Souris

Pour calculer des marges de sécurité avant la première administration de médicaments à des êtres humains, 720 souris, 840 rats et 800 lapins vont être utilisés dans 65 études, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent les composés par voie orale, intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse, sur des durées allant d'un jour à six mois, avec prélèvements de sang, de tissus, de fèces, d'urine, de salive et de larmes. Des mises à mort intermédiaires sont prévues pour prélever les tissus aux différents temps de l'étude. Le porteur écrit à deux reprises que ce projet est "indispensable" à la première administration chez l'humain, sans que la nature des composés testés soit précisée.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer les propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques d'un ou plusieurs composés pharmaceutiques après administration unique ou répétée chez des rongeurs ou des lagomorphes. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme, conformément aux lignes directrices ICH S3 M2 et ICH S3 (TK).

Bénéfices attendus

L'ensemble des études du projet vise à identifier un profil métabolique, pharmacocinétique, pharmacodynamique de biodistribution permettant le calcul de marge de sécurité chez l'Homme en gardant à l'esprit en permanence le ratio bénéfice/risque du produit concerné pour la santé humaine. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme.

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi intramusculaire, sous- cutanée ou intraveineuse…) de façon journalière (voire plusieurs fois/j) hebdomadaire, ou de manière plus espacée (ex: toutes les 2 semaines, mensuel), avec le(s) produit(s) d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure dans le cas de perfusion intraveineuse. La durée des études peut être courte (1j) ou longue [1 semaine, 2 semaines, 1, 3, ou 6 mois]. Des prélèvements sanguins, tissulaires, de fèces, urinaires ou/et de fluides corporels (salive, larmes) seront réalisés au cours du temps et analysés afin de déterminer les niveaux du ou des composés administrés, de leurs métabolites ou d’autres marqueurs pharmacologiques pour permettre l’analyse pharmacocinétique, pharmacodynamique et de biodistribution. D’autres prélèvements sanguins ou urinaires sont également possibles pour bilan urinaire, hémato-biochimique ou hormonal par exemple. L’ensemble de ces prélèvements sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/contrainte pour l'animal). Les animaux seront examinés quotidiennement afin de déceler tout signe clinique. Les consommations alimentaire et/ou hydrique pourront être suivies. Des examens ophtalmologiques, échographiques, radiologiques, comportementaux peuvent être réalisés. Le poids corporel sera mesuré à différents temps au cours du projet. Les animaux seront euthanasiés à la fin du projet et un examen microscopique sera réalisé sur les tissus collectés si nécessaire. La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1h/animal/jour (en considérant par ex. 1 journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant par exemple 1 administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h) pour les rongeurs. Dans certaines situations, les animaux peuvent être soumis à un hébergement individuel dans leur cage (en cas d’agressivité ou de soins individuels par exemple).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures [prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle (uniquement pour les rongeurs)] et/ou aux effets systémiques (exemples : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés. Un hébergement en individuel (rare), avec contacts olfactifs, visuels et sonores préservés et enrichissements additionnels, peut être requis (ex. pour suivre la consommation alimentaire individuelle ou pour des études par voie dermale).

Devenir

En parallèle des prélèvements sanguins, réalisés au cours de l’étude, l’évaluation de la pharmacocinétique, de la pharmacodynamie et de la biodistribution, peut nécessiter des euthanasies intermédiaires afin d’effectuer des prélèvements tissulaires et/ou une analyse histopathologique selon les différents temps de prélèvements définis dans l’étude. Ceci pour permettre l'évaluation de l'exposition du composé ou des composés dans le tissu cible, et /ou pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus, respectivement. A ce titre tous les animaux de ce projet seront euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

L'évaluation pharmacocinétique, pharmacodynamique et de la biodistribution d'un composé ou de plusieurs composés administrés dans un organisme complet ne peut pas être réalisée qu'avec des études in vitro, car il n'existe pas d'alternative complète in vitro pour ce type d'évaluation en raison de la complexité d'un organisme vivant. Seule l’observation sur un organisme vivant dans son ensemble permet d’évaluer les différentes phases d’absorption, de métabolisme, de distribution et d’élimination du/des composé(s), de définir les relations et/ou interactions entre ces différentes phases et de pouvoir déterminer l’exposition du/des composé(s) administré(s) dans l’organisme.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude et du nombre de doses testées. En effet, des animaux des deux sexes seront utilisés uniquement pour permettre l'évaluation de l'effet du sexe sur les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques et sur la biodistribution. Par ailleurs, il peut y avoir une comparaison avec des composés de référence, un criblage de plusieurs produits, etc. Mais le nombre d’animaux par groupe correspondra au minimum permettant une analyse statistique fiable, conformément aux recommandations des lignes directrices. Ce projet permettra de réaliser 65 études, 35 chez le rat; 10 chez la souris et 20 chez le lapin, avec un nombre d'animaux déterminé à minima afin d'obtenir des résultats robustes et fiables permettant d'atteindre tous les objectifs de l'étude en procédant à toutes les analyses nécessaires.

Raffinement

En général, les doses utilisées sont des doses pharmacologiques, faibles et similaires à celles utilisées chez l'Homme. L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité, etc. Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et/ou au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés par des soins (ex : antibiotique/anti- inflammatoire), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des prélèvements sanguins seront effectués selon les bonnes pratiques vétérinaires de fréquence et de volume. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie locale ou générale pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, par ex : les administrations intramusculaires et intra-articulaires. Les rongeurs et les lapins sont hébergés en groupe dans la majorité des situations. Cependant, soit en raison d'incompatibilités sociales observées parfois chez le lapin ou les souris mâles, soit dans certaines situations expérimentales rares (rongeur uniquement) un hébergement individuel peut être nécessaire. Il devra être dûment argumenté (ex : voie d’administration dermale, bilans d'élimination en collectant les urines et fèces). Le cas échéant, des enrichissements supplémentaires seront proposés et le contact visuel et olfactif sera maintenu.

Choix des espèces

Les espèces rat, souris et lapin sont des espèces de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) et sont couramment utilisées pour l'évaluation pharmacocinétique, pharmacodynamique et de la biodistribution et acceptées par les autorités. Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs : résultats déjà existants (essais préliminaires in vitro et in vivo), voie d'administration choisie, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique. De façon standard, les rats, souris et lapins seront âgés de 6 à 10 semaines, 6 à 8 semaines et 3 à 4 mois, respectivement, correspondant à un niveau « jeune adulte » de croissance et de développement nécessaire et suffisant pour conduire les expérimentations. Toutefois, ce projet pourra être effectué avec des animaux juvéniles ou avec des animaux plus âgés (> 1 an) en fonction de l’objectif de l’évaluation et de manière à ce que l’état physiologique de l’animal permette une réponse non équivoque des systèmes analysés après traitement avec le(s) composé(s) et ainsi permettre une évaluation adéquate des paramètres ciblés. Les animaux ne doivent pas être gravides.

Cinq injections en cinq jours pour faire pousser une tumeur de la prostate, puis une castration chirurgicale de trente minutes, puis des injections bloquant ou stimulant les cellules tueuses naturelles jusqu'à trois fois par semaine, et enfin un inhibiteur de l'hypoxie cinq jours par semaine. 8 660 souris vont être utilisées de cette façon, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur chiffre à une heure et deux minutes le temps total d'intervention par animal et qualifie les douleurs postopératoires de mineures. Il annonce vingt animaux par groupe expérimental, sans expliquer comment ce calcul aboutit à 8 660 souris.

Objectifs

Afin de mieux comprendre la résistance aux androgènes dans le cancer de la prostate (CaP), ce projet vise à étudier les effets de la castration chirurgicale dans plusieurs modèles murins de cancers prostatiques. En effet, le traitement du cancer de la prostate chez l'homme repose sur la chirurgie et l'utilisation de traitement anti androgénique appelé castration chimique. Malheureusement, après un temps limité de sensibilité aux traitements, 20% des patients développent des résistances à ces traitements et les cancers "résistants à la castration" sont de très mauvais pronostic. Il est donc primordial de mieux comprendre la résistance à la castration. Les études récentes menées au laboratoire mettent en évidence une implication forte du facteur de transcription Hif1a induit par l'hypoxie dans le développement de la résistance à la castration. Ainsi nous voulons étudier le mécanisme moléculaire sous-jacent pour mieux comprendre par quel biais l'inactivation de Hif1a rend ces tumeurs sensibles à la castration. Nos données préliminaires montrent un infiltrat de cellules natural killer majeur dans les souris sensibles à la castration comparé à celles qui présentent des tumeurs résistantes à la castration. L'objectif est donc de conduire une étude dans laquelle les cellules natural killer sont bloqués ou stimulés afin de voir la réponse sur la croissance des tumeurs après castration. Comme nos premières études déjà publiées montrent également un effet de l’inhibition d’Hif1a sur la résistance à la castration nous aimerions tester l’effet synergique de l’inhibition de Hif1a et de l’activation des cellules NK dans des cancers résistants à la castration. L’objectif est également d’étudier le rôle des cellules natural killer dans l’initiation des métastases.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si la stimulation des cellules Natural killer peut empêcher l'apparition de métastases et si la combinaison entre la stimulation des cellules Natural killer et l'inhibtion de Hif1a peut permettre une meilleure sensibilisation à la castration et par quels mécanismes. Si cela s'avère être le cas, cette étude pourra ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement du cancer de la prostate résistant à la castration.

Procédures

Les souris subiront 5 injections sur 5 jours pour induire l'apparition des tumeurs (5 minutes par souris), puis une intervention chirurgicale (castration ou contrôle) à différents stades de la tumeur (30 min par souris) et les injections de traitement stimulant ou bloquant les cellules natural killer 1 à 3 fois par semaine pendant 0 à 4 semaines (jusqu'à 12 minutes) et une administration d'un inhibiteur de l'hypoxie 5 fois par semaine pendant 0 à 3 semaines ( jusqu'à 15 minutes). Les animaux subiront donc 1 heure et 02 minutes d'intervention.

Impact sur les animaux

Les effets secondaires post chirurgicaux sont principalement des douleurs mineures facilement prévenues par une antalgie post-opératoire systématique. Une infection post-opératoire peut survenir dans de très rares cas. En cas de mauvaise ligature des artères, une hémorragie peut avoir lieu. Cette complication est très rare et facilement visible du fait du gonflement important de la zone et d'effets secondaires généraux sur l'animal. Le blocage des cellules natural killer a été déjà éffectué dans de nombreuses études chez la souris et sont administrés en routine par un laboratoire collaborateur sans observation d'effets secondaires. L'activation des cellules natural killer peut engendrer une perte de poids transitoire des souris traitées dans les 48h suivant l'administration, les souris reprennent habituellement leur poids de départ dans la semaine qui suit l'injection. La croissance des tumeurs de prostate est lente et donc les variations de poids liée à leur croissance ou régression sur 2 semaines est négligeable. L'inhibition de l'hypoxie peut entrainer une perte de poids général de l'animal qui sera suivi au cours du temps.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter les organes et de les analyser.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.Par ailleurs, nous utilisons des organoïdes dérivés des tumeurs pour étudier un certain nombre de paramètres, cependant l'étude du microenvironnement nécessite de se placer en condition in vivo stricte.

Réduction

Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Afin d’obtenir des résultats significatifs avec une bonne puissance, nous aurons besoin de 20 animaux par groupe. Le nombre d’animaux sera de 8660 souris maximum.

Raffinement

On procèdera à l'anesthésie générale des souris par inhalation d'isoflurane, et après l'induction, une analgésie par buprénorphine en injection intrapéritonéale sera faite. En post-opératoire, une analgésie systématique par injection de métacam sera faite. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. En cas de signe de douleur, de la buprénorphine sera administrée jusqu'à 3 fois par jour. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage.Par ailleurs, les animaux castrés (ouverture abdominale avec retrait des tesitcules) et les animaux opérés mais non castrés (ouverture abdominale sans retrait des tesitcules) seront séparés: une cage opérée mais non castrée versus une cage castré par exemple pour éviter tout risque de domination. En cas de signe de douleur (dos voute, un pelage hérissé ou inactivité après stimulation, l'animal sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Après les injection-intrapéritonéales, les animaux seront surveillés quotidiennement pour détecter une éventuelle infection sur les sites d'injection, et en cas d'observation de rougeur, de voussure ou de signe de douleur, les animaux seront retirés de l'étude et un avis vétérinaire sera pris. Par ailleurs, pour prévenir une éventuelle perte de poids liée aux traitements, le poids sera pris 1 fois par semaine pendant la durée de l'étude et si une diminution est observée, de la nourriture enrichie sera administrée aux souris, si une perte de poids une perte de plus de 20% était détectée, les animaux seraient mis à mort et retirés des études.

Choix des espèces

La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le CaP humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux utilisés seront adultes. A l'âge de 8 semaines, nous administrons un produit pour induire le développement de tumeurs. Puis à différents temps, nous débutons les expériences (castration, neutralisation des cellules Natural Killer, stimulation de ces cellules et l'inhibition de l'hypoxie) avec les différents groupes expérimentaux et nous euthanasierons les animaux à un temps court et un temps long après les traitements.

Gavées quinze jours ou nourries trois mois avec des compléments, certaines recevant en plus une injection de LPS pour déclencher une inflammation aiguë, 1 280 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Le projet cherche à démontrer qu'une supplémentation nutritionnelle limite le déclin cognitif et les troubles de l'humeur liés à l'âge. Le porteur annonce des tests comportementaux de cinq à dix minutes étalés sur trois semaines, sans préciser lesquels, et ramène les effets attendus du gavage quotidien à une irritation de l'œsophage.

Objectifs

Le projet vise à étudier l’impact de nutriments/ combinaison de nutriments sur les capacités cognitives chez des souris adultes et âgées ainsi que les mécanismes d’action mis en jeu dans ces processus (neuroinflammation par exemple).

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif de démontrer qu’une supplémentation nutritionnelle en nutriments permet 1) de limiter et de prévenir le déclin cognitif lié à l’âge et donc de favoriser le vieillissement en santé, véritable enjeu de santé publique dans une population toujours plus vieillissante ; 2) de limiter les symptômes les troubles de l’humeur (anxiété, diminution de l’interaction sociale, dépression) associés au vieillissement. Ce projet s’inscrit donc dans le cadre de recherche portant sur la nutrition préventive et personnalisée. Les résultats attendus sont donc une amélioration des troubles de l’humeur et de la cognition au cours du vieillissement.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions afin d’évaluer l’impact de la supplémentation nutritionnelle sur la santé cognitive et mentale. Les supplémentations nutritionnelles seront données soit dans leurs croquettes pendant 3 mois, soit par gavage gastrique pendant 15 jours. Enfin, certains animaux recevront une seule injection de LPS en ip afin d’induire une inflammation aigue qui sera évaluée 2h après. Les tests comportementaux d'une durée de 5 à 10 min sont étalés sur environ 3 semaines et chaque test est séparé du suivant d'au moins 2 jours pour le bien-être des animaux.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas d’effets indésirables attendus induits par la supplémentation nutritionnelle car l’alimentarité du produit a été démontré. Cependant le gavage quotidien peut avoir des effets indésirables légers comme une irritation de l’œsophage. Les tests comportementaux induisent un stress de courte durée (le temps du test) chez l’animal. L’injection de LPS peut induire un malaise aigu pendant quelques heures après l’injection.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever les cerveaux et réaliser des analyses biochimiques ou immunohistologiques.

Remplacement

L’étude des comportements de type cognitifs et troubles de l’humeur ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro

Réduction

Le nombre d'animaux sera réduit au mieux en se basant sur des expériences préalablement menées au laboratoire qui ont montré́ par le biais de tests statistiques des différences entre plusieurs groupes. La significativité́ de différence statistique entre plusieurs groupes sera déterminée par analyse de variance ou t-test ou tests non paramétriques en fonction des comparaisons souhaitées. D’après les études déjà menées au laboratoire sur l’analyse de marqueurs comportementaux et cérébraux, nous estimons que 16 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour atteindre une signification statistique.

Raffinement

Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux la douleur (antalgique/sédatif avant mise à mort) et l’inconfort (manipulation régulière et enrichissement de l’hébergement) des animaux. L’hébergement se fera en cage collective et l’environnement sera enrichi : igloo et carré de coton. Les animaux seront soumis à plusieurs tests comportementaux toujours espacés d’au moins 2 jours afin de limiter le stress. Des points limites ont été quantifiés pour limiter toute douleur chez les animaux.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. C’est un animal sur lequel les traitements nutritionnels et les évaluations comportementales sont faciles à conduire et maitrisés au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille (faciles à manipuler) et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l’animalerie de l’unité. Les souris seront utilisées soit adultes pour valider les déficits comportementaux des animaux âgés (groupe contrôle), soit âgées pour évaluer l’impact de la supplémentation sur la prévention des troubles cognitifs et de l’humeur liés à l’âge.

Nourries vingt semaines à un régime gras jusqu'à l'obésité et au diabète, puis gavées chaque jour pendant vingt-huit jours et isolées en cage individuelle sur toute cette période, 220 souris subissent aussi quatorze incisions de la veine de la queue pour mesurer leur glycémie. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit que le régime peut altérer les capacités motrices au point de rendre l'animal incapable d'accéder à la nourriture et à la boisson, créer un état dépressif et de l'anxiété, et que l'hébergement individuel sera "source d'angoisse prolongée". Toutes sont tuées à la fin de la procédure pour les analyses post-mortem.

Objectifs

La prévalence mondiale de l’obésité est en constante progression. L'obésité est un facteur de risque majeur pour le développement du diabète de type 2 et de perturbations cardiométaboliques dont la MAFLD (Metabolic dysfunction-Associated Fatty Liver Disease). Cette pathologie est principalement caractérisée par une profonde perturbation du métabolisme du foie et par un développement de fibrose. Actuellement, aucune approche médicamenteuse efficace n’est commercialisée à l’heure actuelle. L’objectif de notre projet est d’étudier les potentielles interactions entre 2 cibles thérapeutique sur l’évolution de fibrose dans un modèle de souris souffrant de MAFLD.

Bénéfices attendus

La prise en charge et le traitement du diabète de type II et de ses complications est un enjeu de santé publique de plus en plus prégnant. Les stratégies médicamenteuses bien que multiples voient leurs limites dans le fait qu’elles ne ciblent généralement qu’un récepteur et donc qu’un point précis du métabolisme, limitant ainsi leur efficacité. Ce projet permettra de nous renseigner sur le réel potentiel thérapeutique d’une double approche pharmacologique dont les deux stratégies ont déjà chacune démontré des effets hépato-protecteurs. Ceci pourrait avoir un réel impact pour les patients.

Procédures

Pendant les 20 premières semaines de la procédure, les souris seront manipulées hebdomadairement pour monitorer leur masse corporelle. Cette action mécanique durera 30 secondes par souris à chaque fois, soit un total de 10 minutes par souris cette période. Pendant les 28 jours de traitements pharmacologique, la masse corporelle sera évaluée quotidiennement. Cette action mécanique durera 30 secondes par souris à chaque fois, soit un total de 14 minutes par souris cette période. De plus, l’administration quotidienne des traitements pharmacologiques par gavage oro-pharyngé nécessitera l’immobilisation de chaque animal pendant 10 secondes supplémentaires, soit 19 minutes au total par animal sur cette période et 29 minutes sur l’ensemble du projet. Pour chaque test nécessitant une mesure de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local afin de prélever du sang total et ainsi réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et aura lieu 14 fois par animal (2 x 7 prélèvements à 5 jours d’intervalle).

Impact sur les animaux

En plus d’une altération des paramètres métaboliques, un régime gras de longue durée peut entrainer une prise de poids importante et altérer les capacités motrices de l’animal au point de le rendre incapable d’accéder à la nourriture et la boisson. Le régime gras peut également altérer la santé mentale des animaux et créer un état dépressif et de l’anxiété. Enfin, l’hébergement en cages individuelles pendant les 28 derniers jours de la procédure sera source d’angoisse prolongée.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.

Remplacement

L’obésité, le diabète de type 2 et le développement de MAFLD sont le fruit de dérégulations multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin et une perturbation de l’homéostasie lipidique ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier ces aspects, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de projets similaires précédemment réalisés. Grâce à notre expérience du travail sur les molécules antidiabétiques, nous avons pu au cours des projets réduire le nombre d’animaux par groupe en optimisant les temps et doses de traitement. En effet, il ne nous est plus nécessaire de réaliser des effets doses, ni de multiplier les temps de traitements, pour un large spectre de molécule, dont celles utilisées dans ce projet. De plus, l’utilisation des animaux a été réfléchie afin qu’un maximum de données soient obtenues avec un minimum de douleurs et de stress pour les animaux. Ainsi des tests in vivo et des prélèvements d’organes seront réalisés chez les mêmes animaux. Pour ces raisons, avec une seule dose et un seul temps de traitement, nous avons réduit le nombre d’animaux pour mener à bien ce projet et obtenir un puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe (10 animaux par cages) pendant les 20 premières semaines avec un enrichissement de leur milieu de vie, dans une pièce calme et tempérée. Les aliments et l’eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié et des soins pourront être apportés si l’état de santé des rongeurs le nécessite. Pendant les traitements pharmacologiques, les souris seront amenées à être hébergées de manière individuelle afin de pouvoir monitorer la prise alimentaire quotidienne pouvant être influencée par les différends traitements. Pour chaque cas, un enrichissement plus important sera apporté dans chaque cage. De plus, le contact visuel et olfactif entre animaux sera maintenu via l’utilisation de cages transparentes sans couvercle filtrant.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’espèce humaine. Dans ce sens, dans le cadre de la recherche fondamentale, il paraît déterminant de choisir un modèle animal dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris, qui sur le plan neurobiologique et métabolique, présente de multiples similarités avec l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le début du projet fera appel à des souris de 12 semaines. Considérant les 20 semaines de régime WD, les animaux seront âgés de 32 semaines lors du commencement de l’approche pharmacologique et de 36 semaines lors de la fin de l’expérimentation.

Une fausse route pendant le gavage ou un saignement qui ne s'arrête pas après une prise de sang entraînent la mise à mort immédiate de l'animal. 130 souris vont être utilisées dans ces conditions, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus. Elles sont gavées, saignées toutes les trois semaines, privées d'eau et de nourriture quatre heures avant chaque gavage, isolées une heure pour la collecte des fèces et placées en cage à métabolisme. L'objet réel du projet est de comparer des émulsifiants alimentaires, protéines de pois et arabinoxylanes, à un polysorbate déjà utilisé par l'industrie, le porteur qualifiant ces gestes de "nécessaires pour répondre aux questions scientifiques d'intérêt".

Objectifs

La carence en vitamines liposolubles, une forme courante de malnutrition, pose des défis importants à la santé humaine et au développement dans le monde entier. Malgré leur rôle crucial dans le métabolisme et l'immunité, les carences en vitamines liposolubles constituent un problème de santé mondial qui touche tous les groupes d'âge. Les émulsions huile dans eau sont souvent utilisées pour encapsuler et délivrer ces vitamines. La plupart des études disponibles reposent sur des études in vitro et mettent en jeu des émulsifiants tels que le polysorbate 80, la carboxyméthylcellulose ou l'hydroxypropylcellulose. Bien qu'il s'agisse d'émulsifiants largement utilisés par l'industrie alimentaire, leur utilisation dans les produits de consommation courante fait l'objet d'une certaine controverse car certaines données suggèrent que ces émulsifiants ont un impact négatif sur le microbiote intestinal, en augmentant sa capacité à pénétrer la couche de mucus normalement stérile, et qu'ils peuvent être à l'origine d'une inflammation intestinale et d’états pathologiques associés. Parallèlement à cette controverse, l'intérêt pour une transition vers des aliments et des ingrédients plus durables est apparue ces dernières années, tant dans la communauté des chercheurs que dans l'industrie alimentaire. Les régimes alimentaires durables sont des régimes alimentaires ayant de faibles conséquences sur l’environnement, qui contribuent à la sécurité alimentaire et nutritionnelle ainsi qu’à une vie saine pour les générations présentes et futures. Ce projet de recherche vise donc à évaluer l'effet inflammatoire/anti-inflammatoire d’émulsions stabilisées par des émulsifiants « durables » (protéines de pois, arabinoxylanes), sans et avec vitamines liposolubles, chez la souris et de comparer leurs effets à ceux induits par une émulsion stabilisée par des polysorbates. Le projet cherche également a évaluer les conséquences de l’usage de ces nouveaux émulsifiants sur la métabolisation des vitamines.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de clarifier plusieurs questions scientifiques, à savoir : • Connaître l'effet inflammatoire/anti-inflammatoire et l’effet sur la perméabilité intestinale de nouveaux émulsifiants « durables » et voir si les vitamines peuvent réguler cet effet inflammatoire. • Evaluer la nature de la métabolisation des vitamines E et D et l’effet des émulsionnants sur cette métabolisation.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvement sanguins au début puis 1 fois toutes les 3 semaines pendant la procédure. La durée de chaque prélèvement sanguin est calculée autour de 5 minutes. Le gavage sera réalisé avec les animaux en état de vigile. La procédure de gavage est estimée à 2 minutes hors la préparation de la seringue.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont : 1) Stress lié à la manipulation pendant les prélèvements, pesées hebdomadaires et des changements de litière 2) Stress pendant les prélèvements sanguins 3) Stress pendant le gavage. 4) Stress lie à la privation d’eau et de nourriture pendant 4h avant les gavages, et la séparation des individus pendant le temps nécessaire pour collecter les matières fécales (approximativement 1 h) 5) Stress lie aux cages à métabolisme Malheureusement il s’agit de gestes nécessaires pour répondre aux questions scientifiques d'intérêt

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite étudiés pour évaluer les effets des émulsifiants sur l’inflammation et la métabolisation des vitamines E et D.

Remplacement

Les modèles in vitro (e.g. culture cellulaire) ne reproduisent pas la complexité biologique du tube digestif (mucus, mouvement, échange entre organes, présence d’un microbiote). Le recours au modèle animal demeure la meilleure approche pour étudier l’inflammation et la métabolisation des vitamines puisque (actuellement) seul un modèle animal permet d’avoir une approche intégrée de ces phénomènes complexes multiparamétriques.

Réduction

Ce projet est constitué de 13 conditions au maximum. Ce nombre est choisi en se basant sur les résultats préliminaires physicochimiques qui ont permis d’éliminer les conditions non pertinentes et donc de réduire drastiquement le nombre d’individus. Pour chacune de ces conditions, et compte tenu de la variabilité interindividuelle existant chez la souris et de la difficulté de la mise en place du protocole, des groupes de 10 individus sont nécessaires pour assurer la validité statistique du phénomène observé. Un nombre plus restreint d’animaux ne permettrait pas une finesse suffisante des résultats pour répondre à nos objectifs de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Le début des régimes aura lieu après 7 jours d’adaptation dans l’animalerie. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. L’enrichissement sera actualisé toutes les semaines afin d’apporter de la nouveauté aux souris. L’enrichissement sera fait avec des igloos, des tubes, des cabanes, du papier kraft, de la cellulose, du bois ou du foin. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Tout animal présentant des signes de mal-être sera mis à mort. Une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude. Les souris seront observées 15 minutes après la procédure pour détecter des signes de douleur ou de détresse. Dans le cas d’une fausse route lors du gavage ou d’un mal-être des souris, les animaux seront mis à mort Pour atténuer les niveaux de stress des souris associés a les cages à métabolisme, les souris seront soumises une période d’habituation des souris : 2 ou 3 jours avant la collecte d’urine, les souris seront placés 8h dans les cages afin qu’elles s’imprègnent de cet environnement. Toutes les procédures invasives (prélèvement sanguins, mis à mort) seront réalisées sous anesthésie générale. Lors des prises de sang, si le saignement venait à ne pas s'arrêter, l'animal serait immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Dans cette étude nous utilisons des souris pour évaluer la biodisponibilité des micronutriments et de l’inflammation, car leur système de digestion et d’absorption est anatomiquement proche de celui de l’homme. L’utilisation de ce modèle permettra la comparaison de résultats avec des études scientifiques déjà disponibles. Bien que nous devions essayer d'utiliser des modèles cellulaires in vitro chaque fois que possible pour réduire le nombre d'animaux au minimum, dans ce projet, les modèles cellulaires disponibles ne peuvent pas fournir de réponses à nos questions, lorsque des processus physiologiques complexes sont impliqués. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement et rester comparable avec les études déjà faites, qui utilisent aussi de jeunes adultes.

Une injection sous la peau tous les deux jours pendant trente-cinq jours, deux passages sur tapis de course, deux gavages au glucose et deux séances d'imagerie sous anesthésie. 256 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour que leurs organes soient pesés et analysés. Elles sont d'abord rendues obèses par douze semaines de régime hyperlipidique, afin de tester une molécule anti-obésité seule ou associée à une molécule de référence. Le porteur résume les nuisances à des injections "pouvant altérer le bien-être" des animaux, écrit être "malheureusement contraint" d'utiliser des modèles animaux, et précise que l'efficacité de cette molécule a déjà été validée in vitro et in vivo par ses collaborateurs américains.

Objectifs

L'obésité est un problème de santé publique majeur et croissant qui est fréquemment associé à des complications métaboliques telles que le diabète de type 2, l'hypertension, des concentrations de lipides élevées dans le sang et les maladies hépatiques. Le développement de nouvelles molécules susceptibles de réguler la prise alimentaire, de réduire la masse grasse et de renforcer la masse musculaire est actuellement en plein essor. L’objectif de ce projet est de tester l'effet d’une nouvelle molécule pharmaceutique d’intérêt donnée seule ou en combinaison avec une molécule de référence.

Bénéfices attendus

Notre étude, en améliorant la connaissance sur les effets et le mode d’administration de nouvelles molécules pour lutter contre l'obésité et ses complications nous permettra de préparer la mise en place d’une étude clinique de phase 1 et à terme une meilleure prise en charge des patients obèses. Cette étude permettra de déterminer si au-delà de la perte de masse grasse attendue, on peut aussi espérer voir une augmentation de la masse musculaire.

Procédures

Les souris recevront tous les 2 jours une injection sous-cutanée sur une période de 35 jours. Des prélèvements de sang ponctuels seront effectuées à j32 et à J53. Les souris subiront deux gavages oraux avec du glucose à jour 32 et 53. Une mesure d'activité physique sur tapis de course sera réalisée à jour 26 et à jour 47. Une mesure de dépense énergétique sera faite à jour 29 et 50. A jour 35 et 56, une acquisition d’images d'une durée de 30 à 40 minutes sera réalisée sur animaux anesthésiés pour déterminer le pourcentage corporel en masse grasse et masse maigre. Un prélèvement sanguin terminal sera réalisé sous anesthésie avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Le protocole comporte des actes (injections sous cutanée) pouvant altérer le bien-être temporaires des animaux et apporter un stress sur une courte durée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récolter et peser différents organes pour définir les conséquences du traitement et permettre des analyses moléculaires des modifications induites.

Remplacement

Il est à noter que l'efficacité de la molécule a déjà été validé par nos collaborateurs américains via une étude pilote réalisée in vitro et in vivo. Le métabolisme énergétique et le développement de l'obésité est un processus physiologique complexe, impliquant l’action combinée d’une multitude d’organes et de diverses voies métaboliques. Il est donc actuellement impossible d’étudier ce paramètre d’une façon intégrale ex vivo ou in vitro et nous sommes malheureusement contraints d’utiliser les modèles animaux.

Réduction

Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en oeuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée et d'un logiciel dédié au calcul d'effectif. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude.

Raffinement

Enfin, les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations. Les cages seront enrichies par des frisottis et un dôme en carton. Après une semaine d'adaptation et d'acclimatation, les souris seront nourries pendant 12 semaines avec le régime hyperlipidique. Afin de limiter les souffrances expérimentales, une surveillance attentive et quotidienne des animaux sera réalisée au cours de la procédure. Des signes cliniques définissant les points limites, au-delà desquels l’expérimentation serait arrêtée et l’animal euthanasié, ont été fixés.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser de manière intégré les mécanismes de régulation de l'homéostasie énergétique. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie (et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines au moment de la mise sous régime hyperlipidique et la fin des études sera prévue 16 à 19 semaines plus tard. A cet âge, les paramètres métaboliques sont stables et ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale.