Souris

Isolées en cage individuelle pendant sept semaines avec un accès intermittent à un biberon d'alcool, 200 souris subissent ensuite deux prélèvements sanguins sous anesthésie et un examen IRM de deux heures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Le projet cherche à cartographier les modifications de connectivité cérébrale associées à la consommation massive et rapide d'alcool. Le porteur qualifie cette consommation de "volontaire et non forcée", tout en décrivant un isolement de sept semaines imposé par le protocole, une déshydratation possible et un état d'anxiété ou de dépression à l'arrêt de l'alcool.

Objectifs

Selon les estimations de l’OMS, la consommation excessive d’alcool entraîne environ 3 millions de morts par an (5% de la mortalité dans le monde). D’après le manuel de diagnostic et de statistique des troubles mentaux, le trouble d’usage de l’alcool est défini comme un « schéma problématique de consommation d’alcool entraînant une détresse importante au point de vu clinique ». Il a été montré que les troubles liés à la consommation excessive d’alcool sont de nature hétérogène. De plus, il existe différents types de troubles d’usage de l’alcool avec des bases neurobiologiques spécifiques. Parmi les différents types de troubles de l’usage de l’alcool, nous nous intéresserons à la consommation massive et rapide d’alcool, encore appelée binge drinking. Le binge drinking est défini comme un mode de consommation d’alcool suffisant pour générer une quantité d’alcool dans le sang de plus de 80 mg en une période de temps de 2 heures. Ce type de consommation d’alcool est particulièrement répandu chez les adolescents, et sa prévalence augmente chez les femmes. De plus, il est clairement démontré que l’alcoolisme sévère touche différemment les femmes et les hommes. De ce fait, il est important de caractériser la connectivité et l’impact neurobiologique de ce type de consommation d’alcool (binge drinking) pour comprendre les conséquences de ce mode de consommation d’alcool au niveau cérébral. Ce projet a pour objectif d’identifier les altérations de la connectivité cérébrale liées au trouble de l’usage de l’alcool, dans le cas d’une consommation de type binge drinking. L’identification des changements de connectivité cérébrale et la mise en évidence de l’implication de zones spécifiques au niveau du cerveau pourraient aider la recherche préclinique et clinique, et accélérer les stratégies thérapeutiques et de prévention.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude devraient aider à mieux comprendre les altérations de la connectivité cérébrale qui tendent le développement d’un profil de consommation excessif et rapide d’alcool. L’identification des changements de connectivité cérébrale et la mise en évidence de l’implication de zones spécifiques au niveau du cerveau pourraient aider la recherche préclinique et clinique, et accélérer les stratégies thérapeutiques et de prévention.

Procédures

Les animaux seront soumis à: 1) un protocole d'accès volontaire et intermittant à un biberon d'alcool pendant 7 semaines 2) deux prélèvements sanguins séparés de plusieurs semaines et réalisés sous anesthésie 3) un examen IRM sous anesthésie incluant: une séquence d'IRM fonctionnelle de 16 min, une séquence d'IRM anatomique de 10 min, et une séquence d'IRM de diffusion de 60 min (TOTAL=2 heures) 4) un test comportemental pendant 5 min. Les souris seront également hébergées individuellement durant toute la durée du protocole, soit 7 semaines.

Impact sur les animaux

La procédure expérimentale est basée sur une consommation volontaire et non forcée de l’alcool sur une courte période. Les souris peuvent cependant présenter un état de déshydratation suite à la consommation excessive d’alcool. Ce protocole exige par ailleurs que les souris soient isolées ce qui peut induire un stress chez les animaux, les souris peuvent également être dans un état d’anxiété et/ou de dépression dû à l’arrêt de consommation d’alcool. Le prélèvement sanguin peut entraîner : une perte de poids corporel, des hémorragies sous-cutanées et un œdème. Le test comportemental peut générer du stress en raison de l'isolement des souris pour la réalisation du test.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin d'effectuer des prélèvements d'organes d'intérêt.

Remplacement

Le modèle animal est pour le moment le seul modèle qui permet d’étudier dans son ensemble les phénomènes complexes mis en œuvre dans l'addiction à l'alcool au niveau cérébral à l'échelle du connectome. En effet ces atteintes sont multifactorielles, nécessitant un grand nombre d’acteurs, et toutes les conditions ne sont pas reproductibles fidèlement dans un modèle de culture cellulaire. L'alcoolisme est une pathologie hétérogène qui implique une grande variabilité des profils symptomatiques. L'étude chez l'animal permet un suivi au cours du temps et un contrôle de l'historique de consommation incluant différents paramètres. Il n'est pas non plus possible de réaliser des prélèvements tissulaires chez l'humain.

Réduction

Le nombre de souris est réduit au minimum d’animaux nécessaire afin d'assurer l'efficacité des tests statistiques et donner des résultats statistiquement fiables en fonction des expériences réalisées. Ainsi, le nombre d'animaux a été déterminé par une analyse de puissance statistique et sur la base de nos études antérieures sur l'addiction à l'alcool. En raison de la forte variabilité des phénotypes de consommation d’alcool, 50 souris seront nécessaires par groupe pour effectuer nos analyses conduisant à un total de 200 animaux.

Raffinement

Le stress potentiellement engendré par la pratique expérimentale sera limité au maximum. A leur arrivée à l’animalerie, les souris bénéficieront d’une phase d’acclimatation à leur nouvel environnement de 2 semaines. Dans chaque cage d'hébergement, l'environnement sera enrichi par : 1- des lanières de papier permettant l’édification du nid afin de stimuler l’activité naturelle et diminuer le stress. 2- deux cylindres de coton pour l’édification du nid. 3- un morceau de bois pour que les souris usent leurs dents. 4- un tube pour fournir un abri. Durant l'examen IRM, le raffinement sera respecté par l'usage d’une anesthésie afin de réduire au maximum le stress de l'animal. Les yeux des animaux seront protégés du dessèchement grâce à l’application d’un gel de protection. Un tapis chauffant permettra le maintient des animaux à une température physiologique. La température et la respiration seront en permanence surveillées par un système de monitorage. En cas de chute de la température et/ou d’une respiration altérée, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM et pris en charge. Il sera alors placé dans une cage mis sous une lumière chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Les animaux seront habitués aux procédures comportementales préalablement à la réalisation des expériences. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris de fond génétique C57BL/6. Cette souche est la plus utilisée dans l'étude du comportement lié à l'alcool et c'est également celle que nous avons utilisée dans nos études précédentes. Des informations standardisées sur sa génétique et son comportement sont connues. Des modèles de souris génétiquement modifiées présentant une sensibilité accrue à l’alcool que nous pourrions utiliser à l’avenir sont également disponibles, qui n'existent pas chez d'autres espèces. Nous utiliserons des animaux agés de 8 semaines. Le binge drinking chez les adultes entraine des effets chroniques, des coûts pour la santé et la société. Il s'agit ici d'étudier des effets de la consommation excessive sur un cerveau pleinement développé.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation qui provoque l'agrégation de la protéine tau et un déclin cognitif dès cinq mois, et reçoivent une injection intrapéritonéale par jour pendant 28 jours, en alternant les flancs pour limiter l'inflammation aux points de piqûre. S'y ajoutent un passage de dix minutes dans un labyrinthe en croix et jusqu'à trois passages quotidiens de dix minutes en champ ouvert pendant cinq jours consécutifs, avant le prélèvement des cerveaux. Le porteur rappelle que la plupart des composés testés jusqu'ici ont échoué en essai clinique faute d'effet sur le déclin cognitif des patients, et qualifie néanmoins sa molécule de "très prometteuse" si l'effet se confirmait chez la souris.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est la première cause mondiale de démence et est un problème de santé publique majeur. En 2019, 30 millions de personnes étaient atteinte de cette pathologie dans le monde. Elle se caractérise par un déclin cognitif progressif se traduisant par des pertes de mémoire et finalement l’installation d’une démence après plusieurs années. Au niveau cellulaire, l’un des marqueurs principaux de la maladie est l’agrégation anormale d'une protéine (la protéine tau) sur laquelle nous nous focalisons dans le cadre de ce projet. Cette agrégation, autrement appelée tauopathie se solde par la mort des neurones, cause du déclin cognitif chez les patients. Des résultats préliminaires obtenus au laboratoire chez la souris adulte montrent que la molécule 1) est distribuée au sein du cerveau, 2) restaure les troubles cognitifs associés au vieillissement, 3) prévient les troubles de la formation de nouveaux neurones, 4) améliore la connectivité entre les neurones. Nous avons montré que cette molécule a également un effet bénéfique au niveau de la vascularisation cérébrale. L’ensemble de ces résultats prometteurs nous a conduits à émettre l’hypothèse que cette molécule pourrait atténuer la tauopathie dans un contexte de maladie d’Alzheimer. Ce projet a pour but d’évaluer l’efficacité d'un composés dans un modèle de souris transgénique par l’étude de ces propriétés sur la tauopathie et de son effet pro-cognitif. Si nous établissions la preuve de son efficacité, cette molécule pourrait devenir un potentiel médicament dans le contexte de la maladie d’Alzheimer pour laquelle aucun traitement n’existe jusqu’alors.

Bénéfices attendus

Ce projet, qui a pour objectif d’évaluer un candidat médicament, pourrait apporter de nouvelles perspectives thérapeutiques si l’effet de la molécule testée était confirmé sur la tauopathie et se traduisait par une amélioration cognitive chez les souris transgéniques. Si la molécule testée permettait d’envisager un arrêt de l’évolution ou une amélioration du déclin cognitif, cette molécule serait très prometteuse car bon nombre de composés testés jusqu’alors ont échoués en essai clinique ces dernières années par manque d’effet significatif sur le déclin cognitif chez les patients.

Procédures

Les animaux seront injectés quotidiennement avec la molécule développée, en intra-péritonéal. Pour limiter l'apparition d'une inflammation au point d’injection, les injections se feront alternativement dans le flanc droit et dans le flanc gauche de l’animal. Enfin, les animaux participeront à des tests cognitifs pour lesquels ils seront préparés par une acclimatation préalable afin de réduire leur stress potentiel. Pour les tests comportementaux, les souris seront placées 1 fois dans un labyrinthe en forme de croix pendant 10 minutes. Pour d’autres tests comportementaux, les souris seront placées, individuellement dans une boite (openfield) pendant 10 minutes, 1 à 3 fois par jour pendant 5 jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les souris seront injectées quotidiennement avec la molécule pendant 28 jours. Ces injections qui nécessitent de manipuler l'animal ce qui peut induire un stress ponctuel de quelques minutes et une douleur légère au point d'injection. Enfin, une perte de poids pourrait être associée au traitement. La répétition des injections quotidiennes pendant 28 jours pourrait également conduire à des nuisances additionnelles pour les souris (perte de poids / répétition d'un stress potentiel). C'est pourquoi le dégré de gravité de cette procédure est modérée. A l'âge de 5 mois, les signes cognitifs observés n'altèrent pas gravement l'état général des animaux.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort car les cerveaux des animaux seront prélevés pour valider l’action de la molécule. Ainsi, à la fin de l’étude, l’effet pro-cognitif de la molécule pourra être déterminé dans le cadre de tauopathies.

Remplacement

L’étude de l’effet de la molécule sur la tauopathie pourrait être menée sur des cellules en culture mais cette alternative ne permettrait pas de mettre en evidence l’effet pro-cognitif du composé qui représente un aspect fondamental de cette étude.

Réduction

Pour ce projet, des animaux transgéniques et des animaux controles seront testés à l'aide de tests comportementaux. Pour ce type d'expérimentation, les effectifs nécessaires pour obtenir des statistiques robustes ont été déterminés par un test statistique via un logiciel spécialisé. Ainsi, grâce a ce logiciel, nous nous sommes assurés de pouvoir obtenir des résultats statistiques exploitables en employant un nombre d'animaux minimal. Au cours du projet, des analyses statistiques intermédiaires seront réalisées et si les résultats des expériences sont déjà robustes, cela nous permettrait de réduire encore le nombre de souris déterminé au départ.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être animal, les souris seront manipulées quotidiennement 2 à 3 minutes par les mêmes expérimentateurs pendant 7 jours avant le début des expérimentations. Ces mêmes expérimentateurs feront les injections et les tests comportementaux tout au long du projet. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettront de garantir leur bien-être. Une grille d'évaluation permettra de suivre l'état général des animaux. En cas de dégradation de cet état général, les animaux seront euthanasiés afin d'éviter de prolonger une éventuelle souffrance.

Choix des espèces

Le modèle de souris transgéniques a été choisi pour ce projet du fait de sa pertinence scientifique pour l’étude de notre molécule et de l’expertise du laboratoire partenaire sur ce modèle. En effet, depuis plusieurs années, le modèle est implanté dans ce laboratoire et fait l’objet de nombreuses caractérisations de la tauopathie. Le laboratoire dispose d’une banque de réactifs qui permettent de caractériser très précisément l’évolution de la pathologie dans ce modèle. Ainsi, les partenaires sont capables grâce à leurs outils d’évaluer au mieux les effets de la molécule testée. De plus, ce modèle de souris transgéniques fait l’objet de nombreuses publications scientifiques montrant un déclin cognitif dès 5 mois chez les animaux transgéniques ce qui valide le recours à ce modèle pour étudier l’effet pro-cognitif de notre composé.

Une hypothermie maintenue trois à cinq heures pour 84 souris, une chirurgie d'injection directe dans le cerveau pour 360 autres, des injections intraveineuses répétées pour 876 : 1 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort quatorze ou soixante jours après le traitement. Une partie porte des mutations modèles de la maladie d'Alzheimer, avec déficit moteur, perte de mémoire spatiale, anxiété, anomalies de posture et difficultés à s'alimenter. Le projet teste des fragments d'anticorps censés faire passer des oligonucléotides à travers la barrière qui protège le cerveau. Le porteur annonce des tests comportementaux sans dire lesquels, et se réserve "le droit de ne pas divulguer le nom des gènes ciblés".

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA) reste la cause la plus fréquente de démence. La thérapie génique basée sur les oligonucléotides a montré un grand potentiel thérapeutique car elle peut réguler potentiellement n'importe quel gène spécifiquement ciblé. Cependant, plus de 98% des médicaments développés pour des applications cérébrales ne parviennent pas à traverser la barrière hématoencéphalique (la barrière qui protège le cerveau des agents toxiques véhiculés par le sang), ce qui entrave leur application en clinique. Notre équipe et son partenaire biotechnologique ont développé des "vecteurs", basés sur des fragments d’anticorps, qui facilitent le transport de produits biologiques à travers la barrière hématoencéphalique. Nous faisons l’hypothèse que notre construction fragment d'anticorps pourrait être utilisée pour transporter efficacement des oligonucléotides dans le tissus cérébral et réguler des facteurs de risque pertinents de la MA. Pour évaluer cette hypothèse, nous avons conçu et testé in vitro plusieurs oligonucléotides ciblant des facteurs de risque génétiques connus, associés à la physiopathologie de la MA. Le premier objectif de notre projet est de tester l'efficacité des oligonucléotides chez la souris de type sauvage après injection directe dans le cerveau. Le second objectif du projet est de sélectionner de nouvelles constructions de fragments d'anticorps, conçues pour améliorer les caractéristiques de franchissement de la barrière hématoencéphalique des fragments d’anticorps. Ces deux premiers objectifs nous aideront à sélectionner les oligonucléotides les plus actifs en termes de régulation génique et le fragment le plus efficace en termes de franchissement de la barrière hématoencéphalique in vivo. Le conjugué fragment d’anticorps - oligonucléotide représentera notre médicament final. Par conséquent, le troisième objectif du projet sera de tester l'efficacité de nos nanomédicaments à réguler efficacement l’expression des gènes cibles, d’abord chez les souris sauvages après administration systémique (injection intraveineuse, IV). Enfin, notre quatrième objectif sera de tester nos nanomédicaments sur des souris modèle de la MA afin de vérifier i) leur efficacité dans la réduction des lésions neurodégénératives et ii) dans l'amélioration des fonctions cognitives, en comparaison avec nos placebo.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mettre au point une nouvelle famille de médicaments à base d'oligonucléotides présentant des caractéristiques de distribution efficaces dans le cerveau et destinés à la régulation de facteurs de risque génétiques impliqués dans la physiopathologie de la MA. Plus précisément, ce projet validera in vivo nos nanomédicaments dont l'efficacité et l'innocuité ont déjà été testées in vitro. Nous répondrons à trois questions scientifiques principales : 1) nos nouvelles constructions fragment d'anticorps 2.0 peuvent-elles délivrer encore plus efficacement des oligonucléotides dans le cerveau que le fragment 1.0 déjà disponible; 2) nos oligonucléotides peuvent-ils réguler l'expression des facteurs de risque génétiques liés à la MA ; 3) l'inhibition des gènes ciblés améliorera-t-elle les fonctions cognitives dans les modèles de la MA. À ce jour, il n'existe aucune alternative in vitro capable de reproduire la complexité d'un système vivant, c'est pourquoi les études sur des modèles de souris restent une étape cruciale et inévitable dans le développement de thérapies dédiées au cerveau. En outre, les études précliniques sur des modèles murins de la MA restent le principal moyen prédictif pour étudier l'efficacité d'un nouveau médicament contre la MA, avant de passer aux phases cliniques. Par conséquent, les animaux restent les seuls modèles permettant d’évaluer nos hypothèses, de réaliser nos objectifs, de répondre à nos questions et de développer de nouvelles thérapies pour la MA. Dans le cadre de ce projet, nous sélectionnerons les nanomédicaments à base d'oligonucléotides qui ont un effet thérapeutique intéressant. A plus long terme, ces nanomédicaments seront produits à plus grande échelle pour validation dans des études cliniques. Par conséquent, notre projet devrait accélérer le développement de thérapies innovantes pour la MA, sachant qu’il n’existe à ce jour aucun médicament efficace contre la MA. En outre, grâce à la modularité de notre technologie, nos études ouvriront la voie à la recherche d'un plus grand nombre de facteurs génétiques impliqués dans d'autres troubles neurologiques (par exemple, la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques, les encéphalopathies, etc), élargissant ainsi encore l'impact scientifique de ce projet.

Procédures

Tous les animaux ayant reçu une injection dans le cerveau, soit 360 souris vont subir : - une chirurgie en vue d'injection des oligonucléotides directement dans le cerveau d'une durée de 30 minutes- des prélèvements de sang intermédiaires répartis sur la durée totale de la cinétique (maximum x3, séparés de 24h à 72h) qui seront réalisés sur animaux vigiles en contention à partir de l'extrémité de la queue, la durée d'un prélèvement n'excédera pas 5 minutes. Tous les animaux seront mis à mort 14 jours après injection dans le cerveau. Lors de l'induction de l'hypothermie, tous les animaux soit 84 souris vont subir une contention dans un dispositif dédié, des injections intraveineuses et l'induction d'une hypothermie. L'état d'hypothermie peut durer de 3 à 5 heures. Tous les animaux seront perfusés et mis à mort 14 jours après injection intraveineuse. Les animaux ayant reçu une injection intraveineuse, soit 876 souris, vont subir une contention dans un dispositif dédié, des injection intraveineuses, des prélèvements de sang intermédiaires répartis sur la durée totale de la cinétique (maximum x3, séparés de 24h à 72h) qui seront réalisés seront sur animaux vigiles en contention à partir de l'extrémité caudale et des tests comportementaux, ces manipulations peuvent durer une dizaine de minutes par animal. Tous les animaux seront perfusés et mis à mort à 60 jours après injection intraveineuse.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables susceptibles d'entraîner du stress et/ou de l'angoisse sont les suivants : la chirurgie pour l'injection ICV est susceptible d'entraîner de la douleur, la contention lors des multiples prises de température rectale (prise discontinue sur 5h maximum), des différents prélèvements de sang au niveau de la queue et lors des injections intraveineuses peut générer du stress et /ou de l'angoisse. L'induction de l'hypothermie peut provoquer inconfort jusqu’au retour à la température normale. Les anesthésies (par injection ou par inhalation) et les tests comportementaux sont susceptibles de générer du stress. Les souris modèle de la maladie d’Alzheimer sont censés présenter une perte neuronale et une perte des fonctions cognitives et motrices avec l’âge. Pour tous les modèles les phénotypes typiques sont un déficit moteur, un déficit de la mémoire spatiale, de l'anxiété, des anomalies posturales, des difficultés d'alimentation, et une mauvaise reconnaissance des objets nouveaux. Tous ces phénotypes sont plus graves chez les animaux homozygotes que chez les hétérozygotes, c'est pourquoi nous n'utiliserons que des souris hétérozygotes.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort pour procéder à l’évaluation de l’efficacité de l’inhibition génique de nos médicaments, par des tests biochimiques et de biologie moléculaire.

Remplacement

Des études in vitro ont montré que nos nanomédicaments inhibent les gènes sélectionnés et sont adsorbés par les cellules neurales grâce aux fragments d’anticorps. En outre, des études de toxicité in vitro ont prouvé que les médicaments testés sont sûrs et n'induisent pas de réactions indésirables dans les cellules. Ces études in vitro nous ont permis de réduire le nombre de médicaments sélectionnés et d’identifier les meilleurs candidats pour chaque gène ciblé, avec un potentiel d'application clinique. Cependant, les études in vitro ne prennent pas en compte les paramètres physiologiques complexes. Pour faire face à cette limite des études in vitro, nous prévoyons de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, en l'occurrence la souris, qui est le premier modèle animal disponible relativement proche de l'homme et largement utilisé pour l'étude in vivo des mécanismes physiologiques et des nouvelles thérapies développées. À l'heure actuelle, il n'existe pas de système prédictif in vitro, de modèle à base d'organoïdes ou de modèles bioinformatiques capables de fournir toutes les réponses aux enjeux pharmacocinétiques, pharmacodynamiques, toxicité et effets secondaires. En ce qui concerne le développement de nouvelles thérapies pour la maladie d'Alzheimer, les études précliniques sur des modèles de souris transgéniques dédiés restent la principale approche prédictive pour étudier leur efficacité, avant de passer à la phase clinique. Par conséquent, à notre connaissance, les animaux sont le seul modèle qui pourrait nous permettre de tester nos médicaments.

Réduction

Notre étude sera structurée et bénéficiera d’une analyse statistique appropriée pour réduire le nombre d'animaux nécessaires. Plus précisément, la taille de l'échantillon pour chaque objectif a été calculée sur la base d'une analyse de puissance. Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=12 (6 mâles +6 femelles), à raison de maximum 15 groupes par étude. Nos données préliminaires ont montré une distribution homogène des oligonucléotides dans toutes les régions du cerveau lors de l’administration dans le cerveau. Par conséquent, pour réduire le nombre total d'animaux le cerveau sera divisé en deux hémisphères et chacun d'eux sera utilisé pour une évaluation différente. Par exemple, pour la localisation de l'ARN, la moitié du cerveau sera utilisé pour les approches de RNAscope (pour évaluer la distribution des ARNm cibles) et l'autre moitié pour les approches de siRNA scope (pour évaluer la distribution des siRNAs). De même, la moitié du cerveau pourra être utilisé pour la quantification de l'expression génique et l'autre moitié pour les analyses biochimiques. Cela nous permettra de réduire de moitié le nombre d’animaux.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux sont hébergés en zone d'élevage de l'animalerie entre 4 à 5 souris par cage enrichies par des dômes en carton. Les souris seront transférées dans la zone expérimentale 7 jours avant toute expérimentation. - La chirurgie se fera sous analgésie suivi d'une anesthésie. Une fois l'animal anesthésié, il est placé sur un tapis chauffant. Les yeux sont protégés par un gel protecteur oculaire. Avant incision de la peau du crâne, une infiltration d’anesthésique local est appliquée. Une analgésie post-opératoire est établie pour réduire au minimum la douleur pendant les heures et les jours qui suivent la chirurgie. Préalablement aux injections intraveineuses, les souris sont habituées au dispositif de contention et lors de l'induction de l'hypothermie, nous veillerons à ce que la température ne descende pas en deçà de 30°C. - Après chaque prélèvement sanguin, une compresse est appliquée sur le bout de la queue pour arrêter le saignement. Préalablement aux tests comportementaux, les animaux sont manipulés régulièrement pour les habituer aux environnements des différents tests et à l'expérimentateur. Tout au long des 3 procédures, les animaux sont quotidiennement surveillés et pesés 3 fois par semaine. Une grille d'évaluation est appliquée. Notre réaction dépendra du score constaté. Quant au phénotype dommageable des souris modèles de la maladie d’Alzheimer, les souris seront mises à mort dès l'apparition des signes évidents de troubles nerveux fonctionnels.

Choix des espèces

À l’heure actuelle, à défaut d’alternatives, le modèle rongeur, ici la souris, reste le modèle le plus accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de celle de l’homme. Par sa petite taille, la souris est intéressante pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques et diminution des posologies). La MA est un trouble neurologique multifactoriel qui implique différents mécanismes à l'origine de la maladie. De plus, les principaux modèles animaux expérimentaux de la MA sont des souris transgéniques. Nous nous réservons le droit de ne pas divulguer le nom des gènes ciblés. Pour les procédures sur les souris sauvages, nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes » ayant en moyenne de 7 à 12 semaines. A cet âge, on limite ainsi les variations interindividuelles qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l’expression de certaines protéines. Les procédures sur les souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer seront effectuées sur deux 2 tranches d'âge : 1) les jeunes animaux (1 à 3 mois) qui ne présentent qu'un dépôt faible/initial d'espèces toxiques Aβ et Tau (stade précoce) ; 2) les souris âgées (6 à 8 mois) qui se caractérisent par un dépôt élevé et diffus d'espèces toxiques Aβ et Tau dans toutes les régions du cerveau (stade avancé).

Pour étendre à trois autres types de dengue un candidat vaccin à ARN messager, 1 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent deux à trois injections dans la peau du dos ou dans le muscle, à trois ou quatre semaines d'intervalle, avec trois prélèvements sanguins à la lancette. Le porteur indique que les gonflements aux points d'injection peuvent provoquer une boiterie, et prévoit une alimentation gélifiée pour faciliter la mastication après chaque prise de sang. Son calcul de réduction aboutit à 20 souris traitées et 20 témoins par expérience, répétée trois fois, soit 120 animaux, un chiffre que rien dans le résumé ne relie au millier demandé.

Objectifs

Il existe deux vaccins vivants atténués contre la dengue. Dengvaxia® est recommandé pour les 9-45 ans en zones endémiques ayant déjà été infectés, mais augmente le risque de dengue sévère chez les non-infectés, rendant son usage inadapté pour les voyageurs. Qdenga®, un est recommandé dès 4 ans, indépendamment d'une exposition antérieure, sans risque accru de cas sévères. Il a été montré chez des personnes asymptomatiques ou peu symptomatiques infectées par le virus de la dengue une activation de la réponse immunitaire adaptative (lymphocytes T notamment) corrélée à des taux d’anticorps anti-dengue circulant plus faibles que chez les patients symptomatiques. Cette activation des lymphocytes T permet chez les patients asymptomatiques de combattre l’infection virale sans activation forte et incontrôlée du système immunitaire. Un vaccin à ARN messager un type de dengue a été développé. Notre projet vise à étendre cette approche aux 3 autres types, via un vaccin ARN. Les cellules musculaires produiront alors des protéines virales, déclenchant une réponse immunitaire. Ce vaccin pourrait être utilisé seul ou avec d'autres, notamment chez les non-exposés à la dengue, les enfants de moins de 9 ans, et les voyageurs. Nous voulons grâce à cette étude : 1.Identifier et caractériser les lymphocytes T des souris vaccinées et évaluer la quantité ainsi que la qualité de leurs réponses, validant ainsi l'immunogénicité (la capacité de protéger) de notre nouvelle formulation. 2.Utiliser notre formulation seule ou en association avec des vaccins préexistants et comparer les protections ainsi induites. 3.Mesurer la production éventuelle d’anticorps si activation des lymphocytes B. 4.Mesurer la protection induite par notre nouvelle formulation contre les quatre différents sérotypes.

Bénéfices attendus

Un vaccin qui induit des réponses des cellules T contre la dengue peut offrir plusieurs avantages importants : Bénéfices du projet à court terme : Améliorer la formulation actuelle de notre candidat vaccin en élargissant la protection que nous avons vu contre un type du virus de la dengue aux 3 autres types. Combiner notre approche ciblant une activation de la réponse cellulaire uniquement avec des vaccins plus classiques activant réponses anticorps et cellulaire pourrait nous permettre d’étudier finement les bénéfices et/ou les inconvénients de chacune des approches et d’améliorer nos connaissances en immunologie fondamentale. Bénéfices du projet à long terme : On estime à 390 millions le nombre d’infections par le virus de la dengue chaque année, dont 96 millions se manifestent cliniquement. La moitié de la population humaine vit dans des régions menacées par ce virus. Deux vaccins sont aujourd’hui sur le marché mais présentent encore des limitations dans leur recommandation, ce qui permet d’envisager le développement d’autres types de vaccins, notamment grâce à la technologie à ARN messagers qui a largement prouvée son innocuité et sa rapidité de déploiement dans la lutte contre la pandémie de SARS-CoV-2. Un vaccin efficace contre le virus de la dengue pourrait réduire l'incidence de la maladie et des complications qui lui sont associées. Largement utilisé dans les zones endémiques, il permettrait de diminuer la transmission du virus et de protéger non seulement les sujets vaccinés mais aussi les sujets non vaccinés. .

Procédures

Immunisation : Les animaux seront vaccinés 2 à 3 fois par voie intradermique au niveau du dos ou par voie intramusculaire à des intervalles de 3 à 4 semaines. Prélèvement des échantillons sanguines : Au jour 0 et 7 jours après chaque immunisation, des échantillons de sang sont prélevés. Au total seront 3 prélèvements de quelques secondes par prélèvements seront réalisés sur chaque animal au cours des expériences.

Impact sur les animaux

Les vaccins à ARN messager ont été soumis à des essais cliniques rigoureux, montrant un bon profil de sécurité et une efficacité élevée. En outre, les réactions indésirables graves sont extrêmement rares, et la technologie a fait ses preuves en termes de sécurité et d'efficacité dans plusieurs vaccins approuvés. Mais, comme tous les vaccins les principaux effets secondaires attendus sur les souris peuvent être des gonflements locaux aux sites d’injections qui peuvent induire une boiterie, mais ils disparaissent en général rapidement et les souris retrouvent leur mobilité. Les prélèvements sanguins de faible volume nécessitent uniquement une contention simple et une ponction à l'aide d'une lancette au niveau de la veine, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Cette procédure peut entraîner une douleur de courte durée.

Devenir

En fin d’expérience, tous les animaux immunisés et le contrôle seront mis à mort car il est nécessaire afin de récupérer des organes pour poursuivre leur étude ex vivo.

Remplacement

Pour développer ce candidat vaccin, nous avons sélectionné des séquences de peptides immunogènes en se basant sur notre expérience, sur la littérature et sur des outils informatiques. Pour explorer notre hypothèse et valider l’immunogénicité de nos constructions, nous souhaitons utiliser un modèle animal de souris car c’est le modèle de référence pour les études vaccinales précliniques. Pour se développer, la réponse immunitaire a besoin de multiples partenaires (types cellulaires différents) interagissant au sein de tissus différents (ganglions, rate, circulation sanguine), en suivant une chronologie très précise. La réponse immunitaire se mesure dans des temps relativement longs (jusqu’à deux-trois mois dans notre étude). Pour le moment aucun modèle alternatif n’arrive à reproduire la complexité du système immunitaire c’est pourquoi nous avons besoin d’utiliser des souris pour étudier notre candidat vaccin.

Réduction

Nous avons déterminé le nombre moyen d'animaux utilisés pour les essais comparatifs d'un traitement ou d'un vaccin pour ce projet en examinant la littérature et en exécutant des tests statistiques. Par conséquent, nos groupes expérimentaux seront constitués de groupes de 20 souris (5 souris par sous groupe fois 4 conditions) tests et 20 souris témoins par expérience et chaque expérience sera répétée trois fois. Ces animaux ne peuvent pas être réutilisées car nous avons besoin de leurs organes lymphoïdes pour mener des expériences ex vivo.

Raffinement

Notre expérience précèdente a montré que l’administration de différents types de vaccins d’intérêts avec anesthésie n'entraîne pas de pathologie spécifique ni n'altèrent leur état de santé. Les immunisations seront effectuées sous anesthésie. Après l'injection, les animaux seront placés dans des boîtes préchauffées pour maintenir leur température et surveillés jusqu'à leur réveil complet. Si une boiterie est observée et persiste au-delà de 24 heures, des analgésiques seront administrés. L'alimentation sera adaptée à une texture gélifiée pour faciliter la mastication et la litière sera remplacée par un matériau plus doux. Après chaque prise de sang, l'alimentation des animaux sera adaptée pour faciliter leur mastication (à base de gel). Les animaux seront également réhydratés par une injection de solution saline physiologique afin de compenser le volume sanguin prélevé.

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence pour les études vaccinales précliniques. Pour se développer, la réponse immunitaire a besoin de multiples partenaires (types cellulaires différents) interagissant au sein de tissus différents (ganglions, rate, circulation sanguine), en suivant une chronologie très précise. La réponse immunitaire se mesure dans des temps relativement longs (jusqu’à deux-trois mois dans notre étude). Pour le moment aucun modèle alternatif n’arrive à reproduire la complexité du système immunitaire c’est pourquoi nous avons besoin d’utiliser des souris pour étudier notre candidat vaccin. La réponse immunitaire de la souris est suffisamment proche de la réponse immunitaire chez l’homme pour que les résultats soient transférables à l’humain. La taille réduite des souris permettrait d’immuniser des groupes statistiquement pertinents des deux genres (mâles et femelles). Les souris âgées de 6 à 16 semaines seront utilisées. Cet âge garantit que leur système immunitaire soit mature pour développer des réponses contre une immunisation.

Les souris utilisées sont dépourvues de système immunitaire fonctionnel, irradiées puis greffées avec des cellules humaines pour porter une immunité qui n'est pas la leur. 320 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Elles reçoivent l'anticorps testé en intraveineuse, puis des prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse toutes les deux à trois semaines, puis tous les sept jours jusqu'à disparition de l'effet du produit. Le porteur présente ce modèle comme "une alternative solide à l'utilisation de primates en recherche préclinique", l'anticorps ne reconnaissant ni les cellules de rongeurs ni celles de primates.

Objectifs

L’objectif du projet est l’évaluation de l’effet pharmacologique d'un anticorps monoclonal sur les réponses immunes humaines dans un modèle murin de souris immunodéficiente humanisée. Ce modèle murin consiste à injecter les traitements chez la souris immunodéficiente préalablement reconstituée avec des précurseurs humains. D’une façon très intéressante, ce modèle nous permettra de répondre à deux questions qui sont : combien de temps et où va l'anticorps dans le corps une fois injecté, et comment agit-il sur la cible ?

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus à l’issue de cette étude, permettront de : - Déterminer le potentiel thérapeutique de l’anticorps testé, - Suivre la cinétique de l'effet thérapeutique dans le temps, - Déterminer la dose efficace - Evaluer les caractéristiques pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de traitement.

Procédures

- Irradiation des souris vigiles dans une boîte spéciale (3min) ; - Injection des cellules humaines et traitement en intraveineuse sur animal vigile (5min/animal, une seule fois) ; - Sous anesthésie gazeuse, des prélèvements sanguins seront réalisés sur toutes les souris (10min/souris, toutes les 2-3 semaines avant injection des traitements, puis tous les 7 jours aprés injection des traitements jusqu'a la disparition de l'effet de l'anticorps) ; - Euthanasie sous anesthésie gazeuse (6min/animal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances qui ne concernent pas que la douleur sont présentes, on note : - Le stress de l’animal à cause des manipulations fréquentes pour l’irradiation et les prélèvements, ce stress peut affecter le comportement des souris. - Risques d’infections après irradiation, au site d’injection et de prélèvement - L'exposition répétée à des procédures expérimentales peut entraîner une diminution de l'activité, un changement dans les comportements sociaux ou alimentaires.

Devenir

À la fin des expériences, les animaux seront autopsiés afin d'effectuer des prélèvements d'organes/tissus, ce qui justifie la mise à mort des souris.

Remplacement

Vu la complexité du système immunitaire, les études préalablement réalisées ne peuvent pas remplacer les études sur les organismes vivants. Il est donc nécessaire de déterminer les caractéristiques pharmacologiques du candidat médicament dans un modèle proche de l’Homme. Une alternative solide à l’utilisation de primates en recherche préclinique est le modèle de souris dites « humanisées ».

Réduction

Les caractéristiques pharmacologiques des candidats médicamenteux dans ce modèle seront analysées par le biais des tests statistiques. Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs ; et de sorte à avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus.

Raffinement

La saisine a été modifiée comme suit : Au début du protocole, les souris seront réparties par groupe de 5 souris par cage, avec des moyens d’enrichissement standard à l’espèce (frisottis, dôme et tunnel). Une surveillance quotidienne des animaux en protocole sera réalisée pour déceler une éventuelle douleur, une souffrance ou un mal-être. Les animaux souffrants seront séparés des autres pour leur offrir une facilité d’accès à la nourriture et l’eau. Nous prévoyons une administration d’analgésique en sous cutané deux fois par jour pour tout animal souffrant. Ces injections seront débutées quand les souris commencent à manifester les premiers signes de souffrance (voussure de dos, légère inactivité, poils ébouriffés). A noter qu’en cas de manifestation des points limites ou en cas de souffrance non gérable par anti-douleur ; l’animal sera euthanasié. Les animaux atteignant les différents points limites ou tout signe montrant une souffrance physique caractéristique d’un mal-être, seront euthanasiés. La perte de poids sera calculée par rapport au poids initial à jour 0. Les conditions d’hébergement et de soins aux animaux seront les suivantes : les souris seront hébergées par groupe de 5 maximum dans des cages de type 2L disposées sur des portoirs ventilés ; un change de litière régulier (minimum 1 fois par semaine) sera réalisé ; un contrôle de l’alimentation et des boissons sera effectué à chaque passage, soit par l’utilisateur, soit par les animaliers. La salle d’hébergement est soumise aux rythmes jour / nuit et à une isolation efficace afin de limiter les bruits. L’accès à l’animalerie est strictement limité au personnel autorisé. Les personnels habilités à accéder à l’animalerie doivent revêtir une tenue adaptée avec charlotte, masque, sabot et gants

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris immuno-déficiente pour deux raisons principales : * Elles présentent une facilité de reproduction, d'hébergement et de manipulation. * L’anticorps ne peut être testé que dans un modèle de souris humanisé avec des cellules humaines car il ne reconnait pas les cellules de rongeurs (absence de cross-réactivité) ou de primates. Ces souris immuno-déficientes permettent l'acceptation d’une greffe de cellules immunes humaines. Un tel protocole chez des souris immunocompétentes ne serait pas possible, les cellules et tissus humains seraient rejetés par le système immunitaire. Pour l’injection des cellules humaines, nous avons choisi d’utiliser des souris âgées de 5 semaines. C’est l’âge idéal décrits dans la littérature et de notre expérience pour injecter les cellules humaines. Pour l’injection des anticorps tests, les souris seront âgées de 18-20 semaines environ ; à cet âge-là, l’humanisation des souris est acceptable pour les pourcentages et les nombres des différentes populations cellulaires humaines répondants aux critères d’inclusion, elles ont également un poids relativement stable ce qui facilite leur manipulation, l’injection des anticorps, les prélèvements et l’évaluation physique (bien être).

5 720 souris vont être utilisées pour une intervention de trente minutes chacune, l'implantation d'un dispositif dans la mâchoire sous anesthésie générale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation qui altère leur dentition et les expose à des difficultés de mastication et à une perte de poids pendant toute leur vie, indépendamment de la chirurgie. L'objet du projet est de tester des membranes synthétiques censées remplacer les greffes osseuses de la mâchoire chez de jeunes patients atteints d'une maladie génétique rare. Toutes sont tuées, une partie pour génotypage non conforme, les autres pour prélèvement de tissus, et le porteur ramène l'effectif à un calcul de puissance sans donner ni le nombre de groupes ni le nombre d'animaux par groupe.

Objectifs

La pathologie d’intérêt est une maladie génétique rare avec des conséquences variées incluant des troubles dans le développement des dents et des mâchoires, avec des complications osseuses et métaboliques associées. Dans les défauts dentaires, cette pathologie est très fréquente et représente environ 52% des cas, représentant alors un enjeu de santé publique majeur. A l’heure actuelle, les troubles dentaires et osseux de la mâchoire sont traités par réhabilitation orale incluant des implants, greffes osseuses et des prothèses. Il s’agit d’une procédure clinique chirurgicale en deux étapes à savoir une greffe osseuse pour établir un volume osseux suffisant puis une pose d’implant dentaire, avant la phase prothétique. La procédure est lourde et à l’origine de risques de comorbidités et de douleur importants, et ce avec des résultats à long terme non optimaux chez les patients atteints de la mutation ciblée. Nous proposons une stratégie efficiente et novatrice utilisant un implant pour remplacer les greffes osseuses afin de régénérer l’os au niveau de la mâchoire pour une population souffrant de sévères lésions osseuses dans le cadre de la pathologie ciblée, en particulier pour un public de jeunes patients. L’objectif principal est donc de répondre au besoin de stratégies thérapeutiques, notamment pour la reconstruction de la mâchoire, via une procédure légère et peu traumatique pour ces patients que ce soit au niveau psychologique ou physique, avec des complications et une douleur post-opératoire largement diminuée par rapport aux standards actuels. Notre stratégie sera évaluée In Vivo sur des souris portant la même mutation que l’homme. Cette phase permettra d’évaluer le potentiel de régénération osseuse des implants dans un contexte se rapprochant le plus des conditions cliniques existantes (opération chirurgicale, incision, troubles métaboliques sur modèle vivant).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’évaluer des options thérapeutiques moins invasives que les greffes osseuses tout en étant plus efficace pour ces patients. Notre objectif est donc d’optimiser la régénération osseuse en chirurgie maxillo-faciale ou traumatologique en développant des membranes synthétiques bioactives tout en privilégiant une approche peu invasive avec une diminution la douleur et du temps de cicatrisation. Ce projet permettra donc de mettre au point un protocole thérapeutique apte à répondre à la problématique des déformation osseuses au niveau de la mâchoire liées aux mutations génétiques.

Procédures

Un prélèvement pour génotypage sur animal vigile sera effectué. Une implantation sous anesthésie générale d’une durée de 30 min au niveau de la mâchoire.

Impact sur les animaux

La chirurgie induit une douleur modérée ainsi qu'une perte de poids principalement sur les 2 semaines post-opératoires. Le modèle génétiquement modifié ayant une dentition altérée, ces souris pourraient avoir des difficultés à mastiquer induisant un risque de perte de poids et ce tout au long de leur vie. L'implantation permet toutefois la reconstruction osseuse de la mâchoire.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour génotypage non conforme et prélèvement de tissus pour analyse post-mortem

Remplacement

Après des études in vitro validant la non-toxicité et la biocompatibilité des implants, il est nécessaire de passer à des études in vivo étant donnée la complexité de l'environnement osseux et oral. Les modèles in vitro, possibles grâce à la collecte de cellules sur les modèles de l’étude, seront utilisés pour permettre une première évaluation, mais ils ne permettent pas de reproduire l’ensemble des paramètres lié à la régénération de l’os (inflammation, recrutement cellulaire, vascularisation, minéralisation…). La solution thérapeutique développée implique de plus un acte chirurgical. La faisabilité technique de cet acte n’est pas possible in vitro. De plus, la gestion de la douleur peri- et post-opératoire est une donnée importante à minimiser : cet élément n’est pas reproductible sur d’autres modèles. Ainsi, il n’existe à ce jour pas de modèle alternatif pour ce type d’étude.

Réduction

La réduction des effectifs est liée à une approche statistique adéquate et à l'utilisation de modèles standardisés. L’effectif animal de chaque groupe a fait l’objet d’une évaluation statistique via calcul de puissance. Globalement, la stratégie tendra à diminuer le nombre total d’animaux en priorisant certaines stratégies.

Raffinement

Tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale. De plus, une anesthésie locale et des traitements antidouleurs seront appliqués pour réduire la douleur péri- et post-opératoire. Compte tenu des potentielles douleurs pouvant être générées suite aux actes, un suivi rigoureux après l’intervention et une prise en charge précoce de la douleur seront effectués, en cas de signes de souffrance animale. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des conditions optimales. L’environnement des cages est enrichi à l’aide de carrés de cellulose et de frisure pour la construction des nids, de tunnels pour permettre aux animaux de se cacher et ainsi diminuer le niveau de stress. La nourriture sera adaptée pour les rongeurs ayant cette condition et l’eau de boisson seront donnés ad libitum. Des points limites ont été établis pour soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le modèle de la souris, un modèle d’étude vivant, a été sélectionné pour vérifier la régénération osseuse induite par un dispositif implantable formulé car malgré les variations inter-espèces, le phénotype dentaire chez la souris de la pathologie étudiée est reproduit. De plus, nous avons à disposition des techniques et des outils micro-chirurgicaux développés à ses fins permettant d’étudier la régénération osseuse de la mâchoire chez la souris. Les souris génétiquement modifiées utilisées pour nos procédures constituent donc un bon modèle pour mieux comprendre la maladie étudiée et la réponse métabolique aux traitements.