Souris

Selon le score de douleur atteint et sa persistance, les souris reçoivent un analgésique ou sont tuées. 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante une sonde thermique dans l'abdomen, puis pour une partie d'entre elles un objet métallique de un centimètre sur un sous la peau du flanc, que des champs magnétiques échauffent de deux à trois degrés pour reproduire une fièvre ou une inflammation locale. L'effectif de 880 est présenté comme le minimum permettant des résultats statistiquement significatifs, sans qu'aucun calcul ne soit donné.

Objectifs

La température corporelle des mammifères dont l'homme est régulée, mais peut augmenter, notamment dans tout le corps lors de la fièvre, et localement dans les zones inflammées. L’élévation de la température peut être induite par différents mécanismes, notamment la production de chaleur dans de la graisse. La température est capable d’influencer la réponse du système immunitaire. L’effet de la température sur la réponse humorale, qui est caractérisée par la production d'anticorps par des cellules spécialisées, les lymphocytes B (LB), reste mal connu. La capacité des LB à produire des anticorps en réponse à la vaccination ou à des microbes est un processus complexe, nécessitant la coopération avec d'autres cellules, et la formation de structures spécialisées dans les organes du système immunitaire (ganglions lymphatiques ou rate), difficile à modéliser in vitro. Notre but est donc d’étudier in vivo chez des souris l’effet d’une augmentation locale (comme dans l’inflammation locale) ou du corps entier (comme dans la fièvre) de la température sur la réponse humorale. Dans un premier temps, nous analyserons l'effet de l'élévation globale de la température corporelle sur la réponse humorale en réponse à une vaccination. Nous étudierons également si la production de chaleur dans la graisse spécialisée participe à l’élévation de la température lors de la fièvre, et si elle modifie la réponse humorale. Enfin, nous mettrons au point un modèle permettant de tester l’effet d’une augmentation locale de la température autour d’un ganglion lymphatique, mimant l’effet d’une inflammation locale, sur la réponse humorale.

Bénéfices attendus

Comprendre l’effet de la température sur la réponse humorale pourrait avoir un impact dans le domaine de la vaccination : l’élévation de température pourrait, par exemple, être utilisée pour augmenter la réponse immunitaire (cette stratégie est déjà à l’étude dans le domaine des cancers). De plus, l’identification de la production de chaleur par la graisse comme mécanisme de contrôle de la température et de la réponse humorale pourrait permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour augmenter (vaccination) ou diminuer (maladies causées par une réponse immunitaire trop importante ) la réponse humorale.

Procédures

Les souris seront injectéés avec des sondes thermiques dans le ventre, sous anesthésie générale de 10 minutes maximum. Certaines souris seront vaccinées par voie sous-cutanée (durée de l'injection : 1 minute), et une élévation de température de 2 à 3°C sera induite pendant 2 jours à l'aide d'un champ magnétique. Du sang sera prélevé une fois par semaine (animaux vigiles, durée du prélèvement 1 minute), et au moment de l'euthanasie sous anesthésie (durée du prélèvement : 2 minutes). D'autres souris seront implantées avec des objets métalliques de 1cm x 1cm sous la peau du flanc par chirurgie sous anesthésie générale (durée de la chirurgie : 10 minutes), dans une position n'affectant pas la mobilité des animaux. 10 jours plus tard, une élévation locale de température de 2 à 3°C sera induite pendant 3 heures à l'aide d'un champ magnétique, puis les souris seront mises à mort.

Impact sur les animaux

L'élévation de la température et la vaccination, peuvent dans certains cas induire une douleur et une perte de poids (déshydratation) modérée et transitoire (2 jours), correspondant à la fièvre. L'implantation d'objets métalliques peut également mener à un inconfort et une douleur modérée et transitoire, correspondant à une petite chirurgie cutanée (3 jours). Les expériences se terminent par l'euthanasie des souris.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir prélever différents organes nécessaires à l'analyse de la réponse immunitaire.

Remplacement

Nous avons effectué des expériences in vitro afin d’étudier l’effet d’une élévation de la température sur les lymphocytes B. Il est cependant impossible in vitro de reproduire l’environnement complexe impliquant la coopération entre de nombreux types cellulaires qui permet aux lymphocytes B de produire des anticorps in vivo. Il est également impossible d'étudier in vitro la contribution à la fièvre et l’inflammation de la production de chaleur dans la graisse. Il est donc nécessaire d’étudier cette réponse in vivo, dans un modèle animal dont le système immunitaire et le contrôle de la température est proche de l’homme, comme la souris. Pour les implants d’objets métalliques, nous avons au préalable testé la capacité du champ magnétique à élever la température d’objets en différents métaux sans les implanter à des souris, et avons sélectionné les 3 plus ‘chauffant’ pour les tests in vivo.

Réduction

Le nombre de sours (880) a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

L'implantation des objets métalliques par chirurgie se fait sous anesthésie générale, avec analgésie. De plus, nous avons mis au point une grille permettant de quantifier la douleur des souris. Les critères sont la perte de poids, l’apparence, le comportement, l'activité de souris et des signes cliniques tels que les yeux anormaux, un écoulement nasal, ou un fèces anormal. Les animaux seront observés le lendemain puis deux fois par semaine suite à l'injection des sondes thermiques, tous les jours pendant 3 jours suite à l'implantation d'objets métalliques, et 7 jours suite à la vaccination, puis 2 fois par semaine. Des points limites ont été établis, et selon le score de douleur et sa persistance, la douleur sera traitée soit par analgésie, soit les animaux seront euthanasiés. La perte de poids pouvant être signe de déshydratation sera traitée par injection de solution de réhydratation. Afin de diminuer le stress potentiel des souris, elles sont habituées avant les expériences à être manipulées et à des changements d'environnement. Enfin, les animaux sont maintenus sans isolement, avec enrichissement (bâtons à ronger, éléments permettant la nidification, accès illimité à la nourriture et l’eau de boisson), et sont observés tous les jours.

Choix des espèces

La souris dispose d'un système immunitaire proche de l'homme, bien caractérisé. De plus, c'est un animal qui régule la température comme l'homme. Les animaux seront utilisés entre 8 et 20 semaines (âge adulte),

Les souris reçoivent trois injections de vaccin en cinq semaines, selon les procédures dans l'abdomen, sous la peau, dans le derme, dans un muscle, par le nez ou par le vagin, et subissent six prises de sang entre la semaine qui précède la première injection et la cinquième semaine. 3 444 souris, dont des lignées génétiquement modifiées pour exprimer des protéines humaines, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester 18 vaccins contre le SARS-CoV-2, le virus Nipah, l'hépatite B, Chlamydia trachomatis, la coqueluche ou la tuberculose. Le porteur parle pourtant d'une nuisance légère au moment de chaque injection et de chaque prise de sang, et affirme que la réponse immunitaire est "sans conséquence sur l'animal". Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour analyser leur moelle osseuse, leur rate, leurs ganglions et les tissus par lesquels entrent les pathogènes.

Objectifs

Les objectifs du projet sont de tester la capacité de vaccins à activer des réponses immunitaires dans les infections comme l’infection à SARS-CoV-2 (nouveaux variants), à Nipah virus (un virus léthal qui émerge contre lequel il n'existe pas de vaccin), HBV (le virus de l'hépatite B contre lequel il n'existe pas de vaccin), Chlamydiae trachomatis (CT, une bactérie sexuellement transmissible contre laquelle il n'existe pas de vaccin), Bordetella pertussis (responsable de la coqueluche dont les cas sont en nette augmentation du fait d'une diminution de la protection induite par le vaccin acellulaire) ou encore Tuberculosis mycobacterium (afin de traiter les formes latentes de la tuberculose) et d’identifier pour chaque vaccin la meilleure voie d’administration et le meilleur adjuvant afin d’obtenir des réponses immunitaires optimales et adaptées à chaque pathogène. Les plateformes vaccinales que nous évaluons dans ce projet ont démontré leur innocuité dans une précédente étude. Ce qui change ici ce sont les antigènes (petits morceaux de microbes qui ne donnent pas la maladie) véhiculés par ces plateformes vaccinales. Nous devons nous assurer que ces antigènes sont bien capables d'activer des réponses immunitaires dans un organisme vivant. Cette évaluation préclinique est primordiale avant de pouvoir tester ces vaccins chez l'homme dans des essais cliniques. Certains de nos vaccins sont des anticorps associés à des petits fragments de microbes. Ces anticorps reconnaissent des protéines humaines à la surface des cellules clefs pour activer le système immunitaire. Pour tester ces vaccins, nous devons utiliser des souris génétiquement modifiées qui expriment ces protéines humaines. Le projet vise également à déterminer la persistance de la réponse immunitaire induite par les vaccins après avoir choisi les plus efficaces et l’adjuvant le plus efficace pour chaque vaccin.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont le développement de nouveaux vaccins dans des maladies infectieuses avec un impact sur la santé humaine.

Procédures

Les interventions effectuées seront des injections de vaccins par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intradermique, intranasale, intramusculaire ou intravaginale selon les procédures ( à semaine 0, 3 et 5) et un prélèvement périodique de sang pratiqué sur les souris (Semaine (S)-1, S0+1 jour, S2, S3+1jour, S4, S5+1 jour) après la vaccination.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront 3 injections de vaccin (nuissance légère au moment de l'injection) et seront soumis à des prélèvements sanguins réguliers (nuissance légère au moment du prélèment). La réponse immunitaire générée est sans conséquence sur l’animal tout le long de la cinétique expérimentale.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin d'évaluer les réponses immunitaires induites par les vaccins dans les organes lymphoïdes primaires (moelle osseuse) et secondaires (rate et ganglions lymphatiques) et dans les tissus périphériques portent d'entrée des pathogènes.

Remplacement

Les plateformes vaccinales utilisées dans ce projet ont déjà été évaluées dans un précédent projet. Ce qui change ici se sont les antigènes (petits fragments de microbes qui ne provoquent pas la maladie) véhiculés par nos plateformes vaccinales. Nous devons nous assurer que ces antigènes sont bien capables d'activer des réponses immunitaires dans un organisme vivant. Cette évaluation préclinique est primordiale avant de pouvoir tester ces vaccins chez l'homme dans des essais cliniques. Les nouvelles versions de vaccins que nous allons tester dans ces modèles animaux ont été présélectionnés sur la base de plusieurs tests in vitro sur des cellules en culture. Ainsi seuls les vaccins candidats qui auront donné les meilleurs résultats seront ensuite utilisés chez l’animal. Nous nous proposons ici de tester l’efficacité de ces vaccins pré-sélectionnés dans des modèles de souris (induction de réponses immunitaires systémiques, muqueuses et de longue durée). Les réponses immunitaires sont des processus complexes dont la mise en place est conditionnée par des interactions dynamiques impliquant de nombreux partenaires cellulaires présents dans différents compartiments de l’organismes (site d’entrée du pathogène/antigène, ganglion drainant, site effecteur). A l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires dans le cadre d’une infection naturelle ou après une vaccination. C’est pourquoi nous avons besoin de travailler avec ces modèles animaux.

Réduction

Dans le cadre de la « Réduction », nous avons calculé le nombre minimal de souris (n=7 par groupe) nécessaires pour que les résultats soient significatifs et selon nos précédents travaux. Il s'agi ici de tester 18 vaccins avec et sans adjuvant et injectés selon différentes voies afin de trouver les meilleures conditions d'utilisation de ces vaccins c'est-à-dire l'adjuvant et la voie d'administration qui induiront les réponses immunitaires optimales. Ce nombre, impliquant tous les groupes des six procédures, est estimé à 3444 souris et est calculé sur la base d’une formule statistique couramment utilisée dans l'expérimentation animale afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux par procédure.

Raffinement

Les souris sont élevées avec soin et respect, en présence d’éléments d’enrichissement (bandelette de coton et neslets pour faire un nid et un tunnel en carton pour se réfugier et jouer) afin de réduire au maximum la souffrance animale, qu’elle soit physique ou psychique. Nous avons ainsi établi une grille de bien-être des animaux qui comprend l'évaluation de 10 signes cliniques et prend en compte des points limites. Les animaux sont toujours manipulés par une personne expérimentée.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler chez la souris car notre projet nécessite d’étudier les réponses immunitaires chez des animaux génétiquement modifiés afin de d'exprimer un gène humain dans un type cellulaire donné. En effet, certains de nos vaccins sont des anticorps associés à des petits fragments de microbes. Ces anticorps reconnaissent des protéines humaines à la surface des cellules clefs pour activer le système immunitaire. Pour tester ces vaccins, nous devons utiliser des animaux génétiquement modifiées qui expriment ces protéines humaines. Ces modifications génétiques sont possibles chez la souris. D’autre part, les modèles murins de vaccination ont déjà été mis au point et sont largement décrits dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (après 8 semaines afin de minimiser l’impact des perturbations endocriniennes observées avant cette tranche d’âges).

Mises à jeun quatorze à quinze heures pour la moitié d'entre elles, puis enfermées cinq minutes dans une enceinte de 800 cm3 où leur consommation d'oxygène est mesurée, 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées ensuite, le projet reposant sur des prélèvements de biopsies et de plasma. L'objectif est pédagogique, initier des étudiants de deuxième année de licence à la physiologie animale, chaque binôme travaillant sur une souris. Le porteur décrit une veille active vers des simulateurs numériques, qu'il situe à un stade "incompatible avec les objectifs pédagogiques", et qualifie le recours à l'animal d'"indispensable".

Objectifs

L'objectif de cette formation est d'initier les étudiants de 2eme année de la Licence de Sciences à la physiologie animale par la pratique expérimentale.

Bénéfices attendus

Les étudiants connaitront les problématiques de l'expérimentation animale, apprendront à se confronter à une démarche scientifique, mettront en oeuvre les bonnes pratiques de laboratoire et seront capables d'expliquer un processus physiologique en utilisant leurs connaissances fondamentales et les résultats de l'expérimentation réalisée.

Procédures

Etape 1: La moitié des animaux seront soumis à un jeûne de 14-15 h, l'autre moitié sera nourrie. Etape 2 : Les animaux seront maintenus dans une enceite de 800 cm3 pendant 5 minutes au cours desquelles leur consommation d'O2 et leur production de CO2 seront enregistrée. Cette étape nécessite une manipulation des animaux qui dure environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront être légèrement stressés par les étudiants au début de l'expérience. C'est pour cela qu'un temps est dédié lors du jour 1 à la familiarisation avec la manipulation des animaux. Le confinemment dans l'enceinte de calorimétrie peut stresser certains animaux. Une fenêtre permet de surveiller leur activité et le suivi du taux de CO2 permet de détecter une consommation anormale d'O2 due au stress et de ressortir l'animal le cas échéant. La mise à jeûn induit une perte de poids. L'expérience des années passées nous montre qu'avec la souche utilisée (RjOrl:SWISS) cette perte est cependant largement inférieure à 20 % après un jeûne nocturne.

Devenir

Le cohérence du projet pédagogique repose sur l'obtention de données in vivo et sur des mesures réalisée à partir de biopsies ou de plasma . Il est donc nécessaire d'euthansaier les animaux après la procédure de calorimétirie.

Remplacement

Le replacement des animaux utilisés à des fins d’enseignement est mis en œuvre par l’équipe pédagogique de physiologie animale de manière globale et cohérente sur l’ensemble des 3 années de la formation par l’équipe pédagogique. Cette stratégie repose sur le développement de travaux pratiques expérimentaux sur explants, cellules animales ou bien sur ordinateur quand les logiciels de simulation numériques pertinents sont disponibles. La seule exception concerne l’étude de fonctions totalement intégrées complexes comme l’ajustement métabolique induit par le jeûne (mobilisation simultanée de plusieurs organes, régulations hormonales, etc), étudié dans l'Unité d'Enseignement "Physiologie en Pratique". En absence de simulateur numérique éprouvé, le recours à l’animal reste indispensable, pour que les étudiants comprennent les liens de causalités entre les différentes régulations. Les enseignants mènent une veille active et interagissent avec des mathématiciens et informaticiens dans le but d’évoluer vers des outils numériques de remplacement qui pour l’instant sont à un stade de développement incompatible avec les objectifs pédagogiques visés, en particulier en termes de développement logiciel.

Réduction

L'accès à l'Unité d'Enseignement "Physiologie en Pratique" est soumise à un numerus clausus fixé à 20 étudiants. Les étudiants travaillent obligatoirement en binômes ce qui limite le nombre d'animaux à 10 par année auquels se rajoutent 2 animaux supplémentaires prévus en cas de critère d'inclusion non satisfait : animal bléssé, poids insuffisant, agressivité/isolement). Chaque binôme n'utilise qu'un seul animal puisqu'il traite une seule condition expérimentale et échange les résultats avec un binôme ayant traité l'autre condition expérimentale, l'utilisation est donc réduite à 0,5 animal/étudiant.

Raffinement

Après livraison des animaux par le fournisseur agréé et en attente de leur utilisation (délai d'adaptation au sein de l'établissement minimum de 5 jours), les animaux sont hébergés par groupe (4-5 animaux par cage) avec enrichissement réglementaire (maisonnette). Afin de diminuer la nervosité des mâles un mini tunel en carton , de la frisure et 2 à 3 buchettes Aspen brick 5x1x1cm (bois tendre) sont ajoutés dans chaque cage. Si au cours de l’hébergement, un animal présente un comportement agressif, ce dernier sera euthanasié si c'est plus de 24 h avant la fin de l'expérimentation ou bien isolé dans une cage si c'est moins de 24 h avant la fin de l'expérimentation. S’il présente des blessures, il sera retiré de la procédure et euthanasié et remplacé par un animal supplémentaire. L’état des animaux est surveillé tout au long de la procédure par les enseignants et les étudiants. Afin que les étudiants puissent comprendre les notions de bien être, d'état sanitaire et de stress chez la souris, ils évalueront par l'observation l'état de l'animal aux jours 1 et 2 à l'aide d'une grille d'observation dans laquelle sont reportés : l'état du pelage (lisse/hérissé), l'apparence des paupières (ouvertes/fermées), le comportement exploratoire (normal/prostration/immobilité) et le poids de l'animal.

Choix des espèces

1- La souris est un modèle pertinent pour étudier le métabolisme des mammifères. Les nombreuses données concernant la physiologie et la génomique de ce modèle fournissent des points de repères et de comparaison pour mettre en évidence le fonctionnement des processus physiologiques, éléments indispensables à la compréhension de ces processus par les étudiants. 2 - Tous les concepts et notions de physiologie intégrative enseignés en cours et en travaux dirigés concernent exclusivement les mammifères (humain en particulier), ce qui rend possible la transposition de ces concepts au modèle rongeur pour leur illustration. 3 - La petite taille de l'animal permet de miniaturiser l'expérience tout en fournissant suffisamment de matériel pour une mutualisation entre binôme. Les animaux utilisés seront des adultes de 6 semaines. Cela correspond à un poids de 30-34 g chez les mâles de la souche utilisée. Ce stade correspond à l'objectif pédagogique qui est de faire étudier expérimentalement aux étudiants l'adaptation métabolique au jeûne chez la souris adulte.

240 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une restriction alimentaire de 20 % pendant quinze mois à partir de l'âge de six mois, et toutes passent de seize à vingt jours en hébergement individuel avant un gavage, une thoracotomie sous anesthésie profonde, un prélèvement total du sang et une perfusion de paraformaldéhyde. L'objet reste exploratoire, comprendre comment une réaction inflammatoire cérébrale qui suit un repas gras évolue avec l'âge. Le porteur écrit que la restriction alimentaire prolonge la durée de vie de plusieurs mois, et affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'équilibre énergétique de façon intégrée.

Objectifs

L’existence d’une réaction inflammatoire postprandiale (ou postprandial inflammatory reaction, PIR) est maintenant bien documentée. En revanche, ses effets sur l’organisme sont encore mal connus. De même, les mécanismes biologiques sous-jacents induisant la PIR ne sont pas tous élucidés. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas, qui est exacerbée lors d’une consommation d’un repas gras. Récemment, il a été montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau chez la souris. La PIR cérébrale se caractérise notamment par une activation des cellules microgliales chez le jeune mâle adulte, sain, en réponse à un repas gras. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas et se produit dans l’hypothalamus, une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire. Les mécanismes biologiques qui déclenchent la PIR cérébrale ne sont pas identifiés. Une hypothèse serait que les lipides nutritionnels qui se retrouvent dans la circulation générale après digestion et absorption soient capables d’activer directement les cellules microgliales de l’hypothalamus. Dans ce projet, nous allons étudier l’influence de l’âge sur la PIR cérébrale en l’analysant de manière comparée entre de jeunes adultes (2-3 mois) et des individus âgés (20-21 mois). En effet il a été montré que la régulation de la prise alimentaire se fait moins bien avec l’âge et que la réponse physiologique à un repas gras pourrait en être affectée. D’autre part, une restriction calorique modérée (20%) sur le long terme étant connue pour retarder le vieillissement, nous allons comparer l’installation de la PIR cérébrale chez des individus mâles âgés nourris ad libitum versus soumis à une restriction calorique modérée prolongée. Les résultats seront comparés aux données obtenues sur de jeunes mâles adultes. Au travers de différentes mesures, nous chercherons à établir des corrélations entre développement de la PIR cérébrale, comportement alimentaire, statut neuro-inflammatoire et compétences cognitives. PIR cérébrale et statut neuro-inflammatoire seront étudiés par histologie post mortem des cerveaux. Ce projet prévoit une étude sur 240 souris.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront de mieux comprendre les déterminants biologiques de la PIR cérébrale chez la souris, et donneront des informations nouvelles sur l’impact des lipides nutritionnels sur le cerveau. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et permettra de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire qui surviennent lors du vieillissement.

Procédures

Les interventions auxquelles les animaux seront soumis sont : -1 gavage 1 à 3 heures avant la mise à mort (durée

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont le stress et la douleur lors de la contention et du gavage, la douleur lors de l’injection intrapéritonéale d’anesthésique en point terminal pour tous les animaux, la douleur en point final lors de la thoracotomie ainsi que l’isolement de tous les animaux en fin de procédure, de 16 à 20 jours selon les procédures. La restriction alimentaire des animaux, même modérée, est source de stress à court terme. Elle est cependant bénéfique sur le long terme avec une courbe de poids stationnaire et une durée de vie prolongée de plusieurs mois.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à l’issue des deux procédures afin de prélever : - le sang en vue d’analyses biochimiques plasmatiques - le cerveau en vue d’analyses histologiques

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou par simulation informatique. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.

Réduction

La mise en place de conditions prandiales définies a été optimisée, standardisée et validées précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, d’éviter des études pilotes supplémentaires, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité inter-individuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Le nombre d’individu par lot (n=12) pour les analyses histologiques, biochimiques, et comportementales a été défini précédemment. Ces effectifs sont appropriés pour réaliser des tests de corrélation et des études statistiques comparatives suffisamment robustes. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux sur des effectifs réduits. Dans le détail, une fois les conditions d’application des analyses vérifiées (nombre d’individus par lot, tests de normalité, test d’égalité des variances) les analyses comparées des groupes expérimentaux deux à deux seront réalisées à l’aide de tests t de student en cas de normalité des données ou de tests de rang dans le cas contraire.

Raffinement

Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et carré de coton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Après réception des animaux, deux semaines d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux avec la mise en place d’une grille de score, l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance, et de méthodes de mises à mort si nécessaire.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Pour l’influence de l’âge et le bénéfice de la restriction calorique, les expériences seront réalisées sur des souris (mâles) jeunes adultes (2-3 mois) et âgées (20-21 mois), afin de comparer les réponses cérébrales en fonction de l’âge.

Modifiées pour suractiver leur système lymphatique, 430 souris femelles vont être utilisées à partir de cinq semaines, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des injections intrapéritonéales tous les deux jours pendant trois semaines, avant d'être transportées vers un second établissement où leur est infligée une perfusion intracardiaque sans réveil. Le porteur résume les atteintes en une phrase, des douleurs modérées et un léger stress liés au développement de la tumeur. La mise à mort sert à récolter les tissus, et le résumé revendique l'expérimentation animale comme "l'unique approche" pour comprendre ces processus.

Objectifs

Le système vasculaire lymphatique a pour but de drainer les graisses, les liquides interstitiels, les macromolécules et les cellules immunitaires afin de maintenir l'homéostasie tissulaire. En condition pathologique, il joue un rôle primordial dans le cancer. En effet, le système lymphatique est le premier site de dissémination métastatique des tumeurs solides, notamment au niveau des ganglions lymphatiques. La lymphangiogenèse, croissance de nouveaux vaisseaux lymphatiques à partir de vaisseaux préexistants, se développe à la fois sur le pourtour des tumeurs et dans le ganglion sentinelle afin de préparer la « niche métastatique ». Bien que ce processus ait été clairement démontré au cours des 20 dernières années, les mécanismes moléculaires restent encore à élucider. Dans ce projet, nous postulons que la croissance du système vasculaire lymphatique péritumoral est stimulée à la fois par la tumeur primaire, mais également par son microenvironement (tissu adipeux). Nous postulons qu’en ciblant le microenvironement tumoral, nous allons pouvoir réduire la lymphangiogenèse et inhibiter la formation de métastases. Afin d’identifier des cibles thérapeutiques anti-lymphangiogéniques, nous allons utiliser trois modèles murins de tumeurs solides ainsi qu’un modèle spontané de carcinome mammaire. D’autre part, des études récentes ont démontré que le système lymphatique participait activement à l’échappement des tumeurs face au système immunitaire en exprimant des récepteurs des points de contrôle immunitaires. Nous allons dans un deuxième temps évaluer les inhibiteurs des points de contrôle dans ces modèles.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle du système lymphatique dans la progression cancéreuse. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Nous espérons pouvoir identifier quels sont les points de contrôle immunitaires exprimés par le système lymphatique afin de proposer des agents anti-lymphangiogéniques en combinaison avec ces molécules.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur, 2 interventions : injection de cellules tumorales en sous-cutané (une seule fois) suivi d'injections intraperitonéales tous les 2 jours pendant 3 semaines. Dans le second établissement utilisateur, 1 intervention : perfusion intracardiaque sans réveil.

Impact sur les animaux

Le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

Le système lymphatique joue un rôle primordial dans les communications inter-organes et dans l’homéostasie tissulaire. Les effets pléiotropiques de ce système font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l'expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de cette molécule dans la fonction endothéliale lymphatique. De même, la croissance tumorale et le développement font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est calculé à l'aide d'un logiciel dédié (G power). Le logiciel utilise un modèle mathématique pour déterminer le nombre d'animaux minimum pour avoir des résultats stastitiquement significatifs à l'aide d'un test two way ANOVA afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement. Nous nous tiendrons au nombre d'animaux par groupes indiqués par le logiciel. Ainsi, il est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car la suractivation du système lymphatique par expression du transgène Ap2-VEGFC a été générée seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des modèles de carcinomes murins (PyMT, LLC, B16). Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 26 semaines.

1 560 souris vont être élevées puis tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour prélever leurs organes lymphoïdes. Une partie reçoit un produit inducteur par voie intrapéritonéale, une injection par jour pendant trois jours espacées de deux jours, geste qui dure une vingtaine de secondes. Les souris privées en permanence de la protéine étudiée développent des lymphomes T à partir de dix semaines : le porteur prévoit de les tuer à neuf semaines, avant que le "phénotype dommageable" ne s'exprime. Il affirme que ces souris sont "indispensables" parce qu'elles seules fournissent des lymphocytes T naïfs dans leur état naturel, qu'aucune lignée cellulaire ne reproduit à ce jour.

Objectifs

Notre équipe étudie une protéine essentielle pour le développement des cellules sanguines et le fonctionnement des lymphocytes B et T. Nos recherches montrent qu'elle joue un rôle clé dans l’activation et la spécialisation des lymphocytes T, mais ses mécanismes d’action restent à élucider. L’objectif de ce projet est de déterminer comment cette protéine contrôle la génération et la maintenance des lymphocytes T inflammatoires. Nous élèverons des souris n'ayant plus cette protéine soit de manière chronique et spécifique dans les cellules T, soit de manière inductible après injection d'un composé spécifique. Ces souris sont indispensables car elles seules permettent d’obtenir des cellules T « naïves » dans leur état naturel, qui sont les cellules dont nous avons besoin pour étudier leur destin inflammatoire et que nous ne pouvons remplacer par un modèle alternatif. Ce projet pourra ouvrir de nouvelles perspectives pour mieux comprendre et traiter les maladies immunitaires. Après mise à mort, les organes lymphoïdes seront récupérés et des expériences in vitro seront réalisées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de comprendre les mécanismes qui contrôlent l'activation et la polarisation des lymphocytes B et T, acteurs principaux de la réponse immunitaire adaptative jouant un rôle crucial dans le développement de cancers et pathologies auto-immunes et inflammatoires. Cela permettra d'établir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.

Procédures

Les injections du produit permettant la suppression de nos protéines se font sur animaux vigiles. Après une contention de la souris, le produit sera injecté à raison d'une injection par jour, pendant 3 jours, à 2 jours d'intervalle. La procédure prend 20 secondes maximum à partir du moment où l'animal est pris en main.

Impact sur les animaux

Les animaux ne possédant plus la protéine d'intérêt peuvent développer des lymphomes T à partir de 10 semaines, ce qui peut rester asymptomatique mais dans certains cas pourrait conduire à une perte de poids, une prostration. Les animaux seront alors mises à mort à l'âge de 9 semaines pour ne pas atteindre un phénotype dommageable. L'injection de tamoxifène par voie intrapéritonéale ne prendra que quelques secondes. Une infection pourrait se développer au niveau du site d'injection du tamoxifène, ce qui pourrait entraîner une douleur. Ce site sera surveillé chaque jour et désinfecté si besoin.

Devenir

mise à mort et prélèvement d'organes

Remplacement

Nous travaillons sur le devenir des cellules T naïves, qui ont la particularité de ne jamais avoir rencontré de pathogène. Jusqu’à ce jour, les lignées cellulaires disponibles ne récapitulent pas les caractéristiques des cellules T naïves. Dans l’état actuel de notre projet, les cellules T näives ne peuvent être remplacées par un autre modèle animal, une lignée cellulaire ou des expériences in vitro que nous avons déjà réalisées. Ces cellules doivent être maintenues dans un environnement in vivo pour maintenir leur caracéristiques spéciales. C'est pourquoi notre projet nécessite d'utiliser un modèle in vivo et qu'il est impossible de remplacer l'utilisation d'animaux dans ce projet. Cependant, au cours de notre expérimentation, nous nous réservons la possibilité d’employer des méthodes alternatives et des modèles in vitro, dès que cela est possible, afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le seul but de ce projet sera de récupérer les organes lymphoïdes afin d’étudier le devenir des cellules T naïves in vitro. Les souris présentant une absence chronique de notre protéine ont un phénotype dommageable et seront observées quotidiennement selon la règlementation. Les souris ne possédant plus notre protéine après injection d'un produit, ne possèdent pas de phénotype dommageable car elles seront utilisées rapidement après induction. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs. Selon les expériences menées in vitro, un test statistique de Mann-Whitney sera effectuée pour comparer les groupes.

Raffinement

Les animaux seront utilisés avant qu'aucun problème de santé potentiel ne se développe. Les zootechniciens surveilleront les souris quotidiennement selon la procédure règlementaire afin de veiller à ce qu’elles ne montrent aucun signe de souffrance comme par exemple le poil hérissé, le dos vouté, une prostration, en s’assurant de ne jamais atteindre un point limite. Les animaux seront élevés en groupe dans des cages ventilées avec le matériel nécessaire pour qu'elles créent leur nid et leur permettre des conditions d'hébergement optimales. Lors de l’injection du produit entraînant la disparition de notre protéine d'interêt, le risque d’infection dans la zone d’intérêt sera pris en considération.

Choix des espèces

Les souris présentent l’avantage de pouvoir être modifiées génétiquement (souris- knock-out, transgéniques), ce qui permet de contrôler l’expression d’un ou plusieurs gènes soit dans un type de cellule spécifique, soit dans toutes les cellules. Le système immunitaire de la souris se rapproche de l’Homme, ce qui permet de travailler dans un modèle de référence pour l’étude des cellules T et de certaines pathologies comme les maladies auto-immunes associées à une dérégulation des cellules T. Pour ces raisons, les souris représentent un modèle de référence dans l’étude des mécanismes qui sous-tendent la pathogénicité des maladies auto-immunes, ce qui est l’objet de notre recherche. Les souris ayant une absence chronique de la protéine d'interêt, sont susceptibles de développer des lymphomes à partir de 10 semaines. Dans ce cas, les expériences seront effectuées sur des animaux adultes sevrés et âgées entre 4 et 9 semaines afin d’isoler les cellules T naïves sans prendre le risque d'une présence de lymphome. Pour la lignée de souris inductibles, nous induirons la délétion d’Ikaros après injection d'un produit. En utilisant ce protocole d’induction, les souris n’auront pas le temps de développer de lymphomes au moment où les organes lymphoides seront récupérés. Le nombre de cellules T naïves diminue avec l'âge. cependant, nous savons qu'un nombre suffisant de cellules T naïves peut être récupéré dans les organes lymphoïdes secondaires jusqu'à l'âge d'environ 20 semaines. Pour notre étude, nous pourrons donc induire la suppression de nos protéines et récupérer les organes pour les études in vitro sur des animaux entre 4 et 15 semaines.