moins stressant (lieu calme, acclimaté et inoffensif) et les souris seront remises avec leurs congénères entre chaque phase de test. Les injections pharmacologiques seront réalisées de façon aigüe de sorte à limiter les interventions sur l’animal.
Choix des espèces
Le modèle de rongeur soumis à des régimes obésogènes permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. En particulier, les tests comportementaux permettant d’évaluer chez l’animal vigile les dimensions cognitives et émotionnelles sont une nécessité expérimentale pour évaluer la réalité physiologique de nos résultats. Les souris seront exposées aux régimes obésogène ou contrôle dès le sevrage (3 semaines d’âge) et pendant 12 semaines afin de couvrir la période de l'adolescence. Les approches immunohistochimiques et biochimiques permettent d’appréhender les mécanismes physiologiques régissant l’effet de différents apports nutritionnels sur les fonctions cérébrales.