Souris
Comment une substance chimique du cerveau, la noradrénaline, affecte le syndrome d’Ondine, une maladie rare qui perturbe la respiration : étude avec des souris modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
Porteuses d'une mutation qui les fait cesser de respirer pendant le sommeil, des souris nouveau-nées reproduisent le syndrome d'Ondine. 1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chaque souriceau est séparé de sa mère jusqu'à une heure pour une mesure cardiorespiratoire, reçoit un gavage à la naissance et se fait couper un morceau de queue vers le quatrième jour de vie. Le porteur liste l'angoisse de la séparation maternelle, les apnées, l'hypoventilation et un défaut de succion qui fait perdre du poids aux mutants, tout en écrivant que ces mutants se développent sans manifester de souffrance nécessitant une prise en charge spécifique.
Objectifs
Le syndrome d'Ondine est une maladie génétique rare diagnostiquée à la naissance : le nouveau-né diminue sa ventilation jusqu’à arrêter de respirer pendant le sommeil. Une caractéristique majeure est l'absence d’un réflexe important : augmentation de la respiration à l’augmentation du CO2 inhalé. La maladie est provoquée par une mutation d’un gène qui contrôle les grandes fonctions vitales comme la respiration. Ce gène est aussi impliqué dans la différenciation et la maturation des structures qui modulent la respiration. Notre objectif est d’explorer l’impact de la mutation dans ces structures. Les résultats de cette étude permettent de comprendre les mécanismes sous-jacents à cette maladie et de proposer des pistes thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront également de préciser l’impact de la mutation restreinte dans des structures importantes pour la modulation de la respiration et d’ajouter des cibles pharmaceutiques. L’objectif est de proposer des thérapies ciblées. L’utilisation d’un traitement pharmacologique réduirait le recours à la ventilation mécanique, l’unique prise en charge actuelle pour cette pathologie, et ainsi réduirait les risques dus à un arrêt accidentel (par exemple une coupure de courant ou une défaillance technique) pendant le sommeil ou à une ventilation inadaptée. De plus, pour des médicaments à visée pédiatrique, l’agence européenne du médicament recommande des tests sur des rongeurs juvéniles pour garantir l’innocuité et l’efficacité du produit sur la population cible.
Procédures
1/ Séparation maternelle concernant les souris avant le sevrage : Procédure 1 : une seule administration du traitement par gavage, par souriceau et à la naissance suivie d'une mesure cardio-respiratoire d'une heure réalisée immédiatement après le gavage (mesure non invasive et sans anesthésie, contention liée au gavage moins d'une minute), Procédure 2 : une seule administration du traitement par gavage, par souriceau et à la naissance suivie d'une mesure cardio-respiratoire d'une heure réalisée immédiatement après le gavage, la mesure est ensuite répétée 5 fois pour 5 âges (une mesure par âge, mesure non invasive et sans anesthésie), 2/ Prélèvement d'un morceau de queue pour l'identification du statut génétique de l'animal 3/ Mesure cardio-respiratoire d'une heure nécessitant une séparation maternelle 4/Administration du traitement par gavage, une seule fois et à la naissance 5/ Prise de poids pour évaluer la croissance pondérale
Impact sur les animaux
1/ angoisse par la séparation maternelle d'une heure pour la mesure cadio-respiratoire 2/Perte de poids pour les mutants qui font des apnées, hypoventilent et ont un défaut de succion/déglutition 3/ douleur légère et de courte durée due au prélèvement d'un morceau de queue pour déterminer le statut génétique de l'animal geste réalisé une fois vers quatre jours de vie) 4/ gêne occasionnée par l'administration unique de produit par voie orale grâce à une sonde de gavage (sonde fabriquée spécialement pour les souriceaux nouveau-né). Jusqu'alors, il n'y a pas de lésions/irritations spécifiques occasionnées par l'utilisation unique de la sonde de gavage.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Utilisation en postmortem du cerveau pour l'étude d'expression génique.
Remplacement
Les études à l'échelle cellulaire et/ou moléculaire contribuent à la compréhension des différents acteurs (gènes, structures) dans la compréhension de la maladie. Toutefois, ces modèles sont limitées car non représentatifs de la pathologie dans sa complexité d’expression et de prise en charge. Étant dans l’optique de recherche de traitement pharmacologique, l’Agence européenne du médicament recommande l’utilisation de l’animal en développement pour les médicaments notamment à visée pédiatrique. L’expérimentation animale ne peut alors être évitée. Dans le cas du syndrome d’Ondine, il n’y a actuellement pas de prise en charge pharmacologique.
Réduction
Nous utilisons l'effectif qui permet d'avoir une puissance statistique suffisante pour tester nos hypothèses. Compte tenu de la variabilité inter-individuelle sur les variables observées comme la ventilation, nous avons déterminé un lot expérimental génotype, dose, génotype*dose de 30 animaux pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. les études publiées sur les variables respiratoires valident l’effectif de 30 animaux par groupe pour obtenir une puissance statistique. Cet effectif peut être réduit si au cours des analyses intermédiaires, un effectif plus faible permet de tester les hypothèses. Par ailleurs, les méthodes de mesures utilisées étant non invasives, nous privilégions une étude longitudinale ce qui réduit l’utilisation d’animaux. Génotype : profil génétique de l'individu
Raffinement
Pendant les mesures, la surveillance est constante. Entre les mesures, la surveillance est biquotidienne pour le suivi de la croissance pondérale. De plus, l’équipe de l’animalerie effectue une surveillance quotidienne de toutes les cages. Des points limites adaptés à l’âge des souriceaux sont décrits et comportent la première semaine de vie le score d’adaptation à la vie extra-utérine pour le souriceau et le comportement de la mère envers sa portée. A partir de 7 jours de vie, nous incluons l’aspect du pelage, la posture et la mobilité des souris. Les mutants dont la mutation est restreinte à des régions spécifiques se développent sans manifester de souffrance nécessitant une prise en charge spécifique. Pour les mesures, nous utilisons des techniques non invasives et contrôlées (durée de la mesure, température dans les chambres de mesure) pour minimiser une possible angoisse des animaux. La durée maximale de séparation maternelle le temps d’une mesure est d’une heure. A la fin de chaque mesure, les animaux sont remis à la mère. Les cages avec les portées sont enrichies en cellulose douce pour le nid.
Choix des espèces
Les études à l'échelle cellulaire et/ou moléculaire permettent de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents. L’approche sur un animal entier permet de voir les effets de la mutation dans un contexte physiologique. La souris constitue un modèle de neuro-développement humain et la souris avec modification génétique est largement utilisée dans l'analyse ou l'étude du développement d'une maladie génétique. Dans le cas du syndrome d'Ondine, les modèles animaux existants sont murins. Les modèles murins permettent de préciser les mécanismes physiopathologiques (examiner les processus conduisant à la maladie) du syndrome d'Ondine et de rechercher les traitements pharmaceutiques. A ce jour, la seule prise en charge des patients est la ventilation mécanique. Par ailleurs, les études précliniques sur des rongeurs juvéniles constituent une recommandation de l'Agence européenne du médicament comme préalable pour garantir l’innocuité et l’efficacité de produit/médicament sur la population pédiatrique cible
Cibler le récepteur 5-HT7 de la sérotonine pour réduire les neuropathies périphériques chimio-induites et évaluer l’effet de nouveaux traitements en préventif et curatif
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Gavées huit fois et piquées sept fois dans l'abdomen après une semaine d'injections quotidiennes d'oxaliplatine ou de vincristine, 750 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever sang, cerveau, moelle épinière et ganglions. Chaque animal passe ensuite trente minutes par jour, trois jours de suite chaque semaine, dans des tests de sensibilité destinés à mesurer la douleur neuropathique provoquée par ces deux anticancéreux. Le porteur indique que les injections quotidiennes peuvent elles-mêmes provoquer une douleur au point d'injection, ce qui lui fait classer certaines procédures en sévères. Il décrit une grille de score et une surveillance renforcée, puis précise que les antalgiques ne seront pas administrés pendant la procédure, leur effet risquant d'interférer avec l'installation de la douleur qu'il veut mesurer.
Objectifs
Dans ce projet, nous nous intéresserons aux neuropathies périphériques chimio-induites (NPCI), un effet indésirable commun des agents anticancéreux. Plus de 60% des patients recevant une thérapie anti-cancéreuse souffrent de NPCI avec pour principaux symptômes l’apparition de troubles sensitifs : douleurs, fourmillements, sensations d’engourdissement, altérations de la sensibilité thermique et mécanique, qui sont souvent associés à des troubles de l’anxiété, dépression et déficits cognitifs. Ainsi, les NPCI sont associées à une forte altération de la qualité de vie des patients, et peut dans certains cas conduire à une diminution des doses et des cycles de chimiothérapie, voire à un arrêt du traitement de l’agent anti-cancéreux. L’amélioration de la prise en charge des symptômes neuropathiques représente donc un objectif thérapeutique crucial, sachant qu’il n’existe actuellement aucun traitement efficace pour les soigner ou les prévenir. Notre objectif principal est d’évaluer le rôle d’un récepteur de la sérotonine comme cible thérapeutique potentielle pour le traitement de ces douleurs et d’évaluer l’intérêt thérapeutique de nouveaux candidats-médicaments. Nous avons déjà démontré que certains ligands du récepteur ont la capacité de réduire les douleurs neuropathiques dans d’autres modèles. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’intérêt de ligands du récepteur dans deux modèles murins de NPCI, après traitement par l’oxaliplatine ou la vincristine, deux agents anti-cancéreux utilisés en clinique chez l'Homme pour le traitement des cancers des voies digestives et des leucémies respectivement. Les NPCI seront déclenchées chez les animaux après une cure quotidienne d’oxaliplatine ou de vincristine pendant une semaine. Les traitements n’induisent pas seulement un stress mais les injections quotidiennes peuvent induire aussi une douleur au site d’injection, aussi certaines procédures ont été classées comme sévères. Ce projet vise deux objectifs : 1) évaluer comment la perte du récepteur impact l’apparition, la durée et l’intensité des douleurs dans deux modèles de NPCI. 2) tester le potentiel thérapeutique de deux candidats médicaments en traitement préventif ou curatif. Nous réaliserons des mesures physiques pour évaluer l'effet des composés sur la douleur (Evaluation de la sensibilité des animaux, test de la sensibilité aux températures et enregistrement de l'activité électrique des nerfs et muscles). Dans cette étude nous utiliserons 750 animaux.
Bénéfices attendus
Parmi les bénéfices attendus du projet, nous espérons pouvoir proposer le développement de molécules thérapeutiques. Nous espérons l'identification d'une molécule qui permettra de réduire significativement la symptomatologie des douleurs neuropathiques chimio-induites. Nous espérons faire progresser les connaissances quant au rôle du récepteur que nous étudions dans les effets des NPCI.
Procédures
Les animaux utilisés dans ce projet sont identifiés par les bagues à l'oreille après l'âge de 14 jours et une partie de l'autre oreille est prélevée pour le génotypage. Cette intervention n'est réalisée qu'une fois par animal et dure moins de 30 secondes. Le génotypage ne sera pas systématique puisque l'élevage sera maintenu avec des croisements homozygote x homozygote. Ainsi, seulement une partie des animaux sera prélevée pour le génotypage. Les animaux ne seront soumis à aucune intervention impliquant des procédures chirurgicales. 8 administrations par voie orale (1min/gavage/jour) sur 640 animaux vigiles, ainsi que 7 injections intrapéritonéale (1min/ injection intrapéritonéal) sur 720 animaux vigiles. 750 animaux effectueront chaque semaine des tests de sensibilité n’excédant pas 30 minutes de test/jour pendant 3 jours consécutifs.
Impact sur les animaux
Nous avons déjà démontré qu'une de nos molécules, parmi nos candidats-médicaments testés, possède des propriétés anti-inflammatoires et antalgiques. Cependant l'injection quotidienne d'Oxaliplatine ou de vincristine pendant 7 jours peut induire l’apparition de troubles sensitifs : douleurs, fourmillements, sensations d’engourdissement, altérations de la sensibilité thermique et mécanique, qui sont souvent associés à des troubles de l’anxiété, dépression et déficits cognitifs. Ainsi, Il est attendu que les souris traitées avec les agents anti-cancéreux soit l’oxaliplatine soit la vincristine seuls (en absence de traitement curatif ou préventif) développeront les effets secondaires les plus importants. Les injections quotidiennes peuvent également induire une douleur au site d’injection. De même, la manipulation des animaux lors des tests comportementaux peut également induire un stress. De plus, nous disposons de souris C57 BL/6 J génétiquement modifiées qui ne possèdent pas de récepteur de la Sérotonine dans leur génome mais qui ne présentent pas de phénotype dommageable.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de réaliser des prélèvements (sang, cerveau, moelle épinière, ganglions).
Remplacement
Des études in vitro seront réalisées en parallèle des études in vivo afin d'obtenir plus d'informations sur les mécanismes d'action et les voies de signalisation impliquées. Cependant, l’évaluation de l’effet anti-inflammatoire et neuroprotecteur des ligands du récepteur 5-HT7 de la sérotonine nécessite l’utilisation de l’animal afin de considérer un organisme entier et de confronter nos ligands à la complexité des mécanismes neurologiques mis en jeux. L'étude du comportement est essentielle dans le développement de médicaments actifs sur le système nerveux. L'effet d'une molécule résulte de son action au niveau de l'ensemble de l'organisme. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de prédire et rendre compte de l'ensemble des phénomènes impliqués dans l'action d'un médicament et en particulier ceux qui conditionnent le comportement.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. Les approches comportementales nécessitent des cohortes de 10 animaux maximum par groupe. Chaque expérience sera réalisée deux fois indépendamment afin d’assurer la validité statistique des résultats. Cependant, si une molécule s’avère inefficace dans une procédure, elle sera abandonnée. En ce qui concerne l’analyse des données, des procédures statistiques adaptées à l’analyse des variables dépendantes relevées seront utilisées.
Raffinement
Nous réaliserons une période d'acclimatation d'une semaine des animaux avant le début des expériences. Les groupes étant composés de 10 animaux, nous mettrons 5 animaux par cages. Les animaux seront stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l'hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Les animaux ont accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle circadien est de 12h/12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères. Le milieu est enrichi avec entre autres, des bâtons de bois à ronger de deux tailles différentes et/ou du celluron et/ou des disques de papier kraft compactés. Les animaux seront suivis tout au long des procédures. En effet, nous réaliserons une observation de l'aspect général extérieur de l'animal (posture, qualité du pelage, faciès, yeux) quotidiennement. Les animaux seront pesés chaque jour de manipulation. Ces points limites ont été établis et sont évalués en observant individuellement les animaux quotidiennement. Ces données seront enregistrées dans une grille de scoring. Tout changement de score dans la grille de scoring sera suivi d'une action correctrice telle que la surveillance renforcée. Si un animal présente des signes de souffrance ou de mal-être lors des visites quotidiennes le matin, nous surveillerons l’animal toutes les 2h plusieurs fois dans la journée. Cependant, les antalgiques ne pourront pas être utilisés pour réduire la douleur au cours de la procédure car cela pourrait interférer avec le développement des NPCI et induire un biais lors des dosages. L'administration d'un antalgique va impacter la mise en place des processus neuroinflammatoires. Toutefois, si un animal présente des signes de souffrance lors des observations quotidiennes, le responsable de projet sera averti. Il prendra contact avec la vétérinaire et/ou la SBEA (La Structure chargée du Bien Etre des Animaux ) pour mettre en place des mesures supplémentaires de raffinement, tels que le dépôt de croquettes humide ou d’hydrogel dans la cage. L'administration d'un antalgique pouvant induire un biais dans l'expérimentation, les résultats obtenus sur cet animal ne pourront être inclus dans l'expérience, ainsi nous préférerons exclure cet animal de l'étude et il sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est: - Un mammifère proche de l'Homme (homologie de 90%) - L’animal de laboratoire le plus utilisé par la communauté scientifique et pour les études précliniques La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études précliniques. Nous utiliserons des souris C57BL/6 car nous disposons actuellement de souris transgéniques qui n'expriment pas le récepteur de la Sérotonine sur ce même fond génétique. Ces souris sont actuellement en élevage dans un établissement hébergeur/producteur de souris accrédité qui donne de nombreux avantages en termes d'élevage, d'animalerie, d'expertise en techniques d'expérimentations animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (7 à 12 semaines) afin de garantir un système nerveux central mature. Nous veillerons à ce que l'âge moyen des animaux par groupe soit homogène.
Etude du rôle d’une cytokine et de sa voie de signalisation dans le vitiligo
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rasées et greffées sous la peau du flanc avec des cellules de mélanome, 392 souris reçoivent au quatrième puis au dixième jour des anticorps qui lèvent le frein immunitaire, avant de subir au douzième jour l'ablation chirurgicale de la greffe et de la peau au-dessus. Une dépigmentation apparaît vers le trente-cinquième jour, et le suivi se poursuit par une anesthésie gazeuse hebdomadaire pendant seize semaines pour peser, mesurer et photographier, avec quatre prises de sang. 400 souris au total sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées entre un et neuf mois pour les prélèvements. Le porteur décrit un arbre décisionnel dont les points limites comprennent la prostration, la taille maximale de la greffe, la nécrose et le saignement.
Objectifs
Les cytokines sont des petites protéines ayant un rôle essentiel dans la régulation du système immunitaire, lors des infections ou lors de maladies auto-immunes. L'équipe est reconnue pour avoir étudié le rôle d'une cytokine produite par les cellules de l'épiderme dans différentes maladies inflammatoires de la peau. Le vitiligo est une maladie auto-immune, caractérisée par l’apparition de taches blanches sur la peau. La prévalence de cette maladie est estimée à 1 % de la population mondiale et il n'existe actuellement aucun traitement pour la guérir. En effet, le vitiligo est une maladie complexe faisant intervenir de nombreux facteurs combinés : prédisposition génétique, stress, frottements. Avec une diminution de cette cytokine dans la peau chez le patient humain, il nous parait important d’étudier la fonction des voies de signalisation de cette cytokine dans la pathogenèse du vitiligo. En utilisant des modèles, nous pourrons développer de nouvelles thérapies. Le projet utilisera les souris initialement développées dans notre laboratoire où sont inactivées les gènes de la cytokine et d’un acteur de sa voie de signalisation dans un modèle d’induction du vitiligo décrit récemment dans les publications. Ce modèle est médié par une réaction auto-immune qui induit une dépigmentation de la peau. On greffe sous la peau des cellules d'une lignée cellulaire de mélanocytes générée à partir d’un mélanome de souris, qui vont induire une réponse immune par la production de lymphocytes T tueurs. Ceux-ci étant réprimés par des lymphocytes T régulateurs (Treg) qui seront bloqués par deux injections d’anticorps neutralisants, ces cellules T tueuses pourront provoquer une réaction auto-immune dirigée contre les cellules de la peau pigmentaires entrainant la décoloration : le vitiligo. Au bout de 12 jours, on retire les cellules greffées et la peau au-dessus de cette greffe. Au bout de 1 mois, on arrive à voir les modifications des populations de lymphocytes T. Au bout de 35 jours, on peut voir la dépigmentation se mettre en place. Entre un mois et 9 mois, nous euthanasierons les souris et effectuerons les prélèvements pour analyser le développement de cette maladie et son impact sur le système immunitaire.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les phénomènes biologiques mis en place lors du développement du vitiligo, d’expliciter le rôle de la cytokine étudiée et de sa voie de signalisation et de proposer de nouvelles thérapies à cette maladie auto-immune très invalidante.
Procédures
392 souris seront anesthésiées, puis rasées et injectées en sous-cutanée sur un des flancs, avec des cellules de mélanome (durée : 5min). Au jour 4 et 10 post-greffe, ces souris vont être pesées puis injectées sans anesthésie en intrapéritonéale par des anticorps neutralisants (durée : 1min). 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi), les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement de la greffe (durée 5x3min). Au jour 12, elles vont subir une opération sous anesthésie générale pour réséquer la greffe (durée = 10min). Puis, 1 fois par semaine, les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement du vitiligo autour de la cicatrice et sur la queue (durée : 16 semaines x 3min). Entre 1 et 4 mois, en plus du suivi visuel, nous prélèverons 3 fois 100µl de sang pour analyser les cellules circulantes du système immunitaire ( 3x1min). Puis, à la fin de l'expérience (de 4 à 9 mois), nous pourrons encore prélever une 4ème fois 100µl de sang pour nos analyses.
Impact sur les animaux
La piqure d’injection des cellules en intradermique dans le flanc gauche sous anesthésie légère gazeuse peut entrainer une rougeur. 392 animaux développeront une masse cellulaire localisée sur le flanc, uniquement au niveau du point d’injection des cellules. La résection par chirurgie, d’une durée de 5 à 8 minutes, entraine au réveil un état de stress lié à un léger manque de mobilité de la patte arrière à cause de la pose de 2 points de suture et des 4 à 5 agrafes le long des berges de la plaie. Durant les premières minutes après le réveil, une douleur est ressentie par les animaux qui présentent des signes (dos vouté, raideur de la patte postérieure gauche, marche avec les pattes postérieures écartées). Après 10min, les souris retrouvent leur mobilité et un comportement normal (grooming, activité exploratoire, interaction sociale). Les sites d’injections d'analgésique en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse légère peuvent présenter une rougeur. Les prises de sang effectuées à la joue nécessitent une contention stressante pour l’animal pendant 30s. La pression sur la joue pour arrêter le saignement ajoute du stress.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer les prélèvements qui seront analysés.
Remplacement
Les cibles (cytokines, récepteurs et cellules) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. L'étude de la réponse immunitaires met en jeu plusieurs organes et réseaux complexes impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre le type d’interaction et les différentes voies de signalisation impliquées dans ces réponses immunitaires ainsi que le processus de pathogenèse du vitiligo.
Réduction
Ce protocole sera appliqué à un maximum de 400 souris. Elles seront utilisées afin de caractériser le rôle de la cytokine étudiée ainsi que des acteurs de sa voie de signalisation dans la pathogenèse du vitiligo. Nous réaliserons une expérience pilote avec un nombre limité d’animaux sauvages pour mettre en place et valider le protocole expérimental publié récemment et déterminer le meilleur moment pour faire nos analyses. Les groupes comporteront 40 souris pour avoir un effectif minimal de 24 (60% à 80% des souris traitées développent un vitiligo d’après la publication) pour obtenir, au meilleur moment choisi lors de l’étude pilote, des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés (fréquences des Treg et des autres populations de lymphocytes T). Nous allons tout d'abord étudier 2 lignées de souris dans laquelle le gène d'intérêt est absent dans tout l'organisme, puis, si des résultats intéressants sont produits, d'étudier ensuite les lignées de souris dans laquelle les gènes étudiés sont absents dans un type cellulaire donné (les cellules dendritiques).
Raffinement
Les souris seront maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales. La prise de photos et le suivi nécessitent une anesthésie gazeuse légère de courte durée. Les souris seront remises dans leur cage avec une courte exposition à la lampe chauffante. En plus de la surveillance journalière, le suivi de la croissance de la greffe (pesée, photos, mesure de la taille) sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). La chirurgie se fera sous anesthésie totale et sous antalgique, par des personnes ayant suivies la formation correspondante. La chirurgie, les médicaments utilisés et leurs doses seront validés par notre vétérinaire. Les observations faites lors des suivis permettront de situer l'état des animaux dans l'arbre décisionnel et d'appliquer ces points limites. L’arbre décisionnel mis en place pour ce projet tient compte de l’apparence physique ("Grimace Scaling"), du comportement (observation de la continuité des activités comportementales normales des animaux), de l’absence de signes d’infection aux lieux de piqures ou de traitements, du développement de la greffe qui ne doivent pas être invalidantes pour nos animaux. Ces critères sont assortis de points limites ou points d’arrêt, définis pour éviter des douleurs entrainant un changement dans les comportements des animaux et des blessures qui impactent nos résultats : prostration, taille maximale de la greffe, signe d’infection au point d’injection, nécrose, saignement.
Choix des espèces
La réponse immunitaire dans le contexte du vitiligo met en jeu différents organes comme la peau, les ganglions lymphatiques, le thymus, rendant nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse. Le modèle animal choisi pour étudier le mélanome est la souris car son système immunitaire est proche de celui de l'Homme avec une immunité innée et une immunité adaptative. De plus, la peau des souris présente des similitudes avec la peau humaine, rendant ce modèle pertinent pour l'étude du vitiligo. D'après la publication de référence, nous utiliserons des souris adultes âgées de 7 à 9 semaines car l'induction du vitiligo est maximal à cette période et les injections ne sont pas génées par le stade anagène du développement du système pileux.
Interactions métaboliques entre neurones et astrocytes
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
709 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 469 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection dans le cerveau sous anesthésie, une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes, ou un système implanté pour une perfusion de deux heures. Trois semaines plus tard, une partie passe un test de reconnaissance d'objet de neuf minutes trois jours de suite, une autre reçoit un guide implanté dans le cerveau puis une membrane de microdialyse qui collecte des échantillons pendant vingt-quatre heures, sans anesthésie et en isolement. Le porteur décrit des travaux menés sur cultures cellulaires, puis conclut qu'il est "indispensable" de passer à un modèle animal pour étudier le dialogue métabolique entre neurones et astrocytes.
Objectifs
Nous souhaitons identifier les protéines et les voies de signalisation qui permettent aux cellules du cerveau de s’adapter à une demande énergétique forte, nécessaire pour la transmission des signaux nerveux et qui fait que notre cerveau consomme 20% de l’energie disponible dans notre corps. Cette question revet d’une importance capitale lorsqu’on sait que les problèmes énergétiques du cerveau sont altérés 20 ans avant l’apparition des symptomes chez les patients atteints de la maladie d’Alzheimer (MA). Dans notre cerveau, les neurones et les astrocytes (cellules gliales majoritaires du cerveau) ont des profils métaboliques spécifiques qui influencent les échanges de molécules permettant de produire de l’énergie. Comment les astrocytes synthétisent et échangent ces molécules aux neurones ? Ce dialogue métabolique entre neurones et cellules gliales est-il altéré au cours du vieillissement normal et pathologique ? Ce sont les deux questions principales que notre projet va aborder.
Bénéfices attendus
Le projet a pour ambition de fournir de nouvelles connaissances sur le fonctionnement du cerveau et sur l’importance des interactions métaboliques entre les neurones et les astrocytes. En identifiant les mécanismes moléculaires qui dirigent l'interaction entre les processus métaboliques et de signalisation des astrocytes, le projet apportera de nouveaux concepts sur la façon dont les astrocytes gouvernent les fonctions cérébrales et sur la façon dont le cerveau utilise différentes voies de signalisation qui convergent pour élaborer l'information. Ces nouvelles connaissances collectées au cours de ce projet seront exploitées dans le domaine des pathologies cérébrales. Ainsi, en plus du vieillisement normal, de nombreuses conditions pathologiques dont les troubles neurodégénératifs et psychiatriques montrent à la fois des altérations du métabolisme cérébral et des dysfonctionnemets des astrocytes. Manipuler le métabolisme de ces cellules gliales pour le rendre plus favorables aux neurones apparaît ainsi comme une stratégie thérapeutique alternative potentielle.
Procédures
Les souris recevront soit une injection intracérébrale sous anesthésie et analgésie (30-45 min de chirurgie par souris) soit une injection intravasculaire sous anesthésie gazeuse de 5 minutes, soit une injection intravasculaire pendant 2h via un système implanté sous chirurgie. Trois semaines après, ces souris seront utilisées soit : 1. pour passer un test de comportement mnésique (reconnaisance d’objet, test de 9 minutes sur 3 jours consécutifs) 2. pour recevoir un guide intracérébral sous anesthésie et analgésie (30-45 min de chirurgie par souris) et ensuite une membrane de microdialyse pour une collecte des échantillons pendant 24h, l’animal libre de ses mouvements sans anethésie pendant 24h 3. pour recevoir en intravasculaire sur 120 min ou par gavage des molécules marquées avant d’être euthanasiées.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les souris utilisées dans ce protocole sont une douleur limitée liée à la chirurgie cérébrale ou vasculaire, un stress pendant l’isolement de 7 jours ainsi que celui du recueil des échantillons de microdialyse pendant 24h en isolation et un stress pendant le gavage ou les injections.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour analyse post-mortem des tissus.
Remplacement
Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre neurones et différentes cellules partenaires, dont les astrocytes. Ces cellules peuvent être étudiées in vitro et notre projet fait suite à des découvertes récentes dont une partie ont été obtenues à partir de ce modèle cellulaire. Pour avancer sur le fonctionnement du cerveau et sur l’importance des interactions métaboliques entre les neurones et les astrocytes, il est indispensable de passer à un modèle animal car ces interactions cellulaires, vasculaires et métaboliques ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles in vitro ou in silico. Ces modèles d’animaux, en particulier souris, permettent ainsi d’étudier les neurones et les astrocytes dans leur environnement natif, en interaction avec le système vasculaire. De plus, il existe des souris modèles de la maladie d’Alzheimer (MA) qui possèdent des mutations génétiques impliquées dans les formes familiales de la MA et reproduisent de nombreux symptômes de la MA. Ces souris modèles ont l’avantage de reproduire certains symptômes cliniques caractéristiques de la MA (ex. déficits mnésiques, anxiété). Au final, seule une approche sur un mammifère modèle possédant un cerveau complexe et exprimant des comportements sophistiqués peut nous permettre d’identifier le rôle des interactions métaboliques entre les astrocytes et les neurones, avec l’objectif à moyen terme de les ciber par des stratégies thérapeutiques adaptées.
Réduction
Le projet prévoit au maximum 709 souris nées dans notre élevage ou achetées chez un fournisseur agréé. Toutes les mesures seront réalisées sur des groupes comprenant au maximum 8 à 10 animaux, nous avons calculé un nombre d’animaux nécessaires le plus réduit possible. De plus, les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques fiables pour des petits échantillons.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation, permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. La gestion de la douleur et de l’inconfort liés aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. En particulier le maintien des souris sur une couverture thermostatée jusqu’à leurs premiers mouvements puis en chambre thermostatée jusqu’à leur réveil complet post-chirurgie permet de réduire la mortalité péri-opératoire des souris. L’habituation des souris 1 fois/jour pendant 3 jours au set-up expérimentaux permet de réduire le stress des souris.
Choix des espèces
Ce projet vise à étudier les interactions métaboliques entre neurones et astrocytes ; les organismes modèles simples possèdent des cellules gliales ressemblantes mais pas identiques aux astrocytes du cerveau des mammifères. Les souris transgéniques permettent d’étudier les interactions neurones-astrocytes dans le contexte génétique de la maladie d’Alzheimer. Le présent projet a pour but d'étudier le métabolisme cérébral chez l’animal adulte et son altération au cours du vieillissement normal et pathologique. Les animaux étudiés seront donc des adultes jeunes (3 mois) et âgés (12 mois). Pour cette étude, il existe des animaux génétiquement modifiés mimant la maladie d’Alzheimer, nous les étudirons au stade pré-symptomatique (4-6 mois), et au stade plus âgés (9-12 mois) correspondant aux phases symptomatiques.
Étude par imagerie intravitale du muscle squelettique au cours de la régénération normale et pathologique.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Huit à dix heures d'anesthésie gazeuse pour une seule séance d'imagerie, après la pose chirurgicale d'une fenêtre d'observation sur le muscle : 432 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit quatre injections sous la peau, cinq gavages sur cinq jours, une injection intrapéritonéale et une injection de toxine dans le muscle pour le blesser. Le projet filme la réparation du muscle chez des souris normales et chez des souris porteuses de la mutation qui sert de modèle à la myopathie de Duchenne. Le porteur écrit que le réveil après cette longue anesthésie serait en théorie possible, qu'il n'a pas d'expérience sur ce point, et que toutes les souris seront donc tuées à la fin de la procédure.
Objectifs
L’ensemble du projet vise à apporter de nouvelles connaissances fondamentales visant à la compréhension des mécanismes cellulaires de la régénération musculaire normale et pathologique, afin à terme de développer de meilleurs traitements pour les patients atteints de dystrophies. Les muscles squelettiques représentent 40% de la masse corporelle et assurent des fonctions essentielles (locomotion, respiration, métabolisme, etc.). Ils ont une capacité remarquable à se régénérer après blessure, notamment via l’intervention de cellules souches spécialisées. Cependant, ces capacités de maintien et de régénération sont amoindries en cas de pathologies telles que les dystrophies musculaires, affectant grandement la qualité de vie des patients voire leur espérance de vie. Il est donc essentiel de comprendre les mécanismes qui contrôlent la prolifération, différentiation et auto-renouvèlement des cellules souches musculaires en conditions normales, ainsi que leur dérégulation en conditions pathologiques. La régénération musculaire est un processus dynamique complexe faisant intervenir de nombreux types cellulaires différents (cellule souches, cellules immunitaires, cellules interstitielles, fibres musculaires, etc.). Cependant, nos connaissances actuelles proviennent de modèles in vitro ou d’analyses statiques in vivo, qui ne reflètent que partiellement la dynamique in vivo. Notre projet vise donc à caractériser la dynamique des cellules souches musculaires et leurs interactions avec leur microenvironnement par imagerie dynamique in vivo directement chez l’animal vivant, en conditions normales et dystrophiques (modèle de myopathie de Duchenne). Pour cette étude, il est essentiel de recourir à des modèles murins génétiquement modifiés qui nous permettent de marquer et suivre spécifiquement les cellules souches et autres cellules musculaires pour comprendre leurs dynamiques et leurs interactions. Nos analyses seront réalisées in vivo car aucun système in vitro ne permet à ce jour de reproduire fidèlement les conditions dynamiques et complexes d’un tissu en cours de régénération.
Bénéfices attendus
Les capacités de maintien et de régénération des muscles squelettiques sont amoindries en cas de pathologies telles que les dystrophies musculaires, affectant grandement la qualité de vie des patients voire leur espérance de vie. Il est donc essentiel de comprendre les mécanismes qui contrôlent la prolifération, différentiation et auto-renouvèlement des cellules souches musculaires en conditions normales, ainsi que leur dérégulation en conditions pathologiques. En visant à caractériser la dynamique des cellules souches musculaires et leurs interactions avec leur microenvironnement par imagerie directement in vivo en conditions normales et dystrophiques (modèle de myopathie de Duchenne), notre projet apportera des informations nouvelles sur les mécanismes cellulaires de la régénération musculaire et de ce fait, des informations essentielles pour les thérapies à développer en cas de myopathies.
Procédures
Le projet comporte une seule procédure, qui regroupe en tout quatre injections sous-cutanées (quelques secondes), un acte chirurgical (sous anesthésie, une heure), cinq injections intragastriques (gavage, quelques secondes, une fois par jour sur 5 jours), une injection intrapéritonéale (quelques secondes), une injection intramusculaire (quelques secondes, sous anesthésie gazeuse 30 minutes), et une session d’imagerie sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse, 8 - 10 heures) avant mise à mort.
Impact sur les animaux
Nous veillerons dans nos expériences à impacter le moins possible le bien-être des souris. À la suite de la chirurgie permettant l’installation de la fenêtre d’observation, des douleurs post-opératoires et une perte de poids peuvent apparaitre dans la semaine suivante. La blessure musculaire par injection de toxine peut induire une boiterie pendant une heure. L’imagerie en elle-même est indolore mais nécessite une anesthésie générale pour permettre la contention de l’animal.
Devenir
La procédure s’achève par une session d’imagerie longue (8 – 10 heures) sous anesthésie gazeuse profonde. Bien que le réveil des animaux soit en théorie possible, nous n’avons pas d’expérience sur ce point et ne pouvons pas anticiper leur état après réveil. Nous ne pouvons ainsi pas garantir le bien-être des animaux qui seraient ainsi réveillés. Tous les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Les cellules souches musculaires peuvent être cultivées in vitro, seules ou avec d’autres cellules musculaires. Cependant, il n’existe actuellement pas de système in vitro suffisamment élaboré pour rendre compte de la dynamique cellulaire existant in vivo lors de la régénération musculaire. Par ailleurs, les cellules souches musculaires perdent rapidement leurs capacités souches in vitro, soulignant l’importance du microenvironnement tissulaire. Ce projet vise à déterminer cette dynamique et complexité cellulaire in vivo en contextes normal et pathologique. Le recours à l’animal est donc ici essentiel et ne peut être remplacé.
Réduction
Les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en tenant compte de notre expérience, - en fonction de la nature de l'expérience et des paramètres mesurés, - de la variabilité de ces paramètres, - de façon à produire des résultats interprétables, permettant d'atteindre une signification statistique (tests : comparaison de deux moyennes sur données appariées). Par ailleurs, des schémas de reproduction des souris transgéniques sont réalisés afin d’obtenir efficacement les cohortes de souris appropriées.
Raffinement
Les animaux sont manipulés le moins possible et un suivi régulier des animaux inclus dans le projet selon leur état général de santé est prévu. Pour l’installation de la fenêtre d’imagerie, les animaux seront opérés dans une pièce dédiée, calme, bien éclairée, avec peu de passage. Un cocktail analgésique et antibiotique sera injecté en pré-opératoire et post-opératoire. De la nourriture gélifiée est ajoutée dans la cage pour faciliter l’accès de l’animal à la nourriture après la chirurgie. Les cages sont chauffées en post-opératoire (2 heures après réveil) pour limiter l’hypothermie éventuelle des animaux. Les animaux sont placés sur une litière douce (cellulose) pendant une semaine après la chirurgie pour limiter l’irritation de la zone opérée. L’effet local de l’injection intramusculaire de toxines peut être une paralysie transitoire du muscle injecté. Au réveil de l’anesthésie, l’animal présente une boiterie transitoire (
Choix des espèces
L’utilisation de la souris repose sur plusieurs critères : • Les souris sont des petits Mammifères. Ils partagent donc de nombreuses similarités avec l’homme. • Elles constituent un modèle très maîtrisé par l’ensemble des équipes de recherche. • Leur temps de génération est court et les effectifs des portées élevés, ce qui permet d’avoir rapidement accès à un grand nombre d’animaux. • De nombreuses lignées existent (souris génétiquement modifiées) pour étudier les acteurs de la régénération musculaire. • Modèles de pathologies humaines : l’accès à des souris « modèles de pathologies humaines » que nous étudions est un avantage considérable pour développer des thérapies (ex : souris mutante « mdx » comme modèle de la myopathie de Duchenne). Nous utiliserons des adultes de plus de 8 semaines. La myopathie de Duchenne se manifeste par une dégénération/régénération chronique du muscle, bien établie et donc facilement observable chez des souris modèle « mdx » (modèles de la pathologie) adultes de plus de 8 semaines.
Repositionnement d’une molécule vasodilatatrice en association avec une radiothérapie focale et du témozolomide sur la progression tumorale et l’hypoxie dans des modèles murins de xénogreffes de glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
64 souris privées de système immunitaire reçoivent chacune une greffe de cellules de glioblastome humain directement dans le cerveau, au cours d'une chirurgie de trente minutes. S'ajoutent trois injections de chimiothérapie sur trois jours consécutifs, trois séances d'irradiation de 4 Gy, des IRM de suivi et, pour 48 d'entre elles, jusqu'à vingt-cinq injections de la molécule testée sur cinq semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les souris dont la tumeur se développe, ainsi qu'une dégradation de l'état général après l'irradiation du cerveau, avec sécrétions au museau et pelades sur la tête. Ces mêmes signes constituent les points limites du protocole, leur apparition déclenchant la mise à mort de l'animal, et le porteur annonce avoir adapté le suivi pour éviter d'y arriver.
Objectifs
L'étude a les objectifs suivants : • Déterminer l'efficacité in vivo de la molécule vasodilatatrice en présence de radiochimiothérapie en tant que composé candidat dans deux modèles de xénogreffes murines de glioblastome humain, déterminée par la survie des animaux et la charge tumorale. • Déterminer l'effet de la molécule vasodilatatrice sur l'hypoxie tumorale telle que déterminée par immunomarquage, afin de déterminer si elle peut augmenter la sensibilité tumorale aux rayonnements ionisants.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles sur le glioblastome (RT+CT)
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, 64 animaux sont concernés. - Injection intrapéritonéale de la chimiothérapie(animal vigile) : 3 fois sur 3 jours consécutifs ; 5 minutes maximum par animal, 64 animaux sont concernés. - Injection intrapéritonéale de la molécule (animal vigile) : 5 fois consécutifs par semaine pendant 5 semaines post radiothérapie au maximum ; 5 minutes maximum par animal, 48 animaux sont concernés. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy sur 3 jours consécutifs : 10 minutes maximum par animal, 64 animaux sont concernés. - Injection sous-cutanée de buprénorphine (animal vigile) : 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux ; 2 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés. - Imagerie IRM pour suivi de croissance tumorale
Impact sur les animaux
Suivant l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de tumeur. Toutefois, ces critères représentent les points limites de l’étude et ainsi, si l’un ou plusieurs de ces éléments apparaissaient, alors les animaux seraient mis à mort. Nous nous attendons également à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale jusqu’à une semaine après l’irradiation. Nous avons adapté en conséquence le suivi des animaux, le raffinement des conditions expérimentales et le scoring afin d’anticiper et d’éviter l’exclusion des animaux par atteinte de points limites.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de récupérer différents organes pour analyses post-mortem.
Remplacement
Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la croissance tumorale. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux différents traitements. Dans ce projet, nous nous intéressons aux phénomènes de vasodilatation, impossibles à appréhender in vitro.
Réduction
L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est, dans ce cas, son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. . Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous estimons qu’au minimum, 12 animaux par groupe au départ sont nécessaires afin de réaliser des tests statistiques puissants , et ainsi comparer les effets des différents traitements et ce, en fonction du temps. Ces 12 animaux sont calculés sur la base d’un test de puissance connaissant la variabilité intrinsèque des modèles tumoraux (environ 25%) basés sur nos travaux antérieurs et en espérant une valeur statistique de 5% pour une puissance de 80%. De plus, 4 animaux par groupe sont nécessaires pour évaluer le niveau d’hypoxie cérébral juste après la RT par une étude immuno-histochimique.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (4 souris par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et bénéficieront également d’enrichissement (roue d’activité, stimulation sensorielle par différents objets). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement pendant les phases critiques (implantation, irradiation) et 3 fois par semaine par la suite. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. Il est à noter que les animaux étant immunodéprimés, ils sont placés dans des cages ventilées individuellement par des portoirs spécifiques (portoirs Innovive), ces deniers étant eux-mêmes dans une zone spécifique et dédiée à la manipulation des animaux immunodéprimés pour la recherche en cancérologie.
Choix des espèces
La souris immunodéprimée est une espèce de choix pour évaluer l’évolution du volume tumoral dans le temps dès lors que les cellules tumorales utilisées sont d’origine humaine. Notre expertise des différents modèles de tumeurs cérébrales, nous a permis d’établir que suivant le type cellulaire, nous obtenons des tumeurs plus ou moins hypoxiques et plus ou moins vascularisés. Ces deux composantes, influençant la croissance tumorale et l’efficacité des traitements actuels, il est nécessaire de travailler avec ces différents modèles in vivo, afin de se rapprocher de la situation clinique. 3.4.11. Indiquez à quels stades de développement les animaux seront utilisés et le justifier : L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 12 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expérimentaux utilisés.
Evaluation d’un nouveau modèle de souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Deux injections intrapéritonéales par jour pendant cinq jours, puis une prise de sang terminale sous anesthésie : 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour que leurs organes soient analysés. Le gène modifié n'est jamais nommé, ni la drogue qui déclenche son extinction dans un organe choisi. Les souris sont examinées à trois, quatre et cinq mois par le test SHIRPA, qui note leur apparence, leur poids, leurs réflexes et leurs sens. Le porteur écrit que la suppression complète de ce gène provoque un placenta anormal et un retard de croissance qui empêchent l'embryon de survivre, et affirme par ailleurs ne pas s'attendre à un phénotype dommageable chez ces animaux.
Objectifs
Ce projet vise à étudier un nouveau type de souris dont un gène a été modifié. Ce gène est essentiel pour le développement normal des souris avant la naissance. Quand ce gène est complètement éliminé, il cause des problèmes comme un placenta anormal et un retard de croissance, ce qui empêche l'embryon de survivre. Pour mieux comprendre ce gène, nous avons créé un modèle où le gène peut être désactivé uniquement suite à l’administration d’une drogue, spécifiquement dans un organe donné, lorsque nous le décidons.. Nous examinerons les souris à 3, 4 et 5 mois en utilisant un test appelé Shirpa, qui nous aidera à évaluer leur apparence, leur poids, leurs réflexes et leurs sens. Enfin, à la fin de l'étude, nous prendrons un échantillon de sang pour réaliser des analyses biochimiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de progresser dans notre connaissance des gènes étudiés en recherche préclinique. Les données générées mettront en évidence d'éventuels phénotypes physiques ou neurologiques chez ces animaux, ainsi que des pistes thérapeutiques potentielles qui pourront être utilisées pour le développement de nouveaux candidats-médicaments dans le cadre des pathologies liées à ce gène. À plus long terme, ces données pourront contribuer au développement de médicaments pour l’Homme.
Procédures
Nous allons réaliser des injections intrapéritonéales chez ces animaux 2 fois par jour pendant 5 jours, cette injection dure quelques minutes. Un prélévement sanguin terminal sera également réalisé.
Impact sur les animaux
Durant ce projet, les animaux recevront deux injections intrapéritonéales par jour pendant 5 jours, ce qui peut induire un certain inconfort. Chaque injection dure quelques minutes et n’affecte pas le bien-être des animaux pendant plus d’une heure. En fin de protocole, les animaux subiront un prélèvement de sang terminal sous anesthésie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédire afin d'analyser les différents organes.
Remplacement
Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la modification génétique d'un gène sur le phénotype physique et neurologique de l'animal. Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Par ailleurs, seule une approche basée sur un mammifère permet de collecter des données initiales concernant les mécanismes physiologiques. Ces données fournissent de nombreuses informations qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle, afin de mieux comprendre la physiologie humaine.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons effectué des analyses permettant de calculer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 10 animaux par groupe constitue un bon compromis entre la puissance d'analyse et la réduction du nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données paramétriques (poids, nombre de redressements, analyses biochimiques) qui seront analysées à l'aide de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Dans le cadre des procédures expérimentales, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress des animaux. Une surveillance quotidienne de leur état, une pesée hebdomadaire, ainsi qu'un suivi régulier de leur état général seront mis en place pour garantir leur bonne santé. Par ailleurs, nous nous engageons à offrir les meilleures conditions d'hébergement possibles, avec un enrichissement adéquat. Ils disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi (nids en quantité suffisante, bâton et balles à ronger). En cas de conflit entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et, si nécessaire, procéderons à des soins locaux. Tout au long des procédures, des seuils limites spécifiques seront établis pour assurer que les animaux demeurent dans des conditions éthiquement acceptables et pour réagir de manière appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être. Nous ne pensons pas que les animaux présenteront un phénotype dommageable car nous avons précédemment réalisé une validation de ce modèle génétique, et les animaux n’ont pas montré de signes physiques.
Choix des espèces
La souris est l’animal modèle de choix pour une première étude de la fonction d’un gène présent chez les mammifères. Elle permet notamment un accès facile à l’ingénierie génétique. Notre étude implique des analyses physiologiques et neurologiques qui nécessitent l’organisme entier et ne peuvent pas être réalisées in vitro. Nous réceptionnerons les animaux à l'âge de 6 semaines, et le traitement commencera à l'âge de 9 semaines. Les tests comportementaux seront effectués à 1, 2 et 3 mois après de début du traitement.
Etude du rôle des plaquettes dans l’insuffisance cardiaque (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une mortalité de l'ordre de 20 % est attendue pendant la chirurgie qui resserre l'artère en sortie du cœur, puis de 5 % pendant le développement de l'insuffisance cardiaque qui s'ensuit. 1 260 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour que leur cœur et leur sang soient analysés. L'opération dure une trentaine de minutes, l'artère est exposée puis rétrécie, et l'évolution de la maladie est suivie chaque semaine par échographie sous anesthésie, dans un second établissement rejoint à pied. L'effectif de 1 260 souris est rapporté à la littérature du domaine et à l'expérience de l'équipe, sans que le calcul soit détaillé.
Objectifs
Cette demande d'autorisation concerne deux laboratoires (EU1 et EU2). L'insuffisance cardiaque est une pathologie évolutive au cours de laquelle le cœur perd progressivement sa capacité à pomper correctement le sang, avec un essoufflement qui apparaît chez les sujets atteints d'abord à l'effort puis au repos. Cette maladie s’installe progressivement le plus souvent suite à la survenue d'un infarctus du myocarde, ou bien en raison de l'hypertension artérielle ou d'un rétrécissement aortique. Elle est due à un changement de morphologie du cœur qui doit s'adapter à de nouvelles contraintes, et qui finit par s'épuiser. Notre étude porte sur l'étude du rôle des plaquettes sanguines dans l'évoluton de cette maladie. Pour ce faire, nous allons utiliser un modèle d'insuffisance cardiaque qui est bien décrit chez la souris, et qui permet d'induire la maladie en quelques semaines. Nous appliquerons dans une 1ère partie ce modèle à des souris modifiées génétiquement chez lesquelles différents déterminants de surface des plaquettes ont été modifiés. En comparant ces souris à des souris non modifiées génétiquement, nous pourrons déterminer si un ou plusieurs de ces déterminants est important dans l'évolution de la maladie du cœur. Dans une 2ème partie, en fonction des données obtenues dans la 1ère, nous testerons différents traitements pharmacologiques susceptibles de freiner le développement de la maladie chez les souris. L'objectif de ce projet est de trouver de nouvelles approches thérapeutiques qui permettrait de traiter l'insuffisance cardiaque.
Bénéfices attendus
Il n'existe actuellement pas de traitement curatif contre l'insuffisance cardiaque. Nous souhaitons par ce projet mieux comprendre l'évolution de cette maladie afin de trouver une nouvelle cible thérapeutique qui permettrait de la combattre. Si un ou plusieurs des déterminants de surface plaquettaire s'avère(nt) être une (des) cible(s) potentielle(s) (Partie 1), nous testerons alors des traitements pharmacologiques dont nous disposons et qui sont capables de les bloquer (Partie 2). Nos résultats pourraient par conséquent s'avérer être bénéfiques à la santé humaine.
Procédures
Tous les gestes techniques sont réalisés sur des animaux analgésiés et anesthésiés à l'aide d'une anesthésie gazeuse. La veille de l'intervention chirurgicale, un prélèvement sanguin (1 min) est prévu ainsi qu'une session d'épilation de la zone opérée. Un prélèvement sanguin final est prévu également au moment de l'euthanasie des animaux. La chirurgie dure environ 30 minutes. Elle consiste en l'exposition de l'artère en sortie du cœur et en son rétrécissement (20 min). L'animal est ensuite recousu (10 min). L'évolution de la pathologie cardiaque est suivie chaque semaine par imagerie en échographie sur les animaux anesthésiés (5 min). Les interventions ont lieu au sein du premier laboratoire (EU1), à l'exception du suivi échographique qui est quant à lui effectué dans les locaux du deuxième (EU2).
Impact sur les animaux
Une certaine mortalité est attendue lors de la chirurgie induisant l'insuffisance cardiaque, estimée de l'ordre de 20%, puis au cours du développement de la maladie (5%). Les autres effets indésirables prévus sur les animaux sont : - une douleur post- opératoire à J0 et pendant 24h - une perte de poids post-opératoire (modérée) - un stress occasionné par les séances d'imagerie
Devenir
Les animaux arrivant à la fin de la procédure sont euthaniasiés afin de pouvoir analyser leur cœur. Nous étudions également leur sang pour analyser des marqueurs de la maladie cardiaque qui peuvent s'y trouver en circulation.
Remplacement
La maladie que nous étudions est complexe et fait intervenir un grand nombre de paramètres différents (inflammation, modification de la paroi cardiaque, dialogue avec d'autres organes comme les poumons et les reins). Il n'est aujourd'hui pas possible de mimer ces phénomènes autrement qu'en utilisant des animaux vivants dont la physiologie est proche de celle de l'être humain.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grâce aux données disponibles dans la littérature du domaine et à notre expérience des modèles animaux. Des tests statistiques permettant de connaître le nombre de souris minimal nécessaire ont aussi été réalisés.
Raffinement
Une grille de score a été mise en place, nous permettant d'agir en cas de souffrance des animaux. Les animaux qui dépassent les points limites que nous avons définis sont euthanasiés. La douleur post-opératoire ou potentiellement occasionnée par les prélèvements sanguins est évaluée et traitée préventivement par l'administration d'un anti- douleur. De la nourriture humide est placée au sol dans leur cage afin de faciliter la prise de nourriture et l'hydratation après la chirurgie. Chaque jour, les animaux sont pesés et leur apparence générale est contrôlée. Du coton est placé dans leur cage pour leur permettre de faire des nids. Le transport des souris entre les deux établissements dure 5 minutes à pied et se fait dans leur cage qui est placée dans un sac de transport.
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont le système cardiovasculaire a un fonctionnement et une organisation très proches de ceux de l'être humain. Ce système est mature lorsque la souris est adulte (à environ 8-10 semaines), raison pour laquelle nous utiliserons des animaux de cet âge, la maladie touchant des êtres humains d'âge adulte. Le patrimoine génétique de la souris est par ailleurs connu depuis de nombreuses années et nous avons à notre disposition des souris modifiées génétiquement qui ne produisent pas un certain nombre de molécules d'intérêt, ce qui permet d'étudier leur rôle (partie 1 du projet), comparativement aux souris qui la produisent normalement. D'autre part, des souris qui ne sont pas modifiées génétiquement seront utilisées dans le cadre du test de nouvelles approches thérapeutiques (partie 2 du projet).
Etudes précliniques : effets de divers composés sur l’activité neuronale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 400
Pour vendre aux entreprises pharmaceutiques la mesure de l'effet de leurs composés sur l'activité électrique des neurones, 800 souris et 400 rats vont être utilisés. 900 d'entre eux sont anesthésiés et tués avant tout réveil, les 300 autres subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous sont mis à mort pour que leur cerveau soit collecté. Ceux qui entrent dans la seconde catégorie reçoivent une injection intrapéritonéale par jour pendant dix jours, et ceux dont l'étude exige des animaux anxieux ou stressés sont immobilisés de force trente minutes. Les composés restent désignés comme "divers composés" et les entreprises qui les commandent ne sont pas nommées.
Objectifs
Dans le cadre de la mise sur le marché d’un composé pharmaceutique, il est obligatoire de réaliser des études précliniques réglementaires sur l’animal avant son administration chez l’Homme. Il est en effet nécessaire de connaitre les organes cibles et les doses toxiques d’un candidat médicament de manière à réduire au maximum les risques liés aux premières expositions humaines lors des phases cliniques. Les neurosciences représentent un important domaine de recherche pour les entreprises pharmaceutiques. Elles regroupent l’étude de nombreuses pathologies affectant des centaines de millions d’individus dans le monde, chiffre qui ne cesse d’augmenter du fait du vieillissement de la population. Nous proposons nos services aux entreprises pharmaceutiques développant des composés thérapeutiques pour les pathologies touchant le système nerveux central. Nous intervenons lors de la phase préclinique, notamment pour déterminer l’effet des composés candidats (toxicité, efficacité, dosage etc.). Pour cela nous allons étudier l’activité électrique des neurones. Le but du projet est de déterminer l’effet, de composés pharmacologiques sur des tissus nerveux.
Bénéfices attendus
- Validation de candidat médicament impliqués dans le traitement de troubles du système nerveux central chez l’humain. -Réduire au maximum les risques liés aux premières expositions humaines lors des phases cliniques. -Détermination des mécanismes d’action des composés sur des neurones.
Procédures
Dans certaines expériences, les animaux pourront recevoir une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 10 jours, avant de réaliser l'étude. Dans le cas où l’étude réalisée nécessitent des modèles d’animaux anxieux/stressés, les animaux seront exposés à un stress via une contention de 30 minutes
Impact sur les animaux
Pour les expériences nécessitant une injection in vivo, la piqure d'aiguille pour l’injection intrapéritonéale (50 microlitre) entraîne une douleur légère de courte durée, répétée quotidiennement pendant 10 jours. Pour les expériences de stress, les animaux subiront une contention unique de 30 minutes induisant un stress physique léger.
Devenir
L’intégralité des animaux sont mis à mort afin de collecter le cerveau.
Remplacement
Afin de limiter le recours à l’expérimentation animal, l'étude de l'activité électrique des neurones de rongeurs pourra être couplée à une étude sur des cultures de cellules humaines. Cependant si cette méthode permet de réduire le nombre d’animaux utilisés, elle ne peut pas se substituer totalement aux expérimentations menées sur l’animal lors de la validation du candidat médicament. En effet, ces méthodes alternatives conservent un caractère réducteur et ne permettent pas d’appréhender l’effet d’un composé sur un réseau de neurones contenant tous les types cellulaires et circuits pertinents pour les études.
Réduction
Les études réalisées nécessitent l’utilisation d’un nombre minimal d’animaux pour être pertinentes d’un point de vue statistique et donc scientifiquement acceptable. Du fait de la variabilité entre les animaux, un minimum de 3 animaux par ensemble de données sera nécessaire, provenant de portées différentes. Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires, les portées seront utilisées pour plusieurs projets, chacun nécessitant des animaux de différentes portées, et 6 à 10 cellules au total seront analysées pour chaque condition afin d’obtenir des résultats suffisamment robustes statistiquement.
Raffinement
Les mesures classiques de bien-être des animaux seront appliquées au cours de leur vie dans l’animalerie par un personnel qualifié et sous la surveillance des vétérinaires. Les animaux sont en cages collectives et bénéficient d’un enrichissement adapté (matériel de nidification, barre à ronger,....), dans un environnement dont l'ambiance est régulée et suivis quotidiennement. Lors de la contention visant à induire un stress chez l’animal, le personnel qualifié et expérimenté prendra soin de ne pas appliquer de pression excessive et de ne pas blesser l’animal. Pour les injections, les animaux seront suivis quotidiennement avec un certaines nombres de critères à surveiller (comportement, poids...). Dans le cas où les points limites seraient atteints, les animaux seront sortis de la procédure.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est actuellement l’organisme-modèle le plus utilisé en recherche biomédicale. Les différents systèmes de son organisme présentent une organisation et une régulation proches de celles de l’homme. Le séquençage complet du génome de la souris, a démontré la proximité phylogénétique des souris et des hommes : 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Le développement des outils de transgenèse ont permis de créer de nombreux mutants de type knock-in ou knock-out et ainsi de nombreux modèles de maladies neurodégénératives ont pu être développé (Alzheimer, Parkinson…). Enfin, les souris peuvent présenter certains troubles neurologiques identiques à l’Homme comme par exemple des troubles liés à l’anxiété, ce qui en fait un bon modèle pour les études précliniques dans le domaine des neurosciences. Le rat (Rattus norvegicus) est également couramment utilisé en recherche biomédicale. Il présente l’avantage, par rapport à la souris, d’être plus proche physiologiquement de l’homme, ce qui confère aux résultats obtenus une meilleure performance translationnelle. Sa neuroanatomie est proche de celle de l’homme en termes de fonction des territoires cérébraux et de connectivité ce qui fait du rat un modèle de choix pour tester l’efficacité ou la toxicité de molécules avant de passer aux essais pré-cliniques chez l’homme. Selon les besoins des projets et des pathologies étudiées, les animaux pourront être utilisés du stade néonatal à adulte (jusqu’à 18 mois).
Repositionnement de molécules thérapeutiques dans des modèles murin de la Dystrophie Myotonique de type 1
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Nourries pendant quatre à huit semaines avec un régime qui déclenche chez elles une myotonie et une faiblesse musculaire, 832 souris reçoivent ensuite jusqu'à vingt injections intrapéritonéales en quatre semaines, sur animal vigile. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger et toutes les souris sont tuées à l'issue. Le porteur écrit que la myotonie et la baisse générale d'activité provoquées par ce régime "ne sont pas dommageables pour ces souris". Il présente la mise à mort comme "strictement nécessaire" pour prélever trois muscles de la patte, le diaphragme et le cœur de chaque animal.
Objectifs
La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est une maladie génétique causée par l’élongation anormale d’une séquence répétée (CTG). Cette maladie touche tout l’organisme mais est particulièrement caractérisée par une myotonie (défaut de relaxation musculaire), une faiblesse musculaire progressive, des troubles cardiaques et cognitifs. Au niveau cellulaire, les ARN messagers mutés vont s’accumuler dans le noyau des cellules sous forme d’agrégats (appelés foci) et induire des dérégulations moléculaires à l’origine des symptômes chez les patients. Ainsi, une protéine a été identifiée comme l’acteur moléculaire majeur dans cette maladie en conduisant à des dérégulations dont certaines ont été associées à des symptômes cliniques, provoquant notamment le défaut de relaxation musculaire suite à une contraction volontaire. Actuellement il n’existe pas de traitement pour cette maladie. Une approche pharmacologique par le repositionnement de médicaments déjà approuvés par les agences réglementaires et / ou déjà utilisés chez l’homme est envisageable. Ainsi, les résultats d'un criblage utilisant des médicaments utilisés dans d’autres maladies a permis d'identifier des petites molécules capables de réduire la formation de foci ou d’augmenter le niveau de protéines d'intérêt dans les cellules de patients et, finalement, de corriger les défauts moléculaires de la maladie.
Bénéfices attendus
La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est la maladie musculaire la plus fréquente chez l’adulte (1 personne sur 8000 en moyenne au niveau mondial). Cette pathologie est très invalidante et ne touche pas identiquement chaque patient. Chez les patients, le degré d’atteinte est corrélé à des tailles différentes de mutations. Actuellement Il n’y a encore aucun médicament pour cette maladie. L’attente des patients pour un traitement ciblé est donc très forte. L’objectif principal de ce projet est l’identification et l’évaluation de composés thérapeutiques par repositionnement de molécules déjà utilisées et validées dans d’autres maladies qui permettraient une amélioration des symptômes spécifiques à la DM1 dans les modèles murins, pour ensuite passer à des essais chez l’homme. Le repositionnent de ces molécules pourraient bénéficier rapidement à l'ensemble des patients atteints de la DM1.
Procédures
Certains animaux seront soumis à un régime alimentaire spécial pendant 4 à 8 semaines (animal vigil, prise alimentaire spontanée). Tous les animaux subiront une injection par voie intra-péritonéal à raison de 5 fois par semaines pendant 4 semaines (animal vigil, 20 injections maximum). L'injection ne depassera pas 30 secondes.
Impact sur les animaux
Le régime alimentaire spécial donné aux souris génétiquement modifiées induira un phénotype tel que la myotonie (défaut momentané de relaxation musculaire après une contraction) et de la faiblesse musculaire provoquant une baisse générale d'activité. Ces phénotypes ne sont pas dommageables pour ces souris. Les injections en intrapéritonéales étalées sur 4 semaines pourraient induire une légère douleur au point d’injection et un stress léger lors des manipulations, tout comme la contention nécessaire à l’injection ou les manipulations lors des mesures du poids effectuées deux fois par semaines à partir du début des injections Les différents traitements sont connus, mais pourraient avoir des effets indésirables dans de rare cas tels que des diarrhées ou une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux qui entreront dans ce projet seront euthanasiés à la fin de la procédure à laquelle ils seront associés. En effet, dans le cadre de l'évaluation d'approches thérapeutiques comme celles décrites dans ce projet, nous devons vérifier la correction des symptômes moléculaires au niveau des tissus cibles. Dans le cas du modèle murin de Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) que nous allons utiliser, nous devons vérifier l'efficacité de notre traitement au niveau des muscles squelettiques (nous analysons généralement 3 muscles par souris : tibial antérieur, gastrocnémien et quadriceps, mais aussi le diaphragme et le coeur) ce qui rend strictement nécessaire l’euthanasie en fin de procédure afin de prélever les organes. Ces marqueurs moléculaires sont très spécifiques à la maladie et corrèlent très bien avec l'état de sévérité et donc également avec l'efficacité du traitement.
Remplacement
Dans un objectif de REMPLACEMENT, une sélection in vitro des composés thérapeutiques dans des modèles cellulaires de la maladie (Dystrophie Myotonique de Type 1 ou DM1) sera effectuée avant toute utilisation dans un organisme vivant. Cependant les modèles in vitro de cellules musculaires restent imparfaits puisqu’ils ne reproduisent pas le contexte tissulaire adulte de la fibre musculaire qui est une cellule hautement spécialisée et différenciée. L’évaluation in vivo de l’efficacité des différents composés thérapeutique nécessite d’avoir recours à des modèles de souris transgéniques qui expriment la mutation humaine DM1 et reproduisent la pathologie au niveau moléculaire et surtout physiologique. Ainsi, seuls les composés montrant une forte efficacité sans effet délétère seront injectés en intra-péritonéale dans deux modèles de souris de la DM1 présentant des tailles de répétitions différentes.
Réduction
Pour ce projet, un maximum de 832 animaux sera utilisé, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront réalisés pour permettre l'interprétation fiable des résultats. Afin de REDUIRE et d’optimiser le nombre d’animaux, le protocole d’étude a été développé pour utiliser tous les animaux issus des croisements (sans distinction de sexe). Les souris n’ayant pas le génotype d’intérêt seront utilisées comme contrôles négatifs dans les différentes expériences. De plus, le protocole est établi de manière à ce que chaque animal testé permette d’obtenir le plus de résultats possibles en physiologie, biologie moléculaire, histologie et ce, sur plusieurs tissus.
Raffinement
Enfin, dans le but RAFFINER le protocole et, en conformité avec la réglementation, toutes les précautions seront prises afin de réduire à son maximum le stress et la souffrance animale. L’entretien des souris ainsi que les différents protocoles expérimentaux seront assurés par du personnel qualifié et le bien-être des animaux est amélioré par la mise en place d’un enrichissement de milieu. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température, d’hygrométrie et d'éclairage sont conformes à la réglementation et sont contrôlées quotidiennement. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'hébergement individuel est évité au maximum. La myotonie étant induite pour un stimuli extérieur, et dans le but de réduire la souffrance et le stress des animaux, une habituation aux gestes de contention et d’injection sera faite avant le début des injections. Une attention particulière sera apportée sur la manipulation douce des cages et des animaux lors des contentions et injections successives. Enfin, un suivi du bien-être des animaux et des points limites seront réalisés quotidiennement. En cas d’effet indésirables observés tel que des diarrhées, l’apport d’aliment et de gelée d'hydratation dans la cage sera effectué.
Choix des espèces
Différents modèles ont été décrit pour l’étude de la Dystrophie Myotonique. Seuls les modèles murins montrent des symptômes robustes similaires aux patients. L’utilisation de ces modèles permettra de valider le repositionnement de molécules thérapeutique dans tous les tissus affectés par la mutation. Les modèles utilisés dans ce projet ne sont pas à phénotype dommageable, la myotonie étant induise par l'alimentation uniquement. Pour ce projet, les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 6 semaines) afin que les tissus soient bien développés et que la croissance soit terminée.
Greffes de substituts cutanés bio-ingéniés chez la souris immunodéficiente
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Dépourvues de système immunitaire pour que les greffons humains ne soient pas rejetés, 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un carré de peau de 20 mm de côté leur est retiré sur toute l'épaisseur au milieu du dos, un substitut cutané est suturé dans la plaie, et les pansements sont changés deux fois par semaine sous anesthésie générale. Le porteur attribue un stress à l'isolement en cage individuelle pendant trois à quatre semaines, isolement qu'il impose pour éviter que les souris ne s'arrachent entre elles les greffons. Elles sont tuées par groupes de six, quinze, trente, soixante, quatre-vingt-dix et cent vingt jours après la greffe, pour prélever la peau autour de la zone greffée.
Objectifs
L’objectif de notre projet est d’évaluer la fonctionnalité de différents substituts cutanés afin de sélectionner les formulations qui permettront de favoriser la régénération du tissu cutané, la revascularisation et la repigmentation au cours du temps après réalisation d’une greffe cutanée. Ce projet est la suite de projets précédemment autorisés au cours desquels nous avons évalué les premiers substituts cutanés sur 3 modèles de plaie cutanée différents. Les substituts cutanés sont obtenus à l’aide de la première machine automatisée au monde à produire des greffes de tissu cutané personnalisées pour les adultes et les enfants présentant des lésions cutanées graves, telles que des brûlures profondes. Ce processus innovant implique la croissance d’une nouvelle peau en utilisant les propres tissus de l’organisme comme modèle. Ces substituts cutanés, produits à partir de prélèvements de peau de différents donneurs (enfant, adulte, homme, femme, peau claire, peau sombre), et sélectionnés sur la base de résultats d’analyses préalables, seront greffés sur des souris immunodéficientes afin d’éviter le rejet des greffes, après induction d’une plaie cutanée sur toute l’épaisseur de la peau. Les nouveaux substituts cutanés seront préparés à partir de cellules de peau jeunes, moyennement âgées et très âgées, avec une seule ou plusieurs couches de cellules, et comprenant ou non des cellules pigmentées. Des prélèvements seront effectués à différents temps après réalisation des greffes de substituts cutanés afin d’étudier la fonctionnalité des différents substituts cutanés greffés, les interactions se mettant progressivement en place entre les substituts cutanés et l’environnement de l’hôte, le développement d’un réseau vasculaire, la régénération du tissu cutané à partir du greffon lors de la cicatrisation, et la repigmentation du tissu cutané régénéré. Un ensemble d’analyses seront effectués sur les prélèvements cutanés collectés et permettront de caractériser au cours du temps la fonctionnalité des substituts cutanés, d’appréhender les interactions se mettant progressivement en place au cours du temps entre les substituts cutanés et l’hôte, et de suivre l’évolution des substituts cutanés au cours du temps. Les résultats obtenus permettront de déterminer les paramètres optimaux pour obtenir le substitut cutané idéal en fonction de chaque donneur.
Bénéfices attendus
Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. Aujourd'hui, si les auto-transplantations (donneur et receveur sont la même personne) sont les greffes de première intention pour la couverture des plaies, elles se heurtent à l’écueil d’une disponibilité limité de peau, en particulier dans la prise en charge des grandes brûlures et les procédures restent invasives et douloureuses. Des greffes de tissu "étranger" peuvent pourvoir au remplacement temporaire de la peau, avant de laisser la place à une auto-transplantation. Subsiste évidemment les risques de rejet, douleurs et infection, et la formation de cicatrices. La technologie utilisée pour produire les substituts cutanés que nous allons évaluer va permettre de révolutionner les traitements actuellement disponibles pour les lésions cutanées les plus sévères et plus particulièrement les grandes brûlures. Il s’agit d’un processus innovant impliquant la croissance d’une nouvelle peau en utilisant les propres tissus de l’organisme comme modèle, évitant ainsi toute forme de rejet de cette auto-transplantation, et permettant de produire une surface de nouvelle peau très importante. Il est donc important de tester ces nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation de grandes brûlures et de larges plaies cutanées.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation d’une greffe de substitut cutané. Sous anesthésie générale, un prélèvement de peau carré de 20 mm de côté sur toute l’épaisseur de la peau sera effectué au milieu du dos et en arrière des omoplates sur l’ensemble des souris. Un substitut cutané sera placé dans le lit de la plaie cutanée et suturé en plusieurs points indépendants. Un traitement analgésique des souris sera administré avant la chirurgie puis après la fin de celle-ci. La chirurgie sera réalisée en 25 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes de substitut cutané seront protégées par des compresse et pansement changés 2 fois par semaine, sous anesthésie générale pendant 10 minutes environ, permettant d’effectuer des observations et de scorer différents paramètres au niveau des greffes cutanés. Un suivi quotidien de l’ensemble des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations, week-ends et jours fériés inclus. Un maintien des souris greffées en cage individuelle sera nécessaire pendant 3 à 4 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les compresse et pansement et surtout le greffon cutané. Après régénération tissulaire et cicatrisation complètes, 3 à 4 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées, les souris seront replacées à 2 par cage jusqu’à la fin des expérimentations.
Impact sur les animaux
L’induction d’une plaie cutanée pour la réalisation de la greffe cutanée va engendrer une douleur modérée transitoire pendant quelques heures. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées, nécessaire tout au long du processus cicatriciel et de régénération tissulaire, soit pendant 3 à 4 semaines maximum, pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le greffon cutané, et l’ensemble compresse, pansement et bandes de sparadrap, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.
Devenir
Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 600 souris seront euthanasiées à différents temps après réalisation de la greffe cutanée, 15, 30, 60, 90 et 120 jours après, avec 6 souris, 3 souris mâles et 3 souris femelles, par temps de prélèvement. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la région greffée pour réaliser un ensemble d’analyses permettant de caractériser sur des temps précoces et prolongés la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation…).
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation …). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous ne grefferons que des substituts cutanés sélectionnés sur la base de résultats d’analyses préalables. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ainsi, 6 souris par temps de prélèvements, 3 souris mâles et 3 souris femelles, seront suffisants. Ce nombre a été déterminé sur la base des résultats des études précédentes obtenus sur différents modèles de greffe cutanée et suivant les mêmes conditions expérimentales. La réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permettra également de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe cutanée (traitement pour supprimer la douleur avant la chirurgie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (traitement pour supprimer la douleur après la chirurgie et observations régulières). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine à chaque renouvellement de pansement, et si une perte de poids trop importante par rapport au poids maximal est observée ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les animaux seront placés dans des conditions permettant d’observer leur comportement pendant leur phase d’activité et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des bâtonnets de coton seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies à traiter chez l’Homme, et la souche de souris utilisée est dépourvue de système immunitaire, permettant d’éviter les risques de rejet suite à une greffe de peau d’un organisme étranger. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 6-7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7-8 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).
Evaluation de l’effet thérapeutique d’un agent anti-viral combiné à la radiothérapie et à l’immunothérapie
- Recherche appliquée
- Cancers
960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une greffe de cellules tumorales puis jusqu'à seize injections de traitement en deux mois. Elles sont anesthésiées pour être placées dans le dispositif qui irradie la tumeur, et toutes sont tuées pour que tumeurs et tissus soient analysés. L'objectif immédiat est de trouver la dose d'un antiviral, le brincidofovir, qui ralentit la tumeur sans l'éliminer, une dose pleinement efficace empêchant de mesurer l'effet de l'association avec la radiothérapie. Le porteur annonce un "changement radical" dans l'administration des radiosensibilisants. La baisse d'appétit, la réduction d'activité et les modifications du comportement social, elles, sont attendues dès la croissance des tumeurs.
Objectifs
Nous prévoyons d'étudier un agent antiviral, pour lequel des études précliniques ont montré qu'il possède des propriétés anti-tumorales et radio-sensibilisantes. L'immunothérapie est devenue un pilier du traitement du cancer, mais son utilisation en association avec la radiothérapie reste limitée. Le projet actuel vise à explorer la synergie potentielle entre ce médicament anti-viral et l'immuno-radiothérapie. Cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles combinaisons thérapeutiques et conduire à un changement radical dans l’administration concomitante de radio-sensibilisants, qui sont restés depuis des décennies bloqués sur des agents relativement anciens et parfois toxiques tels que les dérivés du platine, générant un gain thérapeutique relativement faible (gains de survie souvent de l’ordre de 5 à 10 % par rapport à la radiothérapie seule). Les objectifs de ce projet consistent à : 1-determiner dans un premier temps la dose de médicament permettant d’obtenir un ralentissement de la croissance tumorale sans toutefois induire une élimination totale de la tumeur. Il est à noter qu’il n’y a aucun intérêt à combiner une dose élevée et très efficace de médicament (permettant une élimination totale de la tumeur) avec la radiothérapie, car ceci empêcherait de voir l’effet de la combinaison. De plus, utiliser une très forte dose de médicament pourrait induire des effets secondaires, 2-ensuite, combiner le médicament avec la radiothérapie et l’immunothérapie afin d’évaluer l’effet anti-tumoral de la combinaison, 3-Enfin, comprendre les mécanismes biologiques impliqués en collectant les tumeurs pour réaliser des analyses de cytométrie de flux.
Bénéfices attendus
A travers ce projet, nous visons à minimiser les limitations des thérapies utlisées seules, à améliorer les résultats thérapeutiques et à augmenter la réponse globale des tumeurs en modulant les réactions immunitaires dans le microenvironnement tumoral. Cette stratégie de traitement à multiples facettes non seulement promet d'améliorer les résultats thérapeutiques actuels mais pourrait également nous conduire à développer de nouvelles stratégies de traitement antitumoral plus efficaces. Avec une conception expérimentale et une analyse des données approfondies, ce projet espère fournir une base solide et de nouvelles perspectives pour optimiser les traitements cliniques futurs tout en réduisant les effets secondaires des thérapies en question.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections de cellules tumorales (n=1, 25 secondes) et à des injections de traitements (au maximum 16 injections sur deux mois, durée 25 secondes), sous anesthésie locale. Les animaux vont recevoir une anesthésie générale afin de les placer dans les dispositifs qui permettent la réalisation des irradiations localisées au niveau des tumeurs (n=1, durée 12 minutes en tout).
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent subir un stress léger en raison de leur manipulation par l'expérimentateur, lors des procédures expérimentales (telles que les injections, etc.). Les animaux peuvent également ressentir douleur et inconfort légers à modérés lors des injections sous-cutanées pour l'implantation des tumeurs, les traitements de radiothérapie ou les traitements pharmacologiques. En raison de la croissance des tumeurs ou des effets secondaires des traitements, les animaux peuvent présenter des changements de comportement modérés, tels qu'une diminution de l'appétit, une réduction de l'activité ou des modifications du comportement social.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour études sur les tumeurs et tissus post-mortem.
Remplacement
Ce projet a pour but d’évaluer l'effet thérapeutique d'un agent antiviral, le brincidofovir, combinés à la radiothérapie et à des immuno-modulateurs sur la réponse tumorale. Ceci exige donc un système immunitaire dynamique complet (composé de toutes les cellules immunitaires) en interaction direct avec le stroma tumoral. L’étude du recrutement et de la réponse des cellules immunitaires dans la tumeur ainsi que leur interaction complexe nécessite le recours à un modèle animal vivant entier et ne peut pas être réalisé in vitro ni in silico.
Réduction
Afin de pouvoir observer des différences qui soient statistiquement interprétables entre les différents groupes de traitements, nous avons besoin d’utiliser des tests statistiques solides et adéquats. Ces tests exigent l’utilisation d’un nombre minimum d’animaux par groupe. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique a priori, afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. De plus, notre expertise dans le domaine de la radiobiologie ainsi que les données de la littérature nous permettent de réduire les conditions expérimentales et donc réduire le nombre d’animaux. Le critère de jugement principal pour le calcul de puissance est la taille tumorale . Ce critère est aussi utilisé pour la randomisation des animaux. La randomisation est réalisée de façon à avoir la même moyenne taille tumorale dans chaque groupe de traitement. Ce plan d'étude et cette méthodologie stricts vont nous permettre d'avoir des résultats fiables et valides sur le nombre minimum d'animaux nécessaires.
Raffinement
Toutes les manipulations expérimentales seront menées en veillant à adhérer aux normes les plus élevées pour minimiser la douleur et le stress chez les animaux. Une anesthésie adéquate sera utilisée pendant les expériences. Les conditions d'hébergement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaire. Leur environnement sera enrichi avec du coton ou des maisons en carton afin de diminuer leur angoisse. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Une pesée sera effectuée régulièrement. Les points limite précoces définis seront strictement appliqués.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et des réponses immunitaires pendant le développement tumoral. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront utilisées à un âge de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures.