Souris

Greffés d'une tumeur sous la peau, dans la peau ou dans le coussinet graisseux mammaire, gavés jusqu'à cinq fois par jour et saignés jusqu'à quatre fois par jour à la veine saphène, 88 000 souris et 500 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur affirme réduire le nombre de manipulations au strict nécessaire, dans un projet dimensionné pour environ 170 études par an pendant cinq ans, à la demande de clients. Les animaux dont la tumeur ne pousse pas sont utilisés pour entraîner le personnel au gavage et aux prélèvements sanguins, ou tués pour fournir des organes témoins. Ceux qui passent d'une procédure à la suivante sont tués à la fin de la seconde, les autres à la fin de la leur.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer de nouveaux traitements dans des modèles ectopiques (i.e. injection de cellules cancéreuses à un site ne correspondant pas à celui de la tumeur d’origine) chez la souris ou le rat pour les cancers dont les besoins sont non satisfaits. Ce projet comprend quatre procédures : -Développement de modèles ectopiques - Evaluation de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamie (PK/PD) d’une molécule d’intérêt chez le rongeur porteur de tumeur - Evaluation de la tolérabilité d’une molécule d’intérêt après administration unique ou répétée chez le rongeur porteur de tumeur - Evaluation de l’efficacité d’une molécule d’intérêt sur des modèles ectopiques chez le rongeur. La première étape qui permettra par la suite d’évaluer une nouvelle molécule d’intérêt thérapeutique est le développement de modèles ectopiques. La greffe sera réalisée sur des animaux immunodéprimés pour des cellules tumorales d’origine humaine (xénogreffe) ou sur des animaux immunocompétents de même espèce que la lignée tumorale (modèles syngéniques). En fonction des cellules injectées, les greffes seront réalisées par voie sous-cutanée, intradermique, interscapulaire ou dans le coussinet graisseux mammaire. Trois types d’études pourront ensuite être réalisées sur ces souris/rats porteurs de tumeurs décrites ci-dessous. L’évaluation de la PK/PD est réalisée en analysant les concentrations sanguines et/ou tissulaires d’un composé ainsi que les niveaux d’expression/activation de biomarqueurs associés après administration unique ou répétée du composé. Le modèle PK/PD établi est indispensable pour la détermination des doses et fréquence à utiliser dans les études d’efficacité, de toxicologie réglementaire et il permet également de prédire les doses à administrer lors des phases de preuve de concept en développement clinique chez l’Homme. L’évaluation de la tolérabilité d’un composé est réalisée à des doses thérapeutiques déterminées par des études de pharmacocinétique sur souris naïves et des études PK/PD effectuées en amont. Elle consiste en l’administration unique ou répétée d’un composé et à l’observation de signes cliniques des animaux pour déterminer la/les doses et/ou la fréquence d’administration qui pourront être utilisées dans les études consécutives.

Bénéfices attendus

A l’origine de plus de 10 millions de décès par an, le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde. Les principaux traitements aujourd’hui consistent en la chirurgie et la chimiothérapie, souvent associées à une radiothérapie. Malgré ces options thérapeutiques, le nombre important de décès par an souligne l’inefficacité de ces traitements et la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans le domaine de l’oncologie. A long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Greffe des cellules tumorales à l’aide d’une aiguille réalisées par voie sous-cutanée, intradermique, interscapulaire ou dans le coussinet graisseux mammaire sous anesthésie gazeuse : durée 30 secondes 1 seule fois pendant l’étude. Dans le cas de l’utilisation d’un trocart, sous anesthésie gazeuse : durée 30 sec 1 seule fois pendant l’étude. • Mesure des tumeurs : o Avec le pied à coulisse : durée 30 secondes 2 à 3 fois par semaine sur animaux vigiles. o Avec l’appareil de bioluminescence : durée 10 minutes sous anesthésie gazeuse maximum 3 fois par semaine. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique o par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique, (max5xjour), intrapéritonéale (max4xjour), sous-cutanée (max4xjour), intramusculaire (max2xjour), intratumorale (1 injection/jour), ou intradermique (1 injection/jour) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, d’un seul traitement à plusieurs semaines de traitement selon la procédure réalisée. o par voie intraveineuse à la veine caudale : durée 2 minutes sur animaux vigiles, maximum 2 fois par jour pendant 3-4 jours (dépendant des veines de l’animal). L’installation d’un cathéter sera nécessaire pour des administrations plus longues. • Traitement par irraidation pendant maximum 5 min une seule fois pendant l'étude • Administration de luciférine pour imagerie de bioluminescence o par voie intrapéritonéale (max3xsemaine) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, maximum 3 fois par semaine pendant une à plusieurs semaines selon la procédure réalisée. Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang sur animal vigile o via la veine caudale : durée 30 secondes (max 2xjour) o via la veine saphène : durée 30 secondes (max 4xjour) o via la veine mandibulaire : durée 30 secondes (max 2xjour) o via amputation unique de la queue (coupe 1 à 2 mm sur l’extrémité non innervée de la queue) durée 1 min (max 10xjour). • Prélèvements de sang sur animal anesthésié à l’isoflurane o via la veine sublinguale (max 1x/jour).

Impact sur les animaux

Nuisances des animaux : pour chacune des procédures, les animaux seront injectés avec des cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (sévérité légère) et tatoués (sévérité légère). Certains modèles tumoraux peuvent nécroser, d’où l’intérêt de choisir un site d’injection de cellules tumorales adapté (voie sous-cutanée, intradermique, interscapulaire ou dans le coussinet graisseux mammaire) grâce à la procédure de développement de modèles pour éviter ces nuisances aux animaux. Pour les procédures de PK/PD, de tolérabilité et d'efficacité, les animaux sont traités avec des molécules pendant quelques jours à plusieurs semaines qui peuvent parfois être mal tolérées notamment durant les études de tolérabilité (dose du composé importante) et d’efficacité (traitement à long terme). Ces effets apparaissent potentiellement au fur et à mesure de la croissance tumorale. Effets indésirables : ces procédures peuvent engendrer une dégradation de l'état de santé de l'animal pouvant se traduire par une perte de poids, une hypo- ou hyperthermie, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli), des vocalisations. Les animaux sont observés quotidiennement à minima et jusqu’à 2 fois par jour lors des traitements pour réagir au plus vite à l’inconfort des animaux et y apporter des solutions (arrêt des traitements, réhydratation, raffinement).

Devenir

Les animaux utilisés pour la procédure de développement de modèles peuvent être réutilisés pour effectuer une étude de PK/PD ou de tolérabilité puis seront mis à mort à la fin de cette 2ème procédure. Les animaux utilisés pour une étude de tolérabilité peuvent être réutilisés pour effectuer une étude de PK/PD ou d'efficacité et seront mis à mort à la fin de cette 2ème procédure. Pour les procédures de PK/PD et d'efficacité, ainsi que pour les animaux des procédures développement de modèles et de tolérabilité non-réutilisés, les animaux seront mis à mort à l’issue de leur procédure respective. Quelque soit la procédure, des prélèvements de sang et de tissus pourront être réalisés et feront l’objet d’analyses ultérieures (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques …).

Remplacement

Deux approches sont principalement utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basé sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive avec une multitude de tests in silico et in vitro. Ces modèles in vitro sont utilisés autant que possible en amont pour limiter le recours à l’animal. Cependant, ils ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorales. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive avec une multitude de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme) sans recours à l’animal. En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d'observer une activité sur les modèles qui font l’objet des procédures de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’études prévues pour ce projet se base sur l’analyse rétrospective des trois dernières années, nous estimons que pour les 5 ans de ce projet, 170 études environ seront conduites par an. Les données de mise en place des modèles obtenus dans la procédure développement de modèle" permettront de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans les procédures de PK/PD, de tolérabilité ou d'efficacité. Une analyse de puissance statistique sera appliquée pour la détermination de la taille des groupes expérimentaux. Des analyses rétrospectives seront conduites pour s'assurer de la bonne adéquation du nombre d'animaux par groupe et de la puissance statistique recherchée. Les animaux qui sont exclus des études pour des raisons de taille tumorale trop petite ou trop grande sont toujours utilisés pour permettre d’avoir soit des tissus témoins pour la détermination du pourcentage de liaison aspécifique ou de la concentration des molécules d’intérêt dans les tumeurs. Si des tumeurs n’ont pas du tout poussé, les animaux pourront être utilisés pour des entraînements à différents gestes techniques tels que le gavage ou les prélèvements sanguins ou pour récupérer des matrices blanches (organes, sang, plasma). De plus les procédures sont interconnectées et les animaux peuvent être utilisés pour plusieurs procédures limitant de ce fait l’utilisation d’animaux. Les animaux de la procédure "développement de modèle" peuvent être inclus dans une procédure de PK/PD ou de tolérabilité. Les animaux inclus dans une procédure de tolérabilité pourront également être inclus dans une étude de PK/PD ou d’efficacité.

Raffinement

Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée des procédures. En cas d’apparition de signe de douleur, une injection unique en sous-cutanée d'analgésique sera réalisée. Une fiche de suivi des signes cliniques sera mise en place. Elle permet d’établir un score pour évaluer l’état général de l’animal et en fonction du total des scores des mesures sont appliquées et d’appliquer des points d’arrêt anticipés les plus précoces possibles. Ainsi, à partir d’un total de 4, un suivi vétérinaire sera mis en place avec une surveillance renforcée des animaux et des mesures complémentaires seront prises telles qu’aliment humide au sol ou ajout d’enrichissement, et à partir d’un total de 6, l’animal sera euthanasié. De plus, si un animal atteint un des points limite établis, il sera immédiatement euthanasié. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles ectopiques de cancer chez la souris et le rat existent dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références, etc…) Les données de la littérature indiquent clairement que les rats et les souris adultes représentent des modèles fiables pour l'évaluation de l'efficacité de composés dans le domaine du cancer, nous utiliserons donc des animaux adultes.

Une injection de composant bactérien, deux prélèvements de sang à la joue sans anesthésie et une prise de température rectale toutes les deux heures, le tout en six heures : 648 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le projet vise à vérifier chez l'animal vivant des mécanismes régulateurs de l'inflammation repérés en culture cellulaire, en comparant des souris génétiquement invalidées à des témoins. Toutes sont tuées, le porteur indiquant que l'injection rend leur survie difficile au-delà de six heures et que les prélèvements les affaiblissent. La souris est retenue parce qu'elle est l'animal le plus utilisé en immunologie et que les lignées modifiées sont déjà disponibles.

Objectifs

La réponse inflammatoire est bénéfique pour l'organisme humain car elle le protège efficacement contre les infections et favorise également la réparation des tissus lésés. Cependant, lorsque l'inflammation devient excessive, elle peut devenir délétère et causer des syndromes auto-inflammatoires. L'inflammation est déclenchée par des senseurs de pathogènes ou de stress, notamment au sein des plateformes de signalisation qui contrôlent la sécrétion de composants dans notre sang. Ces composants indiquent à notre système immunitaire de réagir à quelque chose de nocif, comme une infection. Les mécanismes de régulation ainsi que l'activation de la voie de l'inflammation restent peu compris. De nouveaux mécanismes régulateurs de l'inflammation ont été découverts grâce à des approches in vitro. Le projet vise donc à valider l'importance de ces régulateurs in vivo. Pour cela, nous testerons la réponse inflammatoire de souris génétiquement invalidées pour ces mécanismes régulateurs. L'inflammation sera déclenchée par l'injection d'un composant bactérien connu pour induire une inflammation systémique chez la souris, caractérisée par des symptômes précoces tels que l'abaissement de la température et l'élévation des signaux d'alarme déclenchant les mécanismes de défense de l'organisme contre les infections. Ce projet vise donc à comparer ces deux paramètres entre des souris témoins (sauvages) et des souris invalidées pour les mécanismes régulateurs de l'inflammation, 4 à 6 heures après l'injection du composant bactérien. Au cours de ce projet, nous allons étudier plus précisément le rôle respectif des différents composants de cette voie inflammatoire en utilisant des souris génétiquement modifiées capables ou non d'activer cette voie. En résumé, le projet vise à approfondir la compréhension des mécanismes moléculaires régulant l'inflammation. Cette recherche pourrait avoir des implications importantes pour la compréhension et le traitement des maladies inflammatoires chez les humains.

Bénéfices attendus

Une inflammation excessive et dérégulée est associée à des syndromes auto-inflammatoires, entraînant des symptômes qui altèrent la qualité de vie des patients. L'activation d'une voie spécifique de l'inflammation pourrait contribuer à ce phénomène. Les souris souffrant d'une infection sévère présentent une activation de cette voie. L'injection d'un composant bactérien est largement utilisée dans la recherche pour induire une inflammation en formant des complexes protéiques appelés inflammasomes. Jusqu'à présent, les mécanismes de régulation et d'activation de cette voie inflammatoire restent mal compris. Des ligneées des souris chez lesquelles certains régulateurs spécifiques de cette voie inflammatoire ont été désactivés ont été générées afin d'étudier l'impact de ces régulateurs dans la régulation de cette voie chez la souris après une infection sévère. En plus de ces souris, des modèles de souris présentant une fonction inflammatoire dérégulée ont également été créés. En étudiant spécifiquement le rôle de différents composants de cette voie inflammatoire, nous espérons identifier de nouvelles cibles thérapeutiques susceptibles de prévenir une inflammation excessive. En résumé, notre projet vise à approfondir la compréhension des mécanismes sous-jacents à l'inflammation excessive, dans le but d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de développer des stratégies de traitement pour les maladies inflammatoires.

Procédures

Le projet repose sur un modèle d'infections chez la souris, impliquant l'injection d'un composant bactérien sur des animaux éveillés. Cette injection, réalisée sur une durée de 10 secondes, est effectuée une seule fois au début de la procédure sur 648 animaux. Deux prélèvements sanguins seront réalisés sans anesthésie pour prelever petite quantité de sang sur une durée de 10 secondes sur 648 animaux. Un seul prélèvement sur 648 animaux sur une durée de 20 secondes seront realises sous anesthésie générale à la fin de l'expérience.

Impact sur les animaux

Lors de l'injection, il peut y avoir une douleur au point d'injection ainsi qu'une réduction de l'activité et de la mobilité des animaux. De plus, il existe un risque d'hypothermie consécutive à l'injection de substance bactérienne pendant les premières heures. Les prélèvements de sang au niveau de la joue peut induire du stress chez les animaux. En outre, les prises de température rectale peuvent également causer du stress chez les animaux.

Devenir

Tout les animaux utilisés dans procédure seront mis à mort selon une méthode réglementaire. Les souris seront euthanasiées après la procédure, car l'injection de LPS provoque un état inflammatoire chez les souris, rendant difficile leur survie au-delà de 6 heures. De plus, le sang est prélevé à plusieurs reprises pendant la procédure, ce qui affaiblit les souris.

Remplacement

Un modèle basé uniquement sur des cellules isolées ou l'utilisation d'outils informatiques ne pourrait pas refléter toute la complexité de la réponse du système immunitaire face aux infections sévères, ni les interactions entre les différentes cellules immunitaires. Une étude menée sur un animal entier est donc indispensable à des fins exploratoires, et nous utiliserons un modèle d'infection largement validé dans d'autres études.

Réduction

Le calcul du nombre d'animaux par groupe a été effectué afin de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes. Au cours de chaque expérience, plusieurs analyses utilisant diverses techniques seront effectuées sur les prélèvements, ce qui permettra de minimiser le nombre de souris utilisées. L'utilisation à la fois de mâles et de femelles permet ainsi de limiter la perte d'animaux.

Raffinement

Les procédures expérimentales ont été optimisées pour réduire au maximum l'inconfort et le stress subis par les animaux. Leur bien-être est scrupuleusement pris en compte dans toutes les procédures en termes de conditions d'élevage. Il y a un suivi des souris sur 6 heures, la prise de température toutes les 2 heures, l'utilisation de la grille d'évaluation du comportement des souris. La surveillance raprochée des animaux nous permettra d'identifier précocement tout changement physique (blessure) ou comportemental, qui sont des signes de stress. Des points limites bien définis permettent de limiter la souffrance animale au minimum.

Choix des espèces

Les souris sont les animaux les plus utilisés en immunologie, avec un large choix de solutions techniques dédiées disponibles commercialement. Des modèles génétiquement modifiés sont d'ores et déjà disponibles. Il s'agit de jeunes adultes (8-12 semaines) dont le système immunitaire est à maturité.

Pour créer des modèles vivants de gliomes pédiatriques de la ligne médiane, des tumeurs que le porteur décrit comme universellement incurables, 3 450 souris immunodéprimées de cinq à huit semaines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit dans le cerveau, sous anesthésie générale, une greffe stéréotaxique issue d'une biopsie tumorale d'enfant, puis jusqu'à 52 séances d'imagerie hebdomadaires, soit un an de suivi. Les tumeurs mettent quatre à douze mois à se développer et peuvent provoquer ataxie, perte d'appétit, prostration et perte d'équilibre, exceptionnellement une exorbitation des yeux. La procédure s'arrête quand la tumeur émet un seuil de lumière prédéfini, et toutes les souris sont tuées pour analyse de leur cerveau.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de mettre au point des modèles in vivo de tumeurs universellement incurables à ce jour ainsi que de tumeurs chimiorésistantes et responsables de nombreuses rechutes chez le patient. Ces tumeurs sont très différentes des gliomes de l’adulte et des tumeurs corticales de l’enfant et il est nécessaire de pouvoir les étudier plus spécifiquement. Compte tenu de la rareté du matériel primaire disponible et de l’absence de modèles pertinents de ces deux maladies, nous prévoyons de développer des modèles in vivo en réalisant des greffes intracérébrales à partir de biopsies tumorales de patients au diagnostic et/ou à la rechute. Récemment, notre groupe a pu développer les premiers modèles in vivo au monde de gliomes diffus de la ligne médiane à partir de biopsie de patient au diagnostic. Cependant, il reste crucial de renforcer la diversité génétique des modèles ainsi que d’élargir à d’autres types cancéreux afin de généraliser nos hypothèses et de consolider les statistiques sur une plus large cohorte. Afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux, nous développons en parallèle des cultures cellulaires primaires permettant dans un premier temps d’étudier à la fois la biologie de la tumeur mais également sa réponse à de nouvelles thérapies anticancéreuses. Néanmoins, ces modèles alternatifs ne nous permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement (tumeurs cérébrales infiltrantes et métastatiques) ou encore la réponse aux traitements qui implique souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, immunitaire…).

Bénéfices attendus

Obtenir un modèle murin génétiquement modifié de gliomes diffus de la ligne médiane permettra de mieux comprendre les étapes précoces du développement de ces tumeurs, pour le moment encore inconnu. Cette compréhension permettra d’identifier les modifications précoces menant à l’apparition de cellules tumorales permettant l’exploration de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Greffe stéréotaxique sous anesthésie générale et analgésie adatée: 1 par animal, durée entre 1 et 5 minutes. Séance d'imagerie sous anesthésie générale : une fois par semaine, durée 1-5 minutes, nombre maximal : 52 (correspondant à un an de suivi au maximum).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liées à la greffe d'une tumeur dans le cerveau. La greffe, sous anesthésie générale occasionnera une petite plaie sur le dessus du crâne, qui entraînera une gêne légère et temporaire. Par la suite, on pourra éventuellement observer des symptômes neurologiques qui sont fréquemment observés en présence d’un volume tumoral conséquent (ataxie), perte d'appétit et donc perte de poids, prostration des animaux, perte d’équilibre. L’augmentation de la pression intracrânienne peut exceptionnellement entraîner des symptômes tels que l'exorbitation des yeux, l'atteinte de l’oreille interne qui entraineraient l'arrêt immédiat de la procédure.

Devenir

Les animaux ayant tous les greffes de tumeurs dans le cerveau, ils devront être euthansiés à la fin de la procédure pour examens et analyses sur leur cerveau.

Remplacement

Une singularité des gliomes de la ligne médiane (composée du thalamus, du pont et de la moelle épinière), résulte dans leur phénotype systématique d’infiltration des structures de la ligne médiane dans un premier temps, puis plus largement de tout le cerveau au décours de la maladie. Ces particularités résultent des interactions des cellules tumorales avec leur environnement qui ne peuvent être appréhendées que dans des modèles vivo, où la variété et complexité du microenvironnement tumoral peut être reproduite. De plus, la barrière hématoencéphalique, qui isole le cerveau du reste de l’organisme, est une limitation très importante dans le traitement de cette maladie (barrière non rompue) et il est nécessaire de développer des modèles de greffes afin d’évaluer une nouvelle médication avant les phases cliniques. Les molécules médicamenteuses potentiellement identifiées par la suite seront testées sur des modèles de cultures cellulaires afin de limiter leur toxicité lors du traitement des animaux, en déterminant des concentrations et une posologie adéquate. Une des perspectives de ce projet, est également d’étudier le système immunitaire dans toute sa complexité, ce qui n'est possible que dans un animal vivant.

Réduction

Pour la primogreffe (P0), nous voulons uniquement savoir si la biopsie est tumorigène ou non. Pour cela, nous nous contenterons donc de ne greffer que 3 animaux par tumeur afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisé (réponse : oui/non). Si après la primogreffe, les souris présentent des tumeurs, alors nous réaliserons 4 passages successifs afin d’avoir suffisamment de matériel pour stabiliser le modèle, stocker la tumeur et réaliser des tests histologiques et moléculaires sur ces modèles à chaque passage : 1 souris servira au passage, 1 souris pour l’analyse histologique, 1 souris pour l’analyse moléculaire et 2 souris pour la cryoconservation du modèle.

Raffinement

Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale et recevront des anti-douleurs par voie sous cutanée dès l’arrivée des premiers symptômes neurologiques ou de la douleur.. Les animaux seront examinés quotidiennement. Ils seront stabulés en groupes sociaux avec un enrichissement environnemental. Les animaux auront des examens en imagerie chaque semaine, et la détection éventuelle de tumeurs emettant un seuil de lumière prédéfini conduira à l'arrêt de la procédure pour ces aimaux. Des points limites précoces et précis ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

L'utilisation de modèles de souris immunodéprimées permet de favoriser la prise de greffe de tumeurs et de lignées cellulaires cancéreuses humaines. Les animaux utilisés auront entre 5 et 8 semaines correspondant à l’âge du jeune adulte. Nos études préalables nous ont montrées qu'il n'y avait pas différences de prise de greffe chez des animaux juste sevrés (3 semaines) et des animaux adultes (plus de 6 semaines). Cependant, le développement de la tumeur étant lent (entre 4 et 12 mois selon les modèles), nous utiliserons des animaux jeunes afin de ne pas avoir un état général dégradé qui pourrait être dû à la dégénérescence du modèle en fin de protocole.

Génétiquement modifiées pour porter le syndrome de Rett, une maladie qui touche presque exclusivement des filles, 32 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie gazeuse et quatorze injections intrapéritonéales, une par jour pendant deux semaines, chacune précédée d'une contention. Le porteur affirme qu'aucune autre espèce ne peut être modifiée pour imiter cette maladie humaine, et qualifie l'imagerie de non invasive. Toutes seront tuées, au motif qu'un animal ayant reçu un traitement pharmacologique ne peut pas être reclassé.

Objectifs

Le syndrome de Rett est une maladie rare qui touche principalement les filles. Elle se manifeste par des problèmes moteurs (comme des difficultés à bouger) et des troubles du comportement, comme ceux qu'on observe dans l'autisme. Les enfants atteints perdent des compétences qu'ils avaient avant, comme marcher ou parler. Actuellement, il n'existe pas de traitement qui permet de soulager ces symptômes. L’objectif de ce projet est d’essayer de trouver un traitement pour améliorer la situation. Dans une étude précédente, nous avons remarqué que certaines zones du cerveau des souris modèles de la maladie étaient trop actives, ce qui pourrait expliquer certains symptômes. Nous avons aussi découvert que des ions bromures, pourraient réduire les troubles moteurs et du comportement dans ce modèle de la maladie. Le but de ce projet est de vérifier si ces ions peuvent ramener l’activité cérébrale de ces souris à la normale, en utilisant une technique d’imagerie qui permet de voir comment leur cerveau fonctionne.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de vérifier si un traitement avec des ions bromure peut aider à améliorer les problèmes moteurs et les symptômes autistiques des souris atteintes d’un modèle de la maladie de Rett. L’idée est aussi de voir si ce traitement pourrait ramener l’activité du cerveau des souris à un niveau normal. Cela nous aidera à mieux comprendre comment ces ions bromure agissent et s’ils peuvent devenir une solution pour améliorer les traitements contre cette maladie.

Procédures

Les animaux subiront deux séances d'imagerie d’une heure sous anesthésie gazeuse. Ils recevront également des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant deux semaines (14 injections au total). Chaque injection nécessitera une contention de l'animal pendant quelques secondes

Impact sur les animaux

Les animaux recevront une administration quotidienne d'agents pharmacologiques par voie intrapéritonéale. Bien que la probabilité soit faible, une inflammation au niveau du site d'injection ne peut être totalement exclue. La technique d'imagerie utilisée est non invasive, ne générant pas de stress particulier, à l'exception du stress causé par la contention et la manipulation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, car il est impossible de reclasser des animaux ayant subi un traitement pharmacologique.

Remplacement

Pour mieux comprendre les causes de l’autisme et développer de nouveaux traitements, il est essentiel de disposer de modèles animaux que les scientifiques peuvent étudier. En examinant de près le comportement de ces animaux, nous pouvons vérifier s'ils représentent bien les caractéristiques de l'autisme. Cela nous aide également à tester l’efficacité de nouveaux traitements. L’évaluation des effets d’un traitement doit se faire principalement à travers le comportement des animaux, car il n’existe pas de test biologique permettant de diagnostiquer l’autisme. En effet, le diagnostic repose uniquement sur l’observation des comportements. C’est pourquoi nous devons étudier les animaux dans leur ensemble pour capturer toute la variété de leurs comportements.

Réduction

Nous utilisons des outils statistiques appropriés pour déterminer précisément le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation des expériences

Raffinement

Nous mettons tout en œuvre pour que les animaux subissent le moins de stress ou d'inconfort possible tout au long de l’étude. Les souris sont logées en petits groupes, avec tout le nécessaire pour se sentir à l’aise, comme des matériaux pour faire leur nid. Elles sont également manipulées chaque jour pour les habituer à l'interaction avec les expérimentateurs. Pendant l'ensemble du protocole, nous suivons attentivement leur bien-être, en contrôlant leur poids et leur posture, et en surveillant des signes comme la perte de poils ou un dos voûté, pour nous assurer qu’elles ne souffrent pas. Lorsque nous testons de futurs médicaments, nous alternons les côtés pour les injections afin qu'elles soient le moins gênantes possible pour l'animal. Avant chaque expérience, les animaux sont doucement préparés pour les séances d’imagerie, avec une période d’habituation afin de réduire le stress. Lors des imageries, ils sont endormis sous anesthésie gazeuse et maintenus à une température constante grâce à un lit chauffant. Leur température corporelle et leur respiration sont surveillées en continu pour garantir leur confort. Enfin, pour évaluer de manière précise l'effet du traitement, chaque animal sera comparé à lui-même en mesurant son activité cérébrale avant et après le traitement.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux sociaux, ce qui nous permet d’étudier facilement les problèmes de relations sociales, un symptôme clé de l’autisme. Leur comportement très riche nous aide aussi à évaluer d’autres réactions qui peuvent être affectées par l’autisme. Les problèmes de comportement observés chez les souris utilisées pour modéliser l’autisme sont suffisamment clairs pour tester si notre modèle est correct et, si c’est le cas, pour voir si certains traitements peuvent avoir des effets positifs. À l’exception des souris, aucune autre espèce animale ne peut être génétiquement modifiée pour imiter cette maladie humaine. Nous utiliserons des souris adultes (âgées de 8 à 12 semaines), car à cet âge leur comportement est bien développé et les problèmes de comportement se sont stabilisés.