Souris

Issues du croisement de deux lignées transgéniques présentes dans le laboratoire et porteuses d'une fluorescence rouge dans les neurones de l'habénula, 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie stéréotaxique de trente à quarante minutes sous anesthésie générale, le temps d'injecter lentement un traceur dans le cerveau. L'inconfort attendu se limite selon le porteur aux sutures et disparaît avec la cicatrisation en 24 heures, les coordonnées d'injection ayant d'abord été calées sur des animaux morts. Deux à trois semaines plus tard, les 80 souris sont tuées pour prélever leur cerveau, mise à mort que le porteur qualifie d'"indispensable" et qui doit préparer des travaux ultérieurs sur d'autres souris transgéniques.

Objectifs

Ces dix dernières années, un nombre important de travaux précliniques ont adressé le rôle d’une structure particulière du cerveau, l’habénula, dans diverses pathologies psychiatriques, en particulier la dépression, ainsi que dans des processus de récompense/motivation, notamment associés à l’addiction. Les connexions de cette structure sont relativement bien connues car étudiées depuis plus de 50 ans par diverses approches anatomiques et dernièrement par des techniques de traçages génétiques. Cette structure de petite taille est cependant hétérogène, étant constituée de plusieurs types de neurones qui semblent impliqués de manière différentielle dans les diverses réponses émotionnelles et motivationnelles et qui définissent des compartiments dans l’habénula. Ainsi les objectifs des recherches actuelles par de nombreux laboratoires sont de précisément étudier ces divisions. Cependant, ces neurones ne forment pas une population homogène et, jusqu’à aujourd’hui, il n’y avait aucun marqueur afin de caractériser des populations spécifiques. Nous avons identifié un marqueur potentiel sous la forme d’une protéine : TBR1. En effet, nous avons identifié de nombreux neurones exprimant cette protéine dans le télencéphale basal et nous avons de bons arguments (développement) qui suggèrent qu’ils sont à l’origine de projections dans l’habénula. L’objet du projet est de confirmer la nature de ces neurones, les projections dans l’habénula et identifier certaines de leurs connexions. Ce travail est préliminaire à des études fonctionnelles plus poussées avec des modèles de souris transgéniques permettant de manipuler spécifiquement ces neurones, et donc qui permettront l'étude fonctionnelle de ces neurones dans le cadre de pathologies psychiatriques.

Bénéfices attendus

Nous serons à ma connaissance les premiers à identifier un phénotype chimique spécifique d’au moins une population de neurones spécifiquesprojetant dans l’habénula depuis le télencéphale basal. Ce travail ouvre la voie à des études ultérieures avec des modèles de souris TBR1 pour des études à la fois de traçage et fonctionnelles plus exhaustives. Ceci pourra donc déboucher sur des avancées significatives concernant le rôle de l’habénula dans diverses pathologies psychiatriques et notamment des formes résistantes de dépression.

Procédures

Les animaux recevront des injections ciblées de molécules nous permettant de déterminer l'endroit où les neurones ciblés envoient leurs axones. Cette technique nécessite une intervention chirurgicale de courte durée sous anesthésie générale et avec injection d'analgésiques. La durée de l’intervention est de 30 à 40 mn, essentiellement due au temps de l’injection sur plusieurs minutes.

Impact sur les animaux

Les expériences d’injection de traceurs neuronaux sont susceptibles d’entrainer un inconfort temporaire modéré, particulièrement au niveau des sutures. Cet inconfort disparait avec la cicatrisation en 24h. La douleur est prise en charge par des analgésiques.

Devenir

La mise à mort des animaux est indispensable pour le prélèvement du cerveau 2 à 3 semaines après la chirurgie

Remplacement

La nature anatomo-fonctionnelle de ce projet impose de travailler sur l’animal entier et ne peut s’envisager sur modèles in vitro. Le choix de la souris s'impose comme étant le modèle mammifère le plus adapté.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisé, les coordonnées stéréotaxiques seront déterminées initialement sur animaux morts. Le nombre d’animaux utilisés est déterminé par les données passées sur ce genre d’expérience par rapport à la taille de la région ciblée pour l’injection.

Raffinement

Le poids des animaux sera surveillé dans les trois jours suivant la chirurgie. Tout signe de douleur ou le développement d’un hématome sous cutané sera aussi recherché pendant cette période de trois jours. Si des signes de douleur sont apparents, celle-ci sera prise en charge par un analgésique. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas à la troisième journée, une intervention du vétérinaire sera demandée. Afin de faciliter la récupération des animaux, les cages seront enrichies avec des dômes en carton et des nestlets pour permettre la confection d'un nid.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est dicté par les données actuellement disponibles (Atlas pour les coordonnées d’injection et structures déjà décrites) et la présence de deux lignées transgéniques dans nos locaux. Nous utiliserons les souris issues du croisement de reproducteurs permettant une fluorescence rouge dans les neurones qui sont abondants dans l’habénula. Toutes les chirurgies s’effectueront sur animaux adultes.

Pour savoir si des infections répétées altèrent la mémoire des cellules souches du sang, 1288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse. Elles reçoivent jusqu'à dix injections intrapéritonéales espacées de quatre semaines, un gavage, une injection intratrachéale sous anesthésie gazeuse, une irradiation myéloablative suivie d'une greffe de moelle osseuse dans le sinus rétro-orbitaire, puis jusqu'à cinq prélèvements sanguins au même endroit entre 4 et 20 mois. Le porteur indique une fatigue, une hypothermie légère, un inconfort respiratoire et une perte de poids pendant deux à quinze jours, ainsi qu'une douleur des poumons, de l'œsophage ou de l'œil. Une seule phrase justifie l'effectif de 1288 animaux, celle d'une évaluation destinée à obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Objectifs

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont responsables de la production et du renouvellement continu de toutes les cellules sanguines. Les CSH peuvent reconnaître les signaux produits en réponse à des infections et produire plus de globules blancs, responsables de la lutte contre l'infection. Cette reconnaissance induit également une mémoire qui leur permet d'avoir une réponse plus efficace lors d'une seconde infection. Nous étudions comment des stimuli mimant des infections répétées peuvent affecter cette mémoire et si cela peut avoir un impact sur la capacité des CSH à produire les cellules du sang.

Bénéfices attendus

La mémoire immunitaire innée a un intérêt thérapeutique car elle permet une protection large et non spécifique contre différentes infections et pourrait être utilisée comme vaccin. Cette mémoire ayant été récemment mise en évidence dans les cellules souches hématopoïétiques, cellules générant les cellules sanguines, il est important d’en connaître toutes les conséquences sur leur fonction afin d’éviter une déficience de l’hématopoïèse. Ce projet a donc un bénéfice important d'un point de vue fondamental.

Procédures

Les procédures utilisées sont les suivantes : multiples injections de molécules en intrapéritonéale (toutes les 4 semaines, jusqu'à 10 injections maximum) sur souris vigiles, injection permettant l'expression d'une molécule fluorescente par une unique ingestion par gavage sur souris vigiles, injection en intratrachéale (unique) sous anesthésie gazeuse, transplantation de moelle osseuse par une unique injection intraveineuse dans le sinus rétro-orbital après traitements myéloablatifs (une unique dose d'irradiation), injection de molécule (unique) ou prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse dans le sinus rétro-orbital (répété tous les mois, de 4 à 20 mois avec un maximum de 5 prélèvements).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent présenter des signes de stress liés à leur contention. Les procédures sont classées modérées en raison de la répétition des gestes expérimentaux et de l’inconfort que peut ressentir l’animal après des injections mimant une infection ou après une myéloablation. Elles peuvent entraîner, selon les procédures, une fatigue, une légère hypothermie, un inconfort respiratoire et une perte de poids pendant 2 à 15 jours. Les souris peuvent présenter une douleur légère à modérée au niveau des poumons, de l’œsophage ou de l’œil pendant une durée de 5 minutes, minimisée par des antalgiques et des anesthésiques.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure en vue d'analyses.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons déterminer si la mémoire immunitaire des CSH est modifiée par le nombre de stimulations auxquelles elles peuvent répondre et si cela impacte sa fonction. L’inflammation que nous induisons est une réponse immunitaire intégrant des systèmes de communication cellulaires complexes (endothélium, système lymphatique et vasculaire, système neuronal) que l’on ne peut actuellement pas reproduire in silico, ni in vitro, ni ex vivo. De plus, il est impossible à ce jour de maintenir des CSH en culture sans induire leur activation et leur différenciation. Pour une étude longitudinale comme c’est le cas ici, nous n’avons pas d’autre choix que d’utiliser le modèle in vivo. Dans ce sens, le modèle murin est particulièrement bien adapté à ces différentes problématiques. Il n’y a donc pas d’alternative actuellement à l’utilisation des souris pour atteindre l’objectif de ce projet. Cependant, des tests de stimulation et des étapes finales d’analyse de différenciation ont/pourront être effectués afin de limiter son utilisation.

Réduction

Le nombre maximum de souris nécessaires (n=1288) a été évalué afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les expérimentations seront réalisées en veillant à réduire, supprimer ou soulager tout inconfort, douleur ou angoisse subis par les souris afin d'améliorer leur bien-être. Pour cela, les procédures seront effectuées sous anesthésie, dans des conditions stériles, et si nécessaire et si possible, un analgésique et un antibiotique sera administré. L'état de santé des souris sera surveillé quotidiennement à l'aide d'une grille d'évaluation de la douleur, permettant de déterminer les niveaux de douleur afin de prendre les mesures nécessaires pour la limiter. Tout au long de l'étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur. Cela inclut un environnement contrôlé avec une température et une ventilation régulée, une lumière suivant un cycle de 12 heures, et une hygrométrie adaptée. Les souris auront un accès constant à la nourriture et à l'eau. Elles seront maintenues en groupes de 3 à 5 animaux par cage. Leur environnement sera enrichi avec des dômes en carton ou du coton.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. Animal de petite taille et à reproduction rapide. Bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. De nombreuses souches d'animaux génétiquement modifiés permettant de poser les questions biologiques qui nous intéressent existent déjà. Nous utiliserons dans ce projet des souris adultes jeunes (entre 6 semaines et 20 semaines au moment du début de la procédure) et âgées (entre 18 et 27 mois).

1 204 souris vont être utilisées dans ce second volet, chacune passant deux mois de sessions quotidiennes de quarante minutes, la tête immobilisée dans un dispositif de contention, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux opérations du crâne précèdent l'entraînement, la seconde durant jusqu'à deux heures. La tâche apprise repose sur une récompense en eau, obtenue en rationnant les souris à la moitié de leur consommation habituelle, avec une pesée quotidienne destinée à ce que la perte de poids ne dépasse pas 10 %. Toutes sont tuées et leur cerveau prélevé, l'objet déclaré étant de comprendre les altérations sensorielles de l'autisme et de tester une molécule déjà passée en essai clinique chez l'humain.

Objectifs

L’autisme est un trouble neurodéveloppemental caractérisé par des déficits sociaux, des comportements répétitifs et les altérations sensorielles. Il est estimé qu'à l'échelle mondiale, environ un enfant sur 34 est atteint d'autisme. Malgré la prévalence de l’autisme, les mécanismes neurobiologiques responsables des changements du comportement ne sont pas bien compris. Une meilleure compréhension de la neurobiologie de l’autisme est cruciale pour la gestion des symptômes des personnes autistes, le développement d'approches thérapeutiques innovantes, ainsi que pour l’amélioration du diagnostic. L'objectif de ce projet est d’utiliser des souris génétiquement modifiées, possédant les traits de l’autisme, pour étudier de manière plus approfondie les altérations neuronales dans l’autisme. Dans cette étude, qui se déroule dans 2 établissements utilisateurs, nous avons donc choisi de nous concentrer sur deux régions du cerveau qui sont similaires entre la souris et l'homme. Nous proposons de développer et d'utiliser une nouvelle expérience comportementale visant à identifier à la fois les altérations comportementales et les modifications physiologiques cérébrales dans ces souris modèles de l’autisme. Ces mesures nous permettront de tester quels mécanismes cellulaires peuvent être responsables des altérations comportementales liées à l'autisme. Finalement, nous pourrons tester grâce à cette tâche comportementale, si une intervention pharmacologique ciblant ces mécanismes peut corriger les altérations comportementales présentes au niveau sensoriel dans l’autisme. Nous utiliserons pour cela, une molécule expérimentale qui a déjà été testée dans des essais cliniques chez l'homme et dont le profil de sécurité et la pharmacocinétique sont bien définis.

Bénéfices attendus

Des études de dépistage à grande échelle menées aux États-Unis suggèrent que la prévalence de l'autisme est de 1 enfant sur 34. Bien qu'il n'existe pas d'études de cette ampleur en Europe, la prévalence de l'autisme est probablement similaire. Les symptômes sensoriels affectent la grande majorité des personnes atteintes d'autisme et ont des conséquences fortement négatives sur leur vie quotidienne. Par exemple, ils pourront avoir des difficultés pour s’intégrer dans une classe bruyante, des difficultés pour manger certains aliments ou pour porter certains vêtements. Ces symptômes sont une source majeure de stress pour les familles concernées. La compréhension des processus neurophysiologiques qui sont à l’origine de ces difficultés sensorielles peut apporter des informations importantes sur la façon dont le fonctionnement du cerveau est altéré dans l'autisme. De telles études peuvent conduire à l'identification des mécanismes moléculaires, cellulaires et cérébrales qui sont responsables des perturbations sensorielles, révélant ainsi de nouvelles cibles pour le développement de traitements pharmacologiques visant à améliorer des symptômes tels que la surcharge sensorielle ou l'hyper/hypo-réactivité sensorielle. De telles études nécessitent des approches invasives et des manipulations qui ne sont pas possibles dans un cadre clinique. Nous pensons que notre étude permettra de mieux comprendre les types de cellules et les circuits impliqués dans l'altération de la perception multisensorielle. Elle fournira des biomarqueurs précliniques pour l'évaluation de nouveaux médicaments expérimentaux. Elle nous permettra d'évaluer l'efficacité d'un médicament expérimental existant qui a été proposé comme traitement de l'autisme. Notre étude a le fort potentiel de fournir des informations qui, à terme, amélioreront la vie des personnes diagnostiquées autistes. Ces connaissances peuvent également renforcer l'autonomie et le bien être des personnes autistes en leur permettant de comprendre pourquoi elles se sentent comme elles le font dans certaines situations.

Procédures

Tous les animaux inclus dans les expériences comportementales seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : la première durera environ 45 à 90 minutes, et la deuxième durera de 90 à 120 minutes (EU « A »). Pour comprendre les mécanismes neurobiologiques sous-jacent de l'autisme, les animaux apprendront à effectuer une tâche comportementale non aversive et non douloureuse, basé sur les récompenses, pendant 45 minutes par jour (EU « B »). En même temps, nous effectuons des mesures de l'activité des neurones du cerveau (EU « B »). Afin de permettre ces enregistrements, les animaux sont entraînés à accepter une contention partielle (immobilisation de la tête). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de leur tête d’une minute à 35 minutes, pendant 5 jours (EU « B »). Cela permet aux animaux d’apprendre que cette immobilisation est réversible et non douloureuse. Lorsqu'ils seront à l'aise avec le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l'entraînement à la tâche comportementale commencera. Chaque session de travail comportemental dureras 40 minutes, et les sessions seront répétées quotidiennement pendant 2 mois (EU « B »). Tous les animaux inclus dans les expériences visant à définir l'activité du cerveau hors cadre comportemental seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie, qui durera 90 minutes (EU « A »). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de la tête d’une minute à 35 minutes, pendant 5 jours (EU « B »). Cela permet aux animaux apprendre que cette immobilisation est réversible et pas douloureuse. Lorsqu'ils seront à l'aise dans le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l’enregistrement de l’activité du cerveau commencera (EU « B »).

Impact sur les animaux

1) Chirurgies: Les animaux seront soumis à des interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie. Le risque d'inconfort, de douleur, d'infection et/ou de perte de poids est inhérent à ces procédures. 2) Immobilisation partielle : L’enregistrement de l’activité neuronale des différents groupes des neurones nécessite de maintenir la tête de l'animal dans une position fixe. Cette méthode n'est pas douloureuse et est bien établie dans la littérature, mais elle provoque un malaise pendant les premiers séances. 3) Restriction hydrique : Notre tâche comportementale nécessite la mise en place d’une récompense. Après notre étude précédente, nous avons choisi une récompense hydrique (nécessitant la restriction de l’eau). La perte de poids (10 % du poids initial de l'animal) ne peut être évitée car les souris reçoivent une ration d'eau correspondant à 50 % de leur consommation d'eau ad libitum.

Devenir

Toutes les souris seront euthanisiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.

Remplacement

Les expériences proposées dans cette étude nécessitent des circuits neuronaux intacts et des mesures à la fois physiologiques et comportementaux. Un modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité de ces interactions neuronales et ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas adaptées à notre objectif expérimental des approches invasives sont nécessaires pour répondre à notre question scientifique. Les circuits neuronaux sont bien conservés chez les différentes espèces mammifères et sont donc susceptibles d'être fonctionnellement similaires chez les rongeurs et les humains. L’utilisation des modèles de plus faible sensibilité neuronale (tels que la mouche à vinaigre) n’est pas adaptée non plus à notre projet, car cet organisme ne possède pas la structure cérébrale ciblée par notre étude.

Réduction

Une conception expérimentale minutieuse garantira la reproductibilité des résultats et, avec des techniques d'analyse statistique appropriées, l'utilisation d'animaux sera réduite au minimum. Les protocoles comportementaux, physiologiques, et pharmacologiques ont déjà été mis en place pour une étude précédente sur la perception tactile. Une première étude pilote a été réalisée pour modifier les protocoles comportementaux pour étudier la perception multisensorielle. Cette première étude nous a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser ces expériences et avoir des résultats statistiquement valides. Cela nous a permis d'assurer la crédibilité de nos résultats avant de procéder à l'étude principale. Les données comportementales, physiologiques, et pharmacologiques seront recueillies auprès des mêmes animaux. Les injections du traitement seront précédées par les injections contrôles dans les mêmes animaux. Toutes les expériences seront réalisées par groupe de 6 à 8 souris, et notre stratégie sur le nombre des souris nécessaire sera adaptée aux résultats. Ces mesures nous permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés dans l'étude et de mesurer simultanément plusieurs paramètres.

Raffinement

Tous les résultats scientifiques sur les facteurs influençant le bien-être des animaux ainsi que la capacité des animaux à ressentir et à exprimer la douleur, la souffrance, l'angoisse et les dommages durables seront pris en compte. Les expériences seront conçues et réalisées de la manière la plus éthique possible. Des souris transgéniques seront utilisées pour explorer les déficits multisensorielles dans les modèles de souris d’autisme, et aucune souffrance inhérente n'y est associée. Le bien-être des animaux est impératif pour cette étude. Afin de garantir le moins de gêne et de souffrance pour les animaux, le matériel adéquat sera mis à disposition des personnes autorisées, compétentes et dûment qualifiées, qui respecteront rigoureusement les procédures mises en place. Pour les chirurgies: Utilisation d'anesthésiques, d'analgésiques, d'un anti-inflammatoire, d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Tous les animaux seront manipulés en utilisant les techniques les moins stressantes possibles, conformément à la littérature : l'utilisation d'un tunnel ou des mains en forme de coupe. Les animaux seront transférés entre les deux sites dans leurs cages d'origine, pendant leur phase active, et placés dans l'obscurité à l'intérieur d'un chariot. . Pendant la restriction en eau, les animaux seront pesés chaque jour, et leur alimentation en eau sera ajustée afin de s'assurer qu'ils ne dépassent jamais une perte de poids de 10 %. Un tube et du matériel de nidification seront placés dans chaque cage afin de garantir la poursuite de tous les comportements normaux de l'animal. Les animaux seront placés dans des cages collectives afin de garantir des interactions sociales. L'hydrogel qui sera fourni comme source d'eau est considéré comme un enrichissement car les animaux le manipulent abondamment avec leurs pattes avant. Les animaux seront habitués à la pièce d’expérimentation. Les animaux seront progressivement habitués à la fixation de la tête pour garantir un stress minimal. Tous les animaux exploreront librement l'installation avant et après chaque session, en marchant et en grimpant sur ses différentes parties. Les stimulations tactiles et auditives utilisées pendant la tâche comportementale ne sont pas douloureuses et ne provoquent pas des crises d’épilepsie. Des points limites spécifiques et des mesures conservatrices pour chaque phase de la procédure sont définis.

Choix des espèces

L’utilisation des souris transgéniques a été privilégiée pour rester cohérent avec les études antérieures effectuées au sein de notre équipe. Les rongeurs ont des systèmes somatosensoriel et auditif très développés et sont considérés comme une espèce modèle pour les études concernant le traitement de certains types d'informations sensorielles. De plus, à ce jour la souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle il est possible, facilement, de modifier le génome afin de créer des modèles de maladies humaines. L'étiologie de l'autisme a une forte base génétique. Les modèles transgéniques impliquant la manipulation (suppression ou modification des gènes à haut risque pour l'autisme) sont considérés comme les modèles ayant une forte « valeur de construction ». Conformément aux études précédentes, pour explorer le comportement en même temps que l'activité cérébrale, les souris auront 4-5 semaines au début des chirurgies, 8-9 semaines au début de la tâche comportementale. Pour l'exploration de l'activation du cervelet, les souris auront 10 -12 semaines au début de la procédure.

L'extrémité de la queue coupée et le saignement observé jusqu'à trente minutes, puis la carotide mise à nu et ponctionnée, le saignement observé vingt minutes encore : 32 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mêmes animaux subissent les deux épreuves, ce que le porteur présente comme une mesure de réduction. Le projet cherche à mesurer le rôle d'une enzyme, la PKC theta, dans l'arrêt du saignement, avec l'espoir lointain de traitements antiplaquettaires plus sûrs pour les patients. Toutes les souris sont tuées, la ponction de la carotide et la perte de sang qu'elle entraîne étant, selon le porteur, incompatibles avec un réveil.

Objectifs

L’hémostase est le processus biologique assurant l’arrêt des saignements. Elle implique notamment les plaquettes sanguines, qui, suite à une lésion vasculaire, adhèrent, s’activent et agrègent pour former un caillot qui bouche la lésion vasculaire. Ce processus implique différents récepteurs des plaquettes. Des études récentes suggèrent un rôle de la protéine kinase C (PKC) theta dans les voies de signalisation des certains de ces récepteurs. Le but de ce projet est d’évaluer le rôle de la PKC theta dans l’hémostase en évaluant l’impact de son absence ou de la présence d’une PKC theta humaine dans des modèles d’hémostase chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre le rôle de la PKC theta dans l’arrêt du saignement. Les récepteurs comprenant la PKC theta dans leur voie de signalisation sont impliqués dans l’arrêt du saignement mais également en thrombose artérielle. Un bénéfice à long terme de ce projet pourrait être le développement de nouveaux traitements antiplaquettaires impactant peu l’arrêt du saignement, et donc plus sûr pour le patient que les traitements actuellement disponibles.

Procédures

Les animaux anesthésiés sont soumis à un temps de saignement à la queue (coupure de l’extrémité de la queue et observation du saignement jusqu’à son arrêt, maximum 30 min) et à une exposition de la carotide avec un temps de saignement à la carotide (ponction de la carotide et observation du saignement pendant 20 min).

Impact sur les animaux

Pour toutes les procédures, une des nuisances attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée) ainsi que le risque de saignement au site d’incision.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure car une ponction de la carotide, et la perte de sang importante qui en découle, n’est pas compatible avec un réveil de l’animal.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle de la PKC theta dans l’arrêt du saignement. Ce processus étant particulièrement complexe et faisant intervenir plusieurs types cellulaires (plaquettes, globules rouges, globules blancs) ainsi que les conditions d’écoulement du sang (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité. De plus, il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle d’arrêt du saignement in vitro.

Réduction

Le projet se fera par étapes. Les mêmes animaux seront utilisés pour les 2 modèles de temps de saignement afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Ce nombre est fixé à 8 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les effectifs sont calculés selon notre expérience sur les modèles d’hémostase, le critère recherché étant la comparaison de moyennes (temps d’arrêt du saignement, volume de sang perdu).

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Les animaux seront habitués à la contention pour faciliter l’injection IP d’anesthésiant. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’expérimentation • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant l’expérimentation ainsi que son réveil en boite à 37°C • Par l’injection d’analgésique avant chaque procédure. • Par application de gel sur les yeux lors de l’anesthésie afin de les protéger. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont largement maitrisés et caractérisés, notamment les modèles d’arrêt du saignement. De plus, les techniques de mutation génétique ont permis de générer des souris déficientes pour le la PKC theta ou exprimant la PKC theta humaine, nous permettant ainsi d’évaluer leur rôle respectif dans l’arrêt du saignement. Les souris seront utilisées au stade adule entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris adultes et ne présentant pas encore de vieillissement.

Gavage quotidien, trois injections dans l'abdomen par semaine ou implantation d'une pompe sous la peau, radiographies sous anesthésie, deux heures en cage métabolique et prélèvement de sang par ponction du cœur : 284 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet teste trois inhibiteurs déjà développés pour d'autres maladies sur un modèle murin d'ostéopathie striée avec sclérose crânienne, maladie osseuse rare sans traitement. Le porteur écrit n'envisager "aucun autre dommage" que la manipulation et l'isolement, puis conclut avec la structure chargée du bien-être des animaux non-humains que l'accumulation de ces nuisances légères occasionne une souffrance modérée. Toutes les souris sont tuées pour prélever leurs os et leur cæcum, et le porteur affirme qu'aucune alternative ne remplace le traitement d'un "organisme entier".

Objectifs

L’ostéopathie striée avec sclérose crânienne (OSSC) est une maladie osseuse génétique caractérisée par une augmentation de la formation osseuse par suractivation des ostéoblastes, cellules fabriquant le tissu osseux. Cette activation incontrôlée des ostéoblastes est due à une mutation d'un gène particulier. Les patients présentent du fait de la formation osseuse exagérée, des compressions de structures vasculaires et nerveuses, notamment au niveau du crâne, de la mâchoire ou encore du rachis. Il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement à proposer aux patients, qui subissent des interventions chirurgicales à répétition pour lever ces compressions. Un modèle murin de la pathologie a été généré. L’objectif de ce projet est de tester dans le traitement de l’OSSC 3 molécules qui ont déjà été développées et utilisées dans le traitement d’autres pathologies. Grâce à nos précédents travaux, nous avons défini la fenêtre thérapeutique à laquelle nous allons tester 3 inhibiteurs pour traiter les conséquences de la mutation dans le modèle murin de l'OSSC. Entre 8 et 11 semaines, les animaux mutés seront traités avec l'un des trois molécules. A l’issue de ces trois semaines de traitement, les conséquences de l'utilisation de ces 3 molécules seront évaluées par l’analyse du phénotype osseux (analyse par radiographie et microtomographie de l'architecture osseuse).

Bénéfices attendus

L’OSSC est une maladie rare caractérisée par une augmentation de la densité osseuse s’accompagnant de compressions vasculaires et nerveuses. Cette pathologie, causée par des mutations dans un gène identifié et impliqué dans une voie de signalisation impliquée dans le développement osseux, ne bénéficie pour le moment d’aucun traitement efficace. L’objectif de ce projet est de tester dans le traitement de l’OSSC 3 inhibiteurs de cette voie de signalisation déjà développés et utilisés dans le traitement d’autres pathologies. Si l’un ou plusieurs de ces inhibiteurs se révèlent efficaces, ces travaux permettront d’entamer les démarches pour le repositionnement de ces inhibiteurs dans le traitement de l’OSSC.

Procédures

L’identification d’un potentiel traitement pour l’OSSC nécessite soit 3 injections intrapéritonéales par semaine, soit l’implantation de pompes osmotiques soit le gavage quotidien des animaux. A l’initiation du traitement, à mi-chemin et à la fin du traitement, le phénotype osseux des souris est exploré par un examen radiographique qui nécessite une anesthésie et qui dure 5 minutes, 2 h maximum d'isolement en cage métabolique pour le recueil d'urines pour l’analyse des marqueurs osseux urinaires, l’injection de 2 molécules pour analyser la formation dynamique de l’os (2 minutes par injection) et enfin, le prélèvement sanguin intracardiaque pour l’analyse des marqueurs osseux sanguins.

Impact sur les animaux

Aucun autre dommage que d’être manipulé pour l’injection (anesthésies et injections de fluorochromes) et isolé pendant 2h maximum n’est envisagé dans le cadre de la caractérisation du phénotype osseux. Les injections, peuvent éventuellement provoquer une gêne très passagère mais qui ne nécessite pas de médication particulière. Cependant, en concertation avec la SBEA locale, nous estimons que l'accumulation de nuisances légères occasionne une souffrance modérée.

Devenir

Les animaux concernés par cette procédure sont mis à mort pour réaliser des prélèvements post-mortem des os et des caecum qui permettront de caractériser le phénotype osseux et de définir une fenêtre de traitement.

Remplacement

L’OSSC est une maladie rare caractérisée par une augmentation de la densité osseuse s’accompagnant de compressions vasculaires et nerveuses. Cette pathologie, causée par des mutations dans un gène identifié et impliqué dans une voie de signalisation impliquée dans le développement osseux. La culture de cellules mutées in vitro a déjà fourni des informations sur les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette pathologie mais toutes ces études préalables in vitro sont menées sur des cellules de patients. Or, ces derniers ne peuvent être diagnostiqués que quand l’ostéosclérose est déjà installée, celle-ci n’apparaissant que lorsque le gène est muté. C’est pourquoi un modèle de souris où le gène est invalidé a été généré. Ce modèle nous a permis de définir la fenêtre thérapeutique (entre 8 et 11 semaines) où les animaux vont être traités. Aucune alternative ne peut remplacer le traitement systémique d’un organisme entier, ici le modèle murin de la maladie, par des inhibiteurs de cette voie de signalisation.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (284) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires à l’éventuel repositionnement d’inhibiteurs déjà existants pour d'autres applications dans le traitement de l’OSSC. L’analyse initiale du modèle à 6 semaines ainsi que nos travaux précédents permet d’estimer la puissance statistique de nos analyses et l’échantillonnage nécessaire pour caractériser les effets biologiques souhaités.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les conditions standards de l’animalerie. L’utilisation de pompes osmotiques remplace les injections intra-péritonéales ou sous cutanées quotidiennes et réduit donc le stress que représentent la contention et les injections nécessaires sur des périodes prolongées. Le volume libéré par les pompes est beaucoup plus faible que lors d’une injection, puisqu’il diffuse au cours de la journée, et la pompe contient un volume nécessaire pour un traitement chronique sur 4 semaines. Ainsi cela nous permettra de nous affranchir de la clairance et de la demi-vie de la molécule testée. Ce mode d'administration est un mode que nous souhaiterions développer au sein du laboratoire pour limiter le stress des animaux. Sous anesthésie gazeuse, les pompes seront placées sur le côté de l’animal, sous la peau, après avoir effectué une légère incision, puis suturé à l’aide d’agrafes chirurgicales. Ce mode de suture est préféré aux points de sutures avec un fil chirurgical en raison de sa solidité dans le temps et de sa rapidité à mettre en place de manière à diminuer le temps d'anesthésie de l'animal. Les animaux se verront administrer un analgésique au moyen d’une injection sous cutanée ou en intra-péritonéale toutes les 12h pendant 2 jours. Les mesures de densité minérale osseuse, seront effectuées tous les 15 jours sous anesthésie avec analgésie. Le temps de radiographie sera d’environ 5 minutes par animal et il sera surveillé jusqu’à son réveil. Le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs assureront une surveillance quotidienne. Nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux aux différents temps de la procédure qui se résument à 6 injections intrapéritonéales (anesthésies et injections de fluorochromes dilués dans du sérum physiologique qui sont nécessaires au suivi de la formation dynamique de l’os), 2h maximum d’isolement en cage métabolique pour un recueil d'urines. Cependant, dans l’éventualité d’apparitions de signes de souffrance, les mesures préalablement définies dans le projet - surveillance plus fréquente, traitement analgésique et apport de nourriture gélifiée - seront appliquées. En cas d'impossibilité à réduire ou stopper la douleur, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

L’identification de potentiels traitement de l'OSSC, maladie rare osseuse, nécessite l’administration systémique dans un organisme entier, ici le modèle murin de la pathologie. Avant l’initiation du traitement, à 8 semaines, à mi-chemin de la durée du traitement et à la fin du traitement à 11 semaines, le phénotype osseux de toutes les souris traitées sera analysé afin de pouvoir analyser l’effet du traitement sur les animaux.

Gavées quatre jours avec des antibiotiques puis vingt-huit jours avec des probiotiques, 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour l'analyse de leur tube digestif. L'objet du projet est de dérégler leur microbiote intestinal avec une dose légère d'antibiotique, puis de tester quels régimes, prébiotiques ou probiotiques le rétablissent. Le porteur reconnaît que la contention et le gavage constituent des nuisances, avec un risque de fausse route entraînant la mise à mort immédiate de l'animal, et propose comme raffinement des "caresses avant le gavage". Il affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu "selon plusieurs études" qu'il ne cite pas, et indique administrer les antibiotiques dans l'eau de boisson au détriment de la précision des quantités ingérées.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste à perturber l’équilibre du microbiote intestinal en utilisant un traitement antibiotique léger. Plusieurs régimes sont ensuite testés pour évaluer leur capacité à rétablir ou non l'équilibre intestinal. Ces régimes sont constitués de macronutriments (protéines, lipides, glucides), de probiotiques (microorganismes bénéfiques pour l’organisme) ou prébiotiques (substances non digestives favorables au développement de la flore intestinale).

Bénéfices attendus

Expertiser l'impact d'une dose légère d'antibiotique sur l'homéostasie intestinale. Voir l'impact de certains produits (macronutriments, prébiotiques et probiotiques) sur le microbiote intestinal. Trouver des méthodes alternatives pour améliorer l'homéostasie intestinale par des régimes riches en macronutriments,, prébiotiques ou probiotiques.

Procédures

1)Gavage qui dure 4 jours pour les antibiotiques. (20 secondes par souris) 2) Gavage de probiotiques 28 jours. (20 seconde par gavage par souris) 3)Prelevement de féces une fois par semaine. (Maximum 15 minutes par prelevement) 4) Prise du poids une fois par semaine. (15 seconde paar souris) 5) Prise d'urine une seule fois à la fin du porotocole. (Maximum 15 minutes par prelevement)

Impact sur les animaux

Le modèle avec une dose légère d'antibiotique ne génère pas de diarrhée. Aucun effet indésirable n'est attendu selon plusieurs études. Par ailleurs, bien que réalisée par du personnel compétent, la préhension et la contention ainsi que le geste de gavage constituent des nuisances pour les animaux. Le stress, l'introduction accidentelle de liquide ainsi que la perte de poids sont des complications physiologiques et psychologiques que les manipulateurs vont essayer d'éviter.

Devenir

384 souris seront mises à mort pour analyser l'impact des modifications de la flore intestinale sur le tube dijestif.

Remplacement

Une grande étude in vivo est réalisée en amont de ce modèle. L'impact de 240 souches probiotiques, prébiotiques et macronutriment (lipides) a été réalisé in vitro sur des cellules de l'intestin. Seuls les produits avec un fort impact sont retenus pour la phase in vivo. Présélectionner les produits in vitro est une étape très importante vu le nombre de produits qui ne vont pas être sélectionnés pour la phase in vivo. Cependant, l'impact des antibiotiques passe essentiellement par le microbiote intestinal et seul le modèle animal peut offrir la possibilité de perturber le microbiote intestinal ainsi que les effets de cette perturbation sur l'homéostasie intestinale..

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre de souris utilisables pendant la partie in vivo, un grand travail in vitro estréalisé en amont. Les macronutriments, prébiotiques et probiotiques ne présentent que 10 % des produits testés in vitro 90 % des produit testé ne passeront pas à l'étape in vivo. Concernant la partie biostatistique et pour avoir des résultats statiquement interprétables au niveau de l’étude de la flore intestinale, les groupes seront composés de 8 animaux.

Raffinement

Le choix du modèle animal implique automatiquement la prise en compte des mesures de raffinement liées au nombre de souris par cage qui respectera le confort animal. Dans ce modèle le nombre de souris programmé est de 8 souris par cage en portoir ventilé. L’enrichissement des cages et l’entretien des animaux en présence de professionnels et scientifiques expérimentés est la première préoccupation des meneurs de ce projet. Le suivi quotidien des animaux 7 jours sur 7 permettra d’améliorer leurs conditions de vie en captivité en diminuant les sources de stress. Mettre en place une surveillance constante des animaux pendant les procédures expérimentales, pour détecter rapidement tout signe de détresse ou de malaise. Pré-entraîner les animaux à des procédures non douloureuses pour réduire le stress lors des manipulations ultérieures. Utiliser des méthodes de renforcement positif telque les caresses avant le gavage pour faciliter la coopération des animaux. Afin d’éviter de faire subir 2 gavages par jour aux animaux, l’administration des antibiotiques se fera par l’intermédiaire de l’eau de boisson. Cette option prend en compte le bien-être des animaux au détriment de la précision des quantités ingérées. Établir des critères clairs définissant les points limites à ne pas dépasser en termes de détresse, de douleur ou desouffrance animale. Mettre en place des protocoles pour arrêter immédiatement toute procédure en cas de dépassement des points limites, les critéres d'arret par rapport à la souffrance seront les suivants: •score supérieur ou égal à 10 selon critères de jugement •comportement de l’animal : animal isolé par rapport au milieu extérieur, posture inhabituelle, piloérection. •fèces ; décoloration et/ou présence de sang. Au cas ou le gavage abime la trachée ou fait fausse route l'animal est immediatement mis à mort. En cas de souffrance l'utilisation d'analgésique est envisagable.

Choix des espèces

Le protocole sera réalisé avec des souris, car c'est le modèle expérimental le plus utilisé pour l'étude de la santé intestinale et du microbiote. Les modèles murins ont été particulièrement utiles pour mieux comprendre certaines fonctions du microbiote des mammifères, et nous considérons donc qu'ils sont adaptés à nos recherches. Le debut des traitement à 6 semaines coincide avec le debut de maturation de la flore intestinale. Avant la prise des antibiotiques la flore intestinale presentera un indice de diversité trés élevé, l'impact des antibiotiques sur la flore intestinale sera plus important.

1 204 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées et leur cerveau prélevé, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux opérations du crâne sous anesthésie, de 45 à 120 minutes, puis apprend une tâche récompensée par de l'eau, tête immobilisée, quarante minutes par jour pendant deux mois. La récompense repose sur une restriction hydrique, les souris recevant la moitié de leur consommation d'eau habituelle et perdant 10 % de leur poids, perte que le porteur décrit comme impossible à éviter. Il écrit par ailleurs qu'aucune souffrance inhérente n'est associée à l'usage de ces souris transgéniques et que l'habituation garantit qu'elles ne ressentent "ni stress ni anxiété".

Objectifs

L’autisme est un trouble neurodéveloppemental caractérisé par des déficits sociaux, des comportements répétitifs et les altérations sensorielles. Il est estimé qu'à l'échelle mondiale, environ un enfant sur 34 est atteint d'autisme. Malgré la prévalence de l’autisme, les mécanismes neurobiologiques responsables des changements du comportement ne sont pas bien compris. Une meilleure compréhension de la neurobiologie de l’autisme est cruciale pour la gestion des symptômes des personnes autistes, le développement d'approches thérapeutiques innovantes, ainsi que pour l’amélioration du diagnostic. L'objectif de ce projet est d’utiliser des souris génétiquement modifiées, possédant les traits de l’autisme, pour étudier de manière plus approfondie les altérations neuronales dans l’autisme. Dans cette étude, qui se déroule dans 2 établissements utilisateurs, nous avons donc choisi de nous concentrer sur deux régions du cerveau qui sont similaires entre la souris et l'homme. Nous proposons de développer et d'utiliser une nouvelle expérience comportementale visant à identifier à la fois les altérations comportementales et les modifications physiologiques cérébrales dans ces souris modèles de l’autisme. Ces mesures nous permettront de tester quels mécanismes cellulaires peuvent être responsables des altérations comportementales liées à l'autisme. Finalement, nous pourrons tester grâce à cette tâche comportementale, si une intervention pharmacologique ciblant ces mécanismes peut corriger les altérations comportementales présentes au niveau sensoriel dans l’autisme. Nous utiliserons pour cela, une molécule expérimentale qui a déjà été testée dans des essais cliniques chez l'homme et dont le profil de sécurité et la pharmacocinétique sont bien définis.

Bénéfices attendus

Des études de dépistage à grande échelle menées aux États-Unis suggèrent que la prévalence de l'autisme est de 1 enfant sur 34. Bien qu'il n'existe pas d'études de cette ampleur en Europe, la prévalence de l'autisme est probablement similaire. Les symptômes sensoriels affectent la grande majorité des personnes atteintes d'autisme et ont des conséquences fortement négatives sur leur vie quotidienne. Par exemple, ils pourront avoir des difficultés pour s’intégrer dans une classe bruyante, des difficultés pour manger certains aliments ou pour porter certains vêtements. Ces symptômes sont une source majeure de stress pour les familles concernées. La compréhension des processus neurophysiologiques qui sont à l’origine de ces difficultés sensorielles peut apporter des informations importantes sur la façon dont le fonctionnement du cerveau est altéré dans l'autisme. De telles études peuvent conduire à l'identification des mécanismes moléculaires, cellulaires et cérébrales qui sont responsables des perturbations sensorielles, révélant ainsi de nouvelles cibles pour le développement de traitements pharmacologiques visant à améliorer des symptômes tels que la surcharge sensorielle ou l'hyper/hypo-réactivité sensorielle. De telles études nécessitent des approches invasives et des manipulations qui ne sont pas possibles dans un cadre clinique. Nous pensons que notre étude permettra de mieux comprendre les types de cellules et les circuits impliqués dans l'altération de la perception multisensorielle. Elle fournira des biomarqueurs précliniques pour l'évaluation de nouveaux médicaments expérimentaux. Elle nous permettra d'évaluer l'efficacité d'un médicament expérimental existant qui a été proposé comme traitement de l'autisme. Notre étude a le fort potentiel de fournir des informations qui, à terme, amélioreront la vie des personnes diagnostiquées autistes. Ces connaissances peuvent également renforcer l'autonomie et le bien être des personnes autistes en leur permettant de comprendre pourquoi elles se sentent comme elles le font dans certaines situations.

Procédures

Tous les animaux inclus dans les expériences comportementales seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : la première durera environ 45 à 90 minutes, et la deuxième durera de 90 à 120 minutes (EU « A »). Pour comprendre les mécanismes neurobiologiques sous-jacent de l'autisme, les animaux apprendront à effectuer une tâche comportementale non aversive et non douloureuse, basé sur les récompenses, pendant 45 minutes par jour (EU « B »). En même temps, nous effectuons des mesures de l'activité des neurones du cerveau (EU « B »). Afin de permettre ces enregistrements, les animaux sont entraînés à accepter une contention partielle (immobilisation de la tête). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de leur tête d’une minute à 35 minutes, pendant 5 jours (EU « B »). Cela permet aux animaux d’apprendre que cette immobilisation est réversible et non douloureuse. Lorsqu'ils seront à l'aise avec le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l'entraînement à la tâche comportementale commencera. Chaque session de travail comportemental dureras 40 minutes, et les sessions seront répétées quotidiennement pendant 2 mois (EU « B »). Tous les animaux inclus dans les expériences visant à définir l'activité du cerveau hors cadre comportemental seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie, qui durera 90 minutes (EU « A »). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de la tête d’une minute à 35 minutes, pendant 5 jours (EU « B »). Cela permet aux animaux apprendre que cette immobilisation est réversible et pas douloureuse. Lorsqu'ils seront à l'aise dans le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l’enregistrement de l’activité du cerveau commencera (EU « B »).

Impact sur les animaux

1) Chirurgies: Les animaux seront soumis à des interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie. Le risque d'inconfort, de douleur, d'infection et/ou de perte de poids est inhérent à ces procédures. 2) Immobilisation partielle : L’enregistrement de l’activité neuronale des différents groupes des neurones nécessite de maintenir la tête de l'animal dans une position fixe. Cette méthode n'est pas douloureuse et est bien établie dans la littérature, mais elle provoque un malaise pendant les premiers séances. 3) Restriction hydrique : Notre tâche comportementale nécessite la mise en place d’une récompense. Après notre étude précédente, nous avons choisi une récompense hydrique (nécessitant la restriction de l’eau). La perte de poids (10 % du poids initial de l'animal) ne peut être évitée car les souris reçoivent une ration d'eau correspondant à 50 % de leur consommation d'eau ad libitum.

Devenir

Toutes les souris seront euthanisiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.

Remplacement

Les expériences proposées dans cette étude nécessitent des circuits neuronaux intacts et des mesures à la fois physiologiques et comportementaux. Un modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité de ces interactions neuronales et ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas adaptées à notre objectif expérimental des approches invasives sont nécessaires pour répondre à notre question scientifique. Les circuits neuronaux sont bien conservés chez les différentes espèces mammifères et sont donc susceptibles d'être fonctionnellement similaires chez les rongeurs et les humains. L’utilisation des modèles de plus faible sensibilité neuronale (tels que la mouche à vinaigre) n’est pas adaptée non plus à notre projet, car cet organisme ne possède pas la structure cérébrale ciblée par notre étude.

Réduction

Une conception expérimentale minutieuse garantira la reproductibilité des résultats et, avec des techniques d'analyse statistique appropriées, l'utilisation d'animaux sera réduite au minimum. Les protocoles comportementaux, physiologiques, et pharmacologiques ont déjà été mis en place pour une étude précédente sur la perception tactile. Une première étude pilote a été réalisée pour modifier les protocoles comportementaux pour étudier la perception multisensorielle. Cette première étude nous a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser ces expériences et avoir des résultats statistiquement valides. Cela nous a permis d'assurer la crédibilité de nos résultats avant de procéder à l'étude principale. Les données comportementales, physiologiques, et pharmacologiques seront recueillies auprès des mêmes animaux. Les injections du traitement seront précédées par les injections contrôles dans les mêmes animaux. Toutes les expériences seront réalisées par groupe de 6 à 8 souris, et notre stratégie sur le nombre des souris nécessaire sera adaptée aux résultats. Ces mesures nous permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés dans l'étude et de mesurer simultanément plusieurs paramètres.

Raffinement

Tous les résultats scientifiques sur les facteurs influençant le bien-être des animaux ainsi que la capacité des animaux à ressentir et à exprimer la douleur, la souffrance, l'angoisse et les dommages durables seront pris en compte. Les expériences seront conçues et réalisées de la manière la plus éthique possible. Des souris transgéniques seront utilisées pour explorer les déficits multisensorielles dans les modèles de souris d’autisme, et aucune souffrance inhérente n'y est associée. Le bien-être des animaux est impératif pour cette étude. Afin de garantir le moins de gêne et de souffrance pour les animaux, le matériel adéquat sera mis à disposition des personnes autorisées, compétentes et dûment qualifiées, qui respecteront rigoureusement les procédures mises en place. Pour les chirurgies: Utilisation d'anesthésiques, d'analgésiques, d'un anti-inflammatoire, d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Tous les animaux seront manipulés en utilisant les techniques les moins stressantes possibles, conformément à la littérature : l'utilisation d'un tunnel ou des mains en forme de coupe. Les animaux seront transférés entre les deux sites dans leurs cages d'origine, pendant leur phase active, et placés dans l'obscurité à l'intérieur d'un chariot. . Pendant la restriction en eau, les animaux seront pesés chaque jour, et leur alimentation en eau sera ajustée afin de s'assurer qu'ils ne dépassent jamais une perte de poids de 10 %. Un tube et du matériel de nidification seront placés dans chaque cage afin de garantir la poursuite de tous les comportements normaux de l'animal. Les animaux seront placés dans des cages collectives afin de garantir des interactions sociales. L'hydrogel qui sera fourni comme source d'eau est considéré comme un enrichissement car les animaux le manipulent abondamment avec leurs pattes avant. Les animaux seront habitués à la pièce d’expérimentation. Les animaux seront progressivement habitués à la fixation de la tête pour garantir un stress minimal. Tous les animaux exploreront librement l'installation avant et après chaque session, en marchant et en grimpant sur ses différentes parties. Les stimulations tactiles et auditives utilisées pendant la tâche comportementale ne sont pas douloureuses et ne provoquent pas des crises d’épilepsie. Des points limites spécifiques et des mesures conservatrices pour chaque phase de la procédure sont définis.

Choix des espèces

L’utilisation des souris transgéniques a été privilégiée pour rester cohérent avec les études antérieures effectuées au sein de notre équipe. Les rongeurs ont des systèmes somatosensoriel et auditif très développés et sont considérés comme une espèce modèle pour les études concernant le traitement de certains types d'informations sensorielles. De plus, à ce jour la souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle il est possible, facilement, de modifier le génome afin de créer des modèles de maladies humaines. L'étiologie de l'autisme a une forte base génétique. Les modèles transgéniques impliquant la manipulation (suppression ou modification des gènes à haut risque pour l'autisme) sont considérés comme les modèles ayant une forte « valeur de construction ». Conformément aux études précédentes, pour explorer le comportement en même temps que l'activité cérébrale, les souris auront 4-5 semaines au début des chirurgies, 8-9 semaines au début de la tâche comportementale. Pour l'exploration de l'activation du cervelet, les souris auront 10 -12 semaines au début de la procédure.

160 souris immunodéficientes vont être utilisées, chacune portant une tumeur humaine greffée sous la peau du flanc et recevant jusqu'à trente-deux injections intraveineuses sur seize semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont attrapées et maintenues six fois par semaine pour la mesure de la tumeur et la pesée, et subissent des prélèvements de sang sous anesthésie légère. Cinq lignées de cancer humain leur sont greffées, du sein, du pancréas, du poumon, du foie et un mélanome, pour comparer un groupe traité par microARN à un groupe sous placebo. Toutes sont tuées pour que les tumeurs soient collectées, tandis que l'avancée annoncée pour les patients reste écrite au conditionnel.

Objectifs

En France, avec près de 430 000 nouveaux cas de cancers (incidence) et à 150 000 décès (mortalité) en 2023, les cancers représentent l’une des principales causes de mortalité. Le nombre de nouveaux cas de cancers détectés correspond à près de 1 200 cas par jour sur une année. Les cancers les plus fréquents sont ceux du pancréas, du sein, du côlon-rectum et du poumon. Dans ce contexte, les microARNs (miARNs) sont de petites molécules régulant la biologie des cellules cancéreuses. Ils sont actuellement très étudiés en oncologie et représentent de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre objectif est de démontrer l’efficacité de ces candidats sur l’inhibition de la croissance des cellules tumorales humaines dans un modèle de greffes sous-cutanées chez la souris immunodéficiente. Ainsi, 1 lignée de cancer du sein, 1 lignée de cancer du pancréas, 1 lignée de cancer du poumon, 1 lignée de cancer du foie et 1 lignée de mélanome seront utilisées. L’étude de l’effet de ces miARNs sur la croissance des tumeurs de souris greffées avec des cellules cancéreuses, consistera à comparer un groupe de souris traitées avec le médicament à un groupe de souris traitées avec un placebo.

Bénéfices attendus

A ce jour, la mise en évidence de nouveaux traitements ou de nouvelles combinaisons de traitements représenterait une avancée majeure dans la prise en charge thérapeutique des patients atteints de cancer du sein, du pancréas, du poumon, du foie et de mélanome de type agressif et réfractaire. Notre étude s’attache à proposer de nouveaux traitements ou de nouvelles combinaisons de traitements afin de contrecarrer la résistance aux traitements et les mécanismes d’échappement.

Procédures

Des cellules humaines seront injectées en sous cutané (1 fois, 5 minutes), ceci entrainera le développement d'une tumeur au niveau du flanc. Les animaux seront pris en contention 3 fois/ semaine (1 minute) pour la mesure de la tumeur et 3 fois /semaine (30 secondes) pour la prise de poids, pendant 16 semaines maximum et subiront une prise de sang (45 secondes). Lors des traitements thérapeutiques (durée de 4 à 16 semaines), les animaux subiront des injections intra-veineuses (8 fois minimum à 32 fois maximum, 20 secondes) et un prélèvement sanguin (sous anesthésie légère).

Impact sur les animaux

Le développement d’une tumeur après inoculation de cellules tumorales peut entrainer une gêne à la locomotion dans de très rares cas. Lors des traitements, les animaux subiront des injections intra-veineuses répétées et un prélèvement sanguin (sous anesthésie légère). Ceci pourrait entrainer une irritation au point d’injection et une légère douleur. Les contentions multiples pour les traitements, le suivi tumoral ou la prise de poids peuvent entrainer un stress.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, afin de collecter les tumeurs pour analyses.

Remplacement

Notre laboratoire développe des modèles cellulaires en 3 dimensions (type sphéroïdes, tumoroïdes et organoïdes) permettant de remplacer une partie des études précliniques chez la souris en testant in vitro l’efficacité des miARNs. Seuls les miARNs ayant montré un effet significatif sur l’inhibition de l’agressivité des cellules tumorales ont été choisis dans cette étude. Bien que pertinents, ces systèmes comportent des limites et ne récapitulent pas toute la complexité du développement tumoral chez l’homme ce qui explique le recours à des animaux.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons utilisé un test statistique ainsi que des résultats préalables, détaillés dans la littérature. Grâce à ces approches, nous avons déterminé que des groupes expérimentaux composés de 10 animaux permettront d’obtenir des résultats statistiquement corrects et qui ne compromettront pas l’interprétation de nos résultats. Les travaux seront réalisés sur des souris femelles pour les modèles de cancer du sein et sur des souris mâles pour les autres cancers.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi pour limiter leur stress. Les animaux seront surveillés hebdomadairement par le personnel animalier lors du change et quotidiennement par les personnes en charge de l’expérimentation afin d’observer leur comportement, leur apparence et tous signes qui permettraient d’identifier des indications révélatrices de souffrance animale. Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées afin d’assurer le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Les animaux seront anesthésiés pour la greffe cellulaire. Ils seront anesthésiés et recevront un analgésique lors du prélèvement sanguin. Les animaux seront également suivis périodiquement avec des points limites définis en lien avec le site d’implantation des cellules tumorales. Si l’un des points limites définis est atteint, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Dans le cadre de notre étude, nous utilisons des modèles qui sont bien caractérisés dans la communauté scientifique. L’utilisation de souris mâles et femelles permet une analyse statistique plus étendue en comparaison des mammifères de plus grandes tailles et représente un modèle de choix compte tenu des similitudes avec l’Homme. Dans le cadre de notre étude, nous utilisons des modèles qui sont bien caractérisés au laboratoire ou par ailleurs. Dans ce contexte, les modèles de souris immunodéficientes représentent les modèles les mieux caractérisés pour la mise en place de greffe de cellules humaines sans rejet. Nous utiliserons des souris adultes d’âge homogène de 8 à 12 semaines. A ces âges, les animaux présentent des caractéristiques adultes et sont réceptifs à la prise de greffes à 100%.