Souris

Huit injections d'anticorps en quatre semaines sur animal vigile, après une greffe de cellules de mélanome sous la peau : 352 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour collecter les tissus. La tumeur qui pousse sous la peau peut s'ulcérer, et les injections répétées dans l'abdomen provoquer douleur ou ulcération au point de piqûre. L'objectif est de vérifier chez des souris au système immunitaire intact un anticorps déjà testé chez des souris dépourvues d'immunité, où il n'inhibait que partiellement la tumeur. Le porteur indique que cet anticorps a passé les tests de toxicité et est entré en essai clinique chez l'être humain pour d'autres pathologies.

Objectifs

Le mélanome cutané est un cancer de la peau agressif et malgré le développement de thérapies ciblées et d'immunothérapies. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du mélanome. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du mélanome dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer de la peau. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le cancer de la peau de type mélanome est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologies.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses de mélanomes. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. De même, les injections répétées intrapéritonéales peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8-10 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement

810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection anesthésiante dans l'abdomen précède l'instillation d'un liquide directement dans les poumons, geste répété une seconde fois pour une partie d'entre elles, avec un risque de blessure de la trachée. Certaines reçoivent ensuite une goutte de liquide par le nez six fois en deux semaines, et la croissance des tumeurs pulmonaires peut s'accompagner de difficultés respiratoires. La mise à mort sert à prélever les organes pour analyser le système immunitaire, et le porteur conclut qu'il n'existe "pas d'autre possibilité" que l'animal pour reproduire la réponse immunitaire.

Objectifs

L'élastine est une molécule donnant leur élasticité aux organes. Les poumons, de part leur besoin d'élasticité sont riche en élastine. Quand elle se dégrade des molécules appelées peptides d'élastine se forment et peuvent influencer les cellules du système immunitaire. Au cour de la croissance des tumeurs dans les poumons, beaucoup de peptides d'élastine sont produits. De plus ces peptides peuvent provenir d'un emphysème, c'est-à-dire de la destruction des poumons, qui est présent chez 50 à 60% des patients atteints de cancer des poumons. L'objectif de ce projet est de déterminer comment les peptides d'élastine influencent les cellules du système immunitaires pour les empêcher de combattre les cellules tumorales.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d'acquérir des connaissances supplémentaires sur la façon dont les peptides d'élastine influence le système immunitaire dans le cancer. A plus long terme, ce projet nous permettra de proposer de nouvelles thérapies ciblant les peptides d'élastines.

Procédures

Les souris subiront: Procédure 1 et 3: Une injection dans l'abdomen de produit anesthésiant et une injection d'un petit volume de liquide directement dans les poumons. Procédure 2: Deux injections dans l'abdomen de produit anesthésiant et deux injections d'un petit volume de liquide directement dans les poumons à quelques jours d'écart. Procédure 4: Une injection dans l'abdomen de produit anesthésiant et une injection d'un petit volume de liquide directement dans les poumons. Une semaine après les souris devront absorber une petite goutte de liquide par le nez 3 fois par semaine pendant 2 semaines soit 6 fois.

Impact sur les animaux

L'injection dans l'abdomen peut causer une douleur légère de courte durée. L'injection dans les poumons peut provoquer un inconfort. Dans de rares cas, il peut y avoir une blessure de la trachée qui conduira à l'euthanasie de la souris. La croissance des tumeurs dans les poumons pourrait s’accompagner de difficultés respiratoires. L'administration par le nez peut provoquer un inconfort.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure. En effet, l'analyse du système immunitaire nécessite la mise à mort pour le prélèvement et l'analyse des organes.

Remplacement

Les résultats précédemment publié par la communauté scientifique nous a confirmé qu'il n’existe pas d'autre possibilités que l'animal nous permettant de reproduire les mécanismes biologiques complexes à l’œuvre dans la réponse immunitaire. Notre projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaire au plus juste afin de limiter le nombre de souris.

Raffinement

Les techniques utilisées ont été optimisée dans le laboratoire afin de limiter l'utilisation des animaux. Les souris feront l’objet d’une surveillance rapprochée afin de détecter tout stress et souffrance et d'y pallier. De la naissance à la mort, les animaux seront hébergés dans des conditions optimales incluant un enrichissement.

Choix des espèces

Il n’existe aucun modèle n'utilisant pas les animaux capable de reproduire la complexité de la réponse immunitaire, le recours à l’animal est donc nécessaire. La souris est couramment considérée comme proche de l'humain pour l’étude du système immunitaire. L'utilisation de souris jeunes adulte est indispensable puisque la dégradation des poumons est un processus normal du vieillissement qui pourrait changer nos résultats mais le cancer du poumon que nous étudions est une maladie de l'adulte.

Tester si un probiotique améliore l'absorption intestinale chez l'adulte dénutri suppose de créer la dénutrition. 120 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. 110 d'entre elles subissent une restriction alimentaire de quatorze à trente jours, avec la sensation de faim que le porteur reconnaît. Chacune vit seule en cage pendant vingt-huit à soixante-dix jours, témoins compris pour éviter un biais expérimental, et subit deux à cinq prélèvements de sang à la veine submandibulaire sous anesthésie. Au titre de la réduction, le porteur annonce le prélèvement de tous les organes qui pourraient l'intéresser, congelés en vue d'analyses qu'il n'a pas encore prévues.

Objectifs

La dénutrition du sujet adulte est un phénomène retrouvé dans diverses pathologies humaines telles que la sarcopénie (perte musculaire liée à l'âge) ou suite à des chirurgies onco-intestinale par exemple. Nous souhaitons développer un protocole expérimental chez la souris permettant de tester l'hypothèse selon laquelle un probiotique ou ses derivés peuvent améliorer l'absorption intestinale chez le sujet adulte physiologiquement dénutri et ainsi lutter contre le phénomène de dénutrition. Un probiotique se définit comme un micro-organisme vivant qui, lorsqu'il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels. Nous espérons ainsi, dans ce modèle murin de dénutrition, améliorer la fonction intestinale par cet apport de probiotique. Dans un premier temps nous mettrons en place et caractériserons un modèle de dénutrition chez la souris en soumettant les animaux à une restriction calorique. Dans un second temps, nous étudierons comment un traitement par un probiotique ou ses derivés peuvent limiter les effets de cette dénutrition et/ou favoriser les effets d'une renutrition. A terme, cela pourrait permettre de mieux comprendre l'influence du microbiote sur les phénomènes de dénutrition chez l'adulte. Nous espèrons pouvoir ainsi améliorer l’absorption intestinale dans le cadre de la renutrition des patients adultes en post-chirurgie onco-intestinale ou souffrant de sarcopénie par exemple, ces patients présentant tous des altérations de l'absorption intestinale.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes physiologiques de la dénutrition et l'implication du microbiote dans ce phénomène. De plus, nous espérons à l’aide d’un probiotique ou de ses dérivés pouvoir, en ameliorant l’absorption intestinale, limiter l’effet de la dénutrition et améliorer l’effet d’une renutrition. Cela pourrait à terme, par exemple, permettre d’envisager un traitement probiotique des patients agés souffrant de sarcopénie mais également des patients ayant subit une intervention chirurgicale onco-intestinale qui souffrent également d’une altération de la fonction intestinale.

Procédures

- Individualisation des animaux : 70 souris pendant 28 à 42 jours, 50 souris pendant 56 à 70 jours - Restriction alimentaire : 110 souris pendant 14 à 30 jours - Contention de moins de 2 minutes pour une mesure de la composition corporelle : 2 fois pour 120 souris - Prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse : 2 fois pour 20 souris, 3 fois pour 50 souris, 5 fois pour 50 souris. Le geste prend moins d’une minute. - Injection dans le ventre sur l'animal vigile : le geste prend moins d'une minute

Impact sur les animaux

Ce projet ne devrait entrainer que des nuisances modérées chez les animaux : - Sensation de faim associée à une restriction calorique de leur prise alimentaire moyenne pendant un temps limité à une diminution de leur poids (14 jours attendus, 28 jours au maximum). - Stress associé à l'individualisation des animaux pendant toute la durée de l'expérience, tout d'abord, pour calculer leur prise alimentaire puis pour assurer une restriction calorique précise et individuelle. Cette individualisation sera prolongée à la phase de renutrition ad libitum. En effet, après individualisation la remise en groupe des animaux pendant la période de renutrition risquerait de provoquer des combats pouvant induire des blessures graves voire la mort des animaux. Pour éviter un biais expérimental sur les conditions d'hébergement, nous devrons également individualiser les animaux contrôles non soumis à une restriction calorique. - Stress associé à la pesée des animaux qui ne prend que quelques secondes et ne necessite pas de contention de l’animal. - Stress associé aux prélèvements sanguins à la veine submandibulaire, l qui seront espacés d’au moins 7 jours . Ces prélèvements se feront sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. - Le stress lié aux 2 transports (allé /retour dans la journée) des animaux jusqu'à l'analyseur de masse corporelle reste limité (30 minutes de transport, en véhicule climatisé, dans les cages d'hébergement, dans des sacs opaques) - Le stress induit par la contention pour l'analyse de la masse corporelle des animaux est au maximum de 2 minutes. - Le stress associé au traitement par un probiotique ou un post-biotique qui se fera par voie orale à la pipette en déposant délicatement dans le coin de la joue 100µl de solution qui seront alors volontairement déglutis par l'animal. Ce traitement qui se fera après avoir contentionné la souris dure moins d'une minute. le stress induit par une injection dans le ventre et la contention associée de moins d'une minute

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de collecter différents organes en vue d'analyses ultérieures

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme et de son microbiote à une restriction calorique, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier et des interactions avec sa flore dans ce contexte de restriction. C'est pourquoi cette étude nécessite d’expérimenter sur l’animal. Des études précédentes, laissent supposer un effet potentiel des probiotiques utilisés dans le contexte de dénutrition étudié.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser mais sur lesquels nous n’avons pas forcemment prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de ce projet expérimental tout animal de moins de 20g au debut du projet sera exclu. Les animaux seront pesés à minima tous les 3 jours afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement. Les prélèvements sanguins se feront, sous anesthésie, puis un point de compression sera réalisé jusqu'à arrêt complet du saignement. Les animaux seront individualisés dans des cages transparentes pour maintenir un contact visuel avec leurs congénères. Ils auront un environnement enrichi afin de pouvoir exprimer au mieux leur répertoire comportemental (abri, morceau de bois, matériel de nidification en quantité importante). Le traitement se fera en deposant 100µl dans le creux de la joue à l'aide d'une pipette. Le transport jusqu'à l'analyseur de masse corporelle par RMN se fera dans les cages d'hébergement mises dans des sacs opaques, dans un véhicule climatisé et le temps de trajet est limité (30 minutes). Les animaux seront habitués au préalable au tube de contention dans les jours précédent la premiere analyse de masse corporelle.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix pour étudier la flore dans une étude nutritionnelle. Afin de pouvoir modéliser la dénutrition chez l'adulte, il est nécessaire d’utiliser des animaux adultes. Nous utiliserons donc des souris mâles de 12 semaines au début de l'expérience (10 semaines à l'arrivée dans l'établissement).

1 536 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont bloquées jusqu'à cinq minutes dans un tube en plastique pour mesurer leur composition corporelle, jusqu'à quatre fois chacune, 384 d'entre elles subissant en plus une neurochirurgie sous anesthésie générale et 128 une seconde opération pour remplacer un implant. 496 souris passent deux semaines seules en cage de calorimétrie et 752 un test de tolérance au glucose après cinq heures de jeûne, le régime hypercalorique pouvant faire augmenter leur poids de 200 %. Le porteur espère que ces données serviront à moduler les cellules microgliales pour contrer les troubles métaboliques, "dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse".

Objectifs

Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour lutter contre l’obésité et ses comorbidités, il est nécessaire de mieux connaître les phénomènes biologiques qui régulent la prise alimentaire et le poids corporel. Une région du cerveau appelé hypothalamus regroupe des neurones sensibles aux signaux des autres organes du corps, les renseignant sur l’état énergétique de l’organisme. La consommation d’un régime hypercalorique riche en graisses (High fat diet, HFD) entraîne une inflammation de l’hypothalamus. On sait que les microglies, qui sont les cellules immunitaires du cerveau (qui protègent le cerveau des attaques extérieures), sont aussi impliquées dans la régulation du poids corporel. En effet, elles participent à l’inflammation hypothalamique suite à la consommation d’un régime HFD. Leur activation est variable en fonction de la période d’exposition au régime HFD (entre les premiers jours et plusieurs semaines). On sait que limiter l’activation des microglies en réponse au HFD limite l’inflammation. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans ces cellules restent mal connus. Nous faisons l’hypothèse que certaines molécules microgliales, qui sont impliquée dans les fonctions inflammatoires, participent aussi à la régulation de la prise de poids. Dans ce projet, nous souhaitons présicer le rôle des microglies dans le développement de l’inflammation hypothalamique en réponse à un régime hypercalorique afin de mieux les contenir et ainsi de prévenir la prise de poids. Notre ambition à terme est de permettre l’ouverture de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints d’obésité. Pour cette étude, nous allons utiliser des approches pharmacologiques et génétiques (utilisation d’animaux transgéniques). Nous utiliserons un modèle animal d’obésité, c’est-à-dire des animaux nourris avec une alimentation hypercalorique obésogène. Nous réaliserons un suivi métabolique chronique des animaux (prise alimentaire, tests métaboliques), ainsi que de nombreuses études moléculaires à partir des cellules cérébrales isolées. Ce projet comprend six procédures.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de la microglie dans le développement de l'obésité et les dérèglements métaboliques en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements inflammatoires sous-jacents dans le cerveau. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de modulation de la microglie afin de contrer les troubles métaboliques, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

Voici la liste des principaux gestes techniques réalisés sur les animaux. 1) Analyse de la composition corporelle : cette analyse nécessite que la souris vigile soit maintenue en contention, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 1 à 4 analyses de ce type au cours de ce projet, espacées au minimum de 3 semaines (1536 animaux). 2) Neuro-chirurgie : cette technique permettra soit de mettre en place un implant permettant d’injecter des traitements pharmacologiques, soit un virus qui permettra un changement génétique des microglies. Elle est réalisée sous anesthésie générale. Une seule neuro-chirurgie sera effectuée dans la vie de l’animal (384 animaux). Une partie des 384 animaux subiront une seconde chirurgie de courte durée (10 minutes, 128 animaux) pour le remplacement d’un implant sous-cutané. 3) Test de tolérance au glucose : ce test nécessite de réaliser, après un jeûne de 5 heures, une injection de gluocose dans l’abdomen des souris, puis de mesurer leur glycémie à différents temps post-injection. Les 5 mesures de glycémie sont espacées d’au moins 15 minutes chacune. Ce test est réalisé sur souris vigiles. Un seul test sera réalisé durant toute l’étude (752 animaux). 4) Tests de calorimétrie indirecte (496 animaux concernés au maximum) : ces cages spéciales permettent d’enregistrer en temps réel la consommation de nourriture, d’eau, d’oxygène et la dépense énergétique. Elles nécessitent d’isoler l’animal en cage individuelle (pendant deux semaines), qui sont enrichies avec un nid de coton et un bâtonnet de bois à ronger.

Impact sur les animaux

Dans notre étude, les animaux seront parfois isolés à l’âge adulte (suite à une chirurgie ou lors des sessions de cages métaboliques). Cet isolement est nécessaire pour quantifier la consommation de nourriture de chaque animal ou limiter la dégradation des implants. Au-delà du stress d’isolement social, ces animaux subiront un stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Les souris seront aussi maintenues en contention dans leur tunnel en carton carton avec la queue qui dépasse, pendant 5 secondes, pour réaliser des prélèvements sanguins au bout de la queue (zone peu innervée). Le poids des animaux pourra varier en fonction du régime alimentaire donné (+200% sur le long terme en réponse à un régime hypercalorique) ou des restrictions alimentaires (-10% maximum du poids du jour précédent lors d’une mise à jeun). Les nuisances les plus importantes sont attendues lors de la neuro-chirurgie. L’incision de la peau du crâne, l’hypoxie relative et la déshydration induite par l’anesthésie peuvent provoquer des douleurs post-opératoires.

Devenir

À l’issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer des tissus, afin de réaliser des analyses in vitro supplémentaires, qui nous apporteront des informations cruciales sur les conqéquences des changements moléculaires microgliaux.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre le rôle de la microglie hypothalamique sur un ensemble de variables métaboliques intégrées, telles que le poids, la composition corporelle et la régulation de la glycémie. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude. A noter, ce projet a d’abord fait l’objet d’études réalisées in vitro (cultures cellulaires) afin de mieux cibler les voies de signalisation impliquées dans notre hypothèse. De plus, les modèles génétiques nécessaires pour répondre à notre question scientifique ont été développés chez la souris.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil spécifique qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 ou 7 semaines et seront habitués pendant 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, un tunnel en carton pour se cacher et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le métabolisme glucidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, l'inflammation hypothalamique et la réactivité microgliale induite par un régime obésogène est retrouvé à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes, elles arriveront entre 3 et 7 semaines d’âge dans notre animalerie, mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser des atlas de référence pour la réalisation de la neuro-chirurgie.

Injectées avec un agent neurotoxique de la famille des organophosphorés, rasées et épilées à la crème sur le crâne, 480 souris Swiss subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par perfusion terminale. 192 d'entre elles reçoivent des ultrasons focalisés destinés à ouvrir leur barrière hémato-encéphalique, geste qui peut provoquer un œdème cérébral local ou une pétéchie hémorragique en cas de surdose. Les séances d'imagerie durent jusqu'à deux heures sous anesthésie gazeuse, précédées d'un jeûne de six heures. Le porteur annonce deux à quatre tests comportementaux par animal, variables selon les temps de l'étude, sans préciser lesquels.

Objectifs

Les composés organophosphorés (OP) tels que les agents neurotoxiques de guerre (NOP) comme le sarin, ou certains produits phytosanitaires (pesticides) (OPP), constituent une menace actuelle pour les populations militaire et civile. Si des intoxications à fortes doses constituent toujours une menace (attaque terroriste), l’exposition de manière unique ou répétée à un agent neurotoxique à des doses asymptomatiques (terrains de guerre, épandage de pesticides…) est une réalité permanente. Les effets des doses plus faibles, peu symptomatiques voire asymptomatiques, sont peu étudiées. Pourtant, des troubles comportementaux persistants à très long-terme sont observés après une exposition unique à une dose asymptomatique d’OP chez l’animal. Mais des déficits cognitifs et neuropathiques ont également été observés chez des victimes humaines exposées à de faibles doses. En conséquence, il existe un besoin de biomarqueurs d'exposition permettant i) un diagnostic précoce présymptomatique et ii) l'évaluation et/ou le traitement des intoxications par des agents neurotoxiques sur une longue période. La barrière hémato-encéphalique (BHE) représente la principale surface d’échange entre la circulation sanguine et le tissu cérébral. L’atteinte de la BHE et son rôle sur la neurotoxicité suite à une intoxication aux OP reste mal connue. Des perturbations cérébrales suite à une exposition aux OP sont connus et peuvent avoir des effets importants sur la BHE. Il est donc très probable que son intégrité, sa capacité à transporter des molécules entre le sang et le tissu cérébral et son activation soient impactées. La BHE constitue une cible diagnostique intéressante et restaurer ses fonctions une stratégie thérapeutique potentielle originale. L’objectif du projet est d’étudier les propriétés d’intégrité, de transport et d’activation de BHE suite à une exposition aux agents neurotoxique et de les évaluer comme biomarqueur pour la détection et la prédiction des atteintes cérébrales. Cela permettra d’évaluer des stratégies thérapeutiques originales visant à tirer parti de l’atteinte de la BHE, i) soit en restaurant les propriétés physiologiques de la BHE en injectant différents médicaments, ii) soit en permettant le passage cérébral d’un antidote, grâce à la technologie des ultrasons focalisés (FUS). Cette technologie consiste à injecter dans le sang des microbulles gazeuses qui sous l’action locale et brève d’ultrasons focalisés rendent la BHE transitoirement perméable.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer chez l’animal i) des biomarqueurs d’imagerie potentiels pour un diagnostic précoce pré-symptomatique et ii) un suivi thérapeutique ultérieur des intoxications par les agents neurotoxiques et les composés apparentés avec un potentiel de transférer ces biomarqueurs chez l’homme.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : • Intoxication à un agent neurotoxique (ou solution contrôle) par injection (temps d’injection 10 secondes) suivi par une étude comportementale d’observation (durée 1 heure) pour déterminer les signes d’intoxication. L’injection et l’étude comportementale d’observation ne seront réalisées qu’une seule fois (tous les animaux). • Mise à jeun max 6h avant l’imagerie (seulement les animaux dont les radiotraceurs le demandent ) • Réalisation des tests comportementaux, les tests varient selon les points temporels de l’étude (durée 10 minutes maximum ; 2 à 4 tests max par animal) et des sessions d’imagerie à baseline puis différents temps post-intoxication (injection d’un radiotraceur durée 10 secondes) sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum ; tous les animaux) • Thérapie par injection de médicament (1 injection du médicament durée 10 secondes) sous anesthésie gazeuse (durée 5 minutes ; ) • Thérapie par ultrasons (ouverture de la BHE plus 1 injection de médicament) sous anesthésie gazeuse, durée 10 minutes ; 192 animaux). Perfusion terminale sous analgésie et anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables Lors des expériences d’intoxication : • Les animaux peuvent être stressés lors des injections. De plus, l’injection de l’agent neurotoxique ou du traitement par le médicament antidotique peut induire une douleur (moins de 5 minutes). • Les animaux seront exposés à une dose sous-létale asymptomatique du de l’agent neurotoxique qui entraine une intoxication de faible sévérité. Ces effets apparaissent dans la première heure post-intoxication. Une surveillance jusqu’à 6 heures post-intoxication est mise en place pour assurer le bien-être des animaux intoxiqués. Lors des expériences d’imagerie : • Les animaux seront endormis lors des sessions d’imagerie (2h maximum) par voie gazeuse. Lors du réveil, les animaux peuvent être désorientées et stressées. • Une mise à jeun des animaux 6h avant l’imagerie TEP peut entrainer une perte de poids < à 5%. Lors des expériences ultrasonore (US) : • Une surdose ultrasonore peut entraîner un risque d’œdème cérébral local ou de pétéchie hémorragique. La technique des ultrasons focalisés est bien maitrisée au sein du laboratoire, le risque de surdose ultrasonore est donc très faible. • L’injection des microbulles et médicaments en intraveineux peut induire une courte douleur (moins de 5 min). • Les animaux seront rasés et épilés (par application d’une crème dépilatoire) sur la tête pour permettre la transmission des ultrasons. Cet acte peut causer une légère irritation cutanée, résultat d’une réaction inflammatoire limité à la zone de contact.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de prélever certains organes et d’étudier ex vivo certains paramètres et de les confronter aux données en imagerie.

Remplacement

Il n'existe actuellement aucune méthode alternative permettant d'étudier de manière intégrée la réponse du système nerveux central et périphérique à un agent neurotoxique. Par conséquent, l'étude des propriétés d'intégrité, de transport et d'activation de la barrière hémato-encéphalique (BHE) après une intoxication au NOP ne peut être réalisée qu'in vivo. En ce qui concerne l’ouverture de le BHE des études in vitro (sur fantôme et culture cellulaire) ont été réalisées pour affiner les paramètres ultrasonores, caractériser les agents ultrasonores utilisés pour ouvrir la BHE et limiter le nombre d’expériences in vivo en amont de ce projet. Cependant, l’ouverture de la BHE en tant qu’approche thérapeutique après intoxication d’un agent neurotoxique nécessite l’utilisation d’animaux vivants.

Réduction

L’utilisation de l’imagerie en longitudinal permettra de réduire le nombre d’animaux. Un même animal passera plusieurs examens d’imagerie en absence ou présence d’un traitement ce qui réduit le nombre d’animaux. L’approche statistique envisagée devrait permettre la comparaison de quatre conditions expérimentales entre elles avec suffisamment de puissance pour mettre en évidence un phénomène pharmacocinétique notable localisé et dépendant du temps. L'expérience a montré que les tests comportementaux sont les données qui présentent la plus grande variance. Par conséquent, le calcul de puissance est effectué pour les tests de comportementaux. Nous souhaitons être capables de discriminer une taille d'effet de l'ordre de 25% alors même que l'écart-type attendu est lui aussi de l'ordre de 25%. Nos calculs nous amènent à considérer qu’un nombre de 480 animaux répartis en groupes de 24 est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Une semaine d’acclimatation est prévue après accueil des animaux dans l’animalerie. Les animaux seront hébergés en groupe dans une cage avec accès sans restriction à la nourriture et à la boisson. Ils bénéficieront d’un milieu enrichi (matériel de nidification, tunnel, batônnets de bois). L’hébergement individuel des animaux sera limité au maximum afin de minimiser leur angoisse. Les animaux seront hebergés en individuel pendant la 1ère heure suivant l’intoxication afin de suivre l’évaluation de l’intensité de l’intoxication, puis remis en cage avec leurs congénères. Une surveillance journalière des souris pendant une semaine sera réalisée à la suite de l’intoxication notamment en se basant sur une grille d’évaluation préalablement établie Des points limites ont été déterminés en s’appuyant sur les scores de la grille d’évaluation. Tous les examens d’imagerie ou traitements thérapeutiques (ouverture BHE, injections de microbulles et/ou de médicaments) seront réalisés sous anesthésie générale par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal. L’animal sera maintenu sous un dispositif chauffant (tapis, lumière ou flux d’air) pour assurer son bien-être lors des manipulations. Certains radiotraceurs ou médicaments pourront également être administrés par voie intrapéritonéale, ce qui permet une injection rapide chez l’animal éveillé et réduit ainsi la nécessité d’une anesthésie. Lors des examens d’imagerie des larmes artificielles seront appliquées pour éviter le dessèchement de la cornée. Afin de minimiser le stress, la phase de réveil sera réalisée dans la cage de l’animal. L’étude comportementale sera réalisée avec des animaux vigiles mais sera conduite de manière la plus brève possible afin d’éviter tout stress supplémentaire aux animaux. Un suivi quotidien par les zootechniciens et les expérimentateurs sera pratiqué. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés.

Choix des espèces

Les expériences se feront sur la souris Swiss. Cette souche a permis la mise au point de récents modèles d’intoxication aux agents neurotoxiques. Les animaux utilisés sont des jeunes adultes âgés de 9 semaines au moment de l’intoxication, poids de 38-43g. Cet âge correspond aux précédents modèles développés et utilisés dans les laboratoires partenaires sur ce projet, mais il offre surtout la plus grande fenêtre de temps dans une population adulte pour mener des études sur les changements possibles (troubles cognitifs, caractéristiques de la BHE) à long terme et suite à un traitement. De plus, cette souche également utilisée dans notre laboratoire a permis la mise en évidence des désordres métaboliques sur le modèle d’exposition à un agent neurotoxique suivi par imagerie TEP. L’utilisation du même stade de développement nous permet ainsi de pouvoir comparer nos données et évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement avec nos résultats précédents et ceux obtenus par les autres partenaires.

3 850 souris privées de système immunitaire complet vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées puis disséquées. Chacune reçoit sous la peau un fragment de tumeur prélevé sur un patient métastatique, quelques-unes une injection de cellules tumorales dans le cœur, et celles qui reçoivent un traitement subissent un prélèvement de sang hebdomadaire à la mandibule qui laisse des hématomes plusieurs jours. Le porteur retient des souris dépourvues de poils parce que la tumeur se suit mieux sous la peau et que les poils rayent les lames des microtomes, et prévoit 670 animaux par an rien que pour entretenir les lignées de xénogreffes. Il écrit qu'il n'est pas possible de se passer de ces greffes pour proposer des traitements personnalisés aux patients, tout en notant que ces souris sont plus exposées aux infections opportunistes.

Objectifs

Depuis ces dernières années, l’incidence des cancers augmente de par le monde. Avec l’avancé des traitements, la survie des patients s’est améliorée. Toutefois, la maladie métastatique reste un problème majeur et implique une morbidité et une mortalité importante. Dans le cancer, la maladie métastatique est un problème majeur et une cause importante de décès. Si les chiffres sont difficiles à obtenir, une étude estime que 66.7 pourcent des décès par cancers sont dues à des métastases. Leur traitement est rendu d’autant plus difficile que ces métastases ont tendance à résister aux traitements conventionnels. C'est pourquoi nous cherchons à identifier des biomarqueurs de résistance ou de toxicité aux anti-cancéreux, dans l’optique du développement de nouveaux traitements personnalisés.

Bénéfices attendus

La première partie du projet doit permettre de maintenir et de mettre en place de nouveaux modèles de xénogreffes de tumeurs humaines issues de prélèvements métastatiques de patients. Le recrutement des prélèvements métastatiques greffés est fonction de l'incidence des métastases dans chaque type de cancer. Pour le cancer du sein, qui est aujourd’hui le cancer le plus diagnostiqué et la 5eme cause de décès par cancer dans le monde, la maladie métastatique est responsable de la majorité des décès avec, pour ces cas, une médiane de survie à 5 ans de 30 pourcent. Outre les cancers du sein, les autres types de cancers très pourvoyeurs de métastases sont les cancers de la prostate, du pancréas, du poumon, du rein, le cancer colorectal et le mélanome. Le cancer du poumon, du rein et le mélanome métastatiques ont un pronostique particulièrement sombre avec une survie à 5 ans inférieure à 10 pourcent. Ces modèles de xénogreffe consistent à greffer un fragment tumoral humain sous la peau de la souris et constituent des modèles uniques et particulièrement pertinents pour l'étude de la pathologie humaine. Une fois établis, ces modèles doivent permettre de mieux comprendre les mécanismes de développement des tumeurs humaines, ainsi que permettre de proposer des traitements personnalisés aux patients. La seconde partie; qui consiste à traiter les souris xénogreffées avec des thérapeutiques déjà utilisées dans le cadre du soin, ou de nouveaux composés innovent; doit permettre de proposer des nouvelles alternatives au traitement de ces pathologie, comprendre les mécanismes d'échappement des tumeurs et, dans le cas de nouveaux composés, évaluer leur potentiel thérapeutiques en vue d'essais cliniques. L'objectif étant d'améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux utilisés sont immundéficients. Leur système immunitaire n'est pas complet ce qui limite les risques de rejets de la greffe. Tous les animaux de ce projet seront greffés avec des tumeurs humaines. La plupart recevront un fragment sous-cutané. A de rares exceptions, certains animaux pourront recevoir une injection sanguine de cellules tumorales. Dans les 2 cas, le geste s'effectue sur animal anesthésié et la durée de l'acte ne dépasse pas les 5 minutes. Les greffes sous cutanées se feront sous analgésie générale. Les injections sanguines de cellules tumorales se feront sous analgésie locale. Une partie des animaux xénogreffés sera traité afin d'évaluer l'efficacité des traitements sur la progression des tumeurs. Dans ce cas, les modalités de traitement varient. Les modalités retenues étant le gavage, l'injection intra-péritonéale et l'injection intraveineuse. Le choix des voies d'injection et des posologies étant soumis à la molécule thérapeutique employée. Les animaux en traitement seront également soumis à un prélèvement de sang hebdomadaire effectué à la mandibule. Le traitement et le prélèvement d'un animal s'effectue sur animal vigile et ne dure pas plus d'une minute.

Impact sur les animaux

La xénogreffes d'une tumeur humaine ; dans la mesure où il s'agit d'insérer un petit fragment tissulaire en sous-cutané ; est un acte peu invasif et peu douloureux. Les injections sanguines présentent un risque hémoragique au moment de l'injection. La croissance des xénogreffes sous cutanées occasionnera une gêne pour l'animal si elle est trop volumineuse. En sous cutanée, les greffes sont peu métastatiques et nous n'avons pas constaté que cela entrainait une diminution du bien-être animal. Les cellules tumorales injectées dans le sang auront une dissémination systémique entrainant la formation de tumeurs dont nous suivrons l'évolution par l'évaluation des signes cliniques de l'animal. Enfin, les traitements qui seront réalisés n'entraineront pas d'effets indésirables majeurs dans la mesure où les doses, les voies et les fréquences d'administration seront établies à partir de la pratique clinique. Les nuisances sont liées à la contention, l'insertion de la canule de gavage et la piqure à l'aiguille. Les prélèvements de sang à la mandibule occasionnent des hématomes localisés pendants quelques jours. Les souris sont immunodéficientes car athymiques, mais nous n'avons pas constaté d'impact de ce caractère sur leur qualité de vie. L'immunodéficience des animaux utilisés peut leur conférer une sensibilité aux infections opportunistes plus grandes.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés à la fin de l'expérimentation. La survenue de l'euthanasie est soumise à l'atteinte des points limites fixés. La dissection complète des animaux est systématique après l'euthanasie. Les prélèvements effectués permettent d'effectuer des analyses histologiques et moléculaires. Le recueil systématique des échantillons participe au raffinement des modèles.

Remplacement

L’objectif de notre projet est de pouvoir étudier les mécanismes de résistance aux traitements de tumeurs métastatiques de patients. Des cultures de cellules peuvent être réalisées dans certains cas mais avec des résultats très variables. Par ailleurs, la culture cellulaire sélectionne un type cellulaire, et on perd donc la richesse et l’organisation structurelle de la tumeur telle qu’elle existe chez le patient. Ceci constitue un biais analytique important car on sait qu'une tumeur est constituée d'une variété de cellules tumorales, plus ou moins sensibles aux agents thérapeutiques. Les cellules et les structures qui entourent les tumeurs jouent également un rôle dans les mécanismes de résistance. C’est pourquoi il n’est actuellement pas possible de nous passer de ces modèles de xénogreffes pour la prise en charge personnalisée des patients et la mise au point de nouveaux agents thérapeutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour maintien des lignées de xénogreffes a été évalué en fonction de notre expertise de plusieurs années dans le domaine. Pour chaque tumeur, 4 souris sont greffées pour limiter le risque d’échec de prise de greffe. Ce risque varie en fonction de l’agressivité tumorale. Nous utilisons en moyenne 670 souris pour entretenir ces xénogreffes par an. Pour 5 ans, 3350 animaux seront donc nécessaires. Pour les traitements, 10 animaux par groupes est un nombre minimum pour avoir une puissance statistique suffisante. Nous testons une dizaine d’agents ou de combinaisons d’agents thérapeutiques par an, soit 100 animaux traités par an (soit 500 pour 5 ans). Pour 5 ans, 3850 animaux seront nécessaires.

Raffinement

Pour les xénogreffes réalisées en sous-cutanée, les animaux sont anesthésiés. La technique chirurgicale de greffe est peu douloureuse mais une analgésie générale est donnée au préalable. Pour les xénogreffes de cellules tumorales en intracardiaque, les animaux sont anesthésiés durant toute la procédure. La posologie des traitements administrés aux animaux est adaptée des traitements faits chez l’homme. Les doses administrées sont donc bien en dessous des doses létales et la toxicité des molécules se rapproche des effets observés chez l’homme. Les traitements sont administrés par gavage, intraveineuse ou intrapéritonéale. Afin de limiter les nuisances subies par les animaux tout au long du projet, des points limites suffisamment précoces ont été établis. Un suivi quotidien des animaux est opéré par du personnel qualifié. Les animaux sont élevés en groupe sociaux (4-5 par cage) avec enrichissement. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Une surveillance quotidienne est assurée par le personnel de l'animalerie et les membres de l'équipe de recherche. Les souris utilisées sont immunodéficientes mais nous n'avons pas constaté d'impact de ce caractère sur leur qualité de vie. Néanmoins, conformément aux recommandations du fournisseur, les animaux seront hébergés en cages à couvercles filtrant. Le change sera effectué sous atmosphère contrôlée et propre. Enfin, la stérilisation des consommables (litière, enrichissement, eau et nourriture) et des équipements (cages, portoirs, bouteilles, etc.) limitera le risque d'infection chez ces animaux.

Choix des espèces

Ce projet utilise des souris immunodéficientes adultes, de 6 semaines. Le caractère d'immunodéficience limite le risque de rejet de la greffe des cellules humaines Par ailleurs, le choix d’animaux dépourvus de poils nous permet de suivre plus facilement le développement sous cutané de la tumeur. L’évaluation de la taille tumorale est facilitée. L’absence de pilosité est un critère important pour les analyses histologiques. En effet, les poils ont tendance à rayer les rasoirs de microtomes. Les souris xénogreffées sont choisies jeunes adultes afin de maximiser les chances de prise de greffe. En effet, les cellules de la graisse brune situées entre les omoplates constituent un terreau nutritif pour les tumeurs xénogreffées, favorisant leur développement. Cette graisse brune disparait avec l’âge.