Souris
Etude du rôle de SREBP dans la régénération pulmonaire au cours de l’emphysème
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Une incision au niveau du cou, refermée par un fil de suture, pour instiller dans la trachée une élastase qui détruit une partie des alvéoles pulmonaires : 288 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs prélèvent les poumons sous anesthésie après exsanguination, à vingt et un, quatre-vingt-dix ou cent cinquante jours selon les groupes. Le projet teste si l'activation d'une protéine du métabolisme des lipides dans les fibroblastes permet de reformer des alvéoles, piste qui déboucherait sur un traitement de l'emphysème humain, aujourd'hui inexistant. Le porteur dispose de co-cultures 3D de cellules humaines qu'il décrit comme des "outils in vitro d'intérêt", tout en concluant qu'elles "ne peuvent pas se substituer complètement" au modèle murin.
Objectifs
L’emphysème est une maladie pulmonaire provoquant une destruction alvéolaire irréversible, sans traitement disponible actuellement. Une des causes de l’absence de réparation des alvéoles est le manque de lipides dans les fibroblastes (cellules de structure) qui entourent les cellules souches épithéliales des alvéoles. Activer les voies qui augmentent la synthèse de lipides dans les fibroblastes pourraient être un moyen d’induire une réparation des alvéoles au cours de l’emphysème. SREBP (Sterol regulatory element-binding proteins) est une protéine importante impliquée dans la synthèse des lipides. Notre hypothèse est que l'augmentation de la protéine SREBP dans les fibroblastes pourrait favoriser la réparation des alvéoles au cours de l’emphysème. Pour tester cette hypothèse, nous allons utiliser des souris ayant une délétion de deux protéines (Insig1 et Insig2) qui empêchent la synthèse de lipides. L’emphysème sera induit par une injection d’élastase dans la trachée, substance qui provoque une destruction alvéolaire partielle. Le niveau de sévérité de l’emphysème sera évalué par des analyses morphologiques du poumon. Pour étudier la capacité de ces cellules à former des alvéoles, nous mettrons en culture 3D des fibroblastes issus de ces souris avec des cellules épithéliales de souris contrôles. Nous anticipons l'augmentation du nombre d'alvéoles chez les souris génétiquement modifiées et une augmentation de la prolifération et de la différentiation cellulaire en culture 3D.
Bénéfices attendus
Si les souris ayant une absence de Insig1 et 2 présentent une réparation alvéolaire suite à l'injection d'élastase, cette voie sera considérée comme cruciale dans la réparation alvéolaire et pourrait mieux être étudiée chez l'homme pour créer de nouvelles alvéoles chez les patients souffrant d'emphysème pulmonaire. Les agonistes de la voie SREBP pourraient alors être envisagés pour traiter l'emphysème chez l'Homme.
Procédures
Instillation dans la trachée sous anesthésie générale, injection dans le péritoine sur animal vigile et prélèvement des poumons sous anesthésie générale après exanguination, sans réveil. Les animaux seront répartis de cette manière : i) le nombre d'alvéoles pulmonaires sera évalué à 21, 90 et 150 jours : pour chaque temps 24 souris seront injectées à l’élastase vs 24 souris au PBS (contrôle), ii) la co-culture 3D permettra d'étudier les capacités des fibroblastes à former des alvéoles à 21, 90 et 150 jours : pour chaque temps 24 souris seront injectées à l'élastase et 24 souris a PBS (contrôle).
Impact sur les animaux
Le modèle génétique induisant la délétion de Insig1 et Insig2 dans les fibroblastes n'est pas un phénotype dommageable pour les animaux. L’injection d'élastase nécessite une petite incision au niveau de l’avant du cou que nous refermons avec du fil de suture. Cette procédure est modérée avec un faible risque d'infection au niveau de la plaie.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélever et étudier leurs poumons.
Remplacement
La variabilité des caractéristiques des patients ayant de l'emphysème comme leur âge ou encore l’implication d’autres maladies rend plus complexe l’interprétation des résultats en provenance de l’Homme. Le modèle de souris emphysémateuse ayant une activation de SREBP permettra de déterminer si les cellules responsables de la régénération sont les fibroblastes dans l’emphysème pulmonaire et si SREBP est la protéine clé dans ce processus. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. Actuellement, nous disposons de modèles de co-culture cellulaire 3D chez l'humain qui ne peuvent pas se substituer complètement aux modèles murins mais qui représentent des outils in vitro d’intérêt pour étudier la dysfonction cellulaire chez les patients atteints d'emphysème pulmonaire. Les inconvénients majeurs de ces modèles sont la disponibilité des échantillons et la variabilité entre les patients (consommation de tabac, arrêt de la cigarette, sévérité de l'emphysème, âge, comorbidité, traitement,...).
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est limité à 288, correspondant au minimum pour obtenir des résultats significatifs. Pour l’ensemble des manipulations animales nous utiliserons 3 groupes : Le groupe ayant une activation de SREBP et deux groupes contrôles nécessaires pour ce type de modification génétique. Pour chaque expérience et pour chaque groupe de souris, les animaux seront injéctés soit à l'élastase, soit au PBS. Pour résumer, nous aurons 8 animaux par condition, c'est à dire 16 animaux par modèle génétique, donc 48 animaux par expérience. Nous faisons 2 expériences (nombre d'alvéole et culture 3D) à 3 temps différents, ce qui fait un total de 288 animaux.
Raffinement
Les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière sur le comportement et les signes de douleurs des animaux ayant reçu une injection dans la trachée. Cela permettre de ne pas rater une mauvaise réaction de l’animal à l’instillation d’élastase lorsqu’il se réveille de l’anesthésie et ainsi d’agir à temps pour éviter toute souffrance. Une surveillance sur 24h est faite de principe, il y a très exceptionnellement un problème dans les suites de l’injection. Les souris sont hébergées en groupe de 4 par cage, dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. Une grille d’évaluation des points limites sera utilisée pour graduer le mal être, avec mise à mort compassionnelle si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Les possibilités d’analyse avec des anticorps sont importantes chez la souris et la mise au point de modèles génétiquement modifiés est bien développée chez la souris. Le modèle d’emphysème induit par l’élastase permet par une unique injection d’obtenir un emphysème important chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge 2 mois, correspondant à la fin du développement total de l’appareil respiratoire chez la souris.
Etude de la diversité moléculaire et fonctionnelle des interneurones cholinergiques du striatum et conséquence sur la micro-circuiterie striatale chez la souris saine et pathologique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie stéréotaxique de trente à soixante minutes pour injecter des composés directement dans le cerveau, puis pour une partie des animaux cinq heures d'enregistrement électrique sous anesthésie, procédure dont ils ne sortent pas vivants : 1 783 souris vont être utilisées, dont 194 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chez les souris rendues parkinsoniennes par destruction unilatérale des neurones dopaminergiques, le porteur attend chez environ 20 % d'entre elles une altération du comportement alimentaire et de la prise de boisson, avec perte de poids sévère. Le projet vise à montrer que ces interneurones du striatum forment des sous-populations distinctes, hypothèse qualifiée de "très innovante". Les tests censés évaluer les déficits moteurs tiennent en quinze minutes au maximum et ne sont jamais nommés.
Objectifs
Les dysfonctionnements des interneurones cholinergiques du striatum (CINs) sont impliqués dans un large éventail de troubles neurologiques et neuropsychiatriques qui représentent un fardeau social et économique élevé pour la population mondiale. Ces interneurones font partie d'un réseau impliqué dans les apprentissages sensorimoteurs. L'hypothèse principale de ce projet est que les CINs présentent une diversité moléculaire qui peut être liée à leur hétérogénéité fonctionnelle. Il s'agit d'un projet très innovant car les CINs ont jusqu'à présent été considérés comme une population homogène, excluant toute possibilité de diversité fonctionnelle. Plus précisément, nous voulons analyser les gènes exprimés par les CINs et, surtout, établir le lien entre ces gènes et les propriétés fonctionnelles évaluées à l’aide d’approches anatomiques, électrophysiologiques et d’imagerie chez la souris. Décrypter la diversité moléculaire des CINs nous permettra de mieux comprendre leur rôle dans les nombreuses pathologies impliquant ces interneurones, notamment dans la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Si l'on considère que le processus pathologique de la maladie de Parkinson affecte différemment des sous-populations spécifiques d’interneurones cholinergiques, les résultats de notre étude devraient permettre d'améliorer les stratégies thérapeutiques en ciblant sélectivement la/les sous-population(s) appropriée(s). Considérant que les interneurones sont impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques dont le coût sociétal dans la population européenne est considérable, nous espérons que mieux comprendre les mécanismes sous-tendant ces troubles neurologiques contribueront à en améliorer le traitement.
Procédures
- Une contention pour procéder à des injections intra-péritonéales et sous-cutanées. - La plupart des souris subiront une chirurgie stéréotaxique permettant l’injection intracérébrale de composés sous anesthésie générale et avec une analgésie appropriée. La chirurgie proprement dite dure entre 30 et 60 minutes et les souris ne sont opérées qu’une seule fois. - Des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer les déficits moteurs. Durée maximale: 15 min. - Certains animaux subiront une perfusion intracardiaque pour prélévement (procédure terminale, durée : 3 min). - Des enregistrements électrophysiologiques sur animaux anesthésiés (procédure terminale, durée: 5h). Un même animal peut subir plusieurs interventions mais chaque intervention n'est faite qu'une seule fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues concernent d'une part les injections intrapéritonéale et sous-cutanées et d'autre part, les chirurgies stéréotaxiques. Les nuisances liées à la chirurgie stéréotaxique sont bien tolérées et n'ont que peu d'impact sur les animaux grâce aux soins post-opératoires. En revanche, elles peuvent être plus sévères chez les animaux rendus parkinsoniens. Ce modèle de la maladie de Parkinson entraine en effet la destruction unilatérale des neurones dopaminergiques. Cette destruction peut affecter les comportements alimentaire et dipsique chez environ 20% des animaux et entrainer une perte depoids sévère. De tels effets ne sont pas observés chez les animaux injectés contrôles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les méthodes in vitro ne peuvent pas reproduire le fonctionnement d’un organe aussi complexe que le cerveau en raison de l’isolement des cellules du contexte physiologique.
Réduction
En maintenant notre animalerie dans le respect des bonnes pratiques, nous nous efforçons de minimiser la variabilité induite par le stress ou par la présence de pathogènes. Afin de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire, nous utilisons le calcul de Puissance lors de la planification des expériences : ce calcul permet de fixer un effectif tel que l’on ait 80% chances de vérifier notre hypothèse pour un seuil de significativité inférieur à 5%. Cependant ce calcul nécessite de connaître au préalable la taille de l’effet et la variabilité des mesures, ce qui n’est pas toujours possible. Par expérience nous avons déterminé pour les expériences de physiologie que des effectifs comprenant 10 à 15 cellules issues de 7 à 8 animaux (mâles et femelles) nous permettent de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux. Pour les analyses moléculaires et cellulaires, 6 animaux/groupe sont nécessaires. Ceci prend en compte les problèmes susceptibles de survenir aux différentes étapes de l’expérimentation et qui peuvent amener à écarter des animaux. Les analyses statistiques appropriées seront réalisées. D’autre part, afin de réduire le nombre de souris et de s’assurer de la reproductibilité des résultats, les paramètres d’injection (coordonnées stéréotaxiques, quantités de vecteurs infusés et délai d'expression des transgènes) et les conditions expérimentales pour les expériences in vitro (ex : utilisation de nouveaux anticorps) sont toujours testés lors d’expériences pilotes. Enfin, pour limiter le nombre d'animaux produits, nous utilisons à la fois des animaux mâles et femelles.
Raffinement
Les souris sont maintenues en groupe (de 2 à 5 animaux par cage) pour éviter l’isolement social, avec enrichissement de l’environnement qui est régulièrement renouvelé afin de diversifier au maximum l'environnement et permettre un maximum de comportements proches des comportements naturels. Lors de la chirurgie, nous utiliserons un anesthésique volatil qui par rapport à un anesthésique injectable permet une induction et un réveil rapides ainsi qu'une meilleure stabilité du niveau d’anesthésie. Ceci améliore la récupération post-opératoire et limite la létalité. Cet anesthésique n’ayant pas d’effet antalgique, une injection d'antalgique est réalisée 30 minutes avant la chirurgie. La température corporelle des souris est maintenue constante par une couverture chauffante thermostatée. Du gel ophtalmique maintient les yeux humides. Avant l’incision du scalp, une analgésie locale est effectuée. Les instruments chirurgicaux sont stérilisés et la zone opérée est désinfectée. La fréquence des visites augmente pour s’assurer d’une bonne récupération des animaux et intervenir rapidement si problème. Nous vérifions particulièrement les signes de douleurs selon une grille qui tient compte de l’aspect général de l’animal, de son poids, de son comportement naturel et induit. Si un animal présente des signes de douleurs (pelage terne, poil hérissé, dos voussé, yeux mi-clos, apathie), il reçoit un traitement antalgique toutes les 24h et est observé deux fois par jour. Si au bout de 48h, il n’y a pas d’amélioration la souris reçoit à nouveau une injection d'antalgique. L’absence d’amélioration le lendemain entraine l’euthanasie. D’expérience, les chirurgies stéréotaxiques consistant à délivrer des vecteurs viraux sont bien tolérées. Les modèles de la maladie de Parkinson peuvent nécessiter un traitement antalgique pour environ 20% des animaux. 10% à 20% de ceux-ci ne sont pas améliorés par le traitement antalgique et sont euthanasiés.
Choix des espèces
Compte tenu du degré de similarité anatomique et cellulaire important entre le cerveau de souris et le cerveau humain, la souris est un modèle de choix pour étudier le rôle des CINs en condition normale et pathologique. D’autre part la souris nous permet d’utiliser tous les avantages des techniques de transgénèse et d’induction de protéines d’intérêt par injection d’AAVs. Nous utilisons des souris sauvages C57/BL6J et des souris transgéniques sans phénotype dommageable sur le même fond génétique. Les animaux utilisés dans ce projet sont adultes (P>30, 20 à 35g) car nous travaillons sur la maladie de Parkinson, une maladie neurodégénérative touchant le sujet adulte.
Description anatomique, perturbation fonctionnelle et enregistrement de la voie cortico-réticulo-spinale afin d’identifier son rôle chez l’animal contrôle et dans des modèles de sclérose latérale amyotrophique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Biopsie de la queue sur le souriceau vigile, puis à l'âge adulte une chirurgie d'une heure et demie sous anesthésie, ou deux chirurgies d'une heure espacées de deux semaines. Une semaine plus tard commencent les tâches de locomotion fine, un jour sur deux pendant six semaines, jusqu'à dix-huit séances et dix-huit heures par animal. 2 151 souris passent par ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 477 d'entre elles et modéré pour 674, afin de cartographier une voie nerveuse reliant le cortex à la moelle épinière. Deux lignées reproduisent la sclérose latérale amyotrophique : les animaux sont utilisés avant l'apparition des symptômes, les reproducteurs gardés quelques jours au-delà des premiers signes, et tous sont tués pour prélèvement.
Objectifs
Le projet vise à caractériser le rôle d’une connexion entre le cortex et la moelle épinière via une région appelée formation réticulée, dans la motricité des pattes postérieures de la souris. Cette connexion existe mais est peu étudiée. Nous cherchons maintenant à caractériser son anatomie plus précise (cartographie), ainsi que le rôle de ces neurones dans une situation physiologique, chez l’animal éveillé libre de ses mouvements. Plus pécisément, nous avons pour objectif de : 1) effectuer la cartographie complète de cette voie, 2) analyser les conséquences de perturbations de cette voie (inhibition ou ablation) sur les comportements moteurs des souris, 3) identifier les neurones de cette voie en enregistrant leur activité électrique grâce à des électrodes, , et corréler leur activité avec le comportement observé, 4) identifier si cette voie est impliquée dans des modèles animaux de sclérose latérale amyotrophique.
Bénéfices attendus
Les fonctions de la connexion entre le cortex et la moelle épinière via une région appelée formation réticulée sont encore mal connues, mais elle pourrait servir à compenser l’atteinte d’autres voies (celle directe entre le cortex et la moelle épinière) lors de situations pathologiques (sclérose latérale amyotrohique, lésion traumatique de la moelle épinière, etc.). Notre projet permettra de caractériser l’activité de ces neurones dans le cadre d’un comportement moteur, et ainsi de poser des hypothèse sur les conséquences de leur atteinte en situation pathologique.
Procédures
Les souriceaux seront soumis à une biospie de queue réalisée sur animal vigil (durée: quelques secondes). Les animaux adultes subiront, sous anesthésie, soit une chirurgie unique durant environ 1,5 heure, soit deux chirurgies à 2 semaine d'écart, chacune durant au plus 1 heure. Au minimum une semaine après la dernière chirurgie, les animaux effectueront des tâches comportementales de locomotion fine. Ces tâches durent une dizaine de secondes et sont répétées pendant un maximum 1h, à raison d’un jour sur deux, pendant jusqu’à 6 semaines. Au maximum chaque animal sera donc testé 18 fois, pendant 18 heures au total.
Impact sur les animaux
La biospie de queue entraine une douleur légère de courte durée. Les chirurgies entrainent inévitablement un stress et des douleurs chez la souris. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les sutures peuvent aussi entrainer une gêne ou des démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et, très rarement, à endommager sa cicatrice. Cette gêne disparait également en quelques jours. Les tests comportementaux envisagés peuvent également être source de stress pour les animaux. Deux lignées de souris modèles de la sclérose latérale amyotrophique sont utilisées. Toutefois, nous nous intéressons à ce qui se passe avant le développement des symptômes de la maladie, donc les animaux utilisés pour les expériences de comportement et les enregistrements ne présenteront pas de symptômes. Seuls les animaux nécessaires à la reproduction pourront être gardés quelques jours après l’apparition des tous premiers symptômes (position anormale ou tremblement du membre postérieur lors du test de suspension par la queue, ou arrêt de la prise de poids), tant qu’il n’y a pas de paralysie ou d’atteinte de la locomotion.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.
Remplacement
Le projet porte sur la voie cortico-reticulo-spinale, c’est-à-dire un circuit complexe comprenant plusieurs noyaux du cerveau et la moelle épinière. Un tel circuit est impossible à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doit être intact pour pouvoir être étudié. Il est impossible à modéliser numériquement car les propriétés des différents éléments sont encore méconnues. Nous devons donc recourir à l’animal pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Les mesures pour réduire le nombre d’animaux ont été étudiées en adéquation avec le projet. Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement valides. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et obtenir des résultats spécifiques de genre. Les expériences seront effectuées de façon séquentielle, afin de disposer des résultats de la cartographie et des expériences pilotes avant d’effectuer les expériences de comportement. Un arbre décisionnel précis permet de n’effectuer ensuite que les lots pour lesquels la faisabilité est avérée, ce qui permettra de limiter le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire et la température de l’animal est maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. Les yeux sont hydratés avec un gel oculaire. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance. En cas de necessite des decisions seront prises en accord avec le veterinaire, la Structure chargee du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique de l’institut pour une prise en charge adaptee des animaux. Des animaux qui ne subissent par les chirurgies sont herbergés avec les animaux tests. Ils sont présents sur la plateforme d’arrivée des tests de comportements, réduisant ainsi le stress des animaux tests et les motivant à faire les tâches sans qu’une restriction hydrique soit nécessaire.
Choix des espèces
L’étude de la communication entre le cortex et les circuits locomoteurs spinaux requiert l’utilisation de mammifère. La souris est un modèle largement utilisé dans l’étude du cortex moteur, et des comportements locomoteurs. De plus, nous avons la possibilité de mimer chez la souris les mutations génétiques que l’on peut retrouver dans les formes familiales de sclérose latérale amyotrophique, ce qui n’est pas possible dans d’autres espèces. Les animaux sont utilisés à partir de 30 jours après la naissance, car c’est l’âge à partir duquel la voie de communication entre le cortex et la moelle a fini son développement
Elevage de souris transgéniques à des fins de recherche biomédicale à visée thérapeutique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Produites pour alimenter d'autres projets du même laboratoire sur les maladies neuromusculaires, 25 400 souris de sept lignées génétiquement altérées vont être élevées et génotypées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 20 865 d'entre elles et modéré pour 4 535. Chaque souriceau subit entre le septième et le douzième jour de vie un prélèvement de queue et un tatouage des phalanges, l'ensemble prenant moins de cinq minutes. Les animaux porteurs des pathologies étudiées peuvent développer une atteinte locomotrice, une respiration accélérée ou des signes de déshydratation, et le porteur indique les tuer avant l'apparition des symptômes lorsqu'aucune expérience ne les attend. Les autres sont maintenus en vie pour la reproduction ou versés à des projets applicatifs, l'effectif de 25 400 étant estimé à partir de l'historique de production de l'établissement et de "besoins" susceptibles d'évoluer.
Objectifs
Ce projet a pour but de produire et de génotyper des animaux d'élevage à des fins d'utilisation scientifique. Il permettra l’élevage de 7 souches de souris génétiquement altérées nécessaires à la mise en œuvre de différents projets de recherche ayant pour but de comprendre la physiopathologie des maladies étudiées dans notre Laboratoire et de trouver des approches thérapeutiques innovantes pour des maladies neuromusculaires.
Bénéfices attendus
Les bénéfices devant découler de ce projet concernent le domaine de la santé humaine. Ils visent à valider l’effet thérapeutique de molécules d’intérêt ou de produits de thérapie génique pour un groupe de maladies humaines rares et orphelines de médicaments, sur des modèles de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de maladies neuromusculaires rares.
Procédures
Les prélèvements de tissus à partir d'un très petit morceau de queue sont réalisés sur animaux vigiles. Cet acte est réalisé en même temps que le tatouage des phalanges et n’est pratiqué qu’une seule fois. Au total, moins de 5 minutes sont nécessaires pour réaliser ces deux actes par animal. En effet, si les prélèvements de tissus s'executent en moins d'une minute, les instruments doivent être désinfectés entre chaque animal ce qui peut prendre 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont liées à la méthode de prélèvement de tissu sur jeunes animaux vigiles pour le génotypage. La contention d’animaux jeunes pour se faire peut entrainer un stress et une douleur légère passagère ne dépassant pas quelques heures. Les animaux porteurs des pathologies étudiées dans notre Laboratoire peuvent présenter un phénotype dommageable de type atteinte locomotrice, polypnée ou signes de déshydratation. Ces symptômes peuvent correspondre à un degré d'inconfort jugé modéré.
Devenir
Euthanasie des animaux ou maintien en en vie pour la reproduction ou une utilisation continue dans des projets applicatifs.
Remplacement
Un effort de remplacement est réalisé en amont voire en parallèle du programme d'élevage. En effet, nous essayons dans un premier temps de répondre aux questions biologiques qui se posent à nous à l'aide de modèles cellulaires. L’utilisation d’animaux dans des études n'est effective que lorsque les modèles cellulaires ne peuvent pas répondre aux questions biologiques. Par exemple, lorsqu'il est nécessaire d’étudier les symptômes liés à des troubles du comportement moteur caractéristiques des maladies neuromusculaires que nous étudions ou encore pour étudier la biodistribution d’un traitement dans l'organisme.
Réduction
Nous avons prévu d’utiliser un total de 25400 souris pour fournir les animaux nécessaires à l'ensemble des expériences pour les 5 années d'études à venir sachant que nos besoins peuvent évoluer en fonction d'éventuelles ré-orientations des objectifs scientifiques à l'appui de nouvelles publications scientifiques et de nouveaux résultats. Aussi nous sommes-nous basés sur les données statistiques de 2022 et 2023 ainsi que sur l'historique des données de production des lignées maintenues dans notre établissement pour faire cette estimation. Cette base d'estimation nous amène à envisager une moyenne de 5080 souris par année pour les 7 lignées de souris objet de ce dossier, soit un total de 25400 souris sur 5 ans. Les deux sexes seront utilisés dans les protocoles lorsque la maladie n’est pas liée au sexe ou que le projet n’est pas dépendant d’un des deux sexes.
Raffinement
Dans ce programme d’élevage, les animaux mimant les pathologies étudiées seront utilisés pour les projets applicatifs ou seront euthanasiés avant l’apparition des symptômes. Nous évitons ainsi l’expression du phénotype dommageable quand il n’est pas associé à un besoin expérimental. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi (maisonnette en cellulose, bâtonnets en bois, élément pour la confection des nids, copeaux, tunnel, autres éléments spatiaux d'enrichissement) et sont observés quotidiennement. Au moment du sevrage, nous ne séparons les fratries que par sexe et ne regroupons pas les mâles (frères et germains) à plus de 2 semaines d'écart d'âge pour limiter le risque d’agressivité. De la nourriture est ajoutée directement sur le sol de la cage et des pipettes d’eau plus longues sont mises en place pour que les juvéniles sevrés ou les animaux présentant une atteinte locomotrice aient facilement accès à l'eau et à l'aliment. Le cas échéant, un aliment hydratant et nourrissant peut être placé à même le sol dans une coupelle pour les animaux déshydratés. Pour ne plus attraper les animaux par la queue lors du change des litières, les zootechniciens utilisent leurs mains jointes en creux ou des tubes pour inciter les animaux à passer d’une cage à l’autre par eux-mêmes. Concernant les biopsies de tissu pour l'identification génétique des animaux, elles sont effectuées une seule fois entre 7 et 12 jours de vie par prélèvement d'un très petit bout de queue (moins de 0,5 mm). Ce prélèvement de tissu est réalisé à un âge où l’ossification et l’innervation des tissus ne sont pas encore bien différenciées.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies comme animaux modèles car ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter les mutations génétiques responsables des différentes maladies étudiées dans notre Equipe, ce qui en font le plus petit modèle animal présentant les signes cliniques et pathologiques mimant ces maladies. Les animaux de ce projet d’élevage seront utilisés à un stade précoce pour les identifications individuelles (microtatouage) et l'identification génétique ; et à un stade plus tardif de maturité sexuelle pour le renouvellement des reproducteurs.
Étude du métabolisme des cancers de la surrénale chez la souris EU 1/3
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Six heures de perfusion de glucose radiomarqué par pompe osmotique implantée sous la peau, trois prélèvements de sang, puis deux séances d'IRM séparées par un trajet en voiture d'un site à l'autre : 2 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce sont des souris Nude, immunodéficientes, dont le porteur reconnaît le "phénotype dommageable", choisies pour qu'elles ne rejettent pas les greffes de cellules tumorales de surrénale posées dans leur flanc ou dans le coussin graisseux du cou. Ces greffes peuvent gagner en profondeur, fusionner avec les muscles dorsaux et comprimer la colonne vertébrale, jusqu'à une paraplégie. Toutes seront tuées pour récupérer la tumeur, le porteur estimant qu'il ne serait "pas possible de maintenir les animaux en vie tout en respectant leur bien être après avoir retiré la tumeur".
Objectifs
Les cancers de la glande surrénale sont des cancers rares qui ont la particularité d’être fréquemment héréditaires. Les patients sont porteurs d’anomalies génétiques qui leur procurent un risque très important de développer une ou plusieurs de ces tumeurs au cours de leur vie. Dans certains cas, ces anomalies génétiques sont par ailleurs la cause de forme plus agressives de la maladie avec le développement de métastases dans les os ou le foie notamment. A l’heure actuelle, les traitements sont peu efficaces pour traiter ces patients et le diagnostic précoce de la présence d’une tumeur, permettant de la retirer par chirurgie reste le traitement le plus efficace. Dans le cas des formes héréditaires, l’identification d’une anomalie génétique permet de proposer un test génétique au membre de la famille pour identifier les individus porteurs de l’anomalie et leur proposer un suivi préventif. Des travaux antérieurs ont montré que l’une des conséquences de ces anomalies génétiques étaient une modification de la façon dont les cellules cancéreuses transforment les sucres, en particulier le glucose. Ces modifications du métabolisme peuvent être utilisées à la fois comme outils diagnostiques (les modifications étant différentes en fonctions du type d’anomalie génétique) et thérapeutique (le ciblage de ces modifications pourrait empêcher les cellules cancéreuses de se nourrir et donc de proliférer). L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles souris chez qui nous grefferons sous la peau des cellules tumorales ayant différentes anomalies génétiques retrouvées chez les patients. Dans ces modèles, nous étudierons comment les cellules cancéreuses utilisent le glucose pour proliférer. Nous développerons également des techniques d’imagerie par IRM qui permettront d’identifier les anomalies du métabolisme du glucose, en lien avec chaque type d’anomalie génétique. Ces travaux devraient permettre à fois d’identifier des voies qui pourraient être la cible de thérapie anti-cancéreuses spécifiques des anomalies génétiques (et donc potentiellement responsables de moins d’effets secondaires des traitements), et de développer des outils facilement utilisables en radiologie pour détecter les patients porteurs de ces anomalies génétiques. Ce projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs ou "EU. La mise en place des modèles de souris est réalisée dans l'EU1 et l'imagerie sera effectuée sur deux appareils d’IRM différents situés sur 2 sites distincts (EU2 et EU3).
Bénéfices attendus
En aidant à la compréhension des différents mécanismes de malignité des tumeurs en fonction de leurs mutations ainsi qu’à la compréhension de leur métabolisme complexe dans un contexte in vivo, le laboratoire pourra proposer de nouvelles cibles thérapeutiques ciblant des métabolites uniquement dans les cellules tumorales de la surrénale. Cette étude pourrait également permettre de développer une méthode innovante de diagnostic précoce ou de réponse thérapeutique pour les tumeurs pouvant, in fine, être transférée chez les patients.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie pour avoir une greffe de cellules tumorales dans le flanc ou dans le coussin graisseux sous anesthésie et analgésie (moins de 10 minutes). Une partie des animaux subira une perfusion intraveineuse de glucose radiomarqué durant 3h, avec 3 prélèvements de sang de 50 µL (30 secondes par prélèvement), sous anesthésie gazeuse et analgésie. Une autre partie des animaux subira une perfusion de glucose radiomarqué durant 6h par pompe osmotique, avec 3 prélèvements de sang de 50 µL (30 secondes par prélèvement), sous anesthésie gazeuse et analgésie. Une troisième partie des animaux sera transportée en voiture du site 1 vers le site 2 pour une première séance d’imagerie IRM de 30 minutes sous anesthésie gazeuse. Après transport en voiture de 30 minutes vers le site 3, ces animaux auront une acclimatation de 3 à 7 jours puis une seconde séance d’imagerie IRM de 30 minutes sur le site 3.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un léger stress lors de la contention, de l’anesthésie et lors du transport vers les différents sites d'expérimentation. L’injection de cellules tumorales peut provoquer de l’inflammation au niveau de la zone d’injection pouvant induire une irritation. L'implantation d’une pompe osmotique sous cutanée ainsi que le développement d’une tumeur dans le coussinet graisseux peuvent causer une légère douleur et potentiellement une réduction temporaire de la mobilité de la souris. Les tumeurs greffées sous le coussinet graisseux des souris peuvent potentiellement se développer en profondeur et adopter un comportement métastatique en fusionnant avec les muscles dorsaux résultant en une compression de la colonne vertébrale. Les animaux peuvent rarement montrer rapidement des signes de difficultés motrices dans les postérieurs, se développant en paraplégie.
Devenir
Les animaux seront élevés pour être utilisés lors d’expérience où ils développeront des tumeurs, suite à une injection de cellules ou une greffe d’un fragment de tumeur dans le flanc ou dans la graisse du cou. À la fin de ces expériences les animaux seront euthanasiés pour récupérer la tumeur car il ne serait pas possible de maintenir les animaux en vie tout en respectant leur bien être après avoir retiré la tumeur.
Remplacement
Les analyses in vitro ne sont pas suffisantes pour l’étude des mécanismes de cancérogenèse, notamment la caractérisation des évènements menant au processus métastatique, qui intègre le microenvironnement tumoral, la néovascularisation, et les régulations endocrines. Il est donc très difficile voire impossible de reproduire fidèlement l'ensemble de ces interactions in vitro, dans des modèles de cellules isolées. De plus, les cellules humaines de ce cancer ne poussent pas en culture in vitro. Il est donc encore nécessaire d’utiliser un modèle murin afin de s’approcher au plus des tumeurs humaines.
Réduction
Les paramètres expérimentaux ont été définis selon des études déjà publiées (temps de traitement, doses et voies d’administration). Nous avons déterminé un nombre restreint d’animaux au maximum de sorte à pallier le problème de variation observable in vivo mais également dû à la différence de taille des tumeurs qui peut considérablement altérer le métabolisme intra tumoral, soit 2240 animaux au total sur 5 ans. Pour chacune des expériences nous avons maximisé les prélèvements et analyses biologiques. Afin de réduire le nombre total d'animaux nécessaires pour atteindre une significativité statistique, nous avons utilisé un logiciel pour calculer le nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats significatifs d’un point de vue statistique. Des analyses statistiques seront effectuées sur chacune des expériences.
Raffinement
Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des maisonnettes et morceaux de bois si nécessaire. Les animaux sont hébergés à un maximum de 5 par cage et s'il y a nécessité d'un hébergement individuel dû à une blessure ou une bagarre, il sera placé en cage double séparé d’un congénère par une cloison transparente trouée. Les animaux Nude présentent un phénotype considéré comme dommageable à cause de leur statut immuno-déficient. Ils seront hébergés en zone d’expérimentation dédiée aux animaux immunodéprimés, sur portoirs ventilés et toute manipulation sera faite sous une hotte de change préalablement désinfectée afin de réduire l'impact de leur phénotype et qu'il ne s’exprime en développant une quelconque maladie. La procédure chirurgicale pour les greffes est pratiquée après administration en sous-cutané d’un analgésique 30 minutes avant la chirurgie. Les animaux sont ensuite endormis et maintenu par anesthésie gazeuse sur un tapis chauffant puis surveillés jusqu’à leur réveil. L’état des animaux est observé, au minimum, deux fois par semaine afin de monitorer leur bien-être et d’observer l’apparition des tumeurs. Les souris sont pesées toutes les semaines pour détecter toute variation de poids anormal, ou stagnation malgré l’augmentation du volume tumoral. Dès l’apparition de tumeurs, celles-ci seront mesurées avec un pied à coulisse deux fois par semaine. Les animaux ayant reçu une greffe de pompe osmotique seront monitorés toutes les heures jusqu’à la fin de l’expérimentation. Le transport des animaux entre les sites d'expérimentation se fera en voiture dans des cages de transport adaptée avec litière, cotons compactés et gelée alimentaire adaptée au besoin des animaux. Des points limites adaptés ont été défini au préalable afin de réduire au maximum la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Le choix des souris permet d’augmenter les chances de prise tumorale à partir des greffes de cellules, nos lignées cellulaires étant également d’origine murine. Par ailleurs le modèle murin nous permet d’avoir accès à des animaux immunodéficients qui constituent un modèle préclinique particulièrement adapté à la réalisation de greffes de cellules et/ou tumeurs humaines ou murines. Nos lignées cellulaires sont issues de différentes souris, rendant préférable l’utilisation d’une souris receveuse immunodéficiente afin de minimiser le risque de rejet de greffes. Les animaux seront âgés de 7 à 8 semaines (jeunes adultes ayant atteint la maturité ; cet âge correspond à l’âge médian de développement de la maladie chez l’Homme). C'est cet âge qui est le plus souvent rapporté dans la littérature pour ce type d'étude, ce qui nous permettra de confronter nos résultats avec ceux d'autres équipes.
Détermination des paramètres ultrasonores pour le traitement de tumeurs cancéreuses
- Recherche appliquée
- Cancers
Une injection sous la peau de cellules de mélanome, de cancer du sein triple négatif ou d'adénocarcinome pancréatique, puis des séances d'ultrasons de quinze minutes sur la tumeur : 216 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus bas. La tumeur peut gêner leur déplacement, sa mesure au pied à coulisse deux à trois fois par semaine provoque un stress et une douleur possible, et les ultrasons laissent sur la peau de petites taches rouges dues à la cavitation. Le projet cherche les réglages d'ultrasons qui augmentent le nombre de cellules immunitaires dans la tumeur, étape préalable à des essais combinant ultrasons et immunothérapie. Le porteur annonce que le traitement sera appliqué quand la tumeur est "encore assez peu volumineuse", sans indiquer de volume, ni comment les 216 souris se répartissent entre les trois modèles de cancer.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans une étude globale qui vise à potentialiser l’effet de l’immunothérapie par les ultrasons par recrutement du système immunitaire et par action sur le microenvironnement tumorale. Les modèles de cancers choisis sont le mélanome et le cancer du sein triple négatif car ils sont sensibles à l’immunothérapie et l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) qui n’est pas sensible à l’immunothérapie. Le mélanome est un cancer de la peau agressif qui touche environ 330 000 nouvelles personnes chaque année dans le monde, avec une incidence en hausse constante. Le cancer du sein triple négatif, une forme particulièrement agressive et difficile à traiter, représente environ 10 à 15 % des cancers du sein, soit environ 225 000 nouveaux cas par an dans le monde. L'adénocarcinome canalaire pancréatique, la forme la plus courante de cancer du pancréas, est particulièrement agressif, avec environ 495 000 nouveaux cas chaque année dans le monde. La combinaison de traitements (chirurgie, radiothérapie, chimiothérapie, immunothérapie) s'avère cruciale pour améliorer les chances de guérison. Il a été prouvé qu’en appliquant des ultrasons, une réduction de la tumeur de 60 à 75% et un recrutement du système immunitaire ont été observés. Le but de ce projet est de mettre au point les paramètres de traitement ultrasonore permettant d’observer une augmentation des cellules du système immunitaire dans la tumeur.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra par la suite d'utiliser ces modèles pour tester des combinaisons d'immunothérapie et d'ultrasons. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de prise en charge des patients atteints de mélanome, de cancer du sein triple négatif et de cancer du pancréas. Ce projet permettra de mettre au point des modèles qui pourront être utilisés pour d’autres projets. La combinaison des traitements en clinique permettra de réduire les effets secondaires engendrés par l’immunothérapie et pourrait être appliquée dans d’autres types de cancers.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés pour une injection sous la peau de cellules tumorales (3 minutes). Ils seront manipulés 2 à 3 fois par semaine pour les peser et pour observer la pousse tumorale. Ils seront à nouveau anesthésiés pour mesurer la tumeur sous échographie et traiter la tumeur par ultrason (15 min).
Impact sur les animaux
Une injection de cellules en sous cutané entraînant une croissance de tumeur peut entraîner une gêne à la locomotion. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Les ultrasons peuvent induire de petites taches rouges sur la peau dues à la cavitation.
Devenir
Les animaux seront mis à mort car les mesures réalisées pour ce projet seront faites sur les tumeurs prélevés après la mise à mort de l’animal pour vérifier que les ultrasons génèrent une réponse immunitaire.
Remplacement
Plusieurs informations ont été données via des études sur des cultures de cellules en 3D : l’élasticité est augmentée après traitement par ultrasons ce qui a permis de designer cette étude sur animal et de l’affiner. Cependant, les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité). L’étude de l’efficacité de la combinaison ultrasons et immunothérapie ne peut se faire qu’au niveau de la tumeur dans son micro-environnement et avec ses interactions avec l’organisme entier.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé grâce à des outils statistiques. Le projet prévoit 3 protocoles différents d'évaluation de croissance tumorale, si l'effet attendu est atteint dès le premier protocole, les 2 autres ne seront pas appliqués, divisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires par 3. Le projet prévoit 3 protocoles différents de traitement ultrasonore pour optimiser les paramètres. Si l’effet attendu est atteint dès le premier protocole, les 2 autres ne seront pas appliqués, divisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires par 3.
Raffinement
Les animaux sont traités par les ultrasons lorsque la tumeur est encore assez peu volumineuse, ce qui limite les dommages. De plus, la mise à mort dans la procédure 2 aura lieu à J7 post-traitement, ce qui permettra de voir l’infiltration des cellules immunitaires. En prévision d’éventuelles douleurs, les souris recevront une injection d’analgésique au préalable du traitement aux ultrasons. Les animaux seront placés sur litière en cellulose pour éviter toute irritation des tumeurs des animaux.
Choix des espèces
La souris est la plus petite espèce qui développe des tumeurs suffisamment grosses pour être traitées par ultrasons. Nous avons choisi des souris âgées de 6 semaines au moment de l’implantation du modèle, car d’une part la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. D’autre part, le traitement débutera entre 8-9 semaines, 8 semaines étant l’âge auquel leur système immunitaire est mature.
Etude de l’impact de l’immunité intestinale dans le cancer colorectal métastatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
8 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules tumorales sous la peau et, par chirurgie, dans le colon et dans le foie, puis jusqu'à trois traitements, deux vaccins, douze injections de substrat et treize anesthésies gazeuses, avec prélèvements de sang et de fèces. Le porteur attend de ces modèles qu'ils éclairent le rôle de lymphocytes intestinaux dont il a déjà breveté l'"énorme potentiel clinique", les retombées pour les patients restant au conditionnel. Il écrit par ailleurs qu'"en général, aucun signe de souffrance des animaux n'est observé dans les jours qui suivent les implantations de tumeurs".
Objectifs
Notre projet vise à améliorer la prise en charge des patients souffrant de cancer colorectal métastatique, souvent incurable. Nous cherchons à développer de nouvelles thérapies, en particulier des immunothérapies. Pour cela, nous voulons mieux comprendre l’immunité développée dans les tumeurs primitives, situées au niveau du colon, ainsi que dans les tumeurs secondaires (les métastases), principalement situées au niveau du foie dans ce type de cancer. Nos travaux précédents, ainsi que ceux d’autres groupes, ont démontré que l’immunité mise en place spécifiquement dans l’intestin, jouait un rôle déterminant dans le devenir des tumeurs aussi bien localement dans le colon qu’à distance, dans les métastases hépatiques ou dans d’autres localisations métastatiques. La réponse immunitaire, développée localement dans l’intestin, est très particulière et comprend notamment des lymphocytes intestinaux spécifiques (cellules immunitaires « tueuses » de tumeurs), qui ont des propriétés et des caractéristiques différentes des lymphocytes localisés dans les autres organes. Dans les modèles murins, ces lymphocytes intestinaux spécifiques ont la capacité, après avoir été activés par les tumeurs de colon, de sortir de l’intestin, migrer dans l’organisme et aller infiltrer et éliminer des tumeurs « extra-intestinales » localisées par exemple dans le foie ou sous la peau. Ainsi, pour étudier ces lymphoyctes intestinaux spécifiques, leurs voies d’activation dans l’intestin, leurs « super-propriétés » anti-tumorales, leurs migrations dans l’organisme, nous devons reproduire la maladie dans sa complexité multi-tumorale chez l’animal, avec des tumeurs primitives localisées dans l’intestin (dans le colon) et des métastases à distance. A terme, étudier ces cellules « tueuses » de l’intestin, nous permettra d’exploiter i) leur potentiel à représenter chez le patient un marqueur biologique (biomarqueur) traduisant la réponse aux thérapies ou ii) leur potentiel à représenter une cible thérapeutique, par exemple pour le développement d’un vaccin.
Bénéfices attendus
Dans le but d’améliorer la prise en charge des patients souffrant de cancer colorectal métastatique, nous utilisons dans ce projet des modèles précliniques afin d’étudier en détail les lymphocytes intestinaux spécifiques "cellules immunitaires tueuses de tumeurs" chez la souris. Nous avons montré que ces cellules sont particulièrement performantes pour éliminer les tumeurs primitives de colon mais aussi leurs métastases (tumeurs secondaires à distance). Nous avons récemment publié des travaux scientifiques dans lesquels nous avions déjà utilisé ces modèles précliniques, ainsi que des cohortes de patients. Nous avons également breveté l’énorme potentiel clinique derrière l’exploitation de ces cellules antitumorales mais beaucoup reste à faire et plusieurs bénéfices sur la prise en charge des patients peuvent decouler de notre projet. Nous pensons que ces lymphocytes spécifiques, provenant de l’intestin, pourraient être augmentés dans la circulation sanguine lors d’un cancer colorectal métastatique, chez les patients avec un bon pronostic. Ainsi, ces cellules pourraient être utilisées comme biomarqueur d’une bonne réponse des patients aux immunothérapies. De plus, nous pensons que ces cellules intestinales ont des meilleures capacités anti-tumorales comparées à des lymphocytes non intestinaux. Il serait potentiellement possible, à l’avenir, de les exploiter pour le développement de vaccins anti-cancer colorectal métastatique chez la souris, puis chez l’homme.
Procédures
Les animaux sont soumis à: 1) des procédures d'implantation de cellules tumorales par voie sous-cutanée mais aussi par chirurgie au niveau du colon et du foie (1 seule fois par animal et dure 5 min par animal) 2) des procédures d'injection intra-péritonéale d’anesthésiant (1 fois à l'implantation du cancer, 2 min par animal), de substrat ( 12 fois par animal, sur souris déjà anesthésiée et dure 2 min par animal à chaque mesure lors du suivi d’imagerie), de traitements (3 fois par animal, elle dure 2 min par animal) 3) une procédure d'administration sous-cutanée de vaccin (2 fois par animal, elle prendra 5 min par animal) 4) un prélèvement sanguin dans la veine maxillaire qui dure 2 minutes par animal 5) des prélèvements de fécès sur animal vigile, 6 fois max par animal, qui dure entre 5 sec et 2 min. L’anesthésie par voie gaseuse sera effectuée 13 fois par animal (12 fois pour le suivi biolum, 1 fois pour l’euthanasie).
Impact sur les animaux
L’injection des tumeurs requiert une intervention modérée et nécessite une contention (indolore) puis un positionnement sur les masques pour induction d’endormissement. L’injection des lignées tumorales dans les différents organes nécessite de piquer avec une aiguille de très faible diamètre, et n’aura lieu qu’une seule fois, sur des animaux endormis, évitant ainsi douleur ou stress. Pour l’injection des traitements, les animaux recevront maximum 3 doses, au début du développement de leur tumeur avec une préhension des souris à chaque fois (temps limité à moins de 30sec) et une piqûre avec une aiguille de très faible diamètre (douleur légère et de courte durée). Pour les mesures de suivi de développement tumoral, les animaux seront régulièrement attrapés (3x/semaine, induisant un léger stress). Nous veillerons à ce que le même expérimentateur suive et traite les souris, afin de créer au maximum une habituation, limitant le stress lié à la contention et à l’injection.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort. Des mesures seront effectuées, des tumeurs, ainsi qu'un grand nombre d'organes/de compartiments associés aux tumeurs, seront prélevés post-mortem. Ces organes comprennent: tumeurs, sang, organes lymphoides secondaires (ganglions lymphatiques, rate), organes sains en bordure de tumeurs (poumons, muqueuse orale, peau). Ces organes ainsi que les cellules immunitaires extraites seront analysés par des approches de protéomique et de transcriptomique.
Remplacement
Notre projet a pour but de comprendre comment l’immunité localement développée dans l’intestin, en particulier par des tumeurs intestinales lors d’un cancer colorectal métastatique, peut impacter l’organisme entier. Pour cela, nous avons absolument besoin d’utiliser un organisme entier, afin d’explorer une immunité locale, intégrant tous les composants cellulaires et la complexité de tumeurs localisées dans le colon et dans d’autres organes (le foie, la peau). Les tumeurs doivent se développer dans leur organe d’origine, afin de développer une architecture, une vascularisation, un réseau cellulaire au plus proche de la réalité d’un organisme. Par ailleurs, nous travaillons sur la migration des cellules immunitaires entre les orgranes ou entre les tumeurs (du colon vers le foie, du colon vers la peau). Pour cela, nous devons travailler sur un système vasculaire et lymphatique complet, tel que l’on peut retrouver uniquement dans un organisme entier. Les études déjà réalisées ex vivo ou in vitro (par exemple dans des organoïdes ou des flasques de culture) ne permettent pas de conserver et reconstituer le microenvironnement des tumeurs et de reproduire sa constitution globale, son évolution complète, sa vascularisation et ainsi que le réseau vasculaire élaboré reliant plusieurs tumeurs dans l’organisme, tels qu’ils ont lieu in vivo. Ainsi, nous ne pouvons pas Remplacer le modèle animal in vivo.
Réduction
Afin de Réduire le nombre d’animaux en expérimentation, une étude complète de la littérature concernant notre projet a été effectuée pour de ne pas reproduire des résultats d’expériences déjà effectuées sur des animaux. Par ailleurs, nous utiliserons des tests statistiques afin de valider nos résultats, standardiser et limiter le nombre d’expériences à effectuer, réduisant ainsi le nombre d’animaux. Nous limitons nos expériences au nombre de 2 (et non 3 comme classiquement fait dans la littérature) car au vu du nombre d’animaux inclus dans chaque groupe, cela suffit pour obtenir des statistiques solides sur nos expériences. Nous concevons également nos expériences afin d'obtenir un maximum d'informations par animal testé, en prélevant en fin d’expérience un nombre important d’organes et de compartiments chez l’animal, ce qui évite l'utilisation d'animaux supplémentaires. Toutes les mises au point sur l’utilisation de ces modèles précliniques ont déjà été validée dans nos précédentes études, de façon la plus rigoureuse et solide possible (dose de cellules à implanter, fenêtre de traitements et de prélèvements). Ainsi, nos protocoles expérimentaux sont verouillés et suivis à la lettre, afin que chaque expérience réalisée dans ce projet soit reproductible et comparables aux autres et que des animaux ne soient pas injectés en vain.
Raffinement
Pour optimiser le Raffinement, notre long recul (>18 ans) sur ces modèles permettra d'évaluer précisément l’apparition de souffrance. Moins de 15% des animaux développeront un cancer au delà du 14eme jour. Un suivi quotidien permettra d’anticiper et d'euthanasier immédiatement les animaux en cas d’apparition de douleur ou de stress. Aucun animal ne sera maintenu en souffrance, ils seront euthanasiés en anticipation du point limite. Toutes les procédures seront réalisées sous narcolepsie. Notre expérience nous permet de réaliser des gestes rapides et précis pour les implantations, diminuant ainsi le temps de manipulation des animaux. Pour les chirurgies, les animaux seront sous analgésie et co-analgésique myorelaxant. Les animaux seront opérés sur des tapis chauffants, jusqu’à leur réveil pour éviter l’hypothermie. Le risque d’hypoventilation sera diminué par oxygénation des animaux opérés. Du gel occulaire sera déposé sur leurs yeux pour éviter le dessèchement. De plus, lors des chirurgies, nous veillerons à bien refermer la membrane péritonéale et la peau séparément afin de ne pas entrainer des adhérences et réduire la douleur post-opératoire. Après intervention, les animaux seront remis en cages, sous surveillance, et les cages ne seront enclenchées sur les portoirs ventilés qu’une fois les animaux bien vigiles, afin d’éviter que la ventilation du rack ne provoque une hypothermie chez les souris. En général, aucun signe de souffrance des animaux n 'est observé dans les jours qui suivent les implantations de tumeurs. Cependant, si des signes de douleur ou stress venaient à apparaitre rapidement en post-opératoire (4 ou 5 jours), cela serait exceptionnel et inhabituel et la décision d’euthanasier les animaux serait immédiatement prise. Cela conduirait à l'exclusion de ces animaux de nos expériences. Les conditions d’hébergement suivront les recommandations de la directive européenne en vigueur. Les souris recevront une alimentation enrichie ainsi que des granulés alimentaires déposés dans les cages afin de limiter le redressement pour se nourrir. Du papier absorbant, des lanières de papier kraft, des rouleaux de carton seront placés dans les cages afin d’améliorer le bien-être des animaux, réduire l’ennui, et leur donner la possibilité de satisfaire leur instinct de nidification. Ces produits d'enrichissement contribuent à diminuer le stress et facilitent la thermorégulation des animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les expériences menées dans le domaine de l’onco-immunologie car: -d’apres la litérature scientifique, le système immunitaire murin, proche de celui de l’Homme est pertinent pour étudier et comprendre le système immunitaire humain. -leur petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo. -la biodisponibilité. Les souris adultes seront utilisées pour le projet (à partir de 6 à 8 semaines). En effet nous nous intéressons à la pathologie du cancer épithélial humain chez l’adulte.
Rythmes cérébraux hippocampiques et codage neuronal chez les souris modèle des troubles du spectre autistique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour étudier comment l'hippocampe rejoue les expériences vécues, 356 souris porteuses de mutations liées à l'autisme vont être utilisées : 196 opérées et enregistrées sous anesthésie profonde sans jamais se réveiller, 160 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Ces dernières reçoivent des électrodes intracrâniennes au cours d'une chirurgie stéréotaxique de deux heures, puis sont enregistrées une heure par jour pendant deux semaines, pendant qu'elles explorent une arène ou dorment, hébergées seules jusqu'à cinq semaines. Le porteur signale que certains souriceaux porteurs de la mutation meurent à la naissance d'une hypotonie générale, et que d'autres animaux perdent leur implant par choc accidentel. La surveillance repose sur des points limites de bien-être général qui déclenchent des soins ou la mise à mort, dont les seuils ne sont pas donnés.
Objectifs
La sensibilité extrême aux informations sensorielles des personnes autistes sous-entend un traitement cérébral de l’information bien particulier. Ce projet a donc pour objectif d’étudier les propriétés du traitement cérébral de l’information chez des souris reproduisant des traits observables dans les troubles du spectre de l’autisme. Plus précisément, nous étudierons l’activité de groupes de neurones présents dans une région du cerveau appelée hippocampe, structure impliquée dans la mémoire épisodique (mémoire des évènements autobiographiques -vécus à la première personne) et sociale. Il a été montré, chez le rongeur puis chez l’Homme, que lorsque nous vivons une expérience certains neurones de cette structure s’activent dans un ordre temporel précis qui récapitule, dans une fenêtre temporelle réduite (quelques millisecondes) cette même expérience. Lorsque l’individu est hors contexte, ces mêmes neurones reproduisent à nouveau cette même activité séquentielle, rejouant sans la vivre directement l’expérience passée. Or, cette propriété de réactivation séquentielle, rendue possible par l’architecture des circuits neuronaux de l’hippocampe, joue un rôle primordial dans la mémoire et l’apprentissage. Puisque l’architecture neuronale de l’hippocampe est altérée chez la personne autiste et dans les modèles de l’autisme, nous émettons hypothèse qu’une des traits comportementaux propre à la personne autiste est due à une anomalie de ce traitement séquentiel. Nous tenterons de caractériser ces altérations ainsi que les mécanismes responsables de ces déficits chez des souris reproduisant des traits observables dans les troubles du spectre de l’autisme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes physiologiques responsables des déficits cognitifs propres aux troubles du spectre autistique. A long terme, ceci pourrait permettre l'élaboration de traitements prévenant ou rémidiant à ces déficits.
Procédures
Un groupe d’animaux subira des enregistrements électrophysiologiques intracrâniens sous anesthésie profonde suivie de chirurgie terminale sous anesthésie. Le deuxième groupe se verra implanter des électrodes intracrâniennes sous chirurgie stéréotaxique (2h). Ceci se fera sous anesthésie gazeuse, anesthésie locale et analgesie. Une semaine plus tard l'activité cérébrale sera enregistrée alors que l’animal explore une arène circulaire et lors de phases de sommeil, pour un total d'une heure par session, une session par jour pour un maximum de deux semaines. A la fin des enregistrements, les animaux seront soumis à une chirurgie terminale sous anesthésie profonde et analgesie. Une fois implantés les animaux seront hébergés en individuel pour 5 semaines maximum (3 semaines en moyenne), le temps des enregistrements.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables suivants sont attendus : l'anesthésie peut engendrer une détresse respiratoire; il peut survenir une douleur post-opératoire; un stress associé à l'isolement d'une partie des animaux ; un stress associé à la manipulation par l'experimentateur; la perte des implants par choc accidentel; la mort à la naissance de certaines souris portant le gène d'autisme (hypotonie générale). Les souris Nudes ont un phénotype dommageable et sont hébergées dans une animalerie adaptée (SOPF). Pour l'expérimentation, elles sont transférées dans une animalerie conventionnelle sous armoire ventilée pour une utilisation immédiate et sans réveil.
Devenir
Les animaux seront mis a mort et les cerveaux prélevés post-mortem caractériser leur état histologique et révéler la localisation des électrodes après les enregistrements.
Remplacement
L’étude de l’intégrité des oscillations hippocampique et de leurs fonctions nécessite l’observation de systèmes neuronaux intacts. Par conséquent, cette étude ne peut se faire que sur l’animal soit vigile en comportement, soit anesthésié. Ceci rend donc impossible l’utilisation de modèle in silico ou d'organoides. A ce jour, très peu d'enregistrements électrophysiologiques de l’activité hippocampique ont été réalisés chez les souris porteuses des gènes impliqués dans l'autisme que nous étudions. Nous avons opté pour l’utilisation de souris plutôt que de rat étant donné que les modèles d’autismes qui nous intéressent nécessitent la réalisation de mutation de gènes. La souris présente davantage de bénéfices étant donné l’accessibilité expérimentale (la réalisation de mutation génétique est plus simple que sur d’autres modèles).
Réduction
Afin de réduire au maximum les éventuelles souffrances induites par les chirurgies ainsi que le nombre d’animaux, la procédure d’enregistrements sous anesthésie (Procédure 1) a été mise en place pour déterminer en premier lieu, les phénotypes électrophysiologiques propres à nos modèles. Ainsi, elle permet de préciser à l’avance les paramètres et patrons à examiner lors des enregistrements chez l’animal en comportement. Par exemple si nos enregistrements anesthésiés révèlent une anomalie spécifique à un certain rythme cérébral dans une structure et non une autre, nous n’étudierons que la structure impliquée et le comportement auquel elle est associée. Ceci nous permettra donc de limiter le nombre d’implantation à des fins d’enregistrements en comportement. L’avancée technologique concernant la miniaturisation des systèmes électroniques et d’électrodes permet maintenant d’enregistrer un grand nombre de canaux, sur de multiples sites simultanément. Un grand nombre de nos analyses reposant sur le nombre de cellules enregistrées , ces progrès nous permettent de diminuer fortement le nombre de souris utilisées. Pour les souris des portées de modèles autistiques, les animaux présentant le génotype requis par l’étude constitueront la population cible ; les animaux ne présentant pas le génotype requis seront aussi étudiés en tant que contrôles de la population cible, réduisant le nombre de portées à produire dans le cadre de cette procédure. De même, les mâles et femelles seront étudiés dans le cadre des procédures TSA, aboutissant à une utilisation de l’ensemble des animaux de chaque portées. Enfin, les données obtenues au cours du projet seront mises à disposition de la communauté scientifique pour analyses complémentaires et utilisation dans des modèles computationnels. Les animaux sont préparés par petites séries de 4 ou 5 et les résultats analysés au fur et à mesure, ce qui permet d'ajuster le nombre final d'animaux utilisés, la procédure s'arrêtant dès que le nombre de 10 expériences réussies par groupe est atteint.
Raffinement
Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture, sera évalué régulièrement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). La souffrance animale est minimisée par les conditions d'élevage (cages collectives, les animaux sont mis en présence de matériel d’enrichissement : un dôme en carton permettant la nidification (sauf protocole 2) , une tige de papier pouvant être rongée et faisant aussi office de matériel de nidification, ainsi qu’une briquette en bois pour le rongeage), le suivi des règles de l'art pour les interventions chirurgicales (aseptie, anesthésie et antalgie, regulation thermique), le suivi régulier des animaux par le chercheur responsable et par le personnel animalier (définition de points limites de bien être général qui déclenchent soins particuliers, voire euthanasie, selon leur gravité). Les animaux sont conservés le minimum de temps nécessaire au projet, dès lors qu’ils ont atteint l’âge adulte. Les souris sont habitués progressivement à la manipulation afin de minimiser le stress. Bien que les animaux soient sujets à une mutation génétique, ces derniers ne présentent aucun phénotype dommageable s’ils ont survécu à la naissance. Enfin les animaux ont un accès illimité à l'eau et la nourriture.
Choix des espèces
Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. C'est également l'espèce de choix pour modéliser la pathologie cérébrale concernée par cette étude, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique, facilité d'élevage, pertinance par rapport aux pathologies chez l'humain) et les dommages éventuels (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives, notamment des aspectis sociaux et de mémoire spatiale, a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus au sein de l’équipe et avec la communauté scientifique ainsi qu’une minimisation du nombre d'animaux utilisés. Les animaux seront de jeunes adultes (7-8 semaines) puisque nous nous intéressons à un système nerveux mature. Nous voulons aussi minimiser autant que possible la durée d'élevage en conditions d'animalerie de laboratoire.
Etude de deux peptides sur leur effet thérapeutique potentiel dans un modèle murin de maladie neurodégénérative impliquant la protéine Tau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris de ce projet portent une mutation du gène Tau qui leur fait développer, à partir de quatre mois, une paralysie progressive des membres postérieurs. 676 d'entre elles vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 436 et modéré pour 240. 240 subissent une biopsie de la queue pour génotypage et 304 une injection dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, geste qui peut provoquer une ulcération de la cornée ou une exophtalmie, afin de faire produire dans leurs neurones un fragment de protéine censé bloquer l'agrégation de Tau. Certaines sont tuées un mois après l'injection, d'autres à cinq mois pour éviter des symptômes moteurs plus graves, et d'autres encore, écrit le porteur, "pour fin d'accouplement et génotype sans intérêt".
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est notamment caractérisée par le dysfonctionnement de la protéine Tau dans les neurones du système nerveux central. Cette protéine, dont la dégradation normale est altérée dans la maladie, s’accumule et s’agrège de façon toxique dans les neurones et finit par entraîner la dégénérescence du cerveau. Nous avons mis en évidence qu’une protéine X interagissait avec Tau. Nous avons également constaté que l’expression de cette protéine X est faible dans le cerveau de patients atteint de la maladie d'Alzheimer et que cette baisse est associée à l’apparition des formes pathologiques de Tau dans les neurones. La partie de la protéine X impliquée dans l’inhibition de l'agrégation de la protéine Tau a été identifiée. Nous proposons dans ce projet d’étudier l’impact thérapeutique potentiel de cette partie de la protéine X sur la progression de cette maladie de Tau chez la souris. Pour cela, nous disposons au laboratoire d’un modèle de souris porteur d’une mutation du gène de Tau générant une maladie proche de la maladie d'Alzheimer et présentant une accumulation de Tau dans les neurones du cerveau et de la moelle épinière. Notre objectif à court terme est de produire dans le cerveau et la moelle épinière de souris deux formes plus ou moins longue de cette partie de la protéine X afin de déterminer à moyen terme leur efficacité à ralentir/guérir la maladie.
Bénéfices attendus
Si la production dans les neurones des parties de la protéine X, dont nous savons qu'elles sont capables d'empêcher l'agrégation de Tau, agit sur l'évolution de la maladie chez ces souris, de nouvelles perspectives thérapeutiques seraient envisageables chez l'homme atteint de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Une biopsie de la queue de courte durée sera effectué sur 240 animaux. Pour l'expérimentation, 304 animaux issus d'accouplement de souris homozygotes Tau seront soumis à une injection intraveineuse. Une injection rapide (moins de 20 secondes) est effectuée sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Certaines souris seront génotypées. La contention et la biopsie de queue sont des gestes bien maîtrisés mais qui peuvent générer de légères douleurs et un court moment de stress chez la souris. Le modèle de souris Tau présente un trouble moteur se développant spontanément et progressivement à partir de 4 mois d’âge et développe une paralysie légère et progressive des membres inférieurs pénalisant la mobilité de la souris. Les expériences d’injection intraveineuse dans le sinus rétro-orbitaire peuvent présenter dans de très rares cas une opacité/ulcération de la cornée ou une exophtalmie.
Devenir
Certaines souris seront euthanasiées pour fin d'accouplement et génotype sans intérêt. D'autres seront euthanasiés à 1 mois post-injection et cela avant l'apparition des troubles moteurs (à partir de 4 mois) pour vérifier la présence de la partie de la protéine X dans les neurones. Enfin certaines souris vieilliront jusqu'à 5 mois d'âge pour vérifier l'effet de la partie de la protéine X sur l'agrégation de Tau dans les neurones, âge auquel elles seront toutes euthanasiées pour limiter l'apparition de symptôme moteur plus grave pour les souris.
Remplacement
Nos résultats obtenus sur des neurones en culture tendent à montrer un effet inhibiteur de cette partie de la protéine X sur l’agrégation et l’accumulation de la protéine Tau. Le passage sur un modèle souris est nécessaire pour évaluer les bénéfices potentiels de ces fragments de protéine au plan moléculaire et surtout au plan fonctionnel sur la motricité de l'animal. En effet, nous voulons voir dans ce modèle si ces fragments peuvent 1) être exprimé dans les neurones, 2) protéger ces cellules de la toxicité de Tau et 3) prévenir une perte fonctionnelle lié à la toxicité de ces neurones. N’ayant aucun autre modèle disponible pour cette évaluation indispensable avant des études possible chez l’homme, ce passage sur modèle animal est incontournable.
Réduction
Nous récupérerons les cerveaux et moelles épinières des animaux soumis aux tests de motricité pour l’analyse moléculaire. Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à notre étude, le cerveau et la moelle épinière de chaque souris seront coupés en deux. Chaque partie sera analysée par deux types d'analyses. Le calcul du nombre d'animaux nécessaire a été effectué par des tests statistiques et basé sur une comparaison de deux moyennes (témoins/traités) au cours du temps dans chaque expérience.
Raffinement
Le modèle de souris utilisé présente un trouble moteur léger à partir de 4 mois d’âge qui progresse jusqu’à 5 mois d’âge. Afin de limiter une possible souffrance de l’animal liée à un trouble moteur, la nourriture sera déposée directement et systématiquement dans la cage à partir de 4 mois d’âge. L’ensemble des expériences d’injection seront réalisées sur des souris anesthésiées. Une observation attentive de la douleur sera effectuée. Après réveil de l’animal, une évaluation hebdomadaire du mal être des animaux basée sur une observation attentive de 5 minutes du comportement de l'animal, sera effectuée par l’expérimentateur et/ou les animaliers sur différents critères (voir tableau scoring). Des analgésiques pourront être administrés par voie sous cutanée pour réduire au minimum une possible souffrance des animaux. Cette observation sera renforcée par un portoir dit "intelligent" dans lequel les souris seront analysées sur leurs motricité 24h/24h, 7j/7j. Cette activité nous permetta d’identifier les cages de souris présentant des niveaux de motricité anormales (agressivité, immobilité …) et d'intervenir précocément pour améliorer en conséquence le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Etant donné nos résultats positifs sur l’efficacité de la région de la protéine X à inhiber l’agrégation de la protéine Tau purifiée, nous avons choisi d’étudier ce modèle murin qui présente certaines anomalies observées dans la pathologie humaine aussi bien sur le plan moléculaire que comportemental. Ce modèle, déjà bien caractérisé, fait l’objet de nombreuses publications scientifiques et nous donne une bonne base de travail pour la mise en place de ce projet. La production de la région d'intérêt de la protéine X sera induite à 1 (stade précoce) et 3 (stade médian) mois d'âge; l’évolution de la tauopathie sera suivie au niveau moléculaire et fonctionnel sur la locomotion des souris et comparée à l’évolution des animaux témoins.
Etude de la neuro-inflammation et du rôle de l’axe intestin cerveau dans un modèle murin d’anorexie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Une perte de poids de 25 % imposée sur quarante-quatre jours, chaque animal isolé en cage individuelle pendant toute la durée du protocole : 432 souris sont soumises à cette dénutrition chronique, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé. Elles passent un test clair-obscur de quinze minutes et un test de construction de nid, 144 d'entre elles reçoivent en plus une injection intrapéritonéale par jour pendant cinq jours, et 36 boivent un cocktail d'antibiotiques pendant quarante-sept jours. Le porteur décrit pourtant ce modèle comme entraînant des "altérations du bien-être animal plus faibles" et un "taux de mortalité nul", par comparaison avec la version aiguë du même protocole. Toutes sont tuées à la fin pour l'étude de leurs tissus, une partie des prélèvements pouvant être échangée avec d'autres projets travaillant sur le même modèle d'anorexie.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont, premièrement, de rechercher la présence d'une inflammation au niveau cérébral (neuroinflammation) dans un modèle d'anorexie chronique chez la souris : le modèle Activity-Based Anorexia. Le second objectif de ce projet est d'évaluer le rôle potentiel du microbiote intestinal dans ce phénomène inflammatoire, via l'axe microbiote-intestin-cerveau. Deux zones d'intérêt seront particulièrement étudiées, au niveau du cerveau : l'hypothalamus, de par son rôle majeur dans le contrôle du métabolisme énergétique et de la prise alimentaire, mais aussi le circuit de la récompense, impliqué dans la composante du plaisir de la régulation du comportement alimentaire. En effet, les patients souffrant d'anorexie mentale présentent des atteintes cérébrales telles qu'une diminution des facultés cognitives, une baisse du volume cérébral et des anomalies de sécrétions d'hormones du métabolisme énergétique, ce qui justifie l'étude du cerveau dans le modèle murin d'anorexie. Ce projet permettrait d’apporter de nouvelles connaissances sur le fonctionnement du cerveau de ces patients et le rôle du microbiote intestinal dans le contexte de l'anorexie, afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques innovantes pour dépasser ces freins à la renutrition.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra de mettre en évidence l'existence ou l'absence de processus inflammatoires au niveau cérébral dans un contexte d'anorexie. Si de tels phénomènes sont montrés, nous pourront alors caractériser le rôle du microbiote intestinal, et notamment d'une molécule reliant le microbiote intestinal et la structure de l’intestin, dans la neuroinflammation associée à l'anorexie. Cette molécule étant connue pour son implication dans la régulation du comportement alimentaire. Il n'est pas possible de montrer de tels phénomènes chez l'Homme, l'accès au tissu cérébral étant nécessaire. L'utilisation d'un modèle animal est donc indispensable à la réalisation de ce projet. D'un point de vue fondamental, ces recherches permettront également de décrire l'activité et le phénotype des cellules gliales, les cellules non neuronales du cerveau, en condition de restriction sévère, ainsi que leurs interactions avec les centres cérébraux de régulation de la prise alimentaire. Il est également à noter que ce projet permettra de mieux caractériser le modèle ctivity-based anorexia sous sa forme chronique (44 jours), modèle moins bien décrit dans la littérature que le modèle aigu (17 jours), bien qu'il soit plus pertinent quant à sa comparaison avec la pathologie chez l'Homme, et moins sévère pour les souris (score de mortalité nul). De plus, il est habituellement observé chez les souris activity-based anorexia femelles une augmentation de la prise alimentaire et du poids corporel en fin de protocole, les souris s'éloignant ainsi de la pathologie anorexique souhaitée. Ce phénomène est évité dans le modèle chronique, puisque la prise alimentaire est contrôlée par l'expérimentateur. Le poids corporel cible des souris est ainsi maintenu stable tout le long du protocole. Sur le long terme, ce projet permettra une meilleure compréhension de l’interconnexion des acteurs de l'axe microbiote-intestin-cerveau dans un contexte de dénutrition chronique, et plus particulièrement le rôle du microbiote intestinal dans la neuroinflammation et le comportement alimentaire, ce qui permettra de proposer des solutions thérapeutiques innovantes pour aider à la renutrition des patients anorexiques, par exemple avec des probiotiques ou par la modulation directe de facteurs de l'inflammation.
Procédures
100% des animaux, soit 432, seront manipulés tous les jours pour la pesée et le relevé des critères de bien-être animal. Les 432 animaux seront en état de dénutrition chronique (perte de poids cible de 25% sur 44 jours). 100% des animaux, soit 432, subiront une injection d'anesthésique/analgésique de 3 secondes, ainsi qu'une contention de 2 min pour la mesure de la composition corporelle deux fois, au début et en fin de protocole, sur animal vigile. Les 432 animaux suivront des tests comportementaux afin d'évaluer leur état d'anxiété et de dépression, à savoir un test clair-obscur de 15 minutes (animaux placés dans un dispositif infra-rouge enregistrant leurs déplacements) qui peut générer un stress dû au nouvel environnement, et un test de formation de nid (nouveau coton placé dans la cage, évaluation par observation au bout de 24h, le coton est laissé aux souris jusqu’à la fin du protocole en tant qu’enrichissement) qui n'engendre ni stress ni douleur. 144 animaux recevront une injection intrapéritonéale de 3 secondes une fois par jour pendant 5 jours consécutifs, afin d’évaluer le rôle d’une molécule clé dans le dialogue bactérie-cellules intestinales. 36 souris auront un cocktail d'antibiotiques dans leur eau de boisson sur l'ensemble du protocole de restriction et 3 jours en amont, soit 47 jours.
Impact sur les animaux
L’ensemble des animaux seront isolés le temps du protocole, avec un faible impact sur le score de bien-être animal pour les animaux contrôles, comme observé dans nos protocoles précédents. Les animaux dénutris, quant à eux, peuvent présenter une diminution de la prise hydrique, et une hyperactivité anticipatoire (avant l'accès à l'alimentation), particulièrement les premiers jours de restriction. Cependant, ce modèle chronique reposant sur une restriction quantitative adaptée au poids corporel de chaque animal, les altérations du bien-être animal sont plus faibles et associées à un taux de mortalité nul, par rapport au modèle activity-based anorexia aigu habituellement employé qui repose sur une restriction temporelle identique pour chaque animal. Les animaux dénutris ont tout de même une perte de poids importante au cours du protocole, en accord avec ce qui est observé en clinique, cet aspect fait l’objet d’un suivi quotidien. Le suivi du bien-être animal est en effet effectué quotidiennement, les points suivants sont évalués : état du pelage, niveau de prostration, état de fatigue, perte de poids, prise hydrique et activité physique, baisse de la température corporelle. Lors des mesures de composition corporelle, la contention de 2 minutes engendre également un stress aigu. La réalisation des tests comportementaux peut également engendrer un stress, de par le changement de pièce d'expérimentation, et la découverte du dispositif. Les animaux dont le microbiote intestinal a été supprimé par antibiothérapie peuvent présenter des signes de douleurs intestinales, de la même manière que précédemment, ces animaux sont surveillés quotidiennement sur la base de critères de bien-être animal. Concernant les animaux génétiquement modifiés, aucune nuisance n'est donc observée sur ces animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux seront mis à mort pour l’étude de leurs tissus à la fin du protocole et des procédures. Une utilisation conjointe sur plusieurs projets peut être envisagée, soit la récupération de tissus non utilisés lors de ce projet ou inversement sur d’autres projets activity-based anorexia ne récupérant pas le cerveau.
Remplacement
Ce travail est un projet de recherche intégré, la dénutrition étant la conséquence de relations métaboliques inter-organes complexes. Il permettra d’analyser les différents signaux mettant en jeu des relations importantes entre le microbiote intestinal, l’intestin et le cerveau. Le recours à des modèles animaux est donc nécessaire pour prendre en compte cet aspect multi-organes. De plus, l'anorexie mentale étant une pathologie psychiatrique, l'étude du comportement (prise alimentaire, activité physique, tests d'anxiété) est nécessaire à l'interprétation des résultats. Ces paramètres comportementaux nécessitent l'emploi de modèles de rongueurs. Cependant pour des études plus mécanistiques telle que l’étude des relations microbiote-cellules intestinales, nous avons recours à des techniques de culture cellulaire in vitro.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, en prenant en compte les résultats de la littérature et de notre équipe sur le modèle activity-based anorexia aigu, nous avons fait le choix de ne pas réaliser certains groupes contrôles et notamment les animaux ayant un accès libre à l’alimentation et à une roue d’activité. En phase terminale du protocole, le maximum de tissus est prélevé et certains peuvent être partagés pour d'autres projets. Les analyses ont été préalablement optimisées et nous permettent de limiter le nombre d’animaux par groupe à 12. Le modèle activity-based anorexia chronique reposant sur une restriction quantitative adaptée au poids corporel de chaque animal, les altérations du bien-être animal sont plus faibles et associées à un taux de mortalité nul, par rapport au modèle activity-based anorexia aigu habituellement employé qui repose sur une restriction temporelle identique pour chaque animal. Il n'est donc pas nécessaire de prévoir plus d'animaux pour compenser une éventuelle perte au cours du protocole. Plus précisément, nous nous sommes basés sur de premiers résultats antérieurs du laboratoire dans le modèle activity-based anorexia aigu et avons calculé à l’aide de formules statistiques qu’il faudrait 12 animaux par groupes pour obtenir un pouvoir statistique suffisant pour la comparaison des groupes entre eux.
Raffinement
Après la période d'acclimatation à l'animalerie d'une semaine, les animaux sont transférés individuellement dans leur cage d'expérimentation. Ce transfert peut s'avérer stressant pour les animaux, c'est pourquoi une nouvelle période d'une semaine d'acclimatation à ces nouvelles conditions est appliquée. Concernant l'enrichissement, du papier kraft est ajouté dans toutes les cages, ainsi qu’un carré de coton ce qui permet la construction de nids pour compenser l'isolement des souris. Le modèle activity-based anorexia chronique reposant sur une restriction quantitative adaptée au poids corporel de chaque animal, les altérations du bien-être animal sont plus faibles et associées à un taux de mortalité nul, par rapport au modèle activity-based anorexia aigu habituellement employé qui repose sur une restriction temporelle identique pour chaque animal. Le suivi du bien-être animal est tout de même effectué quotidiennement, les points suivants sont évalués : état du pelage, niveau de prostration, état de fatigue, perte de poids, prise hydrique, activité physique et baisse de la température corporelle. Ces critères permettent de décider de l'atteinte ou non des points limites. De plus, comme indiqué dans les dernières recommandations, les souris sont manipulées quotidiennement en les faisant monter dans le creux de la main de l'expérimentateur de manière volontaire, et non pas en les attrapant par la queue. En effet, il a été montré que cela réduit significativement le stress et l'anxiété des souris. Un seul et même expérimentateur réalise les manipulations des animaux au quotidien, ce qui permet une meilleure habituation des animaux aux gestes pratiqués et à la présence d'un individu, réduisant le stress. L’antibiothérapie, pour les animaux concernés, est réalisée dans l’eau de boisson et non par administration orale comme fréquemment retrouvé dans la littérature, ce qui limite le stress des animaux et les risques liés à l’administration orale.
Choix des espèces
La souche de souris utilisée dans ce projet est communément utilisée dans les modèles soumis à des interventions nutritionnelles. De plus, il s’agit d’une souche ayant un bon taux de réponse dans le modèle activity-based anorexia. C’est un modèle validé au sein du laboratoire et à l’échelle internationale. Les modèles génétiques utilisés dans ce projet sont d’ailleurs construits sur ces mêmes souris. L'anorexie mentale touche majoritairement les adolescents et jeunes adultes avec 75% des patients déclenchant leur pathologie avant l'âge de 22 ans. Pour mimer au mieux les conditions d'apparition de la maladie nous utiliserons donc des souris de 6 semaines à leur arrivée au laboratoire. En tenant compte des deux semaines d'acclimatation, à l'animalerie puis aux conditions expérimentales, le protocole de restriction débutera sur des souris âgées de 8 semaines, ce qui correspond bien à un stade adolescent. La réussite du protocole activity-based anorexia chronique sur des souris de cet âge a d'ailleurs été montrée dans un article. De la même manière, les animaux arriveront à l'âge de 5 semaines pour les protocoles avec antibiothérapie et pour les animaux génétiquement altérés, afin de tenir compte de ces traitements avant de débuter le protocole de restriction à l'âge de 8 semaines.
Mise en oeuvre des études pharmacocinétiques/pharmacodynamies chez les rongeurs
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 300
Tester des "éléments d'essais" à visée anti-inflammatoire, antibiotique, anticancéreuse ou neurologique et en suivre le passage dans le sang : 4 000 souris et 300 rats vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chaque animal reçoit le produit à l'état vigile, puis subit jusqu'à neuf prélèvements de sang en vingt-quatre heures, avant un prélèvement terminal sous anesthésie. Le porteur reconnaît que les ponctions répétées peuvent provoquer douleur et lésions internes, et présente le micro-prélèvement de 30 µL comme une mesure de réduction, puisqu'il permet de tirer neuf points de mesure du même animal. Sur le remplacement, il renvoie la décision au responsable de chaque étude et affirme qu'"aucune méthode alternative" ne reproduit la diffusion d'un produit à l'échelle de l'"organisme entier", ce qui rendrait "indispensable" le recours à l'animal entier.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de pouvoir conduire différents protocoles dans lesquels différents éléments d'essais seront testés (classe thérapeutique anti-inflammatoire, anti-néoplasique, antibiotique, neurologique principalement) ainsi que l'évaluation des excipients et des produits exploratoires. Suite à ces différentes études, l'objectif est de pouvoir identifier de nouveaux éléments qui pourront par la suite peut être donner lieu à de nouveaux médicaments. Il peut s'agir de conduire des études de pharmacocinétiques (PK) simples: suivre les paramètres de l'élément testé dans les matrices plasma/sérum principalement. Il peut s'agir de conduire des études pharmacocinétique/pharmacodynamique (PK/PD) : suivre les paramètres de l'éléments testés dans les matrices plasma/sérum principalement mais également de suivre les effets de ces éléments testés en suivant certains paramètres biologiques. Il peut s'agir de conduire des études pour mettre en avant les phases Administration, Distribution, Métabolisme et Elimination. Dans ce cas les éléments testés peuvent être suivis dans les fécès.
Bénéfices attendus
L'intéret de ce projet est de pouvoir mener différentes études en testants différents éléments d'essais sur des rongeurs. Cela permettra d'identifier les composés intéressants qui pourront peut être déboucher sur de nouveaux médicaments humains ou vétérinaires. Les différents protocoles entrant dans le scope de ce projet (études PK et/ou PD) seront primordiaux pour avoir des données sur les paramètres phamacocinétiques et pharmacodynamiques des éléments testés afin de déterminer les relations dose/effet.
Procédures
Les animaux seront soumis à différents types d'interventions : -Premier cas: administration de l'élément testé. Cela sera fait sur animal vigile par un personnel formé afin d'éviter tout stress à l'animal, - Puis des prélèvements de sang seront réalisés. En fonction de l'espèce animale, les volumes et le nombre pourront varier. Pour les rats, 9 prélèvements maximum sur 24h. Pour les souris, 9 prélèvements maximum sur 24h. La durée d'un prélèvement est inférieure à la minute. La collecte de fécès pourra se faire dans les cages d'hébergements de manière collective par groupe de molécules testées. Deuxième cas: les animaux placés sous anesthésie générale ( anesthésique gazeux) seront soumis à un prélèvement sanguin terminal. Durée du prélèvement de l'ordre de la minute.
Impact sur les animaux
Suite aux différentes administrations et durant les prélèvements sanguins, les animaux peuvent ressentir du stress, de la peur à la contention. Les prélèvements sanguins seront réalisés à différents sites de prélèvements, cependant il peut y avoir de la douleur, des lésions internes. Tous ces gestes seront réalisés par un personnel expérimenté et formé afin d'éviter au maximum toutes ces nuisances.
Devenir
A la fin de chaque procédure tous les animaux seront mis à mort. Cela sera pratiqué par un personnel expérimenté conformément à la réglementation en vigueur.
Remplacement
Pour les études rentrant dans le scope de ce projet, le responsable de chaque étude s'assurera qu'il n'y a pas de methode de remplacement possible. Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés. Ces techniques de remplacement ne peuvent pas être appliquées dans ce projet.
Réduction
Pour ce projet, il est envisagé d'utiliser environ 300 rats, 4000 souris sur une durée de 5 ans. Le nombre d'animaux inclus dans chaque étude entrant dans le scope de ce projet sera réduit au minimum pour avoir des résultats interprétables. Par exemple, en utilisant la technique du micro sampling (prélèvement de 30 µL de sang par animal), cela permettra de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés car 9 points de prélèvements pourront être réalisés sur le même animal.
Raffinement
Une attention particulière sera portée à l'enrichissement du milieu. Les animaux hébergés en groupe auront, dans leurs hébergements, la présence d'enrichissements variés et renouvelés (buchettes et balles en bois, cachettes, tunnels ...). Les animaux seront observés au minimum une fois par jour pour une prise en charge rapide. Pour préserver les sites de prélèvements au maximum, un point de compression sera réalisé aprés chaque prélèvement avec la possibilité d'appliquer de la glace afin d'éviter la formation d'hématome. Les sites de prélèvements seront alternés autant que possible et le nombre de prélèvement de sang par site sera réduit au minimum. Des points limites ont été défini. Les animaux seront observés quotidiennement et pourront être suivi par le vétérinaire désigné si necessaire.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les espèces majoritairement utilisées dans ces études. Ces espèces sont bien décrites et caractérisées dans la littérature et leur utilisation est conseillée pour les essais de produits pharmaceutiques. Jeunes, adultes ( environ 7 à 12 semaines) Cela dépendra de la cible concernée pour le produit testé.
Eclairage sur MafB : Le chef d’orchestre qui oriente les cellules souches vers la voie myéloïde.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Les souris qui perdent 20 % de leur poids maximum, ou dont le score sur la grille de douleur atteint 10 à 12, sont mises à mort. 4 233 souris vont être utilisées dans ce projet, dont 4 113 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie gazeuse, des injections mimant une infection, et pour certaines une destruction de la moelle osseuse par rayons X suivie d'une greffe de cellules, avec fatigue, hypothermie et perte de poids pendant une quinzaine de jours. Le porteur cherche à établir le rôle d'un facteur de transcription dans la fabrication des globules blancs, et indique que les animaux issus de l'élevage passent d'une procédure à la suivante, les reproducteurs mis à part, avant d'être tués.
Objectifs
L'objectif de notre projet est d'explorer les mécanismes moléculaires permettant la différenciation des cellules souches sanguines, appelées cellules souches hématopoïétiques (CSH), notamment vers la différentiation en globules blancs. Les CSH, résidant dans la moelle osseuse, sont des cellules à longue durée de vie dotées d'une capacité d'auto-renouvellement, nécessaire pour renouveler les différentes cellules composant le sang. En raison de ces caractéristiques, les CSH doivent relever le défi de maintenir un équilibre délicat entre auto-renouvellement et différentiation extensive pour reconstituer les cellules sanguines épuisées. Cet équilibre délicat est crucial pour maintenir l'homéostasie et répondre aux demandes évolutives de l’organisme. Les mécanismes impliqués dans la différenciation des CSHs ne sont pas totalement compris. De par nos résultats antérieurs, le facteur de transcription MafB pourrait jouer un rôle dans cette différenciation. Nous avons montré que les CSH possèdent la capacité de conserver une mémoire des signaux infectieux précédents. Cette mémoire, caractérisée par un ensemble de modifications épigénétiques, a été appelée "immunité entraînée". Ce phénomène a des implications significatives dans la mise en place d’une seconde réponse adaptée à la suite d’un même stimulus. Nos résultats suggèrent que le facteur MafB 1/ joue un rôle dans la différenciation des CSHs en condition homéostatique et inflammatoire (notamment en favorisant la production des cellules myéloïdes (hématies, polynucléaires, monocytes et plaquettes en urgence), 2/ serait impliqué dans la mécanistique de mise en place de la mémoire entrainée des CSH. Alors que MafB est une protéine qui intéragit avec elle-même, dans certains contextes inflammatoires, elle peut former un complexe avec un autre facteur Fos qui pourra potentiellement impacter la différenciation des CSHs et la mise en place mise en place de la mémoire entraînée. Notre projet aura donc pour objectifs: 1/ l’étude du rôle de MafB dans les mécanismes impliqués dans la différenciation des CSHs en conditions homéostatiques ; 2/ l’étude du rôle de MafB dans les mécanismes impliqués dans la différenciation des CSHs en conditions inflammatoires de type myélopoïèse d'urgence et dans l’immunité entrainée au niveau des modifications épigénétiques induites par la primostimulation, 3/ la capacité des CSHs à reconstituer totalement une moelle osseuse en absence de MafB ou en présence du complexe MafB/Fos
Bénéfices attendus
L’étude de la différenciation des CSHs présente de nombreux bénéfices potentiels, tant pour la recherche fondamentale que pour les applications cliniques. Sur le plan scientifique, elle permet de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui régulent la transformation des CSH en différents types de cellules sanguines, notamment les hématies, les polynucléaires, les monocytes et les plaquettes. Cette connaissance approfondie pourrait aider à identifier des dysfonctionnements immunitaires responsables comme par exemple des formes graves du SARS-Cov2 ouvrant ainsi la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques modulant l’activité de ces cellules. En clinique, une meilleure maîtrise de la différenciation des CSH pourrait améliorer les thérapies cellulaires, notamment les greffes de moelle osseuse, et favoriser le développement de traitements régénératifs pour réparer les tissus endommagés. En outre, ces avancées pourraient contribuer à la création de thérapies personnalisées, en optimisant l'utilisation des cellules souches pour répondre aux besoins spécifiques des patients. Finalement l’immunité entrainée représente un concept novateur et sa modulation une alternative thérapeutique en tant que solution de remplacement aux antibiotiques en favorisant la création de vaccins à large spectre.
Procédures
Cette procédure a pour but de produire les animaux d’intérêt utiles au projet à savoir des souris issues des lignées MafB flox CSF1R Cre, MafB flox Vav1 Cre, MafB Flox Vav1 Cre PU1 KI GFP et MafB Flox/MafB E269R Vav1 Cre. D'après nos études précédentes, nous considérons qu'environ 3% des animaux necessiteront un second génotypage fait par prélèvment caudal (--28 jours et sera effectué sous anesthésie gazeuse isofluorane 4%. Le génotypage du modèle PU1 KI GFP se fait de par l’analyse de la protéine PU1 KI GFP présente dans les souris issues de la lignée MafB Flox Vav1 CRE PU1 KI GFP par analyse sanguine en cytométrie en flux. Pour cela, un prélèvement sanguin d'un volume de 100µL effectué en retro-orbital sera effectué sur des souris âgées de 5-7 semaines. . Certaines souris pourront subir en vigile injection intra-veineuse qui entraine une légère douleur de courte durée pour l’injection d’un traceur avant mise à mort, Certaines souris recevront une stimulation inflammatoire soit en injection intra-veineuse dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie gazeuse soit en injection intrepéritonéale sur animaux vigiles. Les souris subiront un prélèvement sanguin (entre 1 et 4 prélèvements séparés d’une semaine) au niveau du sinus rétro-orbitaire sous anesthésie gazeuse puis une injection intrepéritonéale unique pour l’injection d’un traceur avant mise à mort. Pour les stimulations inflammatoires, cela varie de 1 à 3 jour en fonction du type de stimulation. Certaines souris subiront une myéloablation par irradiation aux rayons X sur animaux vigiles (quelques 5 min) puis une transplantation en injection intra-veineuse dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie gazeuse d’une suspension de cellules de moelles osseuses. Les souris subiront un prélèvement sanguin (entre 1 et 4 prélèvements séparés d’un mois) au niveau du sinus rétro-orbitaire sous anesthésie gazeuse puis une injection intrepéritonéale unique pour l’injection d’un traceur avant mise à mort. Les injections ou prélèvements entrainent une légère douleur de courte durée (quelques minutes) localisée au niveau de la zone d’injection ou de prélèvements.
Impact sur les animaux
La myéloablation peut rendre les animaux plus susceptibles aux risques infectieux. La répétition des gestes techniques et l’inconfort que peut ressentir l’animal après une injection mimant une infection ou après une myéloablation pourront engendrer une souffrance modérée. Les souris pourront présenter une fatigue, une légère hypothermie et une perte de poids pendant 2 jours (injection mimant une infection) ou 15 jours (transplantation suivant une myéloablation). Les animaux peuvent présenter des signes de stress liés à leur contention
Devenir
Animaux conservés pour la suite des procédures après la procédure 1 (excepté pour les réproducteurs) et mise à mort pour les autres procédures.
Remplacement
Afin d'étudier le potentielle rôle du gène MafB dans la régulation de la différenciation des cellules souches hématopoiétques, nous ne pouvons pas remplacer le modele murin. En effet, les cellules souches hematopoiétiques étant particulièrment régulées par leur environement, d'un point de vue physique via des interactions directes cellules-cellules mais aussi de part l'ensemble des médiateurs chimiques régulant leur communication, l'utilisation de lignée cellulaire est impossible. Ne pouvant donc pas remplacer le modèle murin, nous réduirons autant que possible leur utilisation.
Réduction
Sur la base de nos données préliminaires, nous calculerons le nombre minimum de souris nécessaires pour chaque expérimentation permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif (calcul du n avec un test unilatéral pour une différence de 10%, un risque alpha de 5%, une puissance bêta de 80%). Nous avons également choisi de comparer les groupes de souris génétiquement modifiées avec leurs contrôles de même portée respectifs et non avec des souris de type sauvage.
Raffinement
Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les souris afin d'améliorer le bien être de l'animal pour obtenir des données fiables. Une anesthésie générale sera utilisée durant les procédures expérimentales (prélèvement sanguin et transplantation). Nous vérifierons l’état de santé des souris quotidiennement : tout changement dans leur comportement ou l’apparition de signes cliniques (posture, prostration, difficultés à se déplacer et à s’alimenter, déshydratation) sera relevé et évalué grâce à une grille d'évaluation de la douleur. Lorsque les souris présenteront une perte de poids supérieure ou égale à 20% de leur poids maximum ou si le score de la grille de douleur atteint 10-12, soit le cas sévère, les animaux seront alors mis à mort. Durant l’ensemble de l’étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur (environnement contrôlé : température et ventilation régulées, lumière avec un cycle de 12h, hygrométrie), avec un accès continu à la nourriture et à l’eau. Les souris seront maintenues en groupes de 3 à 5 animaux par cage. L’environnement est enrichi par des dômes en carton ou du coton.
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. Animal de petite taille et à reproduction rapide. Bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Disponibilité de modèles génétiquement modifiés nécessaires aux études réalisées dans ce projet. Les animaux seront utilisés entre 8 semaines et 2 ans sachant qu’il n’est pas exclu que l’impact de la délétion de MafB évolue au cours du vieillissement.