Souris

Trois chocs électriques de deux secondes à 0,5 milliampère servent à conditionner la peur chez des souris dont les mères ont été privées de litière et d'enrichissement pendant les vingt et un premiers jours de leur vie. 3 325 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit ces chocs comme n'entraînant pas d'altération de l'état général des animaux, et présente la réponse de stress induite chez les mères et leurs petits comme "nécessaire au projet scientifique". Toutes, géniteurs compris, sont tuées pour prélever le cerveau et des organes périphériques. Il annonce enfin jusqu'à cinq tests comportementaux à l'âge adulte, pour un total de 93 minutes, sans préciser lesquels.

Objectifs

Le stress précoce englobe un large éventail d'événements défavorables survenant pendant la période périnatale critique, tels que la maltraitance, la négligence, la pauvreté, la famine et la séparation parentale. Une des principales conséquences de l'exposition au stress précoce est un risque accru de troubles mentaux à l'âge adulte, notamment le trouble de stress post-traumatique. Ce dernier est associé à des altérations des comportements sociaux et cognitifs et, s'il n'est pas traité, peut avoir un impact grave sur la qualité de vie d'une personne. Des études ont montré que les souris exposées à un stress précoce présentent des anomalies cognitives et psychologiques. Un acteur clé dans ce processus est la microglie, la population résidente de cellules immunitaires du système nerveux central, qui joue un rôle important dans le développement cérébral. Pendant le stress précoce, la fonction de la microglie est perturbée, ce qui entraîne un développement du cerveau anormal, contribuant aux troubles de comportements observés. Les vésicules extracellulaires participent dans le cerveau à la communication entre les cellules. Les vésicules extracellulaires sont capables de transporter une grande variété de molécules avec des effets sur les cellules du cerveau. Cependant, dans le contexte du stress précoce, l'implication des vésicules extracellulaires dérivées de la microglie est inconnue. Par conséquent, l'objectif global de ce projet est d'explorer le rôle des vésicules extracellulaires du cerveau dans les mécanismes à l'origine de l'impact négatif de l'exposition à un stress précoce sur la fonction cérébrale normale chez la souris. Enfin, nous avons démontré des bénéfices sur la santé du cerveau d’approches nutritionnelles permettant une augmentation des acides gras de type Omega-3. Nous testerons dans le projet les effets protecteurs d’une augmentation des Omega-3 dans le contexte du stress précoce.

Bénéfices attendus

Notre étude explorera le rôle des EVs dérivées de la microglie comme nouvelle cible dans la pathologie et la progression des troubles liés au stress précoce. Cela apportera un nouvel éclairage sur les mécanismes impliqués dans les troubles liés au stress précoce en tant que trouble développemental, un domaine de recherche encore peu exploré. Nous prévoyons que de nouvelles cibles moléculaires seront identifiées, ce qui pourrait offrir des perspectives prometteuses pour la compréhension et le traitement des troubles liés au stress précoce. Ce sujet est d'intérêt public actuel en raison du fardeau croissant des sujets souffrants de conséquences de stress précoces et des estimations selon lesquelles environ 60 % des enfants sont exposés à une forme de stress précoce.

Procédures

1- stress précoce : 21 jours en limitation de litière et absence d'enrichissement. 2- procédure chirurgicale durant moins de 30 minutes avec un suivi du bien être des animaux. 3- test de peur conditionnée à l'âge adulte nécessitant une association entre 3 chocs de 2 secondes et 0,5mA d'intensité durant la phase d'acquisition en J1. 4- les souris sont soumises à maxium 5 tests comportementaux à l'âge adulte pour une durée totale de 93 minutes (1 test par jour, séparé de minimum 24heures).

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale est susceptible d'induire un épisode de nuisance chez l'animal nécessitant un suivi de son bien être avant sa complète convalescence. La procédure de stress précoce va induire une réponse de stress chez les descendants et la mère, nécessaires au projet scientifique. Les animaux subiront des chocs électriques de faible intensité pour le test de peur conditionnée, sans entrainer d'altération de l'état général des animaux. les autres tests ne durent que quelques minutes et n'induisent pas d'altération de l'état général des animaux. Les animaux transgéniques utilisés ne présentent pas d'altérations de l'état général de santé.

Devenir

Les animaux incluant les géniteurs seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules du cerveau, ainsi que des organes périphériques nécessaires pour les études du projet.

Remplacement

L'étude des effets du stress précoce nécessite l'utilisation d'animaux vivants, car il s'agit d'un stimulus environnemental qui ne peut être reproduit à l'aide de modèles cellulaires. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que chez des animaux vivants et éveillés. L'objectif général du projet est de comprendre les conséquences comportementales et les causes des troubles liés au stress précoce au niveau cellulaire chez la souris. Comme les causes initiales de la pathologie liée au stress précoce sont encore inconnues, il est impossible de les modéliser efficacement en culture cellulaire. Par conséquent, l'utilisation de modèles animaux pertinents et appropriés pour des études in vivo reste une nécessité expérimentale. Ce projet s'efforce d'identifier de tels déclencheurs moléculaires de la pathologie liée au stress précoce, afin que des études futures puissent adopter une approche in vitro. À ce jour, aucune duplication des travaux proposés n'a été identifiée.

Réduction

Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés pour ces expériences, nous avons adopté une approche statistique pour calculer les tailles d’échantillons nécessaires par groupe afin de démontrer un effet significatif. Nous avons alors choisi un nombre permettant un équilibre entre la robustesse des données omiques générées malgré la faible puissance statistique liée au nombre de groupes générés. Réduire ce nombre serait prendre le risque de générer des données non concluantes, ce qui pousserait à reproduire ces expériences avec un nombre plus grand et donc à terme consommerait plus d'animaux. La pertinence du nombre dans les destinations expérimentales repose sur la limite de détection du matériel que nous cherchons à évaluer, notamment concernant l'étude des exosomes. Nous ne pouvons réduire ce nombre au risque de passer sous la limite de détection des appareils de mesure.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur et la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communeauté scientifique.

Choix des espèces

Nous avons changé le paragraphe comme suit : « Ce projet s'inscrit dans la continuité des recherches menées par les porteurs du projet. Leurs données préliminaires ont été générées chez la souris, et l'ajout de nouvelles données issues d’un modèle murin permettra de raffiner les données existantes grâce à une analyse conjointe avec les données nouvellement générées. Dans le cadre d’une étude explorant le lien entre la nutrition et le cerveau, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste une nécessité expérimentale pour comprendre la réalité physiologique de nos résultats. Les stades de développement décrits ici sont conformes à la littérature actuelle, qui suggère que les souris sont les plus susceptibles de développer des symptômes similaires au syndrome post-traumatique pendant le développement postnatal précoce (P0-P21). Par conséquent, nous visons à surveiller les changements dans les vésicules extracellulaires au cours de cette période ainsi qu'à des stades adultes ultérieurs afin de déterminer si ces changements sont durables. »

Soumises chaque mois à un test de coordination motrice de deux à huit mois, puis à un test de douleur exposant leur queue à une source de chaleur, à vingt-quatre heures d'isolement en cage d'observation et à un effort forcé sur tapis roulant, 42 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées, le muscle tibial antérieur étant disséqué sous anesthésie pour mesurer sa contraction. L'objectif déclaré est de vérifier qu'un gène candidat repéré chez des patients cause bien une myopathie, en reproduisant chez la souris mâle les douleurs musculaires à l'effort décrites par les malades. Un amendement indique que dix souris sur vingt-quatre ne se sont pas endormies après l'injection d'anesthésique lors de la mesure de contraction, qu'elles ont été tuées sans subir la procédure, et que celle-ci sera donc répétée sur vingt-quatre autres souris.

Objectifs

Notre travail est principalement axé sur l’étude de nouveaux gènes impliqués dans les myopathies congénitales. Après analyse de données de séquençage d’ADN de plus de 500 patients atteints de myopathies, trois mutations dans un même gène ont été identifiées. Néanmoins, nous ne savons pas si ces mutations sont la cause de la myopathie ou si elles sont là par hasard. Au cours de notre projet, des analyses moléculaires effectuées sur cellules humaines suggèrent que ces mutations mènent à la perte de fonction de la protéine et donc à un effet pathologique. La mesure de l’activité motrice et neuro-sensitive des souris présentant une invalidation du gène d’intérêt permettra éventuellement de confirmer la présence de symptômes associés aux myopathies, tels que retrouvés chez les patients, et cela à l’échelle d’un organisme entier. En dernier lieu, des analyses sur tissus prélevés chez les souris permettront de comprendre les mécanismes de la maladie liée à ce gène et ainsi d’ouvrir des perspectives thérapeutiques. Le gène étant sur le chromosome X, cette maladie concerne très rarement les femmes. Nous n'étudierons donc que les souris mâles. Nous utiliserons 12 mâles dont le gène d’intérêt est intact et 12 mâles dont le gène est invalidé que nous comparerons. Amendement : Seulement 10 souris sur les 24 prévues se sont endormies après injection d'anesthesiques lors de la procédure mesure des propritétés contractiles (Aurora). Les souris ne s'étant pas endormies ont été sacrifiées et n'ont pas pu subir la procédure. Afin de pouvoir obtenir des résultats pour au moins 10 souris par groupe, cette procédure sera répétée avec 24 autres souris dont 12 par groupe.

Bénéfices attendus

Les différents tests d’activité motrice et de neurosensibilité chez la souris permettront de rendre compte de symptômes similaire à ceux des patients atteints de myopathies et d’ainsi confirmer à l’échelle d’un organisme entier ce qui est observé au niveau moléculaire. Les souris analysées constitueront ainsi un modèle murin de myopathie. L’étude de l’activité des souris par test de coordination motrice chaque mois permettra d’observer ou non une différence d’activité en fonction de l’âge de la souris et ainsi de confirmer que nos études à l’âge de 8 mois sont appropriées. Les mesures de neurosensibilité et d’activité spontanée dans la cage sont réalisés avant et après effort sur tapis roulant. Cette décision a été prise car les patients ayant une mutation du gène présentent des douleurs et faiblesses à l’effort. Une fois que l’implication de ce gène dans les myopathies est confirmée, le diagnostic de patients présentant une mutation de ce gène sera facilité et leur prise en charge sera améliorée. Des études plus approfondies permettront de comprendre les mécanismes de la maladie et d’ainsi envisager des nouveaux traitements.

Procédures

Chacune des 24 souris seront soumises à une série de 5 tests au total. De 2 à 8 mois et de manière mensuelle, la coordination motrice des souris sera analysée une fois par mois pendant moins d'une heure sur animal vigile. A 8 mois, des tests de douleur avec exposition au chaud (~1h) et test de mesure d'activité spontanée dans une cage (~24h) seront réalisés avant et après effort sur tapis de course (~1h). Ces trois tests seront réalisés sur animal vigile. A la fin de ces tests, toutes les souris subiront une mesure d'activité contractile sur muscle tibial antérieur dissequé (~1h par souris). L'animal sera anesthésié au préalable. Les muscles seront conservés pour des tests histologiques et moléculaires. Une biopsie de phalanges des souris est effectuée autour du sixième jour de vie dans le but d’analyser l’ADN de l’animal et d’ainsi vérifier la présence ou non du gène d’intérêt. Cette même biopsie servira également à l'identification de l'animal.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à observer un phénotype dommageable après effort sur tapis, de manière similaire aux patients présentant les mutations du gène étudié. En effet, les patients présentent des douleurs musculaires après activité physique. D’anciens travaux préliminaires sur ce modèle animal n’ont relevé aucun phénotype dommageable avant 4 mois. Etant donné que nos tests débutent à 2 mois, nous nous attendons à potentiellement observer des nuisances dès l’âge de 2 mois. Une faiblesse physique et douleur chez la souris pourra mener à une difficulté à se déplacer dans les cages, une difficulté à manger et éventuellement à respirer et une diminution des comportements sociaux et d’exploration. Parmi les différents tests, nous nous attendons à observer des nuisances lors de l’activité sur tapis qui provoque une fatigue de l’animal. La locomotion de la souris après retour dans sa cage risque d’être impactée. Le test de mesure de la douleur qui expose la queue de la souris à une source de chaleur provoque une douleur de très courte durée, égal au temps de réaction de la souris. La mesure d’activité spontanée dans une cage implique un isolement social pendant 24h. La mesure des propriétés contractiles musculaires nécessite une injection d'anesthésique et d'antalgique au préalable. La biopsie des phalanges décrite en 5.6.1 provoque une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette étude afin de procéder à des analyses histologiques et/ou moléculaires.

Remplacement

Afin de limiter les tests sur animaux, des études de l’activité à l’échelle moléculaire et cellulaire sont réalisées sur cellules humaines. L'utilisation d’animaux est cependant indispensable car les symptômes observés chez les patients atteints de myopathies et mécanismes de la maladie ne peuvent être observés et confirmés que dans un organisme entier. En effet, l’ensemble du tissu musculaire en lien avec le système nerveux sont étudiés. Le produit du gène étudié est très bien conservée chez la souris avec 96% d’homologie, ce qui suggère une fonction similaire chez l'humain et la souris. De plus, la souris possède une structure et physiologie du système musculaire et nerveux assez proche de l’Homme pour les comparer et mener à des conclusions. Des techniques de mesure d’activité musculaire sur la souris ont été développées et perfectionnées dans notre équipe depuis de nombreuses années, ce qui fait de la souris un modèle d’étude idéal de myopathies.

Réduction

Etant donné que le suivi en fonction de l’âge par test de coordination n’est pas invasif, cela va permettre de réutiliser les souris pour les autres tests et ainsi réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Chacune des souris subira la totalité des tests au cours de sa vie. Etant donné que le test de force musculaire nécessite l’anesthésie puis la mise à mort de l’animal, les tissus d’intérêt pour analyses histologiques seront prélevés au même moment. Aucun autre animal ne sera donc sacrifié à cet effet. En ce qui concerne les tests avant et après efforts, ceux-ci n’ont de sens pour comparaison statistique que si un même animal effectue les tests avant et après l’effort. Cela réduit encore une fois le nombre d’animaux utilisés. Enfin, le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum tout en permettant d'obtenir une puissance statistique suffisante. Nous pouvons affirmer d’après la littérature qu'au total 24 souris seront nécessaires pour conclure sur le projet : 12 souris modèles de myopathie et 12 souris contrôles saines.

Raffinement

Une vigilance accrue aux moindres signes de douleur pendant les tests ou dans la cage sera appliquée grâce à une grille d’évaluation de la douleur. Les nuisances sur l’animal seront évitées autant que possible et le test arrêté si une des nuisances apparait. La mise à mort de l’animal sera appliquée si la douleur est trop élevée. De la nourriture en gel sera déposée dans la cage dès l'apparition des premiers signes de difficulté pour se déplacer et notamment après l’activité forcée sur tapis. A partir du sevrage, une perte de poids de 20% en moins de 2 semaines ou une immobilité prononcée conduira à la mise à mort. Le suivi du poids se fera une fois par semaine, voire 1 fois par jour si une baisse de poids est observée. Afin de réduire le stress des souris, celles-ci subiront une habituation à l’environnement du test un jour avant les tests et seront toujours manipulées à l’aide de tunnels. Lors de la mesure de force musculaire, les souris seront profondément anesthésiées à l’aide d’un anesthésique puissant. Afin d’éliminer toute forme d’inconfort et de douleur, une molécule à fort potentiel analgésique sera également administrée accompagnée d’un anxiolytique utilisé pour son fort pouvoir sédatif. L’animal est ensuite déposé sur une plaque chauffée afin d'éviter une hypothermie. Afin de protéger et humidifier l’œil, un gel sera appliqué. Avant de débuter l’opération, l’efficacité et la profondeur de l’anesthésie sont vérifiées par une pression exercée manuellement sur les pattes et la queue. Si le rongeur ne montre aucune réaction, l’opération chirurgicale et le test peuvent être réalisés.

Choix des espèces

La protéine issue de notre gène d’intérêt est très bien conservée chez la souris avec 96% d’homologie, ce qui suggère une fonction similaire chez l'humain et la souris. De plus, la souris possède une structure et physiologie du système musculaire et nerveux assez proche de l’Homme pour les comparer et mener à des conclusions. Des techniques de mesure d’activité musculaire propres à la souris ont été développées et perfectionnées dans notre équipe depuis de nombreuses années, ce qui fait de la souris un modèle d’étude idéal de myopathies. Les animaux subiront un test de coordination chaque mois de 2 à 8 mois afin d'obtenir un suivi de l'activité motrice selon l'âge. Cette gamme d’âges permettra d’avoir le plus de données possibles pour conclure, tout en maximisant le temps de repos des souris. Les autres tests moteurs et neurosensitifs seront effectués à l'âge de 8 mois, âge où la souris atteint ses capacités musculaires maximales. Les souris seront sexuellement matures lors de l’ensemble des tests. Elles seront adolescentes de 2 à 3 mois et adultes de 3 à 8 mois jusqu’à la fin des tests.

Greffées d'une tumeur dans le cerveau, gavées quinze fois en trois semaines, irradiées jusqu'à six fois et passées jusqu'à cinquante-deux fois sous imagerie en un an, 223 souris immunodéficientes subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une ataxie, une perte d'appétit et de poids, de la prostration et des pertes d'équilibre à mesure que la tumeur grossit, et, plus rarement, une exorbitation des yeux ou une atteinte de l'oreille interne liées à la pression dans le crâne. Toutes seront tuées pour l'analyse de leur cerveau, dans un test d'efficacité d'une molécule sur un sous-type de gliome de la ligne médiane. Les actes se répartissent entre "certains animaux" sans que le nombre concerné par chacun soit jamais donné, et les effectifs par lot sont justifiés par la seule expérience antérieure de l'équipe.

Objectifs

Les gliomes diffus de la ligne médiane ou DMG sont un sous-groupe de gliome ayant une localisation spécifique (ligne médiane du cerveau), sont très infltrants et actuellement incurables. Ils sont divisés en sous-types présentent des altérations spécifiques qui pourraient représenter des vulnérabilités possibles pour identifier de nouveaux traitements. Récemment, nous avons accumulé des résultats démontrant qu'un sous type de gliomes portant 2 mutations spécifiques ont un meilleur pronostic. En nous appuyant sur ces résultats, nous souhaitons approfondir notre caractérisation de ces tumeurs pour mieux comprendre leur développement, leur évolution particulière et identifier d'éventuelles vulnérabilités ainsi que le mécanisme par lequel ces mutations améliore le pronostic des patients. Pour cela nous allons : (i) Comparer l’évolution des cellules de plusieurs modèles greffés chez la souris en inhibant ou non les effets liés à la mutation spécifique de ces gliomes. Nous chercherons de plus à savoir si cette inhibition à un effet sur la vitesse de croissance (ii) Tester l’efficacité d’une molécule activant la voie mutée dans ces gliomes seule ou en combinaison avec de l’irradiation (qui est le traitement classique actuel de ces tumeurs) dans les modèles de gliome dans lesquelles elle ne l'est pas à l'oigine pour savoir si l’on est capable de reproduire l’amélioration pronostic retrouvée dans ces tumeurs.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension du développement et comportement des gliomes diffus de la ligne médiane et une possible amélioration des traitements pour ces types spécifiques de gliome.

Procédures

Lors des expériences préliminaires, certains animaux subiront un prélèvement de sang. Ce prélèvement unique prend environ une minute sur animal anesthésié (anesthésie générale). Certains animaux subiront une greffe de cellules tumorales dans le cerveau. La procédure dure entre 5 et 10 minutes par animal sur animal anesthésié (anesthésie générale avec analgésie adaptée). Les animaux qui seront traités par gavage le seront 15 fois (5 jours par semaines pendant 3 semaines). Gaver une souris dure quelques secondes sur animal vigile. Des animaux qui seront irradiés le seront maximum 6 fois à faible dose, étalé sur 2 semaines. Cela prend environ 2 minutes par irradiation sur animal anesthésié. Certains animaux auront des séances d'imagerie sous anesthésie générale, durée maximum 10 minutes, nombre maximum : 52 (séances hebdomadaires pendant un an au maximum).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liées à la greffe d'une tumeur dans le cerveau. La greffe, sous anesthésie générale occasionnera une petite plaie sur le dessus du crâne, qui entraînera une gêne légère et temporaire. Par la suite, on pourra éventuellement observer des symptômes neurologiques qui sont fréquemment observés en présence d’un volume tumoral conséquent (ataxie), perte d'appétit et donc perte de poids, prostration des animaux, perte d’équilibre. L’augmentation de la pression intracrânienne peut exceptionnellement entraîner des symptômes tels que l'exorbitation des yeux, l'atteinte de l’oreille interne qui entraineraient l'arrêt immédiat de la procédure. L'irradiation et l'imagerie n'entraînent qu'un inconfort temporaire et léger dû à la préhension avant anesthésie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures pour analyses post-mortem sur les cerveaux.

Remplacement

Une singularité des gliomes pédiatriques de la ligne médiane (composée du thalamus, du pont et de la moelle épinière), résulte dans leur phénotype systématique d’infiltration des structures de la ligne médiane dans un premier temps, puis plus largement de tout le cerveau au décours de la maladie. Ces particularités résultent des interactions des cellules tumorales avec leur environnement qui ne peuvent être appréhendées que dans des modèles vivo, où la variété et complexité du microenvironnement tumoral peut être reproduite. De plus, la barrière hématoencéphalique, qui isole le cerveau du reste de l’organisme, est une limitation très importante dans le traitement de cette maladie (barrière non rompue) et il est nécessaire de développer des modèles de greffes afin d’évaluer une nouvelle médication avant les phases cliniques. Les molécules utilisées ont été testées sur des modèles de cultures cellulaires afin de valider leur efficacité. Nous ne pouvons pas utiliser de modèles de substitution comme les organoïdes car ils ne représentent pas la réalité de la barrière hémato encéphalique et les difficultés de traitement qui y sont liés.

Réduction

Les animaux sont, tout au long des manipulations suivis par bioluminescence, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés (suivi longitudinaux, augmentation de la puissance statistique). Dans le projet nous utiliserons des Go/NoGo. En effet si aucun effet anti-tumoral n’est démontré sur la première lignée ou qu’aucun passage de la barrière hémato encéphalique des molécules ne peut être démontré nous ne poursuivrons pas les manipulations selon ce protocole. De plus les expériences d’escalade de doses permettent de réduire au maximum le nombre d’animaux en écartant les doses potentiellement inefficaces et toxiques. Les nombres d'animaux par lot ont été basés sur l'expérience antérieure que nous avons de ces modèles tumoraux sur ces souris. Ils minimalisés pour permettre des analyses statistiques pertinentes des différents paramètres étudiés au décours des procédures.

Raffinement

Pour limiter la souffrance liée à la chirurgie, les animaux recevront une injection d’analgésique avant la chirurgie, puis une autre injection par la suite si des signes de souffrance sont détectés. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale . La température de l’animal est maintenue grâce à une plaque chauffante durant la chirurgie et le réveil. Une injection de sérum physiologique à la température de l’animal est réalisée avant la chirurgie pour maintenir l’hydratation de l’animal. Un gel oculaire est également utilisé pour éviter la sécheresse oculaire et un désinfectant est appliqué au site d’incision pour éviter tout risque d’infection. Suite à la chirurgie, les animaux sont surveillés le temps de leur réveil complet (quelques minutes) et sont par la suite replacés en hébergement en groupe où ils reçoivent nourriture et boisson ad libitum. Les examens cliniques sont quotidiens. Les animaux sont hébergés en cage de 5 avec nourriture et eau ad libitum ainsi que deux enrichissements comme des maisonnettes ou tunnels en carton, des bâtons de bois à ronger ainsi que du papier pour nidification. Des pooints limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

L'espèce souris, et en particulier la souris immnodéficiente est un très bon modèle de référence pour l'étude des gliomes humains dans un organisme entier. Nous utilisons des souris adultes car le développement des tumeurs chez la souris étant de plusieurs mois, il n'est pas pertinent de prendre des souris très jeunes qui supporterait mal la chirurgie.

750 souris et 1 150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats subissent la pose chirurgicale d'un cathéter dans le canal biliaire, parfois complétée d'un cathéter dans le duodénum et d'un autre dans la veine fémorale, jusqu'à deux heures d'opération, puis vingt-quatre heures d'isolement en cage à métabolisme avec privation d'eau ou de nourriture. Le porteur indique que certains animaux sont tués parce que l'isolement de vingt-quatre heures rend difficile leur retour dans un groupe social. Il présente comme bénéfice pour les rats et les souris eux-mêmes une "amélioration des connaissances scientifiques pour l'espèce utilisée", et l'animal comme un "passage obligatoire" avant toute administration à l'humain.

Objectifs

L'évaluation de l'élimination et de la toxicité sont des étapes obligatoires au cours du développement d'un nouveau candidat médicament. Chaque étude de ce projet a pour but d’évaluer les différentes voies d'élimination (hépatique, rénale, gastro-intestinale, sanguine) d'un candidat médicament et sa toxicité sur les principales voies métaboliques de l'organisme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée (rat et souris) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les souris de ce projet pourront subir une administration (moins de 2 min) suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). Les rats de ce projet pourront subir une chirurgie pour l’implantation d’un cathéter dans le canal biliaire (30 min à 1h) . Cette chirurgie pourra comprendre l’implantation d’un ou deux cathéters supplémentaires un dans le duodénum et/ou un dans la veine fémorale (1h30-2h). Les rats de ce projet pourront également subir une administration (moins de 2 min) suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte de bile et/ou d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). Les rats avec les 2 ou 3 cathéters pourront être mis à 2 reprises en cage à métabolisme séparées d’environ 1 semaine. Les animaux de ce projet pourront subir une chirurgie pour l'implantation d'une minipompe servant à la délivrance en sous cutané, intraveineux ou intrapéritonéal d'une substance (20 à 45 min), suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). La mesure de la diurèse sur 24h pourra être effectuée au maximum 1 fois/semaine sur un maximum de 3 semaines après contrôle de l’état de santé de l’animal (poids et hydratation). La mesure de la diurèse sur 16h pourra être répétée au maximum 2 fois/semaine sur un maximum de 3 semaines après contrôle de l’état de santé de l’animal (poids et hydratation).

Impact sur les animaux

Les souris de ce projet pourront subir une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme (24h) pour la collecte d’urine et/ou de fèces, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, un stress lié à la mise à jeun. Les rats de ce projet pourront subir un stress lié à l'anesthésie gazeuse, un stress postopératoire (une légère douleur/inconfort est possible malgré les analgésiques), un stress lié à la contrainte du bouton dermique lié au cathéter pour le recueil de la bile et/ou du duodénum et/ou de la veine fémorale, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme pour la collecte d’urine et/ou de fèces, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, un stress lié à la privation d'eau et/ou de nourriture.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure du fait soit des prélèvements nécessaires à l'étude soit de leur isolement pendant 24h et de la difficulté à les remettre en groupes sociaux ensuite qui sera vérifiée au cours de la mise au point du modèle de rat avec les cathéters bilaires, duodénal (et/ou fémoral ou carotide) maintenu en vie 8-10 jours.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat ou la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le métabolisme hépatique, intestinal et/ou rénal. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat ou la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 4 à 8 / par groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Les souris et les rats font parties des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale et les études de médecine comparative en raison de leur similarité anatomique, physiologique et génétique avec l'homme (les rats, les souris et les humains partagent environ 95% de gènes). Les rongeurs sont des animaux de petite taille, facile d'entretien, avec un cycle de vie court et pour lesquels il existe une abondance de leurs ressources génétiques. Le rat et la souris sont donc les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer le métabolisme d'un produit et sa toxicité sur les voies d'élimination de ce produit. Animaux adultes, à partir de 7 semaines. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.