Souris
Formation à l’imagerie préclinique chez la souris: Raffinement et Réduction
- Formation professionnelle
Quatre-vingts souris sont tuées parce que le produit de contraste injecté reste plusieurs semaines dans leurs organes, les quatre-vingts autres, passées à l'échographie, sont réutilisées par l'équipe. 160 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal est anesthésié jusqu'à 40 minutes, cathétérisé à la queue, rasé et dépilé, puis soumis à un scanner et à des séances d'échographie de 20 à 25 minutes. Ces gestes servent à former quatre-vingts personnes aux techniques d'imagerie sur petits animaux, à raison de deux sessions par an pendant cinq ans.
Objectifs
Ce projet consiste à former le personnel à l’imagerie préclinique du petit animal. Les personnes qui veulent faire de l'imagerie pour leur projet ont besoin de connaitre le déroulé d'une expérience et de mieux comprendre les tenants et les aboutissants de ce type d'expérience afin de traiter leurs données de la façon la plus appropriée possible.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont que les participants puissent : • Appréhender le potentiel et les principales limitations de différentes modalités d’imagerie préclinique • Sélectionner la modalité d’imagerie préclinique la plus appropriée pour répondre à leur problématique physiologique donnée • Préparer de façon efficace leur étude en imagerie préclinique • Acquérir et analyser leurs images
Procédures
• Anesthésie des animaux : durée maximale 40 min/animal, 160 animaux • Cathéterisation caudale : durée maximale 2 min/animal, 160 animaux • Imagerie CT sans et avec produit de contraste : durée maximale 2 fois 1 à 4 min/animal, 160 animaux • Rasage, dépilation, rinçage et séchage : durée maximale 5 min/animal, 160 animaux • Echographie B-mode et Doppler : durée maximale 25 min/animal, 160 animaux • Echographie avec produit de contraste : durée maximale 20 min/animal, 160 animaux
Impact sur les animaux
Le stress est minimisé par l'implication d'un personnel qualifié à l'expérimentation animale. Les souris sont facilement stressées, la manipulation de l'animal nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Les animaux, après la phase d’acclimatation, seront habitués à être sortis de leur cage. Les nuisances ou effets indésirables seront évalués par les responsables de la formation. Les différentes injections peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection (mais réaliser sous anesthésie). A l’issue de la formation, les animaux seront euthanasiés après une profonde anesthésie gazeuse.
Devenir
Les 80 souris ayant reçu l’agent de contraste seront mis à mort car cet agent est rémanent et reste dans les organes pendant plusieurs semaines. Les 80 animaux utilisés pour l'imagerie échographique seront réutilisés dans notre équipe.
Remplacement
L'objectif de la formation est de former le personnel à l'imagerie préclinique du petit animal. Lors du cours théorique, des photos/ vidéos seront présentées. Cependant, lors des travaux pratiques, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in-vitro ou in-silico.
Réduction
Dans le cadre de cette formation, nous organisons deux sessions par an à raison de huit personnes par session, et de deux animaux/ binôme/modalité d’imagerie sur une periode de cinq ans, nous formerons 80 personnes et utiliserons 160 souris (80/ modalités d’imageries). Nous insisterons sur le fait que le recours aux modalités d'imagerie précliniques permet une exploration longitudinale sur les mêmes groupes d’animaux diminuant ainsi drastiquement le nombre d’animaux.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe, en présence d'enrichissement (morceaux de carton et/ou tube plastique). Les animaux seront observés une fois par jour. Toutes les stratégies d’analgésie, d’anesthésie et de soin seront mises en œuvre. Si nous constatons des bagarres dans les cages, nous procéderons à une séparation des individus pendant une durée maximale d'une semaine et l'animal restera en contact visuel, auditif et olfactif des autres congénères. En cas de blessure, nous appliquerons un nettoyant et un désinfectant sur la plaie jusqu’à cicatrisation complète. Durant la manipulation, l'animal sera anesthésié en gazeux, une protection oculaire lui sera appliquée. Le rongeur sera maintenu sur un tapis chauffant et/ou un lit thermorégulé durant l'imagerie. Dans le cadre de la formation, nous insisterons sur le fait que le recours aux modalités d’imageries précliniques permet de limiter l’utilisation de techniques invasives (ex. biopsie) ou des techniques d’exploration nécessitant l’euthanasie des animaux (ex. histologie).
Choix des espèces
La souris C57/Bl6 est une des principales espèces utilisées dans les laboratoires en raison de l'existence de différents modèles murins de pathologies neurologiques, cardiologiques et oncologiques utilisant ce fond génétique. Nous utiliserons des souris adultes mâles et femelles de 6 semaines en raison des fonctions physiologiques matures.
Etude des fonctions d’un gène dans le développement, la régénération et la maintenance des fonctions musculaires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
2 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Au sevrage, chaque animal subit une biopsie de la queue sous anesthésie, et une partie reçoit quatre injections à un jour d'intervalle, une injection provoquant une lésion musculaire, ou une stimulation avec mesure de force sous anesthésie générale. Le porteur reconnaît que le phénotype dommageable de ces lignées peut altérer la qualité de vie et conduire à la mise à mort des animaux les plus atteints, les retombées annoncées restant la compréhension de mécanismes fondamentaux et l'identification éventuelle de pistes thérapeutiques. Sur l'effectif, il écrit qu'aucun test statistique préalable n'était possible et que le nombre a été calculé "au plus juste" d'après les projets précédents.
Objectifs
Le muscle est la cible de maladies génétiques affectant les fibres musculaires, les cellules souches musculaires, ou la jonction entre le nerf et le muscle. Ces atteintes sont responsables d'une perte progressive des fonctions motrices, d’invalidité et/ou de mortalité anticipée. Si les mécanismes aboutissant à l’altération des fonctions musculaires sont divers, il apparaît que certaines fonctions cellulaires constituent des cibles importantes pour lesquelles les mutations ont un effet particulièrement délétère. C’est notamment le cas des mitochondries, les usines énergétiques cellulaires qui produisent l’énergie à partir du glucose et des acides gras. Des perturbations des fonctions mitochondriales sont associées à une moins bonne formation du tissu musculaire, ainsi qu’à une moins bonne régénération lors des microtraumatismes entraînant un vieillissement musculaire prématuré. Ce projet a pour finalité de caractériser les fonctions d’un gène dans le maintien du fonctionnement des mitochondries dans les cellules musculaires. Nous avons précédemment généré des modèles animaux et décrit les conséquences sur le fonctionnement musculaire. La présente demande vise à poursuivre ces travaux, afin d’identifier le mécanisme d’action du gène d'intérêt et notamment caractériser les fonctions métaboliques (=liées aux mitochondries) perturbées. A terme, le projet permettra de mieux comprendre les mécanismes liant la régulation des mitochondries et les myopathies, et de tester des thérapies ciblant notre gène d'intérêt.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes fondamentaux impliqués dans le développement et la régénération des muscles . Les gènes impliqués dans ces mécanismes sont généralement impliqués dans les maladies du système neuromusculaire comme les myopathies. Ils peuvent aussi être cibles pour l’identification de biomarqueurs ou de pistes thérapeutiques potentielles.
Procédures
Au moment du sevrage, les animaux subiront une biopsie à la queue, sous anesthésie (1 fois, le geste dure 1 minute). Des animaux subiront des injections (4 injections à un jour d'intervalle) pour inhiber le gène d'intérêt. Des animaux subiront l'injection d'un composé qui induit une blessure musculaire, sous anesthésie et analgésie (une seule fois). Des animaux subiront une stimulation musculaire et une mesure de force musculaire sous anesthésie générale (une seule fois).
Impact sur les animaux
Le phénotype dommageable chez certains animaux peut altérer la qualité de vie et dans les cas les plus sévères entraîner la mise à mort des animaux pour raison éthique. La piqure d'aiguille pour les injections intrapéritonéales entraînera une douleur légère de courte durée, et la contention au moment de l'injection entraînera un stress physique de courte durée. Certains animaux subiront une procédure de stimulation musculaire, sous anesthésie générale, qui entraînera un stress lié à la contention et une douleur légère suite à la stimulation musculaire. Certains animaux subiront une injection qui entraîne une lésion musculaire qui peut être douloureuse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car il s'agit de lignées transgéniques qui ne peuvent pas être remises en liberté ni réutilisées.
Remplacement
Des travaux ont été conduits dans l’équipe dans des modèles in vitro (cultures de lignées cellulaires) afin de valider nos hypothèses avant l’utilisation d’animaux. Le recours à l’animal et notamment aux modèles transgéniques permet d’identifier le rôle de certains gènes dans les processus de dégénération et remodelage tissulaire. Ces modèles offrent la possibilité de réaliser des analyses de tissus et même de l’organisme entier pour développer des stratégies thérapeutiques. Par ailleurs, la physiologie et le fonctionnement du système neuromusculaire impliquent des interactions complexes entre le muscle et les nerfs qui ne peuvent pas être reproduit in vitro à l’heure actuelle.
Réduction
Chaque fois que ce sera possible, nous coordonnerons les expériences réalisées par plusieurs expérimentateurs et dans la mesure du possible, nous procéderons à des prélèvements multiples sur le même individu. Les accouplements seront optimisés pour produire strictement le nombre d’individus nécessaires. Les animaux de génotype inutile à la reproduction seront incorporés dans les groupes contrôles, la majorité de nos lignées ayant le même fond génétique. Pour ce projet, il n’est pas possible de réaliser un test statistique préalable à la génération de cohortes, car pour l’ensemble les animaux seront utilisés pour des prélèvements de tissus et des expériences in vitro. Nous avons calculé au plus juste le nombre d’animaux nécessaires sur l’ensemble du projet, sur la base des expériences prévues et de nos projets précédents. Pour l’analyse des résultats, un test statistique adapté sera choisi.
Raffinement
Les animaux reproducteurs seront habitués à l’expérimentateur par une routine d’élevage qui permet de diminuer le stress des animaux. Une manipulation régulière, par contention douce (dans le creux de la main ou dans un tube en carton servant d’enrichissement) sera privilégiée comme méthode de manipulation des animaux. La taille de la biopsie, à l’extrémité de la queue, sera limitée à deux millimètres. Lors des différentes procédures, un suivi régulier des animaux sera réalisé et pour toute manipulation susceptible d’entraîner du stress ou de la douleur, nous aurons recours systématiquement aux techniques d’anesthésie ou d’analgésie. Des points limites adaptés, prédictifs, permettront de détecter rapidement toute souffrance inutile des animaux. Nous utilisons un dispositif expérimental qui permet de réaliser une stimulation musculaire mais également de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux pour l’ensemble du protocole. Cette innovation réduit la variabilité expérimentale inter-animale. On peut estimer que, grâce à ce dispositif, le nombre d’animaux nécessaire à la conduite de ce projet est réduit et que la qualité des résultats est accrue.
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l’Homme dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin permet d'évaluer la fonction contractile du muscle. Certains travaux ont montré que les étapes de la formation et de la régénération du muscle après induction d’une inflammation sont identiques chez la souris et chez l’Homme, rendant pertinent ce modèle pour notre étude. Les animaux pour la reproduction seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle et utilisés en reproduction préférentiellement jusqu’à l’âge de 6 mois, après quoi la fertilité diminue et les animaux seront réformés. En cas de besoin les animaux pourront être mis en reproduction après 6 mois, en l’absence de reproducteurs plus jeunes disponibles. Les tissus seront prélevés majoritairement sur des animaux prélevés à des âges standards dans la communauté scientifique : entre 8 et 12 semaines (jeune adulte). Une petite partie des animaux seront utilisés à l’âge de 64 semaines afin d’étudier l’effet du vieillissement sur la fonction musculaire. Cet âge est basé sur des études précédentes dans l’équipe où nous pouvons observer des lésions microscopiques du muscle sans altération marquée de la qualité de vie de l’animal.
Développement de modèles de souris pour valider la coopération oncogénique de différents gènes dans une pathologie hématopoïétique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des cellules cancéreuses sont injectées dans la veine de la queue ou sous la peau de souris sans poils, l'expansion tumorale gagnant les membres inférieurs et le bassin jusqu'à gêner progressivement les déplacements. 576 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec 10 à 12 prélèvements sanguins hebdomadaires sur animal éveillé et jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie. Toutes sont tuées entre la douzième et la quatorzième semaine, quand la greffe est jugée assez développée pour l'analyse. Le porteur ne retient des gestes pratiqués qu'une douleur "légère et de courte durée", et lit les mouvements d'étirement des pattes comme le signe d'une greffe réussie qui évolue.
Objectifs
Le projet vise à démontrer, chez l’animal, comment deux gènes mutés dans la même cellule contribuent au développement de la mastocytose, une maladie qui affecte plusieurs organes ou uniquement la peau. Nous pourrons ainsi valider les observations réalisées in vitro sur l'implication de nouveaux gènes dans la maladie et qui soulignent la nécessité de développer des traitements personnalisés ciblant les effets de ces gènes sur les patients. Avant de tester de nouveaux médicaments, il est crucial de comprendre comment ces gènes influencent la maladie.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet confirmeront la nécessité de développer des thérapies personnalisées ciblant les dérégulations qui ont lieu chez les patients. La réalisation de ce projet est indispensable avant de prévoir l’étude préclinique qui consistera à tester l’efficacité de nouvelles drogues. Cette stratégie a démontré son efficacité dans notre précédente étude.
Procédures
Une seule injection de cellules cancéreuses sera réalisée chez les souris, soit par voie intraveineuse (dans la veine) soit par voie sous-cutanée (sous la peau). L’injection, effectuée sous anesthésie générale (pour les injections sous la peau) ou sans anesthésie (pour l'injection dans la veine de la queue), dure seulement quelques secondes. Un petit échantillon de sang sera prélevé chaque semaine sur les souris, avec un total de 10 à 12 prélèvements ; chaque prélèvement dure moins de 5 secondes (animal éveillé). Ces animaux seront également examinés par imagerie 3 à 5 fois au total. Les deux méthodes d’analyse sont complémentaires pour le suivi précis de la cinétique de multiplication des cellules. Pour les souris ayant reçu une injection sous-cutanée, un seul prélèvement de sang sera réalisé à la 10ème semaine, pour vérification, car les cellules ne devraient pas migrer dans le sang. Le suivi de la greffe cutanée est fait par imagerie (8 au total). L’imagerie est réalisée sous anesthésie générale et dure maximum dix minutes.
Impact sur les animaux
L’anesthésie générale provoque une baisse de la température corporelle, un assèchement des yeux et un stress dû à la manipulation. L’injection des cellules pourrait provoquer une douleur légère et de courte durée après le réveil. L’imagerie peut entrainer du stress et une gêne de courte durée liée à l’anesthésie. Les prélèvements de sang, bien que brefs, peuvent provoquer du stress et une douleur légère durant les minutes qui suivent le réveil. L’expansion des cellules au niveau cutané peut provoquer des démangeaisons. L'expansion des cellules préférentiellement au niveau des membres inférieurs et du bassin, peuvent entrainer une difficulté progressive de se mouvoir. Des mouvements d’étirements des pattes indiquent une greffe réussie qui évolue, à surveiller de près.
Devenir
Les animaux utilisés sont euthanasiés entre la 12 et la 14 semaine suivant l’injection des cellules, ce délai correspondant au stade où la greffe est suffisamment développée pour permettre l'analyse des souris.
Remplacement
Au cours des trois dernières années, nos recherches en laboratoire ont cherché à comprendre comment certains gènes interagissent dans la mastocytose, un type de cancer qui peut se manifester soit dans plusieurs organes, soit uniquement sur la peau. Cependant, ces études en laboratoire ont leurs limites, car elles ne reproduisent pas entièrement les conditions réelles, où l'environnement autour des cellules joue un rôle crucial dans le développement du cancer, sa propagation et la résistance aux traitements. Les souris sont essentielles pour recréer, même partiellement, les conditions pathologiques chez les humains et pour explorer comment les gènes interagissent afin de tester de futurs traitements. Par exemple, pour mieux étudier la forme cutanée de la maladie, nous utilisons des souris sans poils. Ce modèle nous aide à suivre de près comment les cellules cancéreuses envahissent la peau, de manière similaire à ce qui se passe chez les patients.
Réduction
Nous avons choisi deux types de souris pour notre étude en raison de leur pertinence pour notre travail et de leur utilisation fréquente en recherche. Le premier type nous aide à étudier le cancer quand il touche différents tissus dans le corps, tandis que le second est utilisé pour observer la forme du cancer qui se manifeste uniquement dans la peau. Grâce à notre expérience et aux informations recueillies de précédentes études, nous savons combien de cellules injecter, comment les tumeurs se développent avec le temps, à quelle fréquence nous devons prélever du sang, quand et comment réaliser l’imagerie et quand il est nécessaire de mettre fin à l’étude.
Raffinement
Dans le cadre de notre projet, nous mettrons en place des méthodes de raffinement qui visent à garantir que les modèles animaux sont traités de manière éthique et que leur bien-être est pris en compte. 1.Anesthésie pour réduire la douleur et l'inconfort des animaux. 2.La surveillance régulière de la santé des animaux permet de détecter rapidement toute anomalie ou signe de détresse, ce qui permet une intervention précoce. 3. Enrichissement de l'environnement avec des éléments tels que des abris, des jouets, ou des matériaux à mâcher pour stimuler les comportements naturels et améliorer le bien-être des souris.
Choix des espèces
Le modèle souris s'avère particulièrement approprié pour notre étude sur la mastocytose, car il répond à notre besoin de comparaison avec la pathologie observée chez les patients et repose sur des recherches préexistantes, éliminant ainsi la nécessité de mises au point supplémentaires. Les souris seront greffées entre 5 et 8 semaines d'âge. Les expériences antérieures montrent que ce stade est optimal pour une bonne prise de greffe dans les deux souches, bien qu'il soit possible de les greffer jusqu'à 12 semaines d'âge.
Etude de l’impact d’une exposition précoce et chronique à un agent anesthésique sur le développement du réseau vasculaire rétinien et cortical
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Des souriceaux âgés de 4 à 10 jours sont exposés de façon répétée à un anesthésique général, puis suivis jusqu'à l'âge adulte avec pose d'un cathéter intraveineux, IRM, échographie et incision de la peau du crâne pour glisser des électrodes sous-cutanées. 510 souris vont être utilisées, dont 210 anesthésiées puis tuées sans reprise de conscience, les autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour examiner la rétine et le tractus visuel. L'enjeu déclaré est de savoir si l'anesthésie générale pratiquée chez le jeune enfant laisse des traces durables sur le développement du système nerveux. Le porteur annonce quatre tests comportementaux de cinq minutes par animal sans préciser lesquels, et écrit ne pas pouvoir "souscrire au principe de remplacement".
Objectifs
L’incidence de l’anesthésie générale (AG) dans l’enfance est en constante augmentation. En effet, 1/7 enfant bénéficie avant l’âge de 3 ans d’une AG à des fins chirurgicales, diagnostiques ou pour l’administration de soins. S’il est désormais admis que l’AG pédiatrique est un acte sûr dont le risque de complications immédiates est faible, la communauté publique et scientifique s’intéresse depuis plusieurs années à ses effets indésirables neuro-développementaux. Au cours des 20 dernières années, il a été décrit que les principaux agents anesthésiques utilisés au bloc opératoire interféraient avec le développement du système nerveux central (SNC) qui débute in utero et se poursuit tout au long de la vie. Des études de haut niveau de preuve chez l’enfant indiquent que la mesure de l’intelligence générale n’est pas modifiée après une exposition courte et unique. Néanmoins, l’effet de cette exposition sur la structure cérébrale n’avait encore pas été étudié. De plus, il demeure impossible d’apporter une réponse univoque sur la question des effets indésirables neuro-développementaux à long terme. Au sein du SNC, la rétine, en miroir du cerveau, apparait comme particulièrement intéressante pour des études neuro-développementales. En effet, de multiples parallèles peuvent être réalisés entre la rétine et le cerveau : origine embryonnaire commune, établissement des réseaux neuronaux et vasculaires en parallèle et un statut immunitaire particulier notamment lié à l’existence de barrières physico-chimiques comme la barrière hémato-rétinienne au niveau de la rétine et la barrière hémato-encéphalique au niveau du cerveau. De plus, la rétinogenèse est régulée par de nombreux facteurs et présente des aspects communs à ceux retrouvés au cours du développement cérébral. Notre premier objectif sera donc de déterminer, suite à une AG précoce et répétée, la présence éventuelle d’atteintes développementales au niveau de la rétine, du tractus visuel et de la vision ; et de les caractériser. Notre second objectif sera de s’intéresser aux atteintes structurelles et fonctionnelles du tractus visuel ainsi qu’à leur potentiel caractère prédictif d’altérations cérébrales, responsables de troubles à long terme. Nous nous intéresserons en particulier à l’intégrité anatomo-fonctionnelle du compartiment vasculaire. L’ensemble de cette caractérisation n’est à ce jour pas encore décrite dans la littérature soulignant ainsi l’originalité et la nécessité d’un tel projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter des arguments supplémentaires dans le débat sur l’effet neuro-développemental de l’AG, en particulier à long terme. Nos travaux seront appelés à modifier les pratiques cliniques si nos hypothèses se vérifient. Par conséquent, ils inciteront les professionnels de santé à différer les AG pour chirurgies non urgentes, à utiliser de nouveaux médicaments d’anesthésie moins à risque de toxicité cérébrale, à surseoir le plus possible à l’AG quand cela est possible (e.g. anesthésie loco-régionale, hypnose, etc.) et à adapter la prise en charge et le suivi d’enfants ayant eu une AG. Notre projet aura un bénéfice en clinique mais également en préclinique en mettant l’accent sur un effet de l’AG sur le neuro-développement conduisant à adapter les protocoles expérimentaux associant des questions neuro-développementales et l’utilisation d’agents anesthésiques au cours des protocoles de recherche. De plus, cette étude permettra d’explorer de nouveaux outils diagnostics non-invasifs basés sur l’étude de la rétine et de la fonction visuelle en miroir du cerveau afin de mettre en évidence des atteintes du SNC.
Procédures
1. Tests comportementaux (5 minutes par test, 4 tests seront réalisés pour chaque animal), 2. Pose d'un cathéter intraveineux pour injection de molécules fluorescentes ou traceurs (30 minutes, acte réalisé une seule fois sur l'animal), 3. Protocole d'imagerie par IRM (20 minutes à 1h30 selon les séquences, acquisitions réalisées une seule fois par animal), 4. Protocole d'imagerie par imagerie à ultrasons (45 min par animal, acquisition réalisée en une seule fois) 5.Incision de la peau du crâne et pose d’électrodes sous-cutanées pour prise de mesure de potentiels évoqués visuellement (5min/animal, acté réalisé une seule fois par animal)ou incision de la peau du crâne pourl'acquisition par imagerie à ultrasons (5min/animal, acté réalisé une seule fois par animal).
Impact sur les animaux
Selon la procédure, des nuisances ou effets indésirables sont à prévoir sur les animaux. Toutes les douleurs liées à des lésions de la peau des animaux (incision, perforation) seront empêchées par l’utilisation d'un anesthésique local avant le geste. Ces douleurs seront temporaires et se résorbent sous 48h. Pour les procédures pour lesquelles la douleur est plus importante, nous utiliserons des agents anesthésiants dont la nature et la posologie seront adaptées à la sévérité du geste sous forme d’une injection unique. Les procédures relatives aux évaluations comportementales ou d’imagerie sont indolores, mais peuvent engendrer un léger stress qui ne perdure pas dans le temps, dû soit à un nouvel environnement soit à l’isolement social. Les animaux retournent à un état basal dès qu’ils sont de retour dans leur cage et leur boxe de stabulation.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet fera l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification de traceurs injectés afin d’évaluer l'intégrité anatomique et vasculaire de la rétine d'une part et du tractus visuel d'autre part.
Remplacement
Nous ne pouvons souscrire au principe de remplacement dans ce protocole. En effet, il est nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de notre protocole. De plus, ce projet fait suite à une première étude au sein du laboratoire au cours de laquelle un protocole d’exposition précoce et répété des souris à une AG a été mis en place. Ces premiers résultats ont permis une première caractérisation s’intéressant à l’impact structurel et fonctionnel, au niveau cérébral, d’une telle procédure. L’étude a été menée chez une cohorte d’enfants ayant eu une exposition précoce à l’AG au cours de leur développement. L’altération structurale décelée a été associée à une diminution de la régulation émotionnelle chez ces enfants. Ces résultats, plébiscités après leur publication par la communauté scientifique ainsi que par le grand public (articles de presses parus), incitent à poursuivre ce projet de recherche translationnelle afin d’apporter une réponse au débat controversé des conséquences à long terme d’une AG dans l’enfance. Les connaissances et acquis du laboratoire en complément de la littérature scientifique rendent la souris particulièrement intéressante pour l’étude de l’impact d’une exposition précoce et répétée à une AG. Les observations réalisées à partir de l’utilisation d’un modèle murin nous incitent à étoffer la description des effets indésirables neuro-développementaux de l’AG afin d’aiguiller sur une potentielle relation mécanistique entre les atteintes observées et le mode d’action des agents anesthésiques. Le but étant d’améliorer la prise en charge anesthésique des enfants afin de minimiser l’impact sur leur développement. La chronologie du développement de la rétine, du cerveau et de leurs réseaux vasculaires est bien connue chez la souris. Cela permet notamment d'avoir un a priori des mécanismes du développement rétinien ainsi que de certaines étapes du développement cérébral chez l’Homme, via la prise en compte des fenêtres de vulnérabilité intrinsèques à chacune des deux espèces et par projection des résultats murins existants.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Conformément à la règle des 3Rs, le nombre d'animaux nécessaires au projet a été réduit au maximum, en se basant sur la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, selon nos précédents travaux publiés et la littérature. 510 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, comprenant la réalisation de tests comportementaux et d’outils d’imagerie non invasifs permettant d'évaluer l'intégrité anatomique et vasculaire in vivo du tractus visuel et du cerveau. Tous les animaux seront sujets à ces explorations complètes dans le but de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Cependant, il peut arriver d'avoir de la mortalité ou des exclusions d’animaux durant les étapes de la procédure (exposition à l’agent anesthésique, perte de poids, anesthésie au cours des examens d’imagerie...).
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement sont utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux, notamment par l'hébergement avec leur mère jusqu’au sevrage puis en groupes sociaux de 5 ou 6 animaux après le sevrage, l'enrichissement de leur environnement (maison, paillettes coton et papier kraft en quantité pour la fabrication d'un nid). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié et cela pendant toute la durée du projet afin de veiller à leur bien-être et leur bon développement. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et sous couverture analgésique adaptée au niveau de sévérité du geste, durant chaque procédure. Enfin, tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son et ne présentent aucun trouble du comportement lié aux protocoles .
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les animaux utilisés pour la réalisation du protocole d’AG seront âgés de 4 à 10 jours post-nataux (P4 à P10). Les études de l’impact de cette AG précoce et répétée sur ces animaux sera ensuite étudiée à 15 jours post-nataux (P15) ainsi qu’à 6 semaines (adultes). En effet, les stades P4 à P10 ont été choisis à partir d’expériences déjà menées au laboratoire et publiées dans la littérature. Enfin, les stades P15 et adultes ont été choisis afin d’évaluer à court et long terme l’effet de l’AG.
Compréhension de la relation entre le mucus intestinal et le système myentérique dans la prévention par les acides gras oméga3 de l’hyperperméabilité intestinale induite par l’obésité alimentaire chez la souris fat-1 mâle et femelle
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Les souris utilisées portent une modification génétique qui enrichit tous leurs tissus en acides gras oméga3, à un niveau que le porteur décrit comme inatteignable par l'alimentation. 232 souris vont être utilisées, 72 d'entre elles anesthésiées puis tuées sans reprise de conscience, les 160 autres soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un régime hyperlipidique pendant huit semaines, restent isolées en cage individuelle sur toute cette durée, subissent des gavages, un prélèvement submandibulaire sous anesthésie et une série de prises de sang à la queue toutes les quinze à trente minutes lors du test de tolérance au glucose. Toutes sont tuées par ponction intracardiaque à la fin de la huitième semaine, pour prélever sang et colon.
Objectifs
L’obésité alimentaire contribue à perturber la fonction barrière de l’intestin en détériorant la quantité et la qualité de la flore intestinale. En tant qu’aliments thérapeutiques, les lipides dits en oméga3 (particulièrement présents dans les poissons ou certaines huiles alimentaires) sont connus notamment pour améliorer cette fonction barrière. Dans ce contexte, nous étudions l’impact des lipides dits en oméga3 en particulier sur l’intégrité de la couche de protection qui tapisse l’intestin et la contribution de la flore intestinale. Nous avons montré précédemment que des souris mâles aux tissus riches en lipides en oméga3 sont protégées de l’obésité alimentaire, de l’altération de la perméabilité intestinale et du passage de molécules issues de bactéries de la flore intestinale dans le sang, molécules qui sont capables de provoquer une inflammation chronique de faible intensité. Chez la souris mâle, cette protection est transmissible à d’autres souris par la transplantation de la flore intestinale de souris aux tissus riches en lipides en oméga3. Chez la souris, un excès de lipides alimentaires ne provoque pas les mêmes troubles métaboliques chez les mâles et les femelles. Le poids corporel et l’assimilation du sucre sont moins altérés chez les femelles. Il s’avère donc nécessaire, de comparer chez des souris mâles et femelles aux tissus riches en lipides en oméga3 ou non comment l’obésité alimentaire et ses perturbations au niveau intestinal vont s’installer et si la flore intestinale est impliquée. L’obésité alimentaire entraîne également une modification du système nerveux intestinal. Cette modification pourrait également affecter l’intégrité de la flore intestinale et de la couche de protection qui le tapisse. Le système nerveux intestinal constitue donc une nouvelle cible d’étude, en particulier dans la compréhension des phénomènes contribuant à la mise en place des modifications de la perméabilité intestinale conduisant à une inflammation chronique de faible intensité. Ainsi, dans le contexte de lutte contre l’obésité, les objectifs de ce projet sont de comprendre le rôle des lipides dits en oméga3, chez la souris mâle et femelle dont les tissus sont riches en ces lipides, dans la protection contre l’inflammation chronique de faible intensité et de comprendre le rôle du système nerveux intestinal, de la couche de protection qui le tapisse et de la flore intestinale, différents éléments de la perméabilité intestinale.
Bénéfices attendus
L’obésité induit une altération de la perméabilité intestinale entrainant un passage de molécules de la flore intestinale dans la circulation sanguine, qui est en partie responsable d’une inflammation générale légère et chronique. L’étude de l’impact des lipides oméga3 est une piste privilégiée d’amélioration. Cependant, les études nutritionnelles, chez l’homme ou le rongeur, présentent de nombreux biais rendant les données peu concluantes. Les souris aux tissus riches en lipides oméga3 représentent donc une alternative de choix dans l’étude de l’impact de ces lipides sur les maladies associées à l’obésité alimentaire, bénéfice que nous avons déjà montré sur la prise de poids ou le diabète. Nous avons également récemment montré, chez la souris mâle, que le seul transfert de la flore de souris aux tissus riches en lipides oméga3 à des souris WT les protègent efficacement de ces pathologies mais également des altérations de la perméabilité intestinale et de la couche de protection qui le tapisse. Bien qu’il existe des différences entre sexes dans le développement des troubles métaboliques dus à l’obésité, aucune étude n’a encore exploré cet aspect chez la souris femelle afin de comprendre les différences observées. L’obésité alimentaire entraîne également une modification du système nerveux intestinal. Cette modification pourrait également affecter l’intégrité de la flore intestinale et de la couche de protection qui le tapisse. Le système nerveux intestinal constitue donc une nouvelle cible d’étude afin de comprendre les phénomènes contribuant à la mise en place des modifications de la perméabilité intestinale conduisant à une inflammation chronique de faible intensité. Ce projet a maintenant pour but, dans un contexte d’inflammation chronique due à l’obésité, de comprendre le rôle des lipides oméga3, chez le mâle et la femelle, dans l’amélioration de la fonction barrière de l’intestin et sur la structuration de la couche qui le tapisse l’intestin et sur le système nerveux intestinal. Il est également important de déterminer la contribution de la flore intestinale. En effet, ce projet pourrait permettre l’identification de bactéries favorables, éventuelles futures cibles probiotiques, essentielles au bon fonctionnement de la barrière intestinale lors de l’obésité.
Procédures
Les animaux seront manipulés de façon hebdomadaire afin d’évaluer leur poids. De plus, - Au début du régime, les animaux seront placés en cages individuelles avec couvercle filtrant ou collectives - Aux semaines 1 et 8 des fèces seront collectés (3 à 4 crottes sur une durée d’une dizaine de minutes) - Prélèvement de sang à la semaine 7 d’expérimentation, 4 heures après le gavage avec une solution de Dextran-FITC niveau de la région submandibulaire afin de mesurer la perméabilité intestinale. Chaque prélèvement sanguin sera réalisé en une vingtaine de seconde. - Prélèvement de sang, 4 heures après le gavage avec une solution de glucose, à la semaine 8 d’expérimentation. Le prélèvement est réalisé au niveau de la partie terminale de la queue de la souris aux temps 0, 15, 30, 60, 90, 120 minutes après le gavage au glucose pour mesurer la glycémie (chaque prélèvement sanguin sera réalisé en une vingtaine de seconde). - Un prélèvement terminal sera effectué à la fin de la semaine 8 via une ponction intracardiaque nécessitant une à deux minutes par animal.
Impact sur les animaux
Afin d’éviter la dominance d’un des congénères pouvant limiter l’accès à la nourriture et empêcher le brassage de microbiote entre les animaux, les souris seront placées en cage individuelle munie d’un couvercle filtrant pour la durée de l’étude nutritionnelle (8 semaines). L’obésité provoquée par un régime hyperlipidique peut être source de difficultés pour les animaux rendant le toilettage ou l’accès à l’eau de boisson difficile. Le prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la partie terminale de la queue (à l’aide d’une aiguille 26G) pour la mesure de la glycémie lors du test de tolérance au glucose), le prélèvement submandibulaire après anesthésie à l’isoflurane et les gavages oro-gastriques (pour les instillations de microbiote) sont des gestes pour lesquelles peu ou pas de douleur est attendue puisqu’ils seront réalisés par un personnel maitrisant très bien ces gestes techniques et les animaux seront observés plusieurs fois dans la journée (en cas de fausse route l'animal montre des signes de souffrance assez rapidement). Tous les animaux de l’étude seront suivis par un personnel compétent selon les modalités mise en place par la Structure chargée du Bien-être Animal de la plateforme de Zootechnie. Nous leur donnerons comme enrichissement de milieu dans toutes les cages des carrés de coton pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Une observation générale quotidienne des animaux sera effectuée et une observation et manipulation individuelle hebdomadaire sera réalisée à l'occasion de la pesée et de l'entretien des animaux. Ainsi, si une souris est en souffrance nous pourrons agir rapidement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue du projet afin de réaliser des prélèvements de différents tissus (sang, colon)
Remplacement
Un modèle de souris transgénique dont les tissus sont intrinsèquement riches en lipides en oméga3 est un modèle précieux car cette souris possède un niveau d’enrichissement dans ses tissus qui n’existe dans aucun autre modèle murin et qui est non atteignable par des stratégies alimentaires. D’une part, l’ubiquitisme de l’enrichissement tissulaire en lipides en oméga3 et d’autre part les taux tissulaires obtenus rendent impossible le remplacement de ce modèle de souris par des modèles in vitro. De plus, le protocole décrit vise à étudier le système nerveux intestinal lors de l’altération par un régime riche en lipides de la fonction barrière de l’intestin en relation avec la formation de la couche qui le tapisse (mucus). Il est impossible de complètement modéliser ce processus et ces interactions à travers des approches in vitro. En effet, si la co-culture de cellules entériques gliales et de lignées cellulaires coliques secrétant de mucus pourrait être envisagée, un tel modèle ne permettrait pas de reproduire in vitro la complexité des interactions entre le système nerveux intestinal et les cellules qui secrètent le mucus, mucus qui apparait bicouche avec une structuration très organisée in vivo. Cette structuration très organisée représente un enjeu essentiel pour le maintien de la perméabilité intestinale et le dialogue entre le système nerveux intestinal, le mucus et la flore microbienne qui y vit. Cette étude est par ailleurs menée dans un contexte d’obésité alimentaire. Ce contexte est difficile à modéliser en raison de la complexité des impacts métaboliques observés et de la diversité des approches de régimes utilisés. Cet aspect ne peut donc également pas s’affranchir de l’utilisation d’animaux. Enfin, aucune étude n’a encore exploré chez la souris femelle cet aspect bien qu’il ait été montré des différences entre les sexes dans le développement des troubles métaboliques induits par un régime obésogène. Cette étude est donc unique dans l’approche de l’étude de l’impact des lipides en oméga3 sur le système nerveux intestinal et le mucus intestinal dans un contexte d’obésité alimentaire et de ses pathologies associées.
Réduction
Les effectifs ont été optimisés sur la base des coefficients de variabilité reportés dans la littérature et les différences attendues entre les différents groupes pour les paramètres clés de l’étude. Lors de la conception des protocoles expérimentaux nous avons déterminé le nombre de 12 et 8 animaux par groupe nécessaire et suffisant à l'obtention de résultats statistiquement exploitables. Afin de réduire le nombre d’animaux intégrables dans le protocole, en amont de la production des animaux, les souris WT sont croisées entre et elles et les souris Fat-1 homozygotes entre elles générant des descendants tous intégrables dans le protocole et ceux sans génotypage.
Raffinement
En raison de la nuisance et de la souffrance modérée induite par l’isolement en cage individuelle durant toute la durée de l’expérimentation (8 semaines), une attention particulière sera apportée à l’enrichissement du milieu . Toutes les souris auront accès à des enrichissements de milieu dans chaque cage, constitués de carré de coton et/ou papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Une attention particulière sera également portée à la surveillance de la prise de nourriture et aux comportements liés au stress. Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée en secteur conventionnel et intégration dans le projet. A la suite des interventions (OGTT, instillations de microbiote par gavage ou gavage avec le Dextran-FITC) chaque animal sera examiné. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée.
Choix des espèces
La détermination de l’impact d’un régime obésogène sur la perméabilité intestinale et la relation entre microbiote/mucus est primordiale à notre étude. Cet aspect ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux afin de mimer au mieux un contexte d’inflammation bas grade. Bien que relativement éloignée de l’Homme, l’espèce murine est l’espèce animale de référence dans ce domaine de recherche et la plus utilisée en recherche préclinique avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le modèle de souris transgénique fat-1 est un modèle précieux qui rend cette étude unique dans l’approche de l’impact des lipides en oméga3 sur la prévention de l’hyperperméabilité intestinale induite par un régime obésogène. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 12 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids supérieur à 20g. En effet, nous nous intéressons à l’obésité et aux conséquences métaboliques associées développées par les jeunes adultes car il a été montré que l’augmentation en France de l’obésité touche toutes les tranches d’âge mais que la fréquence semble plus élevée dans les tranches 25-34 et 35-44 (de l’ordre de 8% par an). De telles données sur le jeune adulte ont été également confirmées aux Etats-Unis et récemment en France. De plus, les études précédentes mettant en évidence la transmission de la résistance partielle de l’induction de l’obésité alimentaire par le microbiote de souris fat-1 à des souris WT au laboratoire a porté sur l’animal jeune adulte. Nous souhaitons pouvoir inscrire ces nouvelles expérimentations dans notre objectif thématique plus global.
Rôle de la protéine ACBP dans le contrôle du métabolisme énergétique : étude de sa fonction dans le bulbe olfactif.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour la collecte de sang et de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie stéréotaxique de vingt à vingt-cinq minutes pour l'implantation d'une canule dans le bulbe olfactif, puis vit isolée pour que le dispositif ne soit pas abîmé. Suivent un test de tolérance au glucose de deux heures avec prélèvements sanguins répétés à la queue, cinq heures de privation de nourriture, et un test consistant à chronométrer le temps mis pour retrouver un morceau de cookie au chocolat enfoui dans la litière. L'espoir affiché, un traitement contre l'obésité, repose sur l'hypothèse qu'une protéine stimulerait l'appétit en améliorant l'odorat. Le porteur affirme avoir calculé l'effectif au plus juste, sans donner ni méthode ni chiffre.
Objectifs
La protéine ACBP se lie aux acides gras et interagit avec d’autres molécules. Chez les humains, elle est présente à des niveaux plus élevés chez les personnes obèses et plus faibles chez celles souffrant d’anorexie. Chez les rongeurs, elle stimule l’appétit : lorsqu’on leur administre de l’ACBP, ils mangent davantage et prennent du poids, ce qui peut mener à l’obésité. La majorité des recherches ont étudié son action sur l’hypothalamus, mais son rôle dans le bulbe olfactif (zone du cerveau liée à l’odorat) reste peu exploré, bien qu’il soit connu qu’ACBP y est bien exprimée avec son récepteur GABAarD, rendant son étude dans cette zone pertinente. Puisque l’odorat influe sur l’alimentation, l’ACBP pourrait, en améliorant l’odorat, stimuler l’appétit. Bloquer cette protéine pourrait donc réduire la consommation de nourriture et offrir une piste de traitement contre l’obésité. Pour tester cela, nous allons injecter ACBP dans le bulbe olfactif de souris ou utiliser des anticorps pour bloquer son action, en comparant avec un groupe témoin. Pour se faire, 2 groupes distincts seront mis en place : un premier pour évaluer les effets immédiats sur l’odorat et la régulation du glucose et un second groupe recevra des injections similaires pour observer leur prise alimentaire, avec ou sans aliments appétents. Ce projet cherche à mieux comprendre l’influence d’ACBP sur l’odorat et l’appétit, avec l’espoir de développer des traitements contre l’obésité.
Bénéfices attendus
Chez les rongeurs, la protéine ACBP influence l’alimentation : quand on leur administre cette protéine, ils mangent plus, prennent de la graisse et deviennent obèses sur le long terme. La plupart des études ont examiné l’effet de l’ACBP sur une région du cerveau appelée l’hypothalamus, mais on sait peu de choses sur son rôle dans le bulbe olfactif, la partie du cerveau responsable de l’odorat. Pourtant, l’odorat joue un rôle clé dans l’alimentation. Si l’ACBP améliore l’odorat, cela pourrait expliquer pourquoi les souris mangent davantage. À l’inverse, bloquer cette protéine pourrait réduire l’appétit. Cela pourrait offrir une nouvelle piste pour traiter des maladies comme l’obésité et ses complications.
Procédures
Dans cette étude, les souris subiront une opération d'environ 20 à 25 minutes pour installer un tube dans leur bulbe olfactif, permettant d’y injecter les protéines nécessaires. Ensuite, pour évaluer comment leur corps utilise le glucose, un test de tolérance au glucose sera effectué : leur taux de glucose dans le sang sera mesuré à plusieurs moments (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes) en déposant une goutte de sang sur un appareil similaire à ceux pour humains. De petites quantités de sang (environ 20 microlitres) seront également prélevées aux temps 0, 15 et 90 minutes pour mesurer l’insuline, l’hormone qui régule le glucose, ce qui suffira pour suivre son évolution tout en limitant le volume de sang prélevé. Les tests de tolérance au glucose et à l'insuline durent chacun deux heures. De plus, pour évaluer l'impact de la molécule dans le bulbe olfactif sur la recherche et/ou l'envie pour de la nourriture palatable, des tests comportementaux seront réalisés une fois sur chaque animal, en espacant chacun des tests (métabolique et comportemental) de deux semaines. Le "buried-food test", traduit comme le test de la nourriture enfouie, consiste à mesurer le temps que met la souris à retrouver un bout de nourriture, le plus souvent un morceau de cookie au chocolat odorant, caché dans la litière. Il dure quelques dizaines de minutes et permet d'estimer la performance olfactive de l'aimal, accompagnée de la motivation à chercher de la nourriture. La prise alimetaire d'aliment standard ou d'aliment palatable est également évaluée pendant 3h après une courte période privation de nourriture (5h), ce qui permet de voir si l'animal présente une modulation de son appétit selon la catégorie d'aliment.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une chirugie stérotaxique, avec inhalation d'anésthesiant et injection d'analgésiant, cependant une douleur modérée est susceptible d'être ressentie au réveil. Concernant les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, des nuisances légères peuvent survenir avec les prélèvements de sang à la queue de l'animal (légère douleur) , et avec un faible risque d'hypoglycémie suite à l'administration d'insuline. Les tests comportementaux (capacité olfactive pour retrouver un aliment enfouï, et prise alimentaire) ne présentent pas d'effets indésirables hormis la privation de nourriture préalable au test. Après la chirurgie, les animaux sont isolés afin d'éviter que les cannules de perfusion ne soient endommagées, ce qui représente un stress dû à l'isolement susceptible d'être ressenti par les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude, afin de collecter du sang et des tissus pour analyses ultérieures. Au cours des procédures, si l'animal ne se remet pas correctement de la chirurgie ou qu'un problème survient malgré le suivi post opératoire, perte de poids ou autres problèmes de santé ou de bien-être (problème de locomotion, prostration et qualité du poil, etc.)), l'animal sera mis à mort.
Remplacement
Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôlent les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est impossible de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux est encore nécessaire.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé a été calculé pour que les tests statistiques puissent être fiables et robustes, évitant ainsi de réitérer les expériences, tout en utilisant le nombre d'animaux le plus faible possible.
Raffinement
Nous avons prévu les prélèvements de sang en calculant au plus près les volumes nécessaires aux mesures de l'insuline donc les volumes sont minimes, afin de peu impacter le bien-être animal. Concernant la chirurgie stéréotaxique permettant d’installer les canules d'injection dans le bulbe olfactif, intervenant dans les 2 procédures (et donc toute l’étude), nous avons mis en place une anesthésie et analgésie adaptée avant, pendant et après la chirurgie. Les animaux seront maintenus isolés après chirurgie dans des cages standards avec des milieux enrichis (nids végétaux, tubes) ce qui permettra d'améliorer leur bien-être. Ils seront également observés quotidiennement afin d'identifier les animaux en souffrance et éventuellement d'euthanasier les animaux dont les points-limites auraient été atteints. Une légère perte de poids peut-être observée après les premiers jours suivants l’opération, et un complément alimentaire de type gel enrichi en calorie pourra être proposé aux animaux pour leur permettre une meilleure récupération. Cependant, après une semaine, les animaux qui sont en perte constante de poids (supérieure à 15% de leur poids initial) seront mis à mort. A tout moment, si un point limite est atteint l'animal sera mis à mort pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Nos modèles murins, les souris C57BL6 adultes sont très bien caractérisées au niveau métabolique depuis plusieurs dizaines d'années dans plusieurs laboratoires, dont le nôtre et représentent une souche murine adéquate comme modèle d'étude des maladies humaines. De plus, nous avons l'expertise du suivi du bien-être de l'animal après injection, du phénotypage métabolique des souris.
Etude métagénomique et métabolomique de la dysbiose nasale dans la maladie de Parkinson
- Conservation des espèces
- Enquêtes médicolégales
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies des plantes
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Seize heures sans nourriture avant le test de l'aliment caché, une nuit de test de préférence au sucre, deux tests d'anxiété, un conditionnement de peur sur deux jours : 504 souris enchaînent neuf épreuves comportementales après sept jours d'instillations nasales d'antibiotiques sous anesthésie. Elles reçoivent ensuite par le nez des bactéries ou du microbiote de patients parkinsoniens, ce qui peut déclencher deux mois plus tard une maladie de Parkinson expérimentale, avec malnutrition, troubles de la motricité et faiblesse musculaire. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées pour l'analyse de leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux. Le porteur présente le recours à la souris comme un moyen d'éviter d'utiliser des primates non humains.
Objectifs
La maladie de Parkinson (MP) est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente en France, après la maladie d'Alzheimer. C’est une maladie complexe, d’étiologie encore inconnue, caractérisée par une destruction d’une population spécifique de neurones, entraînant un déficit au niveau de l’initiation et du contrôle des mouvements. Sur le plan moléculaire, des lésions sont retrouvées et correspondent à des amas pathogènes formés par une protéine : l’α-synucléine. Les troubles olfactifs sont fréquents dans la MP et sont souvent présents plusieurs années ou décades avant l'apparition des symptômes moteurs. Les troubles précoces de l’odorat dans la MP pourraient être la conséquence d’un déséquilibre du microbiote nasal. Dans cette étude, nous émettons l’hypothèse qu’il existe un lien entre le microbiote nasal et les déficits olfactifs de la MP. Ce modèle expliquerait tout d’abord les lésions inflammatoires de la muqueuse olfactive constatées chez les patients MP, ainsi que l'accumulation de la protéine neurotoxique dans les structures olfactives. Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nos trois principaux objectifs sont de clarifier (1) le rôle exact de profils spécifiques de microbiotes nasaux avec les performances olfactives, (2) l’impact de l’environnement sur le microbiote nasal et (3) tester le lien entre microbiote nasal et MP. L’opportunité d’étudier deux populations ayant une exposition environnementale très différente, en France métropolitaine et aux Antilles, devrait permettre d’identifier des anomalies du microbiote spécifiques à la maladie de Parkinson. Les souris constituent un modèle pertinent pour ce projet car (1) elles peuvent facilement être colonisées par des microbiotes d’origine humaine et (2) elles peuvent développer des maladies proches de la MP très rapidement après gavage avec des échantillons provenant de selle de patients MP.
Bénéfices attendus
Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nous couplerons notre analyse moléculaire du microbiome avec l’analyse métabolique de la muqueuse nasale et du sérum de patients MP et de souris transplantées avec du microbiote humain de patients MP. Ce projet nous permettra d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans le déséquilibre du microbiote nasal et de proposer des biomarqueurs et des nouvelles cibles thérapeutiques. Les résultats de ce projet pourraient améliorer la prise en charge médicale des patients.
Procédures
Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) - une seule instillation intranasale de bactéries (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) - une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). - Un test d’anxiété (20 minutes) - Un test de reconnaissance de nouveaux objets (20 minutes) - Un test de préférence au sucrose (une nuit) : mesurant leur préférence à boire une solution sucrée plutôt que de l’eau plate (test effectué sur une nuit, biberons additionnés de sucre et biberon normal). - Un second test d’anxiété (10 minutes): - Un test mesurant la perception aux odeurs des souris (15 minutes) - Un test des capacités morices (5 minutes) - Un test d’évitement des prédateurs (10 minutes). - Un test de test de conditionnement de peur (10 minutes pendant 2 jours)
Impact sur les animaux
Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. L’instillation intranasale d’antibiotiques provoque un inconfort de courte durée. - une seule instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. - L’instillation intranasale de microbiote humain ou de bactéries comme des Staphylocoques provoque un inconfort de courte durée et peut induire deux mois après l’instillation une maladie de Parkinson expérimentale chez la souris qui présentera alors des signes de malnutrition, des problèmes de motricité et une faiblesse musculaire. - Une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). La restriction alimentaire induit habituellement un stress physique modéré et de la détresse modérée pendant une durée de 16 heures avant la réalimentation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire que tous leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux soient analysés en détail pour identifier les mécanismes sous-tendant le développement de la maladie de Parkinson.
Remplacement
Malheureusement, à l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour tester la perception, la mémoire et la coordination motrice.
Réduction
Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire le plus possible le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux estimé pour ce projet a été calculé par un biostaticien de manière à ce que, pour chaque expérience, les groupes utilisés soient constitués de 12 souris, le nombre minimal requis pour que l’analyse statistique ultérieure permette une évaluation pertinente des résultats. Nous avons calculé qu’un nombre de 12 souris minimum par groupe est nécessaire.
Raffinement
Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire tout stress et inconfort de l’animal. Après l’instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain, chaque animal fera l’objet d’une évaluation quotidienne pendant 2 jours puis tous les 7 jours pour s’assurer de sa bonne santé (mesure du poids, analyse de l’allure du pelage, de l’état de vigilance, de la posture, du comportement moteur général et du comportement exploratoire dans la cage). Nous allons particulièrement surveiller l’apparition de signes chroniques parkinsoniens comme un trouble de la motricité (allure de la marche, activité locomotrice, comportement exploratoire dans la cage, coordination motrice et équilibre) et une faiblesse musculaire (incapacité à bien se mouvoir sur la grille de la cage). Ces signes cliniques sont habituels dans les modèles expérimentaux de maladie de Parkinson chez la souris. Si l’animal présente des signes parkinsoniens, il fera l’objet d’un suivi plus poussé : Il sera pesé tous les jours et du gel hydrique sera disposé sur la litière pour améliorer la prise alimentaire. Si cet animal en plus des signes parkinsoniens se met à présenter une perte de poids ≥20% du poids basal, est déshydraté ou reste prostré, il sera mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
Le système nerveux des souris est proche de celui de l’humain et sensible au développement de pathologies expérimentales parkinsoniennes comme par exemple après l’administration de microbiote intestinal humain provenant de patient parkinsonien. Nous disposons d’un nombre important d’outils et de données avec ce modèle qui devraient nous permettre de tester les liens entre déséquilibre du microbiote nasal et neuropathologie parkinsonienne et d’établir des schémas thérapeutiques, voire préventifs pour les humains, en évitant donc de recourir à des primates non humains. Nous utiliserons des souris surexprimant un gène humain qui nous permettront d’appréhender le facteur génétique de l’hôte dans la pathologie. Adulte, à partir de 6 semaines après la naissance, car la maladie touche les adultes.
Etude de l’impact des micro-thromboses post-AVC sur l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris ne faisant pas d'accident vasculaire cérébral spontanément, une chirurgie d'une heure sous anesthésie leur en provoque un, avec les déficits moteurs et cognitifs qui suivent. 350 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus. Une partie est génétiquement déficiente pour le facteur XII de la coagulation, et l'ensemble reçoit des injections de nano-gouttes fluorescentes puis des séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie. Le porteur annonce des procédures ayant "un caractère de stricte nécessité" et une batterie de cinq tests comportementaux, sans préciser lesquels.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Cette pathologie est la 3ème cause de mortalité et la première cause de handicap acquis chez l’adulte dans le monde. En France, cent trente mille nouveaux cas sont répertoriés par an. L’AVC pose donc un problème majeur tant dans le domaine de la santé publique que sur le plan humain. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie pour lesquels seul 20% des patients seront éligibles. De ce fait, il existe de nombreux travaux de recherche qui ambitionnent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de traiter un maximum de patients. Pour cela, il est nécessaire de mieux comprendre les processus physiopathologiques des AVC. La thrombectomie, ne conduit malheureusement pas toujours à une reperfusion efficace de la région cérébrale ischémique. L'une des raisons potentielles de ce phénomène pourrait être liée à la formation de microthromboses, dont il a été constaté qu'ils perturbent localement la barrière hémato-encéphalique (BHE). Par conséquent, l'objectif du projet est de caractériser les mécanismes spatio-temporels et fonctionnels de la microthrombose post-recanalisation, également connue sous le nom de phénomène de "no-reflow",puis d’en comprendre les mécanismes sous-jacents afin de déterminer son impact sur l’AVC, en utilisant différents modèles animaux représentatifs de la physiopathologie humaine.
Bénéfices attendus
Ce projet à pour but d’étudier les interactions entre les cellules des microthomboses et les différents composant de la BHE (Cellules endothéliales, péricites, astrocytes) et comment cela va influencer la physiopathologie de l’AVC. Ces travaux devraient permettre d’identifier des mécanismes cellulaires qui pourraient être de nouvelles voies de développement d’outils thérapeutiques pour le traitement des AVC.
Procédures
Les animaux subiront des chirurgies pour induire des AVC puisque les souris n'en développent pas spontanément. Ainsi, il sera réalisé des chirurgies sous anesthésie générale d'une durée de 1 heure maximum, permettant de générer des déficits moteurs et cognitifs. Des injection de nano-gouttes fluorescentes en intraveineux seront également faites sous anesthésie générale soit pendant l'anesthésie associée à la chirurgie soit au moment des acquistions en imagerie. Il n'y aura donc pas d'aneshtésie spécifique à ce geste expérimental. Le suivi en imagerie microscopique ou imagerie médicale (IRM) sera réalisé également sur animal aneshtésie (durée : 1 heure maximum) afin d'assurer l'immobilité des souris. Une batterie de tests comportementaux (5 au total) seront effectués sur les animaux afin d'évaluer les déficits moteurs et cognitifs. La durée de chaque test ne devrait pas dépasser 15 minutes.
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie d’induction de l’AVC, les animaux se trouveront désorientés, avec des déficits neurologiques vecteur de stress. Pour cela une surveillance accrue des animaux sera réalisée sur toute la période post AVC. Il est également attendu des douleurs post-opératoires qui seront prises en charge par une couverture analgésique adaptée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tissus et faire des analyses.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité. L’étude de la formation de microthromboses et de leur impact nécessite la réalisation d’expériences sur l’animal, aucune méthode alternative ne peut remplacer l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information
Réduction
Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité grâce à une analyse de puissance statistique. Ainsi, le nombre d’animaux utilisé a été réduit au maximum. De plus, lorsque cela est possible il est prévu d’utiliser des approches non invasives afin de faire un suivi comportemental et en imagerie.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure chirurgicale et/ou douloureuse. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Ce suivi fera l'objet dun scoring afin d'évaluer les points limites. Les animaux seront hébergés dans des cages par groupe de 5 avec de l’enrichissement (domehome, ouate de cellulose) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Pour la chirurgie et le suivi en imagerie, les animaux seront anesthésiés et sous couverture analgésique.
Choix des espèces
La souris est l'espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien décrites et maitrisée. L'anatomie du système nerveux murin, de la barrière hémato-encéphalique et la physiologie de la souris sont également bien connues et proches de celles de l'homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. Toutes les connaissances et l'expérience que nous avons dans le laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences nécessitent l'utilisation d'animaux transgéniques, des souris déficientes pour le facteur XII de la coagulation. Ce modèle transgénique ne peut être produit que chez la souris. De plus, il n'existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés ou des invertébrés moins sensibles, étant donné que leur anatomie et leur physiologie sont très différentes de celles de l'homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6 à 8 semaines correspondant à un stade jeune adulte seront nécessaires. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de pathologies (AVC) et notamment en conditions inflammatoires (inflammation centrale).
Validation de l’efficacité anti-tumorale d’une thérapie ciblant une protéine impliquée dans la progression et la résistance de tumeurs cérébrales.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des cellules de glioblastome sont implantées dans le cerveau de 272 souris, sous anesthésie, au cours d'une chirurgie de trente minutes. Toutes relèvent d'un niveau de souffrance sévère et reçoivent ensuite trois traitements par semaine sur animal vigile, une imagerie hebdomadaire et deux séances de radiothérapie, qui affaiblissent leur système immunitaire pendant environ deux semaines. Le porteur écrit que les douleurs de la plaie et les céphalées "sont diminuées" par l'analgésie, tout en indiquant que les souris n'atteignant pas les points limites peuvent rester en protocole de six à douze mois. Les souris chez qui aucune tumeur ne se développe sont tuées elles aussi, faute de pouvoir être réutilisées.
Objectifs
Une protéine a été identifiée dans l’invasion, la survie et la résistance du glioblastome, cancer très agressif d’un type de cellules du cerveau. Cette étude évaluera l’efficacité d’un anticorps thérapeutique inhibant cette protéine, en combinaison ou non avec la chimiothérapie de référence et de la radiothérapie permettra ainsi de proposer de nouvelles stratégies antitumorales pour cette maladie.
Bénéfices attendus
Le cancer du cerveau étudié dans cette étude est l’une des plus fréquentes tumeur originaire du cerveau, et en dépit des efforts de la recherche, cette pathologie reste incurable. Les traitements actuels sont très délétères et la survie des patients après diagnostic est de 12-18 mois. Cette étude évaluerait l’efficacité d’une nouvelle stratégie thérapeutique.
Procédures
Les souris subiront différentes manipulations chaque semaine pour des pesées (3x/semaine,
Impact sur les animaux
Toutes les manipulations (pesées, traitements) peuvent entrainer du stress durant le temps des contentions ainsi que pour l'anesthésie (endormissement et réveil) lors de la chirurgie et des imageries. Les nuisances liées à une procédure chirurgicale (douleurs au niveau de la plaie, céphalées) sont diminuées par la mise en place d'une analgésie spécifique et d’un suivi fréquent permettant de l’ajuster en cas de besoin. Le traitement par radiothérapie altère le système immunitaire des souris pendant environ 2 semaines mais le niveau de protection de l’animalerie empêche toute infection. Il se peut cependant que cela entraine une perte de poids et de la fatigue chez les souris.
Devenir
Tous les animaux porteurs de tumeurs seront mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet afin de pouvoir récolter les cerveaux ou les tumeurs pour des analyses biologiques. Les animaux non porteurs ne pourront pas être réutilisés et devront également être mis à mort afin d'éviter un développement de tumeurs de manière tardive.
Remplacement
La protéine d’intérêt étudiée est impliquée dans plusieurs mécanismes associés aux tumeurs qui nécessitent donc la présence de multiples populations cellulaires en interactions complexes. Les cancers du cerveau se caractérisent par pour la diversité des cellules qui les composent ainsi que toutes les interactions entre elles = microenvironnement tumoral. Ces éléments sont nécessaires à la compréhension de l’impact de notre protéine d’intérêt. D’après les publications scientifiques, cette diversité n’est pas retrouvée dans les cultures cellulaires (qui contiennent en général un nombre très limité de types cellulaire différents) mais uniquement dans les tumeurs chez la souris où l’on retrouve un microenvironnement tumoral complet avec tous les types cellulaires comme les cellules cancéreuses, les cellules immunitaires, les cellules des tissus touchés par ce type de cancer. Les tests précliniques sont aussi indispensables pour valider la capacité d’un nouvel outil thérapeutique à atteindre la tumeur au niveau du cerveau (organe protégé par une multitude de barrières physiologiques), et vérifier son efficacité seul ou en combinaison avec des traitements anti-cancéreux existants pour former de nouvelles stratégies de traitement.
Réduction
Le nombre de groupe et l’effectif de chaque groupe d’animaux a été réduit au maximum en se basant sur la littérature et l’utilisation de tests statistiques, notamment dans les premiers groupes ayant seulement pour but visualiser notre anticorps au niveau du cerveau des souris. Ensuite dans les groupes de traitements, bien que des contraintes techniques nous obligent à répéter certains groupes plusieurs fois, l’effectif des groupes répétés a donc été réduit afin d’être mutualisés une fois que tous les protocoles auront été réalisés.
Raffinement
Les souris ont une période d’habituation aux expérimentateurs qui vont suivre le protocole. Les souris seront élevées et hébergées par groupes, avec un milieu enrichi pour améliorer leur bien-être (maison en carton, coton). Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux (pesées, suivi de la croissance tumorale etc.) plusieurs fois par semaine permettra la recherche de tout signe de souffrance. Des points limites adaptés sont mis en place au-delà desquels, si aucun moyen de correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort. L’implantation intra-crânienne, les injections et le suivi de croissance tumorale sont réalisés par du personnel qualifié afin de réduire au maximum le temps de manipulation et le stress des animaux avec au besoin anesthésie et anti- douleurs adaptés. Après traitement par radiothérapie les souris auront de la nourriture gélifiée dans leur cage.
Choix des espèces
La souris sera le modèle dans ce protocole, nous utiliserons des femelles à 8 semaines pour induire la formation de tumeurs d’une manière proche à ce type de tumeurs chez l’Homme, puis nous suivrons cet avancement chez les mêmes individus. La souris est utilisée car elle permet de maintenir la diversité cellulaire dans les tumeurs qui est nécessaire à l’étude de notre protéine d’intérêt. De plus cette protéine n'est pas exprimée dans toutes les espèces mais on retrouve une forte ressemblance entre la forme humaine et murine, justifiant encore l'usage des souris. En dernier lieu, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils destinés à l'analyse des tumeurs qui n'existent pas tous pour d'autres espèces que l'homme et la souris.
Effet de l’apprentissage et le phénotype dit-dépressif sur le connectome neuronal du système olfactif
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Privées d'eau en dehors de deux heures par jour pendant un mois, des souris enchaînent des sessions d'apprentissage olfactif de trente à quarante-cinq minutes, six jours sur sept. Elles sont 560 au total, dont 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées pour l'analyse histologique de leur cerveau. Une partie reçoit de la corticostérone dans l'eau de boisson pendant un mois pour induire ce que le porteur nomme un phénotype dit-dépressif, avant cinq jours de tests comportementaux. Chaque souris peut subir jusqu'à deux chirurgies stéréotaxiques d'une heure, et des souriceaux de six jours sont également utilisés. Les retombées annoncées, de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la dépression et les troubles bipolaires, sont renvoyées au futur.
Objectifs
Les troubles de l’humeur, parmi lesquels la dépression et les troubles bipolaires, sont des maladies psychiatriques hétérogènes affectant environ 15 % et 2 % de la population mondiale, respectivement. Malgré le grave problème de santé publique que représentent ces troubles (l’OMS prédit qu’ils deviendront la cause majeure de morbidité à travers le monde à l’horizon 2030), les traitements existants ont une efficacité limitée et 60-70 % des patients sont partiellement ou non-répondeurs. Il est nécessaire de mieux comprendre la physiopathologie pour proposer de nouveaux outils diagnostiques et pouvoir développer des thérapeutiques plus spécifiques. Outre la modification de l’humeur, des études cliniques ont également montré l’existence d’altérations sensorielles. Chez l'homme, les troubles olfactifs qu'accompagnent les symptômes dépressifs sont cependant peu considérés dans les critères diagnostiques. Chez l'animal, l'ablation du bulbe olfactif, qui constitue un premier relai dans le cerveau pour le traitement des odeurs, induit un phénotype dit-dépressif et un modèle murin de dépression a révélé une déficience olfactive. De manière intéressante, ce déficit olfactif a été associé à un déficit dans a production des nouveaux neurones dans le cerveau mature, processus nommé neurogenèse adulte. En parallèle, des travaux récents ont démontré que les nouveaux neurones pourraient jouer un rôle dans l’attribution de la valeur hédonique des odeurs après un apprentissage olfactif.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont d’approfondir nos connaissances sur le phénomène d’intégration des nouveaux neurones dans un cerveau adulte ainsi une meilleure compréhension de la physiopathologie des troubles de l’humeur. Une meilleure connaissance des liens entre neurogenèse, la fonction du système olfactif et troubles psychiatriques pourrait aider à déchiffrer la physiopathologie de maladies comme la dépression majeur or les troubles bipolaires. Ainsi, la connaissance des mécanismes de neurogenèse adulte pourrait alors permettre dans le futur la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contrôler cette production neuronale, dans le but de restaurer les fonctions cérébrales de patients atteints de maladies neurodégénératives ou psychiatriques.
Procédures
Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales (injections stéréotaxiques). Ces interventions ne durent pas plus d’une heure et chaque animal sera soumis au maximum à deux interventions séparées au minimum par 90 jours. Ils seront également soumis à des tâches d’apprentissage olfactif de type associatif avec renforcement positif pour évaluer les effets de l’apprentissage sur la connectivité du système olfactif. Au cours de cette tâche, les animaux sont progressivement soumis à un contrôle hydrique. Les animaux auront accès à l'eau une fois dans la journée pendant et immédiatement après la tache de comportement (durée totale d’accès à l’eau = 2hs). Ce type d’apprentissage a une durée maximale de 1 mois, avec une session de 30 à 45 minutes par jour, chaque jour (6 jours sur 7). Pour l’induction du phénotype dit-dépressif les souris seront administrées avec de la corticostérone dans l’eau de boisson pendant un mois. Ensuite, des tests comportementaux seront réalisés pendant 5 jours. Chaque test aura une durée maximale de 10 min et on réalisera au maximum 2 tests par jour.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés aux procédures : stress induit et attendu pour les modèles de dépression Le contrôle hydrique peut aussi engendrer du stress aux animaux. Douleur, inconfort modérée de courte durée liés à la chirurgie De plus, les chirurgies pourraient générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort. Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car il est nécessaire de réaliser des études histologiques sur les tissus à l’issue de chaque procédure.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative aux techniques in vivo pour étudier la réorganisation des connections à la suite d’un apprentissage olfactif ou de l’apparition phénotype dit-dépressif. Toutefois, notre stratégie expérimentale est conçue de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en évitant au maximum tout stress et inconfort de l’animal.
Réduction
L’étude statistique impose des cohortes comprenant un nombre suffisant d’animaux afin d’avoir une évaluation pertinente de l’effet des différentes conditions expérimentales sur le comportement. Le nombre de souris minimum par groupe a été calculé pour pouvoir utiliser des tests paramétriques, plus puissants que les tests non paramétriques grâce à des expériences similaires déjà réalisées dans notre laboratoire. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes. De plus, l’analyse des connexions par la technique d’imagerie volumétrique sur du tissu cérébral rendu transparent à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière, nous permettra d’obtenir un maximum d’information pour chaque échantillon, de réduire la variabilité des donnés et ainsi de réduire le nombre d’animaux pour l’évaluation statistique de l’effet des différentes manipulations.
Raffinement
Tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse de l’animal. Pour cela, des points limites précoces et spécifiques seront bien définis. Des interventions adaptées seront mises en oeuvre en focntion des signes cliniques présentés par les animaux. De plus, la durée d’acclimatation à l’animalerie sera d’une semaine minimum. Durant la chirurgie, des anesthésiques et antalgiques seront utilisés, ainsi que des antalgiques de nouveau en post-chirurgie. Tout ceci est indispensable pour le bien-être de l’animal ainsi que pour la validité des résultats des tests comportementaux.
Choix des espèces
On étudie les modifications des connexions neuronales du système olfactif des souris car ce système est impliqué dans une modalité sensorielle très importante chez les rongeurs : l’olfaction. En conséquence, l’utilisation de cette espèce nous permettra d’obtenir des résultats éthologiquement satisfaisants. De plus, les stimuli olfactifs au cours de l’apprentissage olfactif peuvent participer à l’enrichissement de l’environnement des animaux et donc favoriser leur bien-être durant le temps de ces expériences. Notre objet d’étude étant les cellules produites par la neurogenèse chez l’adulte, on utilise dans ces expériences des jeunes souris adultes (8 semaines). Cependant, il faudra comparer l’impact de l’apprentissage et le phénotype dit-dépressif sur les cellules produites dans le cerveau post-natal (neurogenèse post-natale). Pour ce faire, des souriceaux de 6 jours seront utilisés.
formation des expérimentateurs aux gestes techniques chez le rongeur (rat, souris, cobaye, gerbille, hamster) et chez le lapin
- Formation professionnelle
Rats : 1500
Cochons d'Inde : 300
Hamsters dorés : 50
Gerbilles de Mongolie : 50
Lapins : 100
Issus d'autres études quand c'est possible, 3 500 rongeurs et lapins vont être utilisés pour entraîner des expérimentateurs aux gestes techniques : 1 500 souris, 1 500 rats, 300 cobayes, 100 lapins, 50 hamsters dorés et 50 gerbilles. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 360 individus seront réutilisés dans un autre projet et les autres seront tués, notamment lorsque le volume prélevé ne permet pas leur survie. Ils subissent des administrations par six voies différentes, dont l'intrathécale, jusqu'à trois prélèvements sanguins par semaine dans la limite de 7,5 % du volume sanguin total, une pose de cathéter de quarante-cinq minutes et une ponction de liquide céphalorachidien. Le porteur indique que certains gestes s'apprennent sur peaux et animaux artificiels, mais que l'évaluation des critères de réussite "impose que l'animal soit vivant".
Objectifs
Le but du projet est de permettre à une personne en formation (zootechnicien, technicien de laboratoire, directeur d’étude) de se former à la réalisation de gestes techniques. Ce projet résume un certain nombre de gestes techniques que doivent acquérir les expérimentateurs pour pouvoir réaliser des expériences sur l'animal de laboratoire. Il s'inscrit dans le cadre de l'acquisition de la compétence des expérimentateurs (arrêté du 1er février 2013, Bonnes pratiques de laboratoire, AAALAC).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la maitrise de gestes techniques. La formation initiale des personnes doit être complétée par une formation spécifique en fonction des études qu'elles seront amenées à faire pour maitriser les gestes en toute sécurité.
Procédures
Dans ce projet, les animaux vigiles seront administrés par différentes voies (orale, sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse et intrathécale) avec -2 min par administration. Des administrations sur l'animal transitoirement anesthésié pourront également être faites : intradermique, oro-pharyngée, intraveineuse et intratrachéale - environ 5 minutes par administration. Des prélèvements de sang seront réalisés sur l’animal vigile (2 minutes par prélèvement) ou sur l'animal anesthésié (environ 5 minutes par prélèvement). Ces prélèvements seront en général de 0.05 à 2 mL, avec un maximum de 3 prélèvements par semaine et dans la limite de 7.5% du volume sanguin total en adaptant la période de récupération. Une implantation de cathéter pourra être faite sur l'animal anesthésié environ 45 minutes de chirurgie 1 seule fois. Un prélèvement de liquide céphalo-rachidien (1 seul prélèvement) sera réalisé sur animal anesthésié avec un volume maximal de 0,1 ml prélevé
Impact sur les animaux
Les gestes techniques enseignés ne doivent pas affecter la bonne santé / l'état général des animaux utilisés. En fonction du geste et de ses conséquences sur l’animal, un échange se fera avec les responsables du Bien-Etre Animal pour adapter les outils d'observation des animaux en cas de réalisation imparfaite du geste concerné et d'impact négatif sur l'animal. Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie, administrer le produit et pour les prélèvements peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Les chirurgies peuvent induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Les animaux de ce projet pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille lors des administrations intramusculaire, sous-cutanée, intrapéritonéale, intradermique, intraveineuse ou intrathécale ou une contrainte légère liée à l'administration per os lors de l'administration du produit ainsi qu'une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins.
Devenir
euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal ou réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.
Remplacement
Avant tout début de formation, la formation débute par une partie théorique avec une personne expérimentée et certains gestes pourront être réalisés sans animaux grâce notamment à des méthodes alternatives (peaux artificielles, animaux artificiels). Les gestes à acquérir, par du personnel déjà formé aux techniques de base de l'expérimentation animale, imposent que l’animal soit vivant pour évaluer les critères de réussite.
Réduction
Dans la mesure du possible, les animaux seront issus d'études et seront utilisés, après avis du vétérinaire, pour plusieurs gestes techniques de ce projet. Une supervision étroite garantira une utilisation des animaux en minimisant le risque d'erreur.
Raffinement
Les procédures seront réalisées par du personnel compétent déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire, mais devant acquérir une expertise supplémentaire. Ce personnel de formation sera sous la supervision d'une personne experte. Le raffinement sera obtenu par • La mise au point de procédures rigoureuses, • Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques et des points limites, •Des protocoles d'anesthésie et d'analgésie adaptés et maîtrisés, un suivi de l'état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés pour permettre une bonne récupération, • La mise en groupe des animaux, • La mise en place de jouets dans les cages. • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire.
Choix des espèces
Les espèces (rongeurs et lapin) qui seront utilisées dans ce projet correspondent aux espèces cibles autorisées pour l’établissement utilisateur, que les personnes en formation auront à manipuler au cours des expérimentations. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
modulation de l’activité des canaux HCN et douleur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Section des nerfs tibial et péronéal, injection d'un produit pro-inflammatoire dans une articulation de la patte arrière, injections d'un anticancéreux deux fois par semaine pendant trois semaines : les douleurs chroniques sont ici provoquées délibérément. 1 568 souris vont être utilisées, toutes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent jusqu'à trois prélèvements sanguins au sinus rétro-orbitaire par animal, et une surveillance hebdomadaire de l'automutilation de la patte opérée, traitée le cas échéant à l'argile verte. Le porteur range la contention, le gavage, l'isolement et les injections parmi les gestes provoquant "une douleur légère", et réserve la douleur sévère aux "modèles et tests de douleur" eux-mêmes.
Objectifs
Les antalgiques sont peu efficaces et entrainent des effets indésirables qui limitent leur utilisation répétée chez les patients douloureux chroniques. Une nouvelle stratégie, basée sur la modulation de la fonction de certains canaux ioniques, pourrait conduire au développement d’un traitement antalgique efficace et bien toléré. La preuve de concept de l’efficacité de cette stratégie a été validée au laboratoire. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’effet antalgique de ces molécules dans différents modèles de douleur chronique chez l’animal. De plus, ces canaux ioniques étant également impliqués dans certains effets indésirables des opioïdes, nous évaluerons la capacité de ces molécules à limiter les effets secondaires des opioïdes en les administrant conjointement avec des opioïdes.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet fera progresser les connaissances sur la physiopathologie de la douleur, en particulier l’implication des canaux ioniques et le rôle de leur protéine partenaire. A moyen terme, ce projet inclut l’exploration du potentiel antalgique, seul ou conjointement avec des opioïdes, de molécules innovantes dans différents modèles de douleur qui à plus long terme pourraient être évaluées chez les patients douloureux.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront subir les gestes et contraintes suivants (tous les gestes seront réalisés par des personnels formés) : - contentions et injections pouvant induire un stress, éventuellement douleur légère; - prélèvements sanguins au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie dans le respect des volumes recommandés (jusqu'à trois prélèvements par animal, espacés d'une semaine au minimum). Une procédue chirurgicale (section des nerfs tibial et péronéal, réalisée sous anesthésie (durée de l’intervention 10-15 minutes maximm) sera réalisée chez certains animaux. Une induction d’une inflammation articulaire par injection d'un produit pro-inflammatoire sera réalisée dans l'articulation d'une patte arrière chez certains animaux. L'injection d'un anticancéreux sera réalisé 2 fois par semaine pendant 3 semaines pour induire une douleur chez certains animaux.
Impact sur les animaux
Les gestes et contraintes nécessaires à la réalisation de ce projet peuvent occasionner chez les animaux du stress et une douleur légère (contention, gavage, isolement, injections) voire une douleur sévère (modèles et tests de douleur).
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Les animaux utilisés dans les procédures 1 à 3 seront mis à mort puis leurs tissus d'intérêt (ganglions rachidien dorsaux, moelle épinière et éventuellement cerveau) prélevés pour des analyses biochimiques, immunohistologiques ou de biologie moléculaire. Les animaux utilisés dans la procédure 4 seront mis à mort. Il n'est pas prévu d'analyses biochimique ou de biologie moléculaire sur leur tissus.
Remplacement
Ce projet concerne l’étude de l’implication de canaux ioniques dans la physiopathologie et la pharmacologie de la douleur chronique. Il n’existe aucune méthode alternative permettant d’intégrer ces différents niveaux de complexité
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué en fonction de la littérature et de l’expertise du laboratoire sur les modèles proposés de sorte à favoriser des résultats fiables et statistiquement significatifs. Lorsque nécessaire, un maximum de prélèvements seront réalisés sur chaque animal après la mise à mort. L’analyse statistique des résultats sera réalisée par des tests de comparaison de médianes paramétriques ou non paramétriques selon la distribution des données.
Raffinement
L’entretien des lignées ayant un gène non fonctionnel sera réalisé en animalerie dans les conditions standard d’hébergement. Un enrichissement est apporté dans les cages : dômes en carton, et galets de lanières de papier compactées et des bûchettes de bois. Le bien-être des animaux sera régulièrement évalué par du personnel formé. Les animaux ayant fait l’objet d’une chirurgie font l’objet d’un suivi spécifique et de soins post opératoires. Les animaux encore anesthésiés sont dans une cage remplie de litière propre et située sur un tapis chauffant permettant de chauffer uniformément la cage et de réduire l'hypothermie. Les aliments sont placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir. Une solution glucosée en post chirurgie ou en cas de déshydratation pourra être administrée. Une solution hydratante est déposée sur chaque œil de l’animal afin d’éviter une sècheresse oculaire durant la chirurgie. Le lendemain de la chirurgie, un antiseptique local est appliqué sur la cicatrice. Outre la surveiillance quotidienne, la première semaine après chirurgie et une fois par semaine ensuite, une surveillance accrue des animaux et un suivi pondéral est réalisé afin de vérifier la présence ou non d’automutilation au niveau de la patte opérée. Si besoin, de l'argile verte est déposée sur les plaies.
Choix des espèces
Le choix du modèle souris est motivé par la disponibilité des outils moléculaires pour cette espèce, l’importance des données bibliographiques et des données déjà acquises par notre laboratoire sur le projet initié il y a une dizaine d’années. Les animaux seront utilisés à l'âge jeune adulte (8 à 12 semaines) en cohérence avec les données déjà obtenues chez les modèles de douleur utilisés au laboratoire.