Souris
Développement d’un traitement de thérapie génique pour la déficience en acide lipase lysosomale par édition du génome.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Toutes tuées à l'issue, 1 700 souris déficientes en lipase acide lysosomale vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit un prélèvement au bout de la queue, quatre injections espacées de vingt-quatre heures destinées à détruire son système sanguin, une greffe de cellules souches sous anesthésie, puis jusqu'à trente-six prises de sang. Le porteur indique que l'échec de la greffe empêchera définitivement ces souris de produire du sang et les tuera, tout en classant 1 500 animaux sur 1 700 en souffrance légère. Ces souris sont construites pour accumuler des graisses dans les organes comme les nourrissons atteints de la maladie de Wolman, qui meurent entre trois et huit mois. L'effectif retenu repose sur des groupes de huit souris, sans que le RNT explique le passage de ce chiffre au total de 1 700.
Objectifs
Le déficit en la protéine : lipase acide lysosomale (LAL) est une maladie génétique rare. Elle induit une accumulation de gras au niveau des organes, notamment dans le foie qui est fatal chez les patients. La gravité de l'affection dépend de la quantité d'enzymes. La forme la plus sévère de la maladie (maladie de Wolman), absence totale de l’enzyme (
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de développer un traitement curatif pour la déficience en protéine LAL qui pourra être utilisé pour d'autres maladies.
Procédures
Les souris auront un petit prélèvement à l'extrémité de la queue pour analyser leur profil génétique. Les souris recevront 4 injections de traitement pour supprimer leur système sanguin, espacées de 24 heures, chaque injection prenant environ 10 minutes. 24 heures après la dernière injection, elles recevront une injection de cellules souches sous anesthésie, ce qui prendra aussi environ 10 minutes. Quatre semaines plus tard, un prélèvement de sang sera effectué, sous anesthésie gazeuse, pendant environ 10 minutes. En tout, les souris auront 5 injections et plusieurs prises de sang (au maximum 36).
Impact sur les animaux
Les souris déficient en lipase acide lysosomale vivent moins longtemps (environ 8 à 10 mois) et ont un excès de plaquettes dans le sang, mais cela n'affecte pas leur développement ni le bon fonctionnement de leurs organes, car aucune caillot de sang n'a été observé. Le prélèvement à l'extrémité de la queue provoque une douleur passage (
Devenir
Toutes les souris du projet seront euthanasiées.
Remplacement
Pour évaluer de nouveaux traitements innovants basées sur la correction de cellules souches de patient pour la déficience en lipase acide lysosomal, nous devons d’avoir étudier la transplantation de cellules souches dans un modèle de souris. En effet, seuls des cellules de patient sont disponibles actuellement in vitro, ce qui n’est pas suffisant pour reproduire la complexité du compartiment hématopoïétique.
Réduction
Afin de respecter le principe de réduction du nombre de souris, nos prévisions d'effectif sont basées sur des calculs de statistiques comparant la prise de greffe à notre valeur observée de référence. Pour cela, nous avons utilisé un test statistique et selon ces calculs, il faudrait inclure 8 souris par groupe d'études.
Raffinement
Les souris déficientes en lipase acide lysosomale sont plus petites que les souris saines, mais n'ont pas de problèmes de motricité ou de douleur, donc aucune condition particulière d’hébergement n'est nécessaire. Après le prélèvement nécessaire à l'identification des souris, celles-ci seront surveillées pendant une demi-heure afin de s'assurer qu'il n'y a pas de complications. Lors de la réalisation des gestes techniques, les souris seront anesthésiées. Tout au long des études, l'état général des souris (apparence, posture, comportement, etc.) ainsi que leur poids seront surveillés une fois par semaine. Des points limites ont été définis et seront appliqués afin d'éviter toute souffrance des animaux. En cas de plaies, un traitement local sera appliqué. Si les plaies ne cicatrisent pas dans un délai d'une semaine, les souris seront euthanasiées.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris déficientes en lipase acide lysosomal car ce modèle mine l’accumulation de lipides observés chez les patients. De plus, la protéine lipase acide lysosomal humaine est fonctionnelle sur les souris, donc permet d’étudier l’effet thérapeutique in vivo de notre approche. Le prélèvement de queue sera réalisé 7 jours après la naissance des souris. Afin d’étudier la correction de la maladie, les animaux seront greffés à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines pour reproduire les procédures de thérapie génique appliqués à l’homme adulte. L’efficacité du traitement nécessitera un suivie de 16 semaines et de 9 mois (36 semaines).
Une nouvelle opportunité pharmacologique pour limiter le développement de l’insuffisance cardiaque post-infarctus du myocarde dans un modèle murin de pré-diabète
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Pour tester une molécule nommée GC7 sur l'insuffisance cardiaque qui suit un infarctus, 112 souris rendues pré-diabétiques par un régime riche en gras et en sucre vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal suit ce régime pendant dix à vingt-six semaines, subit cinq jeûnes de six heures suivis d'injections de glucose ou d'insuline et de prises de sang, cinq échocardiographies sous anesthésie générale, puis une chirurgie qui bloque une artère du cœur pendant quatre-vingt-dix minutes avant le réveil. Le porteur décrit une prise de poids importante, un retentissement progressif sur la fonction cardiaque, une douleur modérée de quelques heures après l'opération, et un risque de mortalité péri-opératoire "non nul" intégré au calcul des effectifs. Toutes sont tuées huit, douze ou seize semaines après l'infarctus, pour prélever le cœur, le foie, les reins et le tissu adipeux.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque touche près d’un million de personne en France et on lui attribue 70 000 décès par an. Elle se traduit par un remodelage du muscle cardiaque délétère associé à des altérations fonctionnelles qui conduisent le plus souvent à la mort. Elle survient, très souvent suite à un infarctus du myocarde aigu dont la survenue est plus fréquente chez les patients avec un syndrome métabolique. L’objectif du projet est d’utiliser un modèle murin ayant développé un pré-diabète. Nous induirons sur ce modèle un infarctus du myocarde dans le but d’étudier le developpement d’une insuffisance cardiaque. Nous testerons les effets d’une drogue nommée GC7 ayant pour cible un facteur d’initiation de la traduction (protéine se liant au ribosome pour permettre la traduction de l’ARNm en proteines) EiF5A, en aigue, sur la taille d’infarctus, et à long terme sur le developpement d’une insuffisance cardiaque en verfiant si la poursuite d’une diète riche en gras et en sucre altère ou non les effets du traitement. Des études antérieures ont pu montrer que cette drogue permet de moduler l’énergétique mitochondriale. La limitation de l'infarctus et l'amélioration de la récupération fonctionnelle à long terme sont des objectifs majeurs pour améliorer la morbi-mortalité et le bien-être des patients. C’est pourquoi, le suivi dans le temps de ce modèle nous permettra de mieux comprendre l’évolution de cette pathologie cardiaque et de pouvoir évaluer l’efficacité́ de ce nouveau traitement donné à la phase aigüe de l’infarctus dans un contexte métabolique altéré. Nous nous attacherons donc a évaluer l’efficacité de notre traitement à distance de l’infarctus, sur les altérations de la fonction cardiaque ainsi que sur le developpement d’une insuffisance cardiaque, à différents temps (8, 12 et 16 semaines post-ischémie). Nous déterminerons également, en aigu (24h après l’infarctus), la taille d’infarctus. En fin de chaque protocole, des tissus (cœur, sang, reins, tissu adipeu, foie) seront prélevés afin d’évaluer l’inflammation systémique et tissulaire, la fibrose tissulaire au niveau cardiaque et rénale et les atteintes métaboliques du tissu adipeu et du foie. La maladie métabolique peut avoir un retentissement sur la maladie cardiaque et inversement. Il est donc important de comprendre quels sont les effets cardiaques et métaboliques de notre intervention pharmacologique.
Bénéfices attendus
Notre objectif principal est l’évaluation du succès de la transposition de l'effet protecteur ischémique d’un nouveau composé pharmacologique le GC7 dans un modèle in vivo d’insufisance cardiaque post-infarctus chez la souris lorsqu'il est utilisé à une dose unique au moment de la reperfusion. De plus ce travail nous permettra de définir si le GC7 peut être un agent cardioprotecteur lorsqu'il est administré en juste après l’infarctus dans un modèle de souris nourries avec un régime riche en graisses et en sucres. Notre objectif final serait de montrer que le GC7 est un traitement efficace dans la prévention du développement de l'insuffisance cardiaque dans un contexte de pré-diabète quand il est administré à la phase aigue de l’infarctus.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Un régime riche en gras et en sucre pendant 10 ou 26 semaines selon les groupes - 5 tests consistant en l’administration de glucose ou d’insuline (durée < 1 minute) puis prélèvements de sang (durée < 30 secondes). Ces tests sont espacés de minimum 7 jours les uns des autres et sont précédés d’un jeûne court de 6h. - 5 examens échocardiographiques sous anesthesie générale (durée : 15-30 minutes), espacés également de minimum 9 jours les uns des autres. - Une chirurgie mimant l’infarctus du myocarde sous anesthésie générale profonde et couverture analgésique adaptée. Les souris seront soumises à 90 minutes d’infarctus sous anesthésie puis reveillées suite à la recanalisation de l’artère occluse. - Mise à mort pour prélèvement final du sang et des organes d’intérêt.
Impact sur les animaux
Le régime riche en sucre et en gras pendant 26 semaines maximum est associé à une prise de poids corporelle importante et rapide, ainsi qu’à un retentissement progressif sur la fonction cardiaque. Ceci peut induire, après plusieurs semaines de ce régime, un inconfort d’intensité légère à modérée de longue durée pour l’animal. L’induction de l’anesthésie (pour la chirurgie), ainsi que le réveil peuvent s’accompagner d’un léger inconfort et stress de courte durée. La chirurgie cardiaque induit une douleur modérée de durée moyenne (quelques heures). Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs). La chirurgie, c’est-à-dire 90 minutes d’infarctus chez des individus pré-diabétique est susceptible d’être accompagnée d’un risque de mortalité peri-opératoire non nul qui a été pris en compte dans la calcul des effectifs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des 2 protocoles afin de prélever des tissus (cœur, foie, tissu adipeu et reins) en vue d’analyses ultérieures.
Remplacement
Il s’agit ici de l’utilisation d’un modèle chirurgical animal d’étude de l’insuffisance cardiaque post ischémique, nécessitant par essence le recours à l’animal. En effet, l’insuffisance cardiaque post-infarctus est une pathologie complexe que les méthodes alternatives actuelles ne permettent pas de simuler dans son ensemble. Aussi, réaliser un suivi de la fonction cardiaque, sur plusieurs semaines d’évolution de la pathologie nécessite le recours à un organisme entier. De plus, le contexte métabolique altéré (pré-diabète) impliquera des altérations fonctionnelles des tissus adipeux et hépatique qui pourraient retentir sur le remodelage cardiaque. Néanmoins, afin de mieux comprendre certains des mécanismes intracellulaires mis en jeu par l’utilisation du traitement, un des nos collaborateurs effectuera certaines experiences sur des cellules humaines en culture afin de limiter le nombre d’animaux necessaires à cette étude. Ces études sur modèle cellulaire ne pourront pas nous apporter de réponse quand à l’effet à long terme.
Réduction
Les effectifs ont été estimés au minimum nécessaire afin d’obtenir des résultats exploitables : Le nombre d’animaux par groupe a été calculé à l’aide de tests de puissance sur la base des résultats des études précédentes. Le nombre d’animaux de cette étude a été déterminé par une analyse statistique sur un logiciel spécifique. Afin d’analyser nos résultats, nous effectuerons des tests statistiques adaptés afin de comparer nos groupes experimentaux.
Raffinement
Afin de supprimer toute souffrance ou douleur liées aux injections et prélèvements, ceux-ci seront réalisées sous prémédication analgésique et anesthésique local. L’examen échographique sera réalisé sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sous anesthesie générale avec prémedication par injection sous cutané d’un antidouleur. La mise à jeun courte de 6h avant les tests métaboliques est réalisée au matin, ce qui correspond au début de période diurne pour les animaux (c’est à dire à leur période de plus faible activité et en situation post-prandiale). Les prélèvements d’autres tissus (reins, tissu adipeux, foie et sang) en parallèle du cœur sont réalisés sur les mêmes souris afin de compléter l’analyse du profil d’insuffisance cardiaque qui est souvent associé en clinique humaine à une défaillance multi-organes. Des points limites adaptés aux procédure envisagées ont été mis en place.
Choix des espèces
La souris est un modèle largement utilisé dans la littérature dans le cadre d’études mécanistiques ou précliniques portant sur les maladies cardiovasculaires. La différence physiologique majeure au niveau cardiaque entre la souris et l’homme est la fréquence cardiaque. Néanmoins, ce modèle animale semble être adapté au vu des réponses physiologiques et physiopathologiques dans le cadre de l’étude de l’infarctus du myocarde et du developpement de l’insufisance cardiaque. Les animaux participant à ce projet devront être de jeunes adultes (5 à 10 semaines au début de la procédure) pour faciliter les examens échographiques : plus les os sont denses, plus ils gênent le passage des ondes ultrasonores, créant des « cônes d’ombre » sur les images échographiques, dont l’analyse peut alors s’avérer plus complexe. De plus, des experiences préliminaires menées au laboratoire ont permis de mettre en évidence que la diète riche en gras et en sucre devait commencer tôt afin d’avoir des effets cardiovasculaires marqués.
Rôle du microbiote précoce en tant que facteur de risque d’autisme. Etude chez la souris. Site 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Gavées avec les selles de nouveau-nés grands prématurés, 160 femelles gestantes et 640 souriceaux subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les 800 souris de ce site sont toutes tuées. 384 souriceaux passent 20 tests comportementaux différents entre 6 et 68 jours de vie, dont un test de mémoire visuelle et spatiale de 66 minutes, chaque petit étant séparé de sa mère jusqu'à trente minutes et de sa portée jusqu'à quinze minutes. Les mères sont tuées après le sevrage parce que leur microbiote modifié interdit de les rendre à l'élevage, et les souriceaux en surnombre le sont aussi. Le porteur reconnaît que les souris colonisées ne reflètent pas exactement les interactions entre microbiote et hôte chez l'être humain, et présente pourtant ce modèle comme un système expérimental valide pour relier microbiote précoce et autisme.
Objectifs
Ce projet se déroulera dans deux établissements distincts, et certains animaux seront transportés de l’établissement utilisateur EU1 vers l’établissement utilisateur EU2 à J25. Le microbiote intestinal, ou l’ensemble des microbes peuplant le tractus digestif, est considéré comme un composant essentiel dans le développement et la physiologie de l’hôte, notamment pour certains organes comme l’intestin et le cerveau. Alors que 11% des naissances dans le monde sont des naissances prématurées, plusieurs études démontrent que le microbiote intestinal est souvent plus immature et moins diversifié chez l’enfant prématuré par rapport à un enfant né à terme, et ce déséquilibre pourrait être un facteur de risque d’un développement cérébral anormal. Une analyse récente du microbiote intestinal de nouveau-nés prématurés âgés d’1 mois a permis d’associer la composition de leur microbiote intestinal avec un développement cérébral normal ou un développement cérébral atypique, bien qu’il n'ait pas encore été prouvé que le microbiote intestinal cause directement ces différences. Dans ce contexte, nous cherchons à comprendre si la composition du microbiote intestinal dans les premiers jours de la vie pourrait être un facteur de risque de l’autisme. Pour cela, nous transférerons des matières fécales de nouveau-nés prématurés, associés soit à un développement cérébral normal, soit à un développement cérébral anormal. Nous observerons ensuite comment ce transfert de matières fécales humaines affecte chez la souris la physiologie et le comportement, de la période néonatale jusqu'à l’âge adulte.
Bénéfices attendus
L’avantage majeur de ce projet est de reproduire les effets potentiels d’un microbiote intestinal humain sur la physiologie et la santé d’un modèle vivant. Bien que les souris colonisées avec un microbiote intestinal humain ne soient pas le reflet parfait des interactions microbiote-hôte chez I’être humain, il a été montré que la composition et la diversité du microbiote humain implanté étaient conservés chez la souris colonisée. Ce modèle animal représente donc un système expérimental valide pour la compréhension des mécanismes sous-jacents aux interactions entre le microbiote intestinal, les intestins et le cerveau. Dans ce projet, il s’agira d’étudier l’impact potentiel de microbiotes fécaux d’enfants prématurés sur le développement et la fonction du système digestif, du cerveau, et des comportements associés au TSA (Trouble du Spectre autistique) chez la souris colonisée. Nous souhaitons également identifier les mécanismes par lesquels les premiers micro-organismes colonisant le tractus digestif pourraient impacter son propre développement mais aussi celui d’autres organes avec lesquels il communique : les intestins et le cerveau, et si cela constituerait un facteur de risque pour le TSA. En outre, il n’existe pas à notre connaissance de modèle équivalent dans la littérature permettant d’identifier si des microbiotes humains précoces de compositions définies affectent le développement du microbiote lui-même, celui du système digestif, du cerveau et des comportements, et comment cela peut être lié au(x) risque(s) de TSA.
Procédures
Dans ce projet, des gavages seront réalisés pendant 1 à 2 minutes maximum chez l’animal vigile. Un gavage sera réalisé sur un maximum de 160 femelles gestante et 640 souriceaux âgés de 22 jours. Par ailleurs, des échantillons de fèces seront prélevés lors du change hebdomadaire à partir de 14 jours de vie pour chaque souris, à raison de 3-4 selles fraîches émises spontanément après placement de l’animal vigile dans un contenant individuel. Chaque prélèvement de selles n’excédera pas 5 minutes. Pour l’ensemble du projet, 8 prélèvements de fèces seront donc prévus au maximum pour chaque souriceau. 384 souriceaux au total, seront soumis à 20 tests comportementaux différents, réalisés entre 6 jours et 68 jours de vie. Plus précisément, le temps cumulé de test par âge sera de : A 6 jours, 5 minutes maximum, dans 4 tests des réflexes moteurs du nouveau-né. A 7 jours, 10 minutes maximum, dans un test de mémoire olfactive. A 18, 30 et 60 jours de vie, 10 minutes maximum dans des tests d’activité locomotrice et de réflexes moteurs. A 19, 31 et 61 jours, 66 minutes maximum, dans un test de mémoire visuelle et spatiale. A 20, 37 et 67 jours, 30 minutes maximum, dans un test évaluant l’anxiété et le comportement répétitif, des traits comportementaux communs à beaucoup de formes de TSA. A 21 jours, 5 minutes maximum, dans un test d’interaction sociale. De 32 à 34 jours de vie et de 62 à 64 jours, 16 minutes maximum, dans un test mesurant la capacité à résoudre un problème. A 38 et 68 jours, 15 minutes maximum, dans un autre test d’interaction sociale, évaluant aussi la mémoire sociale. Ces tests dureront entre 15 secondes et 30 minutes chacun par animal. Pour les tests de comportement avant sevrage, les souriceaux et leur nid seront séparés de la mère pendant 30 minutes maximum. Pour chaque test individuel, un souriceau sera séparé du reste de la portée pendant 15 minutes maximum. Après sevrage, les souriceaux seront séparés de leurs congénères pendant 30 minutes maximum. Enfin, ces tests seront répétés maximum 3 fois au cours du temps entre 6 et 68 jours de vie, à l’exception du test réalisé à 7 jours et celui réalisé à 21 jours. Ces interventions seront réalisées dans l’EU1, sauf pour 128 souris à 25 jours (moitié mâle, moitié femelle) parmi les 640 souriceaux du projet, transportées de l’EU1 à l’EU2.Le prélèvement de fèces, la mise à mort et le prélèvement d’organes de ces souris s’effectueront à 38 jours de vie dans l’EU2.
Impact sur les animaux
Lors des tests comportementaux avant le sevrage, l’ensemble de la portée sera séparé de la mère pendant 30 minutes maximum, ce qui pourrait provoquer un stress chez les souriceaux. Pour chaque essai comportemental individuel, chaque souriceau sera séparé du reste de la portée pendant une période maximale de 15 minutes, ce qui pourrait induire un stress supplémentaire. De plus, des fèces seront prélevés pour chaque souriceau placé dans un contenant individuel lors de la pesée hebdomadaire et un stress pourrait être induit pendant quelques minutes lors de cette pesée. Par ailleurs, un risque de fausse route ou blessure de l’œsophage peut survenir lors du gavage des mères et des petits de 22 jours. Enfin, le transport peut engendrer un stress éventuel.
Devenir
Les mères seront mises à mort après sevrage de leurs souriceaux car leur microbiote a été modifié et ne pourront pas être utilisées dans d’autres projets ni réintégrées dans l’élevage. Pour la même raison, les souriceaux en surnombre qui n’ont pas servis à équilibrer les portées moins nombreuses, seront mis à mort. Les souriceaux inclus dans le projet seront mis à mort pour des prélèvements d’organes d’intérêt.
Remplacement
Ce projet consiste à transférer le microbiote fécal d’enfants grands prématurés à des souris. Ce modèle animal permettra de déterminer si le microbiote intestinal a des effets sur la santé, et notamment sur le développement cérébral et le comportement des souris. L’utilisation d’animaux dans ce projet est donc indispensable pour cette étude, car il n’existe pas à ce jour de modèles informatiques ou de méthodes de laboratoire pour répondre à cette question scientifique de manière globale et complète.
Réduction
Au préalable, des échantillons de microbiote humain de bébés prématurés auront été sélectionnés selon des critères cliniques spécifiques, liés notamment au développement cérébral de l’enfant, correspondant le mieux à nos objectifs scientifiques. Par ailleurs, ces expérimentations seront réalisées de manière égale chez la progéniture mâle et la progéniture femelle en utilisant tous les animaux d’une portée, de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés du projet. Un test de puissance statistique nous a permis de calculer, à partir de données comportementales précédentes, le nombre minimal d’animaux nécessaires dans le projet. Pour la colonisation avec un échantillon de microbiote humain donné (1 groupe d’animaux), 16 souriceaux par sexe + 8 souriceaux par sexe (servant uniquement de souris inconnues pour les souris testées dans un test d’interaction sociale), seront nécessaires. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Seront ajoutés les éléments suivants dans chaque cage : un tunnel transparent en plastique, des bâtons en bois à ronger, du matériel de nidification et du papier absorbant. Lors des tests comportementaux réalisés avant sevrage, les souriceaux seront séparés de la mère mais seront conservés avec l’ensemble de la portée dans une cage différente pendant la durée de chaque test. Cette cage contiendra de la litière de la cage d’origine ainsi que du matériel de nidification et du papier absorbant déchiqueté par la mère. Après chaque test comportemental, l’ensemble de la portée sera replacé rapidement dans la cage d’origine avec la mère. Lors du change hebdomadaire de la cage, une petite partie de la litière et le nid établi par la mère seront conservés pour éviter tout rejet de la portée. Le bien-être de chaque animal sera surveillé attentivement et régulièrement, et chaque animal sera pesé une fois par semaine. Des points limites adaptés seront mis en place et appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure. Pour le transport, les animaux seront transférés en cage de transport avec leurs congénères initiaux pour ne pas provoquer un stress supplémentaire dû à l’isolement ou à la cohabitation avec des nouveaux congénères. Les animaux seront transportés dans une boite de transport stérile à laquelle sera ajoutée de la litière propre mais aussi de la litière et le nid établi dans la cage d’origine, des bâtons à ronger et du matériel de nidification et de la nourriture provenant de leur cage d’hébergement. Ils seront ensuite emmenés jusqu’à l'EU2 dans un véhicule agréé climatisé (40 min de transport) et seront maintenus au repos 2 semaines avant l’euthanasie pour prélèvement d’organes.
Choix des espèces
Les modèles animaux les plus utilisés pour étudier l’impact d’un microbiote intestinal complexe humain sur le développement et la santé de l’hôte sont les rongeurs. A l’heure actuelle, la souris est le rongeur le plus utilisé dans le cadre de l’étude des interactions entre le microbiote intestinal, les intestins et le cerveau, et permet donc une comparaison fiable par rapport à la littérature actuelle. Plus particulièrement, des souris totalement dépourvues de germes, nées et élevées en conditions stériles, permettront d’étudier l’impact d’un microbiote de prématuré humain sur le développement et la santé des souris. Les souris seront utilisées du stade néonatal (6 jours de vie) jusqu’à l’âge adulte (70 jours) puisque nous souhaitons déterminer si les premiers micro-organismes du microbiote intestinal représentent un facteur de risque déterminant pour le développement cérébral.
Étude du rôle des pièges extracellulaires des neutrophiles dans la progression tumorale du cancer de la peau induite par les ultraviolets dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 140 souris sans poils vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont exposées aux ultraviolets B trois fois par semaine pendant trente semaines, jusqu'à développer des tumeurs de la peau, et reçoivent jusqu'à 210 injections quotidiennes dans l'abdomen ou 90 injections d'anticorps. Le porteur décrit des rougeurs, des irritations, de rares ulcérations et des tumeurs "généralement bien tolérées", tout en admettant que des masses de taille importante peuvent gêner les déplacements. Il indique avoir choisi une souche dépourvue de poils pour éviter le rasage et garantir une exposition uniforme, et affirme que les modèles in vitro déjà utilisés ne reproduisent pas la complexité des tissus vivants.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines molécules de l'immunité innée, un système de défense naturel du corps, peuvent contribuer à l'aggravation des cancers de la peau. Nous nous concentrons sur des traitements potentiels pour ralentir ou stopper la progression tumorale. Les recherches portent sur des cancers de la peau causés par des expositions prolongées aux Ultraviolets B, qui sont un facteur clé du développement de ce type de cancer chez l’être humain. En laboratoire, nous avons observé que certaines molécules de l'immunité innée favorisent le développement des tumeurs. Nous voulons maintenant confirmer ces résultats en utilisant un modèle chez la souris, ou les souris sont exposées aux Ultraviolets B trois fois par semaine pendant 30 semaines (à raison de 2 minutes par exposition) afin de tester différentes drogues capables d'inhiber ces molécules. L’objectif final est de vérifier si ces traitements peuvent réduire efficacement la progression des cancers de la peau, ouvrant ainsi la voie à de nouvelles options thérapeutiques pour les patients.
Bénéfices attendus
Si ce projet aboutit, il pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour traiter les cancers de la peau et, plus largement, améliorer la compréhension des mécanismes qui favorisent le développement des tumeurs dans d’autres maladies. Les résultats pourraient permettre de développer des traitements ciblant des molécules spécifiques de l’immunité innée, offrant ainsi des options innovantes pour ralentir ou stopper la progression des cancers. De plus, ce projet contribuera à enrichir les connaissances scientifiques sur le rôle de ces molécules dans la formation des tumeurs, ce qui pourrait bénéficier à la recherche sur d’autres types de cancers.
Procédures
- Injections intrapéritonéale : 20 secondes x nombre d’injection (quotidien pour les inhibiteurs soit 210 injections, 3 fois par semaine pour les anticorps, soit 90 injections) par animal. Une rotation des sites d’injections sera effectuée à chaque injection. - Manipulation pour prise de poids : 15 secondes par animal, ce qui est le temps nécessaire pour prendre la souris, la poser sur la balance, reporter son poids et la reposer dans sa cage.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de cette étude, certaines interventions peuvent entraîner des effets indésirables sur les animaux. L’exposition répétée aux UVB peut provoquer des rougeurs ou des irritations cutanées, et des ulcérations superficielles peuvent apparaître dans de rares cas. Les tumeurs cutanées développées dans ce modèle sont généralement bien tolérées. Cependant, elles peuvent, dans certains cas, entraîner un inconfort, pouvant se manifester par une modification de la posture ou une réduction de l’activité. Des tumeurs de taille importante pourraient également affecter les déplacements des animaux. Les injections intrapéritonéales prévues dans le protocole peuvent provoquer des réactions locales comme des rougeurs temporaires. Par ailleurs, en réponse à l’exposition aux UVB et à l’évolution tumorale, certains animaux pourraient présenter une perte d’appétit ou une réduction de leur activité.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des tumeurs et l’analyse post mortem des échantillons. Les tumeurs primaires, ainsi que les tissus environnants, seront prélevées pour des analyses histologiques et biochimiques afin de répondre aux objectifs scientifiques du projet. Les critères d’analyse incluront : 1. La taille et le nombre des tumeurs pour évaluer la progression tumorale. 2. La présence de cellules immunitaires dans les lésions tumorales, afin de confirmer leur implication dans le développement des cancers. 3. La fibrose tumorale, qui correspond à l'épaississement et au durcissement des tissus autour de la tumeur, pour comprendre comment ces transformations du tissu peuvent favoriser la croissance et la progression de la tumeur. Ces analyses permettront de valider ou d’infirmer les hypothèses du projet, notamment en ce qui concerne l’efficacité des inhibiteurs et anticorps testés pour ralentir ou stopper la progression des tumeurs. En résumé, la mise à mort des animaux est essentielle pour atteindre les objectifs expérimentaux, tout en garantissant que les animaux ne subissent aucune souffrance inutile à l’issue de la procédure.
Remplacement
Pour comprendre le développement des cancers de la peau, nous avons d'abord utilisé des modèles en laboratoire sans recours aux animaux (modèles in vitro). Ces travaux ont montré que certaines cellules du système immunitaire, appelées neutrophiles, jouent un rôle dans la progression des tumeurs. Cependant, ces modèles ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions qui existent dans les tissus vivants, comme celles entre les cellules cancéreuses, les cellules immunitaires et les modifications des tissus environnants. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux est nécessaire pour ce projet.
Réduction
Nous avons soigneusement calculé le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats fiables. Les tests statistiques préalables et les données obtenues en laboratoire nous ont permis d’optimiser le design expérimental afin de limiter l’utilisation des animaux tout en garantissant la validité scientifique. De plus, des résultats déjà publiés sur des modèles similaires nous aident à prévoir la progression de la maladie, réduisant ainsi le nombre de souris nécessaires. Ainsi un nombre de 10 souris par groupes sera nécessaire pour tester nos hypothèses. Un total de 1140 souris sera ainsi utilisé pour tester toutes nos hypothèses scientifiques.
Raffinement
Des mesures spécifiques seront mises en place pour garantir le bien-être des animaux tout au long de l’expérience. Les souris utilisées seront hébergées dans des conditions optimales, dans des cages ventilées et enrichies, afin de minimiser leur stress. Les manipulations, comme les injections, seront effectuées avec soin, souvent sous anesthésie pour réduire la douleur. Une surveillance régulière (trois fois par semaine) permettra de détecter rapidement tout signe de mal-être, et une fiche d’évaluation sera utilisée pour assurer un suivi rigoureux. Si un point limite est atteint, l’animal sera immédiatement retiré de l’étude de manière éthique.
Choix des espèces
Nous cherchons à comprendre le rôle système immunitaire, dans le développement de certains cancers de la peau. L’utilisation de souris comme modèle d’étude est pertinente car elles partagent de nombreuses similitudes avec l’être humain, notamment dans leur réponse immunitaire et leur réaction au stress causé par les ultraviolets. Nous avons choisi une souche de souris sans poils, particulièrement adaptée aux études d’exposition chronique aux ultraviolets. Leur absence de poils permet une exposition uniforme à la lumière, évitant ainsi le stress lié à des manipulations supplémentaires comme le rasage. Ces souris sont également connues pour leur sensibilité à développer des cancers sous l’effet des ultraviolets, ce qui garantit des résultats fiables et reproductibles. L’exposition aux ultraviolets sera réalisée sur des souris âgées de 7 à 9 semaines, une période correspondant à leur maturité physique initiale. Cela permet de reproduire des conditions similaires à celles observées chez l’adulte humain, où les mécanismes de développement des cancers de la peau sont comparables. Nous nous concentrons uniquement sur l’étude de ces cancers chez l’adulte, car les réactions tumorales et immunitaires diffèrent chez les jeunes ou les animaux âgés. Les prélèvements des tumeurs auront lieu au plus tard 30 semaines après le début des expositions (a raison de 3 expositions de 2 minutes par semaine) ou dès que des critères définis dans le protocole seront atteints. Les souris seront euthanasiées avant tout prélèvement, conformément aux normes éthiques en vigueur. Ce modèle garantit une étude rigoureuse des mécanismes liés aux cancers de la peau, tout en permettant des résultats applicables à la physiopathologie humaine.
Impact d’amyloïdes protecteurs sur la pathologie Alzheimer chez des souris transgéniques de la maladie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Des souris transgéniques destinées à l'étude de la maladie d'Alzheimer subissent toutes une chirurgie du crâne de 30 minutes pour recevoir un produit qui induit la maladie. 3 441 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. Après un prélèvement de queue pour le génotypage, certaines subissent une seconde chirurgie du crâne pour recevoir un médicament, et une partie reçoit un médicament par injection dans une veine à trois mois. Le porteur prévoit une perte de mémoire légère, des crises d'épilepsie fugaces chez certaines souris et des évaluations comportementales qu'il ne détaille pas. Les reproducteurs qui donnent naissance aux souris d'expérience sont tués en fin de période de fertilité.
Objectifs
Dans le monde, les maladies neurodégénératives touchent 55 millions de personnes avec plus de 10 millions de nouveaux cas par an. Elles sont la 7ème cause de décès et la première cause d’invalidité et de dépendance chez les personnes âgées. Parmi elles, la maladie d’Alzheimer (MA) représente 60 à 70% des cas. La MA, est une maladie du sujet âgé, dont le premier facteur de risque est le vieillissement. Actuellement, seuls des traitements à visée symptomatique sont disponibles ; c’est-à-dire qu’ils ne traitent pas la maladie mais masquent certains déficits comportementaux. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouveaux médicaments visant à traiter efficacement cette pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra mettre en évidence de nouveaux traitements dans la lutte contre la maladie d'Alzheimer.
Procédures
L'ensemble des animaux seront soumis à des prélèvements de queue pour génotypage (1 fois par souris, durée de l'acte : 1 seconde), une chirurgie au niveau du crâne afin de pouvoir injecter un produit qui induit la maladie d'Alzheimer (âge adulte, durée de la chirurgie : 30 minutes). Certains animaux recevront une deuxième chirurgie au niveau du crâne pour administrer un médicament (âge adulte, durée de la chirurgie : 30 minutes). Une partie des animaux recevra un médicament injecté dans les veines pour traiter la maladie d'Alzheimer (à 3 mois, duré de lacte : moins d’une minute).
Impact sur les animaux
Lors de la procédure d'élevage, un stress lors de la contention des animaux afin de réaliser le tatouage et le génotypage peut être généré. L’induction de la pathologie Alzheimer peut conduire à une perte de mémoire légère et certaines souris peuvent développer des crises d’épilepsie fugaces. La chirurgie peut conduire à une légère perte de poids transitoire (de 48 à 72h).
Devenir
Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort à la fin de l’étude, c’est-à-dire à la fin des procédures expérimentales, afin de récupérer le cerveau pour des analyses histologiques. Les animaux reproducteurs utilisés pour générer les souris d'expérimentation seront euthanasiés en fin de période de fertilité.
Remplacement
La maladie d'Alzheimer est une pathologie qui touche de façon très intégrée le système nerveux central et altère les fonctions cognitives et comportementales des patients. L’hypothèse que nous posons vise à identifier le potentiel thérapeutique de certains produits pouvant conduire à l’amélioration des troubles cognitifs et comportementaux. A ce niveau d’intégration, seuls des tests in vivo sur animaux vigiles peuvent répondre à cette question. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, les études in vitro et in silico ne permettent pas à l’heure actuelle de prédire l’efficacité d’un traitement sur l’amélioration de troubles cognitifs. De plus, le nombre et la complexité des mécanismes mis en jeux dans la propagation des protéines altérées dans le cerveau ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez la souris. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Sur la base de notre expérience de ce modèle, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce modèle présente une variabilité importante en ce qui concerne les résultats obtenus lors des évaluations comportementales ou des observations neuroanatomiques post-mortem (propagation de la protéine notamment). Cette variabilité, bien que comparable à ce qui se passe dans la réalité clinique, entraine l’utilisation d’un nombre important d’animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe de 2 à 5 individus, nourris ad-libitum, et ayant accès à l'eau à volonté, dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation permettra de garantir leur bien-être et de mettre en œuvre des traitements appropriés si besoin. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Les protocoles de chirurgies ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Des points limites précoces précis et stricts ont été définis. Des échelles cliniques, un soutien nutritionnel adapté et l’application de critères d’arrêts basés sur les points limites permettent de veiller au bien-être des rongeurs. Les animaux bénéficieront de périodes de récupération suffisantes après les anesthésies générales et les gestes chirurgicaux.
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront des souris modèles de la maladie d'Alzheimer. La souris est l’espèce animale qui a été et est encore la plus étudiée dans le domaine des maladies neurodégénératives notamment dans le cadre de développement de médicaments. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les performances de mémoire et les effets d’un médicament sur le développement dans la MA. La maladie se déclare la plupart du temps chez le sujet âgé, mais des déficits discrets apparaissent longtemps en amont du diagnostic. Nous étudierons donc les souris à un temps précoce et à un temps tardif pour refléter les effets observés en début et en fin de maladie, soit entre 4 et 11 mois.
Etudes des circuits neuronaux et des dynamiques corticales impliqués dans les crises audiogéniques chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
À 18 jours de vie, puis chaque jour pendant une semaine à partir de 23 jours, des souris sont exposées à un son qui déclenche aussitôt une crise convulsive, et certaines subissent dix expositions déclenchant des crises, jusqu'à trois par jour. 370 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi une injection dans le cerveau sous anesthésie à 1 ou 3 jours de vie, puis à 56 jours une chirurgie de deux à trois heures qui perce quatre orifices dans leur crâne, et une partie passe des séances quotidiennes d'imagerie d'une à deux heures, tête fixée, sur 31 jours. Le porteur prévoit qu'une crise peut entraîner une "douleur musculaire modérée et de courte durée", et affirme qu'il n'y a "pas de souffrance pendant la crise du fait de la perte de connaissance". Il écrit que les souris, toutes tuées à la fin de chaque procédure, ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées, et annonce que "Certains animaux utilisés pour un type d'expériences seront réutilisés pour un autre type d'expériences".
Objectifs
Le but du projet est d’approfondir la connaissance des mécanismes par lesquels une stimulation sensorielle peut déclencher une crise épileptique. Ce phénomène est bien connu dans les épilepsies humaines, avec notamment le principe de photosensibilité (déclenchement d’une crise après stimulation lumineuse intermittente), qui reste mal compris, notamment en ce qui concerne le site cérébral, où se réalise ce processus et où est générée la décharge épileptique. Les dynamiques d’activation lors d’une crise déclenchée par un son sont également mal élucidées. Ce projet permettra d’étudier comment une perception sensorielle conduit à la génération d’une activité neuronale pathologique. Une meilleure connaissance de ces mécanismes aidera à identifier des structures anatomiques à cibler dans le cadre de protocoles de neurostimulation, actuellement en plein essor dans la prise en charge des patients souffrant d’épilepsie. Enfin, ces résultats pourraient aider à comprendre au sens plus large d’autres mécanismes d’intégration sensorielle neurologique pathologiques, observés par exemple dans la migraine, les acouphènes, ou encore l’hyperacousie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus dans le domaine médical et clinique sont une meilleure connaissance des épilepsies dites « réflexes » (déclenchées par une stimulation sensorielle), incluant des phénomènes tels que celui de photosensibilité, bien connu dans les épilepsies humaines (déclenchement d’une crise après stimulation lumineuse intermittente). L’ensemble de ces épilepsies avec composante réflexe représente environ 5% des épilepsies (soit environ 30 à 50.000 patients en France) bien que ce chiffre soit probablement sous-estimé par défaut d’évaluation systématique. Les déterminants physiopathologiques des épilepsies réflexes sont encore mal connus, en particulier en ce qui concerne le site anatomique d’où sont générées ces crises, et les dynamiques d’activation et de propagation neuronale. Une meilleure connaissance de ces mécanismes aidera à identifier, à long terme, des structures anatomiques à cibler dans le cadre de protocoles de neurostimulation (invasive ou non invasive), actuellement en plein essor dans la prise en charge des patients souffrant d’épilepsie. Ceci impliquera au préalable une phase de translation de ces résultats aux patients, par exemple via l’imagerie fonctionnelle ou d’autres études invasive ou non-invasive. Enfin, ces résultats pourraient aider à comprendre au sens plus large d’autres mécanismes d’intégration sensorielle neurologique pathologiques, observés par exemple dans la migraine, les acouphènes, ou encore l’hyperacousie.
Procédures
Les souris seront soumises à: - une exposition sonore à l’âge de 18 jours, pour une durée maximale de 60 secondes (un jour) - une exposition sonore à l’âge de 23 jours, quotidienne pendant 7 jours, pour une durée maximale de 60 secondes. Ces expositions sonores déclenchent une crise convulsive immédiatement après l’exposition. - une procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie à l’âge de 1, 3 et 56 jours. La durée de la chirurgie est de 2 à 3 heures. - pour certains 10 expositions sonores déclenchant des crises convulsives. Chaque animal subira un maximum de 3 crises par jour. -pour certains animaux des sessions d’1 à 2 heures d’imagerie en contention, quotidiennes sauf le weekend sur 31 jours, après une phase d’entraînement à la contention de 7-15 jours. Les nuisances attendues sur les souris sont essentiellement liées au stress généré par les expositions sonores et les crises épileptiques, ainsi qu’aux lésions réalisées lors des gestes chirurgicaux et aux douleurs que celles-ci peuvent entraîner.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les souris sont : -L’exposition sonore à une intensité contrôlée peut entraîner une douleur légère de courte durée (durée maximale de 60 secondes) -La survenue d’une crise convulsive après l’exposition sonore ou la stimulation lumineuse peut entraîner dans les suites une douleur musculaire modérée et de courte durée (pas de souffrance pendant la crise du fait de la perte de connaissance). Les souris ne subiront pas plus de 3 crises par jour. -L’injection de certains composés à l’âge de 1 ou 3 jours se fait sous anesthésie et analgésie mais peut entraîner des douleurs post-opératoires légères et de courte durée. -La réalisation de 4 orifices crâniens à l’âge de 56 jours se fait sous anesthésie et analgésie mais peut entraîner des douleurs post-opératoires légères pendant 1 à 2 jours selon les observations faites dans des protocoles similaires. -Pour certains animaux, la réalisation une autre chirurgie craniale se fait sous anesthésie et analgésie et peut entraîner des douleurs post-opératoires modérées pendant 1 à 2 jours. -Pour certains animaux, la réalisation de sessions d’imagerie en contention, tête fixée, sur une durée maximale de deux heures par jour pendant 31 jours, peut entraîner un inconfort modéré pendant la durée de la contention. -Le maintien en place d’un dispositif crânien pour envelopper les électrodes intracrâniennes peut entraîner une gêne légère pour les souris, sur une durée totale d’1 à 2 mois.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet ces animaux auront subi des procédures invasives ne permettant pas de réutiliser les animaux au-delà des expériences décrites ci-dessus et auxquelles ils ont été initialement destinés, ni de les adopter en dehors de ce contexte expérimental.
Remplacement
Les outils modernes d’imagerie optique que nous utiliserons permettent d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, permettant de traiter un grand ensemble de données avec un minimum d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés est aussi minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal. Le nombre d’animaux utilisé est donc essentiellement déterminé par la nécessité de mesurer des différences statistiques significatives pour la comparaison des groupes de souris. Certains animaux utilisés pour un type d’expériences seront réutilisés pour un autre type d’expériences. L’utilisation de tests statistiques sur échantillons appariés (lorsque nous compareront la fréquence de survenue de crise audiogène entre un animal stimulé et non stimulé, par exemple) permet de réduire le nombre de sujet nécessaire, chaque animal étant son propre témoin.
Réduction
Les outils modernes d’imagerie optique que nous utiliserons permettent d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, permettant de traiter un grand ensemble de données avec un minimum d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés est aussi minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal. Le nombre d’animaux utilisé est donc essentiellement déterminé par la nécessité de mesurer des différences statistiques significatives pour la comparaison des groupes de souris. Certains animaux utilisés pour un type d’expériences seront réutilisés pour un autre type d’expériences. L’utilisation de tests statistiques sur échantillons (lorsque nous compareront la fréquence de survenue de crise audiogène entre un animal stimulé et non stimulé, par exemple) permet de réduire le nombre de sujet nécessaire, chaque animal étant son propre témoin.
Raffinement
L’utilisation de protéines excitables par stimulation lumineuse à travers la boîte crânienne permet d’éviter une procédure de chirurgicale additionnelle. Pour toutes les procédures chirurgicales, plusieurs mesures supplémentaires seront prises. Pendant la chirurgie, une réhydratation sera mise en place. Le volume de réhydratation sera ajusté en fonction de la durée de la chirurgie. Après la chirurgie, les animaux en récupération sont placés en cage de réveil sur une plaque chauffante, puis replacés dans leur cage qu’il sera possible de continuer à chauffer par des chaufferettes, et reçoivent une analgésie supplémentaire. De l’eau gélifiée sera ajoutée dans les cages suite à la chirurgie pour faciliter l’hydratation des souris. L’environnement de la cage sera enrichi. Les animaux sont suivis quotidiennement, s’il y a des signes de douleur, des doses d’antalgiques sont ajoutées, s’il y a des signes d’infection un traitement antibiotique est mis en place. La phase de récupération est de 7 jours au minimum pendant lesquelles l’animal n’est pas manipulé sauf pour le suivi post-opératoire en première semaine. Des points limites spécifiques et précoces sont définis, entrainant l’arrêt de l’expérience ou la mise à mort si les traitements associés ne permettent pas de diminuer la douleur ou l’inconfort sous 24h. Ils sont basés sur des indicateurs de poids, la persistance pendant plus de deux jours d’une réduction de la mobilité avec dos voussé, d’une piloérection marquée, d’un manque de toilettage ou toilettage excessif ; ou encore la survenue de signes de détresse. Lors d’une crise épileptique prolongée au-delà de 2 minutes, l’animal sera placé sous un masque à oxygène. Pour diminuer le stress et l’angoisse pendant l’imagerie en contention, nous avons mis en place un protocole d’habituation progressive. La souris est placée en contention le premier jour pendant 30min puis le second et le troisième jour pendant 1h. Si à la fin de l’entrainement l’animal montre des signes de stress et d’angoisse, l’animal sera ré-entrainé le jour suivant au palier inférieur et le protocole décalé en fonction. Si ces signes perdurent l’expérience sera arrêtée pour l’animal.
Choix des espèces
Ce projet implique l’utilisation d’organismes vivants dotés d’un système nerveux central permettant l’intégration des perceptions sensorielles. Ces organismes vivants doivent par ailleurs pouvoir présenter des crises épileptiques. La souris est un modèle adapté qui répond à ces deux critères. Par ailleurs, l’utilisation de souris comme modèle animal est nécessaire pour permettre l’application des outils de manipulation ciblée des circuits neuronaux qui nous permettront d’avancer dans la compréhension des mécanismes de l’épilepsie. Ces outils sont mieux établis chez cet animal que dans d’autres espèces. Par ailleurs le modèle souris possède un système auditif similaire à l’homme et est suffisant pour l’exploration de mécanismes fondamentaux. Le stade de développement est un point crucial dans la susceptibilité des souris aux crises audiogènes. La susceptibilité maximale des souris étudiées à la procédure de « priming » (procédure qui confère la susceptibilité aux crises audiogènes après une exposition à un son bref et intense au cours de leur développement) entre 13 et 25 jours post-natal, et idéalement au 18ème jour. Il existe également une fenêtre temporelle de susceptibilité au « kindling » (expansion progressive du réseau épileptique par expositions sonores répétées) se situant entre le 21ème et le 30ème jour post-natal. Ainsi, nous réaliserons le « priming » au 18ème jour et le « kindling » au 23ème au 30ème jour. Une injection intracérébrale sera réalisé chez le souriceau à P1-P3, sous anesthésie générale, pour permettre une expression homogène et diffuse. La procédure chirurgicale principale sera réalisée à la 8ème semaine post-natale, et les expériences d’activation ou d’inhibition des différentes structures, couplées à la neurophysiologie, seront réalisées 5 semaines plus tard (environ 13ème semaine post-natale).
Etude du rôle des convertases, Furin et PC7 dans le recrutement des cellules du sytème immunitaire par les tumeurs
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Toutes tuées pour collecter leurs tumeurs et leurs organes, 5 609 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 2 912 d'entre elles sont tatouées aux phalanges ou aux coussinets entre 7 et 12 jours de vie et subissent un prélèvement du bout de la queue pour le génotypage, 1 680 reçoivent une greffe de cellules tumorales, et 1 008 sont opérées pendant 20 minutes pour induire des métastases dans le foie. Le protocole prévoit aussi des chimiothérapies trois fois par semaine, des irradiations des tumeurs et des séances d'imagerie par bioluminescence une à deux fois par semaine. Le porteur écrit que l'utilisation de la souris est "indispensable" pour comprendre l'action de deux enzymes dans un "organisme entier proche de l'homme". Pour l'analyse de survie, des groupes de 14 souris sont suivis jusqu'à l'atteinte de points limites.
Objectifs
Le système immunitaire joue un rôle important dans la mise en place et le développement des cancers. Notre projet vise à déterminer le rôle des protéines convertases (PCs) dans le recrutement du système immunitaire par les tumeurs. Les PCs sont des enzymes dont les quantités sont fortement augmentées dans de nombreux cancers et qui sont impliquées dans la progression des tumeurs et l’établissement des métastases. De plus, dans le cancer du colon les PCs sont nécessaires à la régulation de l’activité des cellules immunitaires que sont les lymphocytes T. Dans ce projet, nous souhaitons identifier précisément quelles convertases jouent un rôle dans le recrutement des cellules du système immunitaire par les tumeurs, nos candidats sont la Furine et PC7. Pour mettre en œuvre ce projet, nous créerons une lignée de souris génétiquement modifiées qui n’exprimeront ni PC7, ni la Furine dans les lymphocytes T. Ce nouveau modèle nous permettra de définir le rôle de PC7 et de la Furine dans la progression tumorale et l'adaptation des cellules immunitaires.
Bénéfices attendus
Les protéines sont des molécules biologiques présentes dans toutes les cellules vivantes. Lors de leur synthèse, elles peuvent nécessiter des modifications pour devenir actives biologiquement. Ces modifications sont mises en œuvre par les PCs et jouent un rôle important dans dans l’acquisition des caractéristiques cancéreuses des cellules, et dans l'adaptation du système immunitaire. Ce projet amènera à une meilleure compréhension du rôle des PCs , PC7 et Furine dans l'établissement des tumeurs. Nous nous intéressons plus particulièrement à ces deux convertases car des inhibiteurs spécifiques pourraient être utilisés comme de nouvelles thérapies ciblées seuls ou en combinaison avec des agents déjà existants et/ou la radiothérapie pour le traitement de certains cancers.
Procédures
2912 animaux seront soumis à deux gestes invasifs consécutifs pour être tatoués et génotypés par le personnel qualifié et expérimenté de notre établissement utilisateur: 1/ Identification par tatouage digital (réalisé une fois et durée de quelques secondes) et 2/ biopsie de la queue (réalisé une fois et durée de quelques secondes). Pour l'étude de la prolifération tumorale nous implanterons des cellules tumorales d'adenocarcinomes chez 1680 animaux. Les injections auront lieu une fois et durent 5 minutes. Les traitements avec la chimiothérapie seront faits 3 fois par semaine et durent moins d'une minute. Les traitements par irradiation des tumeurs durent entre 3 et 15 minutes et sont répétées deux fois à deux jours d'intervalle. Enfin le modèle de métastases hépatiques nécessitera une chirurgie réalisée sur 1008 animaux en 20 minutes par souris, une seule chirurgie par animal. Le suivi des tumeurs par bioluminescence dure entre 6 et 25 minutes, une à deux fois par semaine.
Impact sur les animaux
Le génotypage est composé de deux actes techniques invasifs, le tatouage au niveau des phalanges et/ou des coussinets et la biopsie de la queue qui consiste en un prélèvement de l'extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une très légère douleur. L'animal est maintenu en contention pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure ce qui est une source de stress. Le développement de tumeurs ou de metastases hépatiques peuvent générer des souffrances se manifestant par des pertes d’appétit donc de poids, des signes physiques ou moteurs. L'irradiation peut induire des irritations locales pour les tumeurs sous-cutanées. Toutes les douleurs liées au protocole seront prises en charge et des mesures compensatoires seront appliquées.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. Les tumeurs et les organes seront collectés pour analyses immunohistochimiques, transcriptomiques et protéomiques.
Remplacement
Des tests sur des cellules tumorales et des cellules immunitaires en culture in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de l'inhibition de PC7 et de la Furine. Nous avons aussi utilisés des organoides pour intégrer une structure tridimensionnelle à nos cultures de cellules tumorales ainsi que des co-cultures (cellules tumorales et cellules immunitaires). Cependant, l’utilisation de modèles in vivo comme la souris est indispensable à la compréhension des mécanismes d’action des PCs dans un organisme entier proche de l'homme, incluant lors du développement tumoral, le microenvironnement, les contraintes physiques, le système vasculaire et le système immunitaire, qui ne sont pas retrouvés in vitro. Cette étape est également nécessaire puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme comme thérapie.
Réduction
Les études statistiques seront réalisées pour comparer 4 groupes ( WT, Furin Fl/Fl*CD4-Cre+, PC7 KO/KO et PC7 KO/KO*Furin Fl/Fl*CD4-Cre+). Afin de limiter le nombre d'animaux, tous les individus porteurs d'un génotype d'intérêt seront utilisés dans nos expériences de prolifération tumorale mais aussi pour des approches in vitro réalisées à partir de prélèvements post-motem (comme par exemple l'isolation des cellules immunitaires à partir de la rate ou de la tumeur). Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons calculé le nombre minimal de souris par groupe pour atteindre une puissance statistique satisfaisante qui correspond à 14 souris ( 7 mâles et 7 femelles) pour l’analyse de survie par le test de Kaplan-Meyer (atteinte de points limites). Nous prévoyons de répéter 3 fois les expériences, avec des lots de 14 souris pour les implantations sous-cutanées. Le sexe des animaux n'ayant pas d'influence sur nos résultats, nous utiliserons des animaux femelles et mâles
Raffinement
Le bien-être de l’animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos reproductions et expériences, mais également à la reproductibilité de nos résultats. Les animaux sont hébérgés dans des cages aux normes (au minimum 2 par cage et 5 au maximum) suivant l'âge et le poids des animaux. Des enrichissements (maisons rouges, jouets) sont présents dans les cages. Au cours de nos expériences, un suivi attentif quotidien des animaux est fait par du personnel compétent et formé, weekend, vacances et jours fériés compris. Les animaux en expérimentation sont pesés un fois par semaine, dès qu'une perte de poids est observée, du nursing et une pesée quotidienne est mis en place. Une fiche de suivie des animaux est remplie par le personnel de l'animalerie. Des mesures compensatoires sont prises si nécessaires. En revanche si l'état de l'animal malgré les mesures compensatoires ne s'améliore pas, le responsable de projet décidera de l'arrêt de l'expérience pour cet animal. Au moindre doute, nous ferons appel aux conseils de notre vétérinaire ou de la structure du Bien-Etre Animal (SBEA). Des injections d'analgésique pourront être réalisées et renouvelées en fonction de la souffrance de l'animal. Des tapis chauffants seront également utilisés dès l’anesthésie des souris, pendant l’opération, et lors de la phase de réveil.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle car c'est un animal de petite taille, facile à héberger et à manipuler. Les séquences peptidiques des convertases sont bien conservées entre l'homme et la souris. De plus, l’organisation du système vasculaire de la souris et sa relation avec le microenvironnement tumoral sont très proches de ceux observés chez l’homme. Enfin, nous avons des modèles transgéniques disponibles uniquement chez la souris pour lesquels nous pourrons utiliser des lignées tumorales syngéniques. Les souris seront tatouées et génotypées entre 7 et 12 jours après leur naissance. Dans les expériences d’implantation de cellules tumorales, les souris auront entre 14 et 16 semaines . Ces adultes présentent de bonnes réponses immunitaires et sont faciles à manipuler.
Appétit hédonique : dimorphisme sexuel et rôle du microbiote chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Pour étudier comment l'appauvrissement de la flore intestinale modifie l'appétit pour les aliments sucrés ou gras, et pourquoi l'effet diffère selon le sexe, 1 032 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, toutes tuées à l'issue pour récupérer leurs tissus. Les procédures comprennent un cocktail d'antibiotiques et d'antifongiques qui peut provoquer une inflammation intestinale, des injections sous la peau deux fois par jour pendant quatre semaines, soit 56 par souris, et un gavage de glucose suivi de sept prises de sang à la queue en deux heures. Pour mesurer ce qu'elles mangent, les souris sont isolées jusqu'à quatre semaines, deux au plus pour la majorité. Une perte de 20 % du poids en une semaine constitue un point limite. Le porteur prévoit aussi des tests comportementaux "adaptés au modèle de dépression", dont il écrit qu'ils peuvent être stressants, sans les nommer.
Objectifs
L'appétit, la satiété et les préférences alimentaires sont influencés par le microbiote intestinal. Plusieurs études récentes indiquent que chez la souris, l'absence ou l'appauvrissement du microbiote intestinal augmentent la consommation d'aliments appétents tels qu'une solution de saccharose, des granulés de saccharose ou des aliments riches en lipides avec un effet potentiel du sexe. Dans cette étude, nous évaluerons l’effet de la déplétion du microbiote intestinal dans notre modèle sur les états émotionnels afin de comprendre les facteurs qui sous-tendent le dimorphisme sexuel observé ainsi que le rôle d'une hormone gastro-intestinale dans l’effet de la déplétion du microbiote intestinal sur la prise alimentaire hédonique.
Bénéfices attendus
Les données issues de ce projet contribueront à une meilleure compréhension des influences du microbiote intestinal selon le sexe sur l’appétit hédonique et des mécanismes associés. Cette étude chez l’animal est nécessaire pour permettre d’envisager par la suite des études plus appliquées dans des modèles de troubles du comportement alimentaire par exemple ou chez l’Homme.
Procédures
Le test de tolérance au glucose sera mené sur des animaux vigiles, une seule fois par animal. Une administration intragastrique avec une solution de glucose sera réalisé. Cette intervention prendra de 10 à 15 secondes par animal. Sept prélèvements de sang au niveau de la queue seront réalisés par ponction de la veine caudale afin de recueillir une goutte de sang par prélèvement. La durée de l’intervention (contention, ponction, prélèvement) sera de 30 secondes par animal. Les prélèvements s’étaleront sur deux heures. Des administrations sous-cutanées bi-quotidiennes pendant 4 semaines seront réalisées sur des animaux vigiles, ce qui représente 56 injections par souris. L'injection prendra de 15 à 30 secondes par animal. Les mesures de prise alimentaire nécessitent un isolement des souris. Cet isolement pourra durer jusqu'à 4 semaines. Il n'excèdera pas 2 semaines pour la majorité des souris.
Impact sur les animaux
L’administration d’un cocktail d’antifongique/antibiotiques pour dépléter le microbiote digestif peut induire des modifications de la motilité intestinale, une augmentation de l’hydratation des selles et une inflammation intestinale modérée. L’hébergement en individuel peut engendrer un stress chez la souris. Les tests de tolérance au glucose nécessitent une étape d'administration intragastrique et une ponction de sang au niveau de la veine caudale. Ces actions peuvent entraîner du stress ou de la douleur chez les souris. Les tests comportementaux adaptés au modèle de dépression peuvent être stressant pour les souris. Les autres interventions ne devraient pas entraîner d'autres souffrances ni d'angoisses.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les tissus biologiques, indispensables pour mener les expérimentations en lien avec les questions de recherche du projet.
Remplacement
Cette étude comprenant des mesures neuro-comportementales ne peut être ni réalisée in vitro ni modélisée in silico. Elle nécessite donc l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu a été déterminé grâce à des données issues de la littérature et des travaux antérieurs au sein de l’équipe. Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des analyses statistiques qui permettront de détecter des différences neurocomportementales ou de réponses physiologiques entre les groupes expérimentaux. La réalisation d’une expérience pilote permettra de choisir des doses d’agents pharmacologiques efficaces sur nos paramètres d’intérêt sur un nombre limité d’animaux afin de garantir le succès des procédures concernées. L’utilisation d’un plan d’étude croisé (administration consécutive des différentes doses du traitement au même sujet) permet de limiter le nombre d’animaux utilisés dans l'expérience pilote.
Raffinement
Les souris seront logées en groupe de 4 par sexe, dans des cages enrichies offrant des zones où elles pourront se dissimuler. Un surenrichissement de la cage sera prévu lors des phases d'hébergement individuel (ajout de matériel de nidification supplémentaire et stimulant le comportement exploratoire). De même, les souris seront habituées à l'administration intragastrique et à la contention avant le test de tolérance au glucose. Les souris seront pesées régulièrement, et elles seront toutes observées chaque jour afin de prévenir la survenue d’un potentiel problème. Dès que nécessaire, des analgésiques seront utilisés pour prévenir la douleur. Des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués, comme la perte de poids >20% du poids sur une semaine.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur le comportement alimentaire en raison de ses réponses reproductibles permettant une robustesse des résultats générés. L’abondance des données dans la littérature sur les mécanismes de régulation de la prise alimentaire dans cette espèce permet d’autre part le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). Enfin, nous disposons déjà de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons décidé de travailler sur des individus « jeune adulte » âgées de 7-8 semaines à l’arrivage pour éviter les effets liés au développement d’une part et au vieillissement d’autre part.
Evaluation de l’effet de substances pharmacologiques sur la sensibilité gustative
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 600
600 souris et 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chaque animal voyant son accès à l'eau réduit à une plage de trente minutes à quatre heures par jour, pendant cinq jours. Ils reçoivent les substances testées en une fois ou par perfusion lente, en administration unique ou répétée sur plusieurs semaines, puis leur aversion pour des solutions amères est mesurée. 900 sont tués parce que les effets à moyen et long terme des substances restent méconnus, les 300 animaux témoins pouvant être réutilisés après accord du vétérinaire. L'objet réel est d'ajuster le goût de candidats médicaments pour que les patients suivent mieux leur traitement, bénéfice formulé au conditionnel face à une soif imposée et à des substances qui peuvent provoquer, selon les termes du porteur, une gêne ou une sensation de mal-être.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est de déterminer comment différentes molécules (candidats médicaments en cours de développement) ayant une potentielle interaction avec les récepteurs gustatifs et/ou les voies impliquées dans la perception gustative au niveau du SNC affectent les préférences et les aversions gustatives chez l’animal. La réponse gustative des animaux en présence de ces molécules sera analysée à travers des tests d'aversion (notamment pour des substances amères). En effet, de nombreux médicaments peuvent altérer le goût, influençant ainsi l'appétit et l'adhésion au traitement. En identifiant et en caractérisant ces effets dès les phases de développement, il est possible d'optimiser les formulations médicamenteuses pour minimiser les impacts négatifs sur le goût et le comportement alimentaire.
Bénéfices attendus
En évaluant les effets des candidats médicaments ayant une potentielle interaction avec le goût, il devient possible de concevoir des traitements mieux tolérés, favorisant une meilleure adhésion des patients à leur régime thérapeutique. Une adhésion accrue mène généralement à une efficacité thérapeutique optimisée, améliorant ainsi les résultats de santé pour les patients.
Procédures
La principale intervention subie par les animaux est la préhension des animaux et l'administration des substances d'essais en bolus d'une durée de quelques secondes ou par perfusion lente de quelques minutes.. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours ou quelques semaines en fonction de l’objectif de l’étude. Les animaux ont un accès à l'eau limité de 30 minutes à 4 heures par jour pour une période maximale de 5 jours.
Impact sur les animaux
L'accès à l'eau est limité à une période journalière définie (sessions d'habituation et de test) ce qui peut entrainer une sensation de soif et un stress temporaire. Les manipulations/contentions réalisées notamment pendant les phases d'administration ou de prélèvements peuvent également entrainer un léger stress. Par ailleurs, certaines substances testées peuvent provoquer une gêne ou une sensation de mal-être.
Devenir
Tous les animaux ayant reçu une substance d’essai dont les effets à moyen et long terme sont méconnus seront euthanasiés en fin d’étude afin de s’assurer que le traitement expérimental n’induira pas d’effet délétère sur l’animal. Les animaux contrôles peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire.
Remplacement
Dans le cadre du développement des médicaments, des tests in vitro ont déjà eu lieu avant l'utilisation de l'animal, ce qui constitue un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire. En vue de réduire le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, seules seront testées les molécules qui ont montré un impact potentiel sur la sensibilité gustative.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif si cela s'avère pertinent. Nos données historiques indiquent qu’un effectif de 10 animaux est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) demeurent l'espèce privilégiée pour évaluer les effets de candidats médicaments sur la sensibilité gustative. Les procédures utilisées sont largement décrites dans la littérature. Tous les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage) que ce soient des rats ou des souris, conformément à la littérature.
Vaccination ciblant les composés de surface de Clostridioides difficile dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rendues sensibles par un antibiotique injecté dans l'abdomen, 300 souris de six à sept semaines sont ensuite infectées par gavage avec une souche pathogène de Clostridioides difficile. Les procédures sont classées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à la fin. Elles reçoivent trois injections vaccinales sous la peau et deux prises de sang à la mandibule, avec un recueil de selles tous les deux jours, l'infection provoquant deux à trois jours de diarrhée et une perte de poids de 5 à 15 %. Le porteur justifie la mise à mort par l'infection elle-même et par l'analyse des tissus, et présente la vérification des candidats vaccins chez l'animal comme "exigible réglementairement" avant toute phase clinique.
Objectifs
Clostridioides difficile (C. diff) est la première cause de diarrhées bactériennes associées aux soins chez l’adulte dans les pays développés et en particulier en France (> 24000 cas par an, dont 14 % de formes compliquées). La mortalité associée aux infections à C. difficile (ICD) est de l'ordre de 3%. Les ICD peuvent évoluer sur un mode épidémique avec la survenue de cas groupés d’infection voire de véritables épidémies locorégionales. Elles représentent un coût sanitaire important pour nos sociétés, en raison de l’augmentation des durées moyennes de séjours et des surcoûts liés à leur prise en charge spécifique. Une antibiothérapie est le plus souvent efficace pour traiter une infection liée à C. difficile, mais les rechutes sont fréquentes (environ 20% des patients). La vaccination est la meilleure approche à long terme pour réduire le nombre de ces infections. Le but de cette vaccination est de lutter contre le développement de la bactérie au niveau du tube digestif et donc de réduire les symptômes ainsi que la dissémination de la bactérie dans l’environnement. Les antigènes testés ont démontré in vitro et in silico des qualités requises pour être considéré comme un bon antigène. Il est toutefois nécessaire de réaliser des tests in vivo dans un modèle d'infection chez la souris qui permet d'étudier la réponse immunitaire induite par la vaccination. L'objectif de ce projet est d'obtenir une preuve de concept de l'efficacité in vivo de ces nouveaux antigènes. Une analyse de l’immunité des animaux sera vérifiée avant et après immunisation. L'efficacité vaccinale sera évaluée par le suivi de la présence de la bactérie pathogène dans le tube digestif (par numération de la bactérie dans les fèces des animaux), une analyse de l’inflammation intestinale et ceci sera corrélé à la réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
Le développement de nouvelles méthodes de prévention des infections à C. difficile permettrait d’offrir de nouvelles options thérapeutiques aux patients et limiter le risque d’infections communautaires et nosocomiales et de diminuer la dissémination de cette bactérie pathogène dans l’environnement. Le développement d'un vaccin permettrait de prévenir les infections à C. difficile ou leur récidive. Les antigènes vaccinaux utilisés dans cette étude sont des facteurs impliqués dans la colonisation par la bactérie du tube digestif et des facteurs de virulence. Si une réponse immunitaire efficace est induite lors de ces essais de vaccination, la bacterie sera limitée dans son développement et les symptomes cliniques de l'infection ne seront donc plus visibles.
Procédures
Le modèle nécessite 3 types d’actes expérimentaux à savoir les immunisations par voie sous-cutanée, l’administration par voie orale de C. difficile (un gavage unique durant la procédure, qui dure moins de 10 secondes par animal) et une injection intrapéritonéale d’antibiotique sous anesthésie locale (une seule injection durant la procédure, anesthésie locale par pommade 10 min avant l'injection qui dure moins de 10 secondes). De plus, le recueil de selles fraiches sera réalisé tous les deux jours, sur la durée de l'essai, ce recueil dure moins d'une minute. Le prélèvement de sang sera réalisé par voie submandibulaire sur animaux vigiles mais anesthésiés localement par lidocaïne, 2 prélèvements à J-52 et J-5. Le prélèvement sera réalisé très rapidement (moins d'une minute) par une personne très expérimentée.
Impact sur les animaux
Le modèle nécessite 3 types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale de C. difficile et 3 injections par voie parentérale (sous-cutanée) pour les immunisations, 1 injection intrapéritonéale (moins de 5 secondes) d’un antibiotique et 2 prélèvements sanguins (moins de 10 secondes) par voie submandibulaire. Suite à l’infection, le modèle peut induire des diarrhées allant de 2 à 3 jours et des pertes de poids qui varient entre 5 et 15% du poids initial des animaux. Les nuisances suite aux infections peuvent être considérées comme modérées. Un arrêt de la diarrhée et un retour au poid initial est généralement observé 3 jours après l'infection. La procédure de gavage par voie orale occasionne pour les animaux une angoisse modérée, de courte durée (moins de 5 secondes) ; le prélèvement de fèces n’occasionne aucune douleur mais peut provoquer une angoisse légère (de très courte durée) dans la mesure où il nécessite de manipuler l’animal.
Devenir
Ayant été infectés par une souche pathogène de C. difficile, et en raison de l'interet de l'analyse des prélèvements des tissus, tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.
Remplacement
Plusieurs tests in vitro et in silico ont permis d'évaluer l'intérêt des candidats vaccins. L'étape de vérification de leurs qualités antigéniques in vivo est exigible réglementairement avant toute nouvelle phase de développement clinique. Le recours à l'animal est indispensable pour valider l'effet thérapeutique. La reconstitution des interactions entre, l’hôte, son système immunitaire et les pathogènes sont complexes et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité de ce processus dans son intégralité.
Réduction
Une planification statistique minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés au nombre de 300, tout en préservant la validité statistique de l'étude. Afin de pouvoir conclure à l'issue de ces expérimentations sans avoir besoin de les répéter, 12 animaux par groupe seront nécessaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 5 avec comme enrichissement un tunnel de carton et du papier pour construction de nids. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées de façon hebdomadaire et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. La procédure d'expérimentation sera pratiquée en utilisant des anesthésiques permettant de limiter la souffrance des animaux qui bénéficieront d'une procédure d'euthanasie anticipée et une sortie d'étude prématurée en cas d'atteinte des points limites éthiquement non acceptables. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
La souris est l'animal le plus utilisé dans le modèle de colonisation par C. difficile car il reproduit de façon rapide et reproductible cette pathologie. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation par C. difficile.
Mise en évidence et caractérisation des phénomènes de NETose dans deux modèles de sclérodermie systémique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Les souris subissent cinq injections sous-cutanées par semaine pendant dix, vingt-huit ou quarante-deux jours, ou une incision dorsale sous anesthésie pour implanter une mini-pompe diffusant un inducteur de fibrose pendant sept à vingt-huit jours. 126 souris âgées de six à huit semaines sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Le produit injecté enflamme et épaissit la peau, les poumons et les reins, ce qui reproduit une partie de la sclérodermie systémique pour y repérer des pièges extracellulaires de neutrophiles. Le porteur annonce une surveillance rapprochée destinée à détecter des points limites "préalablement établis", sans indiquer lesquels.
Objectifs
La sclérodermie systémique est une maladie qui modifie et épaissit la peau et d’autres organes les empêchant de fonctionner correctement. Il n’existe pas encore de traitement efficace. Certains globules blancs de notre organisme (les neutrophiles) sont capables d’éjecter autour d’eux un ensemble de molécules que l’on appelle NETs et qui dans des conditions normales forment des pièges à bactéries. Cependant, ces molécules peuvent être libérées de façon incontrôlée et être impliquées dans la progression de certaines maladies. Le rôle des NETs dans la sclérodermie est encore mal compris. Nous avons montré que des neutrophiles de patients libérent plus de NETs que ceux de sujets sains lorsqu’ils sont stimulés in vitro. Dans ce projet, nous visons à mettre en évidence l’existence de NETs dans des souris chez lesquelles nous aurons reproduit en partie la sclérodermie afin de pouvoir tester dans le futur des médicaments qui empêcheraient la formation des NETs et qui potentiellement freineraient l’avancement de la maladie.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra d’acquérir des connaissances supplémentaires sur les phénomènes mettant en jeu les NETs dans les tissus et dans la circulation sanguine lors de la progression de la maladie et ainsi démontrer la pertinence de chacun des modèles pour l’utilisation ultérieur d’un inhibiteur de NETs. A plus long terme, cela nous permettra de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les NETs dans un contexte de sclérodermie systémique.
Procédures
Dans une première procédure, les souris subiront une injection sous-cutanée d'une solution induisant la fibrose ou d'une solution saline, 5 fois par semaine pendant 10, 28 ou 42 jours. Dans une seconde procédure, les souris subiront 1) une injection sous-cutanée d'une solution d'anesthésiant, 2) une incision au niveau dorsal pour créer une poche sous-cutanée dans laquelle sera implantée la mini-pompe osmotique contenant une solution induisant la fibrose ou une solution saline et 3) une suture. La durée de l'intervention sera de 10 à 15 minutes et la diffusion sous-cutanée de la solution fibrosante durera 7, 18 ou 28 jours.
Impact sur les animaux
L’injection sous-cutanée peut causer une douleur légère de courte durée. La manipulation, l’anesthésie et l’intervention chirurgicale peuvent être des sources importantes de stress physiologique et psychologique chez la souris. Lors de la pose de la mini-pompe, les souris peuvent ressentir de la douleur ou de l’inconfort à l’endroit de l’implantation. Les injections répétées ainsi que la diffusion sous-cutanée des inducteurs de fibrose induisent une inflammation et un épaississement des tissus cutané, pulmonaire et rénal.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure. En effet, l'analyse du système immunitaire et des NETs en particulier nécessite la mise à mort pour le prélèvement et l'analyse des organes.
Remplacement
Les résultats précédemment publiés par la communauté scientifique nous ont confirmé qu’il n’existe pas d'autre possibilité que l'animal nous permettant de reproduire les mécanismes biologiques complexes mettant en jeu plusieurs types cellulaires au cours de la sclérodermie systémique. Notre projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons calculé le nombre d'animaux nécéssaire au plus juste grâce à un logiciel de statistique afin de limiter le nombre de souris utilisées. Pour l’analyse des résultats a posteriori, des tests statistiques adaptés seront utilisés. Une répartition aléatoire des animaux sera réalisée dès leur arrivée. Une banque de tissus sera récupérée pour éviter de refaire des expériences dans l’avenir.
Raffinement
Nous utiliserons une mini-pompe pour faire diffuser l'inducteur de fibrose dans la peau, évitant les injections répétées. Le deuxième inducteur de fibrose que nous utiliserons est très instable dans le temps et nécessite d’être préparé extemporanément. Dans le cas des injections répétées de ce second inducteur, les injections seront réalisées par deux expérimentateurs au niveau du dos de l’animal. Une rotation systématique dans le sens des aiguilles d’une montre sera faite afin de ne pas injecter quotidiennement au niveau du même site. Par ailleurs, ces expériences (injections multiples ou implantation pompe) ne se feront pas en un seul essai (126 animaux) mais seront fractionnées de façon à travailler sur des groupes plus petits améliorant la prise en charge de chacune des souris. Dans le cas de l’implantation de la mini-pompe, une analgésie pré-opératoire sera effectuée par injection sous-cutanée de buprénorphine. Une surveillance post-opératoire rigoureuse sera mise en place après l’intervention pour détecter tout signe de douleur, d’infection ou autres complications. Les animaux feront l’objet d’une surveillance rapprochée afin de détecter les points limites préalablement établis et d’éviter ainsi tout stress et souffrance. De la naissance à la mort, les animaux seront hébergés dans des conditions optimales incluant un enrichissement.
Choix des espèces
Il n’existe aucun modèle cellulaire capable de reproduire la complexité des interactions entre le système immunitaire, le système vasculaire et les tissus. La souris est considérée comme le modèle le plus approprié à l’étude de ces interactions complexes et plus particulièrement à l’étude du système immunitaire. En effet, la maturation ainsi que la réponse à un stimulus du système immunitaire murin sont très proches de celles de l’Homme. Les souris utilisées dans ce projet seront des souris « jeune adulte » âgées de 6 à 8 semaines. Les souris à cet âge ont un système immunitaire mature, essentiel pour modéliser la réponse inflammatoire et fibrotique propre à la sclérodermie. En termes de poids et de taille, les souris de 6 à 8 semaines sont assez robustes pour tolérer les injections répétées sans causer de stress excessif pouvant conduire à une mort prématurée. Les souris de cet âge peuvent par ailleurs subir l’intervention chirurgicale associée à l’implantation de la mini-pompe sans complication post-opératoire. Enfin, ce stade de développement permet une tolérance à la mini-pompe sous-cutanée et favorise une diffusion homogène de l'inducteur de fibrose.
Etude de l’impact d’une invalidation du gène anti-apoptotique TP53 combinée à l’expression d’un mutant activateur de Myd88 dans la lignée plasmocytaire.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Biopsiées à la queue sous anesthésie quand elles sont juvéniles, 244 souris reçoivent ensuite du tamoxifène, des substances introduites dans l'estomac et des immunisations, et subissent des prises de sang sous anesthésie. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger. Ces souris sont construites pour développer des tumeurs de plasmocytes, par désactivation d'un gène qui déclenche la mort des cellules et activation d'un autre qui stimule leur multiplication. Le porteur s'attend à des déformations osseuses liées aux tumeurs, à des difficultés à se déplacer ou à se tenir debout et à l'apparition de masses dans les organes lymphatiques. Toutes seront tuées à la fin de l'étude, le RNT indiquant par ailleurs qu'une partie des animaux modifiés pourra servir à établir de nouvelles lignées.
Objectifs
Dans ce projet, nous créons un modèle de souris pour mieux comprendre comment certains gènes peuvent provoquer des tumeurs dans les plasmocytes, qui sont des cellules du système immunitaire produisant des anticorps pour nous protéger contre les infections. Nous allons modifier l'ADN de ces souris en désactivant un gène qui entraîne la mort des cellules et en activant un autre qui stimule leur multiplication. Cela permettra à ces cellules de survivre et de se multiplier davantage. Grâce à ce modèle, nous espérons comprendre comment ces changements génétiques conduisent à la formation de tumeurs et trouver de nouveaux traitements pour ce type de cancer.
Bénéfices attendus
Notre projet cherche à comprendre comment le cancer se développe en étudiant le rôle de deux gènes dans un type particulier de cellule, les plasmocytes, qui produisent des anticorps. Ces gènes jouent un rôle clé dans la croissance des cellules et sont impliqués dans un cancer du sang appelé myélome multiple. En étudiant ces gènes, nous espérons découvrir comment ils contribuent à la formation de ce cancer, en particulier dans ses stades avancés. L’un de ces gènes aide normalement les cellules à maintenir leur ADN stable, ce qui les protège contre le cancer. Cependant, dans le myélome multiple, ce gène est souvent modifié, rendant les cellules plus vulnérables aux mutations et favorisant leur croissance incontrôlée. L’autre gène, impliqué dans la survie des cellules immunitaires, est souvent activé de manière anormale dans les cellules cancéreuses. En étudiant ces gènes dans les plasmocytes, nous souhaitons mieux comprendre leur rôle dans le développement du myélome multiple. Une meilleure compréhension de ce processus pourrait conduire à la mise au point de nouveaux traitements plus efficaces pour les personnes atteintes de ce cancer complexe, offrant ainsi de nouvelles options thérapeutiques et améliorant les perspectives de traitement pour les patients.
Procédures
Les animaux de ce projet seront soumis à plusieurs interventions dans le cadre des expériences, telles que : 1. Alimentation contrôlée: Des substances spécifiques seront introduites dans l'estomac des animaux pour répondre aux besoins de l'étude. 2. Stimulations du système immunitaire : Des injections seront réalisées pour activer la réponse immunitaire des animaux. 3. Prélèvements sanguins sous anesthésie : Du sang sera prélevé afin d'analyser l'état de santé et certains paramètres biologiques des animaux. 4. Analyse génétique : Un petit échantillon de tissu sera prélevé sur la queue des souris juvéniles sous anesthésie pour déterminer leurs caractéristiques génétiques et sélectionner celles qui participeront aux expériences.
Impact sur les animaux
1. Réactions immunitaires : Les animaux pourraient avoir des réactions indésirables liées à l’activation de leur système immunitaire. 2. Changements de comportement : Des changements dans le comportement des animaux, comme plus de calme ou de fatigue, peuvent être observés. 3. Perte de poids : Si l’animal perd une quantité importante de poids. 4. Problèmes osseux : Des changements dans la structure de ses os, comme des déformations liés aux tumeurs. 5. Problèmes de mobilité ou de posture : Des difficultés à se déplacer ou à se tenir debout. 6. Apparition de grosseurs: Formation de masses ressemblant à des tumeurs, particulièrement dans les organes lymphatiques. Par ailleurs, certaines interventions techniques pourraient occasionner un inconfort pour les animaux : - Biopsies de queue Effectuées sous anesthésie, elles peuvent provoquer une légère douleur passagère ainsi qu’un stress dû à la manipulation. -Injections de tamoxifène : Ce traitement peut entraîner une irritation au point d’injection et un stress temporaire. Un suivi attentif sera mis en place pour assurer le bien-être des animaux tout au long de l’étude.
Devenir
À la fin de l'étude, tous les animaux seront euthanasiés. Ceux qui ne seront pas intégrés aux expériences ou aux croisements seront retirés dès que possible. Pour les animaux ayant subi des modifications génétiques, certains pourront être réutilisés pour établir de nouvelles lignées sans nécessiter d'autres tests. Une fois les expériences terminées, l’analyse des organes des animaux permettra d’approfondir notre compréhension des effets des traitements étudiés.
Remplacement
Bien que des modèles cellulaires, comme les cellules provenant de patients ou des lignées de cellules, puissent être utilisés pour étudier certaines tumeurs de plasmocytes, telles que celles du myélome multiple ou de la maladie de Waldenström, ces recherches en laboratoire ne reproduisent pas la complexité des processus qui se déroulent dans la moelle osseuse ou les organes lymphoïdes, où ces maladies apparaissent naturellement. De même, bien que certaines modifications génétiques des cellules en laboratoire nous aident à mieux comprendre certains aspects de ces tumeurs, elles ne reflètent pas entièrement la manière dont elles se forment et évoluent dans un organisme vivant. C’est pourquoi l’utilisation de modèles animaux, comme la souris, est essentielle pour approfondir nos connaissances. En recréant ces tumeurs chez la souris, nous pourrons observer comment ces modifications affectent l’organisme dans un environnement naturel et complexe. Cela nous permettra d’obtenir des résultats plus précis et de tester de nouvelles thérapies pour traiter ces cancers.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux utilisés dans nos expériences, nous avons mis en place plusieurs mesures pour être plus efficaces tout en respectant leur bien-être. Voici les principales stratégies : - Choix du modèle animal : Nous utilisons une lignée de souris spécifique, ce qui permet d'avoir moins de variations entre les animaux et d’obtenir des résultats plus fiables. - Planification des expériences: Nous organisons les études pour éviter les manipulations répétées, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires. - Utilisation de mâles et femelles : Nous ne faisons pas de distinction entre les sexes, ce qui permet de réduire le nombre total d'animaux. - Euthanasie à la fin des expériences : Les animaux sont euthanasiés à la fin des études, et tous leurs organes sont prélevés pour maximiser les informations obtenues. - Analyses statistiques : Nous utilisons des méthodes d’analyse qui nous permettent de tirer des conclusions solides avec moins d’animaux. - Suivi des animaux : Selon les résultats des analyses sanguines, les animaux sont suivis et euthanasiés à des âges différents pour optimiser leur utilisation. Ces stratégies nous aident à minimiser le nombre d'animaux tout en respectant les règles éthiques et en garantissant leur bien-être.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans un environnement adapté pour minimiser leur stress. Nous les habituons progressivement aux manipulations et assurons un contact régulier avec le personnel soignant. Lors des interventions, des méthodes douces sont utilisées pour réduire le stress, et seules des personnes expérimentées réalisent les manipulations. Les animaux sont anesthésiés pour les prélèvements sanguins. Après chaque intervention, nous les surveillons attentivement pour nous assurer qu'ils se rétablissent bien et qu'ils ne souffrent pas. Ces mesures garantissent leur bien-être et la qualité des résultats.
Choix des espèces
Dans notre projet, nous utilisons des souris qui développent des problèmes similaires à ceux que l'on trouve chez les humains, comme le myélome multiple. Les mécanismes de ces maladies chez les souris sont très proches de ceux observés chez les humains. Par exemple, des protéines appelées immunoglobulines, qui jouent un rôle clé dans le développement de ces maladies, sont très similaires dans les deux espèces. Pour notre expérience, nous avons choisi de faire nos expériences sur des souris âgées de 8 semaines . Cet âge est choisi car les souris ont alors un système immunitaire bien développé, ce qui est important pour commencer les immunisations.