Souris
Caractérisation de la voie d’administration et de la dose optimale de nouveaux composés antidiabétiques
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Jusqu'à dix-neuf prélèvements de sang par incision de la queue et dix-huit gavages ou injections hebdomadaires par animal : 4 800 souris diabétiques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le protocole compare cinq variantes d'une protéine, à cinq doses et par quatre voies d'administration, pour identifier la combinaison la plus efficace contre le diabète de type 1. Le porteur énumère lui-même les risques de perforation de l'œsophage, de perforation d'organes internes, d'œdèmes, d'hématomes et de lésions veineuses liés à ces gestes répétés, tout en décrivant le modèle comme présentant une hyperglycémie modérée. Toutes les souris sont tuées pour des analyses post-mortem.
Objectifs
Notre recherche porte sur le diabète de type 1 (DT1), une maladie caractérisée par la destruction des cellules pancréatiques responsables de la production d'insuline. Cette destruction entraîne des hyperglycémies chroniques, pouvant entraîner de graves complications vasculaires. Nous avons identifié une protéine capable de régénérer ces cellules et avons développé cinq variantes de cette protéine, que nous avons testées sur des souris diabétiques. Nos résultats préliminaires indiquent que ces nouvelles protéines stimulent la prolifération des cellules productrices d'insuline, ce qui pourrait en faire des traitements prometteurs pour le DT1. Pour développer un traitement antidiabétique, nous souhaitons évaluer l’efficacité de chacune de ces protéines. L’objectif est de déterminer laquelle d’entre elles est la plus efficace, ainsi que la dose optimale et la méthode d’administration la plus adaptée. Nous testerons donc cinq concentrations différentes avec quatre méthodes d'administration (intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse et orale) sur un modèle de souris diabétiques, afin d'évaluer leur efficacité dans le contexte du DT1. Notre approche sera séquentielle et hiérarchisée : si l'une des protéines candidates montre de bons résultats avec une méthode et une dose spécifiques, nous pourrons écarter les autres options, réduisant ainsi le nombre de souris nécessaires.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude seront déterminants pour identifier la dose optimale et la voie d'administration offrant la meilleure efficacité antidiabétique de nos analogues. En les combinant avec les autres études en cours, notamment les études pharmacocinétiques, nous maximiserons les chances de succès dans le développement d'une thérapie pour le diabète de type 1.
Procédures
En plus de la mesure de la glycémie en début de procédure, plusieurs prélèvements sanguins seront effectués sur chaque animal, selon leur groupe : trois prélèvements seront réalisés par ponction de la veine caudale (après incision de la queue) pour le groupe traité pendant 3 semaines (soit 4 prélèvements au total, incluant le prélèvement initial; durée de l'intervention : 30 secondes); dix prélèvements seront réalisés pour le groupe traité pendant 10 semaines (soit 11 prélèvements au total; durée de l'intervention : 30 secondes); dix-huit prélèvements seront réalisés pour le groupe traité pendant 18 semaines (soit 19 prélèvements au total; durée de l'intervention : 30 secondes). En fonction des groupes, chaque animal recevra soit une injection, soit une administration orale par gavage du composé, effectuée de manière hebdomadaire : trois injections ou administrations orales pour le groupe traité pendant 3 semaines (durée de l'intervention : entre 30 secondes et 1 minute); dix injections ou administrations orales pour le groupe traité pendant 10 semaines (durée de l'intervention : entre 30 secondes et 1 minute); dix-huit injections ou administrations orales pour le groupe traité pendant 18 semaines (durée de l'intervention : entre 30 secondes et 1 minute).
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans cette étude constitue un modèle classique pour l'étude du diabète de type 1 (DT1), présentant généralement une hyperglycémie modérée. La ponction de la veine caudale, qui implique l'extraction de sang de la veine située dans la queue, peut entraîner une douleur ou un inconfort, avec un risque d'infection si le site n'est pas correctement aseptisé. Ces prélèvements seront effectués de manière hebdomadaire, pouvant atteindre jusqu'à 18 prélèvements selon les groupes, augmentant ainsi le risque d'infection. L'administration orale par gavage peut provoquer du stress et de l'inconfort, avec des risques de perforation ou de blessure de l'œsophage, ainsi que d'aspiration de liquide dans les poumons, entraînant des difficultés respiratoires si la sonde est mal positionnée, surtout en cas de répétition de la procédure. Les injections intrapéritonéales (IP), sous-cutanées (SC) et intraveineuses (IV) comportent également des risques d'inconfort et de douleur au site d'injection. Pour les injections IP, il existe un risque de perforation des organes internes, tandis que les injections SC peuvent provoquer des œdèmes ou des hématomes si elles sont administrées trop rapidement. Les injections IV, quant à elles, comportent des risques de saignements et de lésions veineuses. Dans tous les cas, une infection peut survenir si les conditions d'asepsie ne sont pas rigoureusement respectées. Il est important de noter que les injections et les gavages seront également réalisés de manière hebdomadaire, jusqu'à 18 administrations selon les groupes, ce qui accentue les risques liés à ces procédures répétées.
Devenir
À la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre des analyses post-mortem.
Remplacement
Dans notre étude, les composés développés présentent des caractéristiques pharmacodynamiques uniques qui ne peuvent être pleinement évaluées que dans des systèmes biologiques complexes, comme ceux des souris. L'étude in vivo est essentielle pour mesurer avec précision l'efficacité et l'interaction de nos analogues avec leurs cibles biologiques, ainsi que pour comprendre les réponses physiologiques qu'elles déclenchent. Ces mécanismes ne peuvent pas être reproduits de manière fiable par des méthodes in vitro ou par modélisation informatique, rendant l'approche in vivo indispensable pour évaluer l'efficacité thérapeutique potentielle des composés.
Réduction
Nous veillerons à utiliser un nombre minimal d'animaux dans nos expériences. Des analyses statistiques sur des échantillons préliminaires ont révélé que 16 animaux par condition suffisent pour obtenir des résultats exploitables, sans nécessiter de répétitions supplémentaires. Certaines souris peuvent ne pas développer d’hyperglycémie, mais elles ne seront pas écartées, car elles présentent une infiltration lymphocytaire significative, un indicateur préclinique important du diabète de type 1 (DT1). Ainsi, notre étude inclura les souris diabétiques et prédiabétiques pour obtenir des données complètes et fiables sur l'efficacité de nos composés. Enfin, pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous adopterons une approche séquentielle et hiérarchisée. Si un composé montre une efficacité notable avec une voie d'administration et une dose spécifique, les autres conditions seront progressivement écartées. Nous ajusterons les expériences en fonction des résultats obtenus, conformément aux principes des 3R.
Raffinement
La glycémie sera mesurée par prélèvement d'une goutte de sang de la veine caudale. Avant l'incision, une crème analgésique contenant de la lidocaïne sera appliquée sur l'extrémité de la queue pour assurer une anesthésie locale. La ponction sera effectuée rapidement et avec précision pour minimiser le stress, et une légère pression sera appliquée pour arrêter le saignement et prévenir les hématomes. Pour les injections intrapéritonéales (IP), sous-cutanées (SC) et intraveineuses (IV), la zone d'injection sera désinfectée avant et après chaque administration, afin de réduire le risque d'infection. Des aiguilles de petit calibre seront utilisées pour minimiser la douleur et les traumatismes tissulaires. Avant une injection IV, la queue de la souris sera réchauffée dans de l’eau tiède afin de dilater les vaisseaux sanguins, facilitant ainsi l'injection et réduisant les tentatives. Les volumes injectés seront limités afin d’éviter tout inconfort. Pour l'administration orale (gavage), des sondes d’alimentation adaptées seront employées afin de minimiser le risque de perforation de l’œsophage ou de lésions internes. Les animaux seront surveillés attentivement pour déceler tout signe de détresse ou de difficultés respiratoires. Tous les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi et en groupes sociaux, dans des portoirs ventilés. Ils auront accès à de l'eau stérilisée et des aliments irradiés pour minimiser les risques de contamination. Durant toute la procédure, les animaux seront surveillés à l’aide d'une grille de score pour évaluer et objectiver les éventuelles souffrances, avec des points limites précoces et des mesures correctives adaptées.
Choix des espèces
Les souris utilisées dans cette étude constituent un modèle de référence pour l'étude du diabète de type 1 (DT1), car elles développent spontanément la maladie par des mécanismes similaires à ceux observés chez l'humain. Leur phénotype et les étapes de progression du DT1 sont bien documentés, ce qui permet des études précises et reproductibles. Dans notre étude, ces souris sont essentielles pour évaluer l'efficacité de nos composés dans un contexte de DT1. Pour cette étude pharmacodynamique (i.e. l'étude des effets des analogues sur l'organisme), nous utiliserons des souris âgées de 8 à 20 semaines. Cet intervalle d'âge correspond à la période adulte, où les processus métaboliques sont stabilisés, offrant ainsi une meilleure représentativité des réponses physiologiques et pharmacologiques. À cet âge, les souris présentent un profil métabolique mature, ce qui permet d'obtenir des données d'efficacité plus fiables et transposables, tout en minimisant les variations liées à la croissance ou aux effets du sevrage.
Etude des facteurs influençant la dynamique de colonisation et de clairance digestive lors d’une infection à Clostridioides difficile
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Toutes tuées en fin de procédure pour que soient prélevés les segments de leur tube digestif, 280 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont suivies pendant près de six semaines, reçoivent jusqu'à vingt gavages oro-gastriques pour être infectées par Clostridioides difficile puis réinfectées et traitées aux antibiotiques deux fois par jour pendant huit jours, subissent deux injections dans l'abdomen et deux prélèvements de sang par la joue sous anesthésie. L'infection provoque des diarrhées et une perte de poids que le porteur qualifie de légère à modérée et spontanément résolutive en deux à trois jours. Le recours exclusif à des femelles est justifié non par la biologie de l'infection mais par la "nécessité" de cohérence avec les essais antérieurs de l'équipe.
Objectifs
Clostridioides difficile est une bactérie capable de coloniser le microbiote digestif après sa perturbation par des antibiotiques (ATB). Une fois implanté dans le tube digestif, cette bactérie va provoquer une diarrhée sous l’action des toxines qu’elle produit. Les infections à C. difficile (ICD) sont caractérisées par un taux important de récidive (25% des cas), parfois multiples et particulièrement invalidantes pour les patients malgré un traitement antibiotique bien conduit. A ce jour, les déterminants conduisant à la récidive sont encore mal connus. Plusieurs hypothèses non exclusives ont été avancées pour expliquer leur survenue notamment 1) la persistance de la perturbation du microbiote induite initialement par les antibiotiques, voire la perturbation additionnelle induite par les antibiotiques utilisés dans le traitement des ICD ; 2) une réponse immune non efficace pour neutraliser l’action des toxines produites par la bactérie ; 3) la persistance de la bactérie sous sa forme sporulée (forme de résistance non sensible à l’action des antibiotiques) ou sa survie dans des niches écologiques digestives non accessibles aux antibiotiques. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet a pour objectif de mieux comprendre le processus de colonisation digestive et les déterminants favorisant une disparaition complète de la bactérie du tube digestif ou au contraire la récidive et notamment la rechute à partir de bactéries persistantes dans le tractus digestif sous une forme ou dans une niche écologique particulière à identifier
Bénéfices attendus
Les données qui seront obtenues au cours de ce projet permettront de mieux comprendre le mode de survie de C. difficile au sein du tractus digestif (forme et localisation) permettant la récidive de l'infection et d'identifier des espèces bactériennes associées à la colonisation et à la décolonisation digestive de C. difficile. Elle permettra également de préciser la cinétique de mise en place d'une réponse immune efficace avec la prodcution d'anticorps neutralisant l'action des toxines et son rôle dans le processus de protection de l'hôte contre l'action des toxines produites par la bactérie. Ces données sont essentielles pour identifier et construire les bases de nouvelles stratégies de prévention de traitement des ICD complémentaires aux antibiotiques et limiter le risque de récidive que ce soit par l'utilisation de probiotiques de nouvelles génération et/ou de stratégies d'immunisation notamment la vaccination.
Procédures
Les animaux seront suivis tous les jours longitudinalement pendant près de 6 semaines. Au cours de cette période, ils seront soumis à 2 injections intrapéritonéales sous anesthésie locale du point d’injection (durée de l'IP 30 secondes à 1 minute), à des gavages oro-gastriques (de 1 à 20 selon les procédures) pour l’infection et la réinfection et l'administration biquotidienne des traitements antibiotiques pendant 8 jours (durée du gavage 30 secondes à 1 minute). Il sera également réalisé des prélèvements quotidiens de selles, à 2 prélèvements de sang par voie submandibulaire sous anesthésie générale (durée 2 à 3 minutes).
Impact sur les animaux
Le poinçonnage aux oreilles peut provoquer une douleur légère de courte durée. Les piqures d’aiguille pour les injections intrapéritonéales peuvent provoquer une douleur légère de courte durée. Les gavages orogastriques des animaux pour d’une part pour provoquer une infection digestive et d’autre part pour l’administration par voie orale des antibiotiques du traitement de l’infection peuvent provoquer un stress durant le geste dont la durée est courte. L’infection digestive par C. difficile peut provoquer chez les animaux infectés des signes digestifs de type diarrhée, avec perte de poids légère à modérée liée à une déshydratation légère. Ces signes seront spontanément résolutifs après 2 à 3 jours et l’infection dans ce modèle n’est ni sévère, ni mortelle. Au cours de l’infection, les animaux seront suivis quotidiennement : observation clinique, pesée, recueil des selles et changement de litières. Cette surveillance quotidienne n’occasionne aucune douleur mais peut également provoquer une angoisse légère dans la mesure où elle nécessite de manipuler l’animal. Au cours de ces essais, un prélèvement de sang sera réalisé par voie sous mandibulaire susceptible de provoquer une douleur légère et de courte durée liée à l’incision et un stress du à la manipulation de l’animal mais minimisée par l’anesthésie préalable des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure expérimentale car le prélèvement de différents segments du tube digestif permettra d’identifier le site de persistance de la bactérie dans le tube digestif potentiellement à l’origine des récidives des ICD.
Remplacement
Le recours à l'animal est indispensable pour étudier les différents facteurs impliqués dans le processus de colonisation et décolonisation digestive de C. difficile. Aucun modèle in vitro, ex vivo ou in silico n'est capable de reproduire la complexité du processus infectieux dans son intégralité (réponse immune et perturbation du microbiote digestif). Pour les études portant sur le microbiote, les essais de colonisation chez l'animal restent une étape incontournable pour étudier son rôle, car même les expériences sur modèles cellulaires en trois dimensions ou en biofermenteurs modélisant le tube digestif ne permettent pas de reproduire idéalement le processus infectieux global.
Réduction
La méthodologie de ce projet a été construite sur la base des données déjà collectées au sein de notre équipe et celles de la littérature. Cette expérience acquise nous a ainsi permis de nous focaliser sur les points d’intérêt importants de suivi des animaux et de ne pas démultiplier inutilement les temps de suivi. De plus, une planification statistique rigoureuse a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés au nombre de 280, tout en préservant la validité statistique des résultats de l'étude. L’étude de la rechute, à distance du premier épisode, est intégrée dans l’essai de suivi cinétique de la colonisation et de disparaition digestive lors de ce premier épisode afin de limiter le nombre d’essai et d’animaux nécessaires. Enfin, les groupes contrôles des animaux ont été mutualisés aussi souvent que possible.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 4 par cage avec un tunnel de carton et du papier pour construction de nids comme enrichissement. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer qu'ils subissent le minimum de stress possible. Les litières seront changées quotidiennement pendant la période d’infection et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. Du gel hydrique sera mis dans les cages afin de faciliter la réhydratation des animaux pendant toute la période des signes cliniques de diarrhées. La procédure d'expérimentation sera pratiquée en utilisant des anesthésiques permettant de limiter la souffrance des animaux qui bénéficieront d'une procédure d'euthanasie anticipée avec une sortie d'étude prématurée en cas d'atteinte des points limites éthiquement non acceptables.
Choix des espèces
Le modèle d’infection chez la souris est maintenant établi et classiquement utilisé dans les protocoles d’étude de la colonisation et d’infection digestive par C. difficile par toutes les équipes de recherche travaillant sur ce sujet. Ce modèle se rapproche de l'histoire naturelle de l’ICD non compliquée observée chez l'Homme. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 8 semaines. Ce choix est motivé par la nécessité de travailler à la fois sur des animaux ayant atteint l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation et d'infection par C. difficile déjà décrit par notre équipe et d’autres équipes. Enfin, le choix d’animaux femelles est également motivé par la nécessité de cohérence et d'homogénéité avec nos essais précédents sur la même thématique.
Impact des fongicides sur les fonctions de l’unité gliovasculaire au cours du développement cérébral (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injection intraveineuse de billes magnétiques, injection d'un produit de contraste dans les enveloppes du cerveau, incision de la peau : 420 souris subissent ces interventions sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Les femelles reproductrices reçoivent des fongicides avant l'accouplement, pendant la gestation et pendant l'allaitement, et leur descendance est suivie jusqu'au stade adulte pour observer les vaisseaux du cerveau. Les séances d'imagerie durent jusqu'à une heure par jour, sur deux jours. Les doses administrées sont celles autorisées dans l'eau potable par l'Union européenne et présentées comme non nuisibles pour la santé, alors que l'objet déclaré du projet est de déterminer les effets nocifs qui peuvent en découler.
Objectifs
De récentes études épidémiologiques suggèrent que l’exposition aux pesticides est associée à des troubles neurodéveloppementaux. La majorité de ces études se focalisent sur les neurones et les cellules gliales, cependant une composante reste encore largement inexplorée : la composante vasculaire. Ce projet est divisé en deux parties : - Partie 1 du projet dans l'Etablissement utilisatuer 1 : administrations de fongicides aux animaux géniterus, afin d'étudier les fonctions vasculaires des animaux issus de femelles traitées avant l'accouplement, pendant la gestation et lactation puis après leur sevrage. - Partie 2 du projet dans l'Etablissement utilisateur 2 : étude de l'action des fongicides sur le développement cérébral, plus particulièrement la composante vasculaire, avec deux techniques d'imagerie fonctionnelle peu invasives, pour observer l'inflammation vasculaire, les flux liquidiens dans le cerveau ainsi que le couplage neurovasculaire. Nous réaliserons cette étude dans des modèles murins "sains" et prédisposés génétiquement aux troubles du spectre autitiques, et ce chez les deux sexes. Pour cette étude nous utiliserons un nombre total de 420 animaux.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de mieux comprendre le mode d’action des fongicides sur le développement cérébral d’animaux sains et prédisposés génétiquement aux troubles du spectre autistique, dans l’espoir d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter au plus tôt contre les malformations cérébrales induites par les pesticides, même à faibles doses.
Procédures
Certains lots de souris subiront des interventions (dans l'Etablissement Utilisateur 2) de type : injection intraveineuse de billes magnétiques, injection intra-cisternale de produit de contraste ou une incision de la peau. Toutes ces interventions seront réalisées sur un animal anesthésié et analgésié. La durée de la procédure 2 sera de 40 minutes environ (injection + imagerie). La procédure 3 sera séparée en 2 jours, l'imagerie durera 1h chaque jour. La procédure 4 durera environ 20 minutes.
Impact sur les animaux
Certains lots de souris subiront des interventions (injection intraveineuse) qui peuvent entraîner des effets modérés (irritation au site d'injection). Les lots d'animaux traités avec les fongicides seront exposés à des doses retrouvées dans l'eau potable, autorisées par l'Union Européenne (directive 2020/2184) et considérées comme non nuisibles pour la santé. Le but de notre étude est de déterminer les effets nocifs qui peuvent découler de cette exposition.
Devenir
Les animaux utilisés pour la procédure 2 seront mis à mort afin de prélever les cerveaux et de faire nos analyses. Les autres animaux seront également mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux par expérimentation : 10) a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible.
Raffinement
Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des analgésiques seront coadministrés pour limiter toute souffrance à l’animal. En plus de l'anesthésie, une analgésie sera réalisée pour tout animal subissant une thoracotomie. Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux (gestion optimale de l’élevage, actes de chirurgie ou d’injection intrapéritonéale, gestion de l’anesthésie/analgésie, analyse des points limites). Les animaux sont transportés en groupe de 5 et de l'hydrogel sera placé dans les boîtes de transport afin que les animaux puissent s'hydrater pendant le trajet.
Choix des espèces
La souris est un mammifère où les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'Homme. Cette étude sera sur le stade adulte et nous permettra de voir les effets à long terme d’une exposition prénatale sur le développement et les répercussions au stade adulte.
Impact d’une exposition alimentaire aux pesticides sur un modèle murin génétiquement prédisposé à la colite, une inflammation chronique du colon.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Privées du gène de l'interleukine 10, elles développent spontanément une colite et reçoivent pendant dix semaines une alimentation contenant du glyphosate à deux doses réglementaires, avec collecte hebdomadaire de fèces puis prélèvement de sang sous sédation profonde juste avant la mise à mort. L'inflammation peut provoquer des diarrhées sévères, une déshydratation et une perte de poids atteignant 20 % en quelques jours, seuil qui déclenche alors la mise à mort. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit le dialogue entre microbiote, intestin et foie, et présente l'usage d'un animal de laboratoire "entier" comme "nécessaire".
Objectifs
Les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI) sont des pathologies complexes qui résultent de la combinaison de plusieurs facteurs de risques : génétiques et environnementaux. Dans ces facteurs environnementaux, un déséquilibre du microbiote intestinal, ensemble des bactéries colonisant les intestins, favorise l’apparition de ces pathologies. D’autre part, les contaminants présents dans notre alimentation, tel que le glyphosate, pourraient jouer un rôle dans ces pathologies, notamment chez des individus génétiquement prédisposés. Le glyphosate est le pesticide le plus utilisé dans le monde, et les consommateurs sont principalement exposés via leur alimentation. Chez les plantes, il agit en inhibant une protéine indispensable à la survie de la plante, mais cette protéine est aussi présente dans certaines bactéries du microbiote intestinal. Ainsi, nos résultats préliminaires montrent que l’exposition au glyphosate impacte la composition du microbiote intestinal. Cependant il n’est pas connu si ces changements du microbiote, induits par glyphosate, peuvent favoriser l’apparition de MICI. L’interleukine 10 (IL-10), une molécule du système immunitaire impliquée dans la réponse anti-inflammatoire, est la principale protéine anti-inflammatoire intestinale. Des souris dont l’interleukine 10 a été supprimée (IL-10-/-) développent spontanément une inflammation de l’intestin en vieillissant. De plus, le microbiote intestinal joue un rôle majeur dans le développement de cette pathologie chez ces souris IL-10-/-. Ce modèle de souris est donc approprié pour étudier l’impact de facteurs environnementaux sur le développement des MICI. Dans ce projet nous souhaitons donc étudier l’impact d’une exposition alimentaire au glyphosate sur le développement de l’inflammation intestinale, en utilisant des souris mâles et femelles dont l’interleukine 10 a été invalidée.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact de l’exposition alimentaire au glyphosate dans le contexte d’une prédisposition génétique au développement de pathologie intestinale telle que la colite. Nous évaluerons ainsi les effets de l’exposition aux pesticides sur le microbiote intestinal, et leur impact sur la progression de la colite.
Procédures
Les souris seront nourries avec un régime contenant ou non du glyphosate, à deux doses différentes : la DJA (dose journalière admissible) et la NOAEL (dose sans effet nocif observable), pendant 10 semaines. Les fèces des souris seront collectées sur animaux éveillés de façon non invasive : les souris seront gardées dans des boîtes en plastique (désinfectées et non hermétiques), dans un endroit bien ventilé, de manière à pouvoir faire leurs besoins sans contrainte ni manipulation inutile pendant 2 heures. Ces prélèvements auront lieu chaque semaine. A la fin des expérimentations, les souris seront mises sous sédation profonde afin de prélever le sang (geste effectué en 30 secondes). Suite à la collection, l’animal sera euthanasié. L’ensemble des autres prélèvements sera réalisé post-mortem.
Impact sur les animaux
Les souris de ce modèle, peuvent, pour certaines, développer, à partir de 8 semaines, une colite qui peut engendrer une déshydratation suite à des diarrhées sévères, et une perte de poids pouvant atteindre 20% de leur poids initial en quelques jours, ce qui constitue un point limite mettant fin à l’expérimentation pour ces souris. Selon nos résultats préalables la survie globale de cette cohorte est estimée à 85% pour les femelles et 90% pour les mâles âgés de 14 semaines. Aucune perte de poids ni de signe de toxicité n’ont en effet été observé dans la précédente cohorte de souris de type sauvage exposées aux mêmes doses de glyphosate dans le laboratoire.
Devenir
A l'issu de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever le sang et différents organes pour réaliser les analyses et répondre à la question scientifique.
Remplacement
L'utilisation d'animaux de laboratoire entier est nécessaire car le projet étudie des phénomènes biologiques (voies métaboliques) qui font intervenir différents tissus (microbiote intestinal, intestin grêle, gros intestin, foie) agissant en synergie via un dialogue inter-organe. De plus, afin d'étudier l'interaction entre l'alimentation, le microbiote intestinal et le génome de l’hôte, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec notamment la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (modèles cellulaires).
Réduction
Nous avons conçu l’expérience pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé par un calcul de puissance et basé sur nos résultats préliminaires. Les résultats de notre étude de pouvoir statistique (calcul permettant d’évaluer le nombre nécessaire d’individus pour confirmer ou non notre hypothèse de recherche) basée sur des résultats préliminaires mesurant un marqueur non invasif d’inflammation intestinale nous a permis de définir le nombre d’animaux nécessaires par groupe expérimental. Nos données préliminaires montrent également que les effets du glyphosate peuvent être dépendants du sexe, nous étudierons donc séparément une cohorte de souris femelles et une cohorte de souris mâles afin de comparer les effets du glyphosate dans les 2 sexes.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement pendant toute la durée du protocole par du personnel compétent. Les mesures nécessaires à la prise en charge de la douleur potentielle des souris avec colite seront adaptées en fonction de l’état des animaux (analgésie et suivi des signes de mieux/mal être avant et après le traitement). Les effets du traitement seront contrôlés par une surveillance selon un score standardisé. Ce score (prenant en compte la variation du poids de l’animal, son apparence externe, les signes cliniques mesurables et le changement de comportement) correspond à une grille d’évaluation clinique permettant de prendre des mesures progressives (points limites) en fonction de l’élévation du score (augmentation de la fréquence des observations, administration de solution saline pour lutter contre la déshydratation, administration d'antalgiques pouvant être renouvelé toutes les 12h, euthanasie précoce). Ainsi, le protocole expérimental pourra être atténué voire suspendu en cas de mauvaise tolérance ou de souffrance des animaux. L’environnement des animaux sera enrichi afin de leur permettre d’avoir un comportement le plus naturel possible (cotons, maisons, cycle jour/nuit).
Choix des espèces
Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche sur les MICI car c’est un modèle permettant notamment l’étude des interactions entre l’alimentation, les polluants de l’alimentation (tels que le glyphosate), le microbiote intestinal et l’intestin. De plus, nous utiliserons un modèle de souris déficient pour l’interleukine 10 (souris IL10-/-) permettant de modéliser l’apparition d’une colite similaire à la colite hémorragique chez l’Homme. Ce modèle génétique de colite existe uniquement chez la souris. Nous utiliserons des souris de 4 semaines et les exposerons aux différents régimes pendant 10 semaines. En effet, nous souhaitons étudier un éventuel effet potentialisateur du glyphosate sur l’inflammation intestinale. Or, les souris IL10-/- développent spontanément une colite qui peut évoluer rapidement vers des stades sévères à partir de 12 semaines d’âge. Ainsi, afin d’être capable d’observer un éventuel effet du glyphosate, nous devons donc utiliser ces souris assez jeunes, juste après le sevrage.
Validation d’un mécanisme impliqué dans la résistance des cellules de mélanome aux cellules immunitaires NK
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une perte de poids supérieure à 10 % par rapport au maximum enregistré déclenche la mise à mort de l'animal. 629 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 448 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome sous la peau du flanc sans anesthésie, une injection de cellules immunitaires dans la veine de la queue pouvant provoquer des métastases pulmonaires et un essoufflement, et pour certaines 48 injections dans l'abdomen étalées sur seize semaines, afin de vérifier si une protéine resensibilise les cellules tumorales aux cellules Natural Killer. Les tumeurs sont mesurées au pied à coulisse jusqu'à ce qu'une nécrose, un suintement, un dos voûté ou des yeux mi-clos entraînent la mise à mort.
Objectifs
Le mélanome cutané (15 500 nouveaux cas par an en France) est un cancer issu des mélanocytes, cellules responsables de la pigmentation de la peau. Le pronostic de ce cancer diagnostiqué précocement est favorable, mais au stade métastatique celui-ci reste très mauvais. Malgré les progrès dans le traitement des patients atteints de mélanome cutané métastatique avec les thérapies ciblées et les immunothérapies, plus de la moitié de ces patients développent des résistances. Notre équipe a montré que les cellules de mélanome sont capables de s’adapter et d’échapper au système immunitaire et aux thérapies ciblées. De nouvelles approches thérapeutiques sont alors nécessaires afin de resensibiliser les mélanomes au système immunitaire et aux thérapies ciblées. Nous avons étudié le rôle d'une protéine sur la sensibilité des cellules de mélanome au système immunitaire et sur les résistances des cellules aux thérapies ciblées. In vitro, nos résultats montrent que la diminution d’expression de cette protéine diminue la sensibilité des cellules de mélanome au système immunitaire et que cette protéine est perdue dans les résistances aux thérapies ciblées. Les cellules Natural Killer sont des cellules appartenant au système immunitaire inné et qui ont un rôle dans la destruction immédiate des cellules cancéreuses. Nous avons montré que les cellules qui expriment notre protéine sont sensibles à la mort induite par les NK. L'objectif de ce projet est de confirmer et de valider in vivo la resensibilisation des cellules de mélanome à la mort induite par les cellules NK en modulant l'expression notre protéine, mais aussi de valider les cellules Natural Killer comme une thérapie potentielle dans le traitement des mélanomes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une validation in vivo des observations faites in vitro, montrant que l’expression de notre protéine par les cellules tumorales est capable de les sensibiliser à la mort induite par les cellules immunitaires NK. Ce projet permettra également de valider l'approche et l'intérêt thérapeutique d'utiliser les cellules Natural Killer pour éliminer les cellules tumorales du mélanome. Ces validations sont indispensables pour envisager, in fine, un développement clinique de nouvelles approches thérapeutiques ciblant ce récepteur.
Procédures
Les souris seront soumises à une injection de cellules en sous-cutanée au niveau du flanc gauche (les souris sont non anesthésiées.) ainsi qu’une injection intraveineuse de cellules immunitaires dans la veine caudale (veine située au niveau de la queue). Dans certains cas, des souris pourront recevoir une drogue pour les sensibiliser au NK par injection intra-péritonéale 3 fois par semaine pendant 16 semaines au maximum (48 injections).
Impact sur les animaux
Avant l’arrivée aux points limites décrits, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Les souris subiront une injection sous-cutanée de cellules qui peut entraîner des rougeurs (lésions) au site d'injection. Les souris peuvent être gênées par la croissance de la tumeur (perte de poids (malnutrition et/ou déshydratation), mobilité réduite) et peuvent également présenter des altérations visibles de la peau (lésions, nécroses…). Chaque animal sera soumis à une injection intraveineuse au niveau de la veine caudale, ce qui peut entraîner des métastases dans les poumons et un essoufflement possible de la souris peut être observé. Certains animaux pourront également être soumis à une injection intra-péritonéale 3 fois par semaine pendant 16 semaines au maximum (48 injections), pouvant entraîner une rougeur (inflammation) ou une infection au site d'injection.
Devenir
À l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs de mélanome et/ou les organes (foie, poumons, ...) présentant des métastases afin de réaliser des analyses in vitro.
Remplacement
Compte tenu de la complexité du processus impliqué dans la formation des mélanomes, résoudre ce problème uniquement par l’analyse in vitro n’est pas suffisant et l’utilisation de modèles animaux est essentielle. Par conséquent, pour l’instant, aucune méthode alternative ne permet de remplacer complètement le modèle murin dans notre étude.
Réduction
En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaire à cette étude a été déterminé à l'aide du logiciel GPower, et d'un test de puissance statistique. Il faudra donc 16 souris par groupe. Également, une analyse statistique sera réalisée pour valider les effets sur la croissance de la tumeur. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs/métastases et organes (tels que le foie, la rate, les poumons, sang) pour des analyses histologiques, biochimiques et cytométriques. Dans le meilleur respect du bien-être animal et dans le but de réduire, nous utiliserons des souris mâles et femelles provenant de notre élevage.
Raffinement
En termes de raffinement, les souris seront hébergées à plusieurs par cage avec un environnement enrichi et seront observées deux ou trois fois par semaine selon la procédure par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, de stress ou d’inconfort. De plus, nous avons établi une liste de points limites et de critères d'arrêt des souffrances. Par exemple, une perte de poids supérieure à 10 % de la pesée la plus élevée de toutes les pesées (depuis le début de l’expérimentation) entraînera une mise à mort des souris. Si une observation est faite au niveau de l'apparence physique des souris (absence de toilettage, dommages corporels importants, prostration, yeux mi-clos), le comportement des souris (dos voûté, essoufflement suite à l'injection en veine caudale) et/ou l'apparence des tumeurs (tumeur nécrosée, suintement, volume), les souris seront mises à mort. Les manipulateurs sont en possession du niveau opérateur ou concepteur qui permet d’avoir une bonne vision et une excellente capacité à détecter les problèmes de santé, stress ou malaise. Le suivi est fait par des méthodes non invasives (mesure des tumeurs sous cutanées au pied à coulisse, pesée des animaux régulières). En ce qui concerne les souris immunodéficientes, ces dernières seront manipulées sous une hotte de type PSM dans des conditions d'hébergement stérile (igloo, nourriture, changement de cage en condition stérile). Ces conditions d'hébergement permettent donc le maintien d'un statut sanitaire exempt d'organisme pathogène spécifique.
Choix des espèces
Nous utiliserons un modèle de souris immunodéficientes. L’utilisation de ces souris immunodéficientes (absence de cellules B, T et NK) nous permettra une bonne prise tumorale des cellules humaines utilisées et de valider spécifiquement l’impact des NK dans la prise tumorale en fonction de l'expression du récepteur d'intérêt. Pour les procédures expérimentales, les souris sont utilisées au stade adulte (7 semaines). Nous utiliserons des animaux jeunes adultes dans l’ensemble des procédures, de façon à étudier des organismes stables, qui ne sont ni en développement ni en sénescence. De plus, les données de la littérature ainsi que nos données précédentes montrent une meilleure homogénéité dans la prise tumorale entre les animaux de cet âge.
Visualisation et modulation des cellules cérébrales individuelles afin de comprendre et traiter les problèmes mnésiques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 514 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 440 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent jusqu'à trois craniotomies sous anesthésie avec injection d'un vecteur viral ou implantation d'un dispositif dans le cerveau, un conditionnement aversif douloureux, jusqu'à cinq jours de restriction alimentaire, et pour certaines une injection d'acide kaïnique déclenchant des crises d'épilepsie. Celles qui portent des implants d'électrophysiologie restent isolées jusqu'à deux mois, ce que le porteur décrit comme un stress "modéré à fort". Il retient la souris plutôt que le rat parce que la littérature est plus riche et que son équipe y est déjà formée, ce qui éviterait de tuer des animaux supplémentaires pour adapter les chirurgies.
Objectifs
L'étude de la mémoire et de ses bases neuronales est essentielle pour comprendre ses mécanismes et pouvoir, à partir de ces analyses, traiter les troubles qui y sont liés, comme la maladie d'Alzheimer, le syndrome de stress post- traumatique et d'autres types d'amnésie. Dans ce projet, nous proposons d'utiliser un modèle animal pour étudier comment la mémoire est stockée et rappelée à court et long terme. Cela nous permettra de comprendre les modalités d’activation des régions impliquées, et, en visualisant et en modifiant leur activité, de comprendre dans quelle mesure ces régions influencent le maintien de souvenirs spécifiques. En particulier, nous utiliserons une tâche de conditionnement classique pour former et étudier des souvenirs émotionnels, positifs et négatifs. Par ce projet, nous souhaitons répondre à quatre questions principales : quels sont les changements d'activité observés au niveau des cellules individuelles (1) ou du cerveau entier (2) lorsqu'un animal apprend et se souvient d'un événement passé ? La manipulation artificielle de ces régions identifiées peut-elle influencer le comportement de l'animal (3) et l'activité des régions cérébrales qui leur sont liées (4) ?
Bénéfices attendus
Le modèle souris est un excellent modèle translationnel, qui nous permet d’étudier la complexité des fonctions cognitives telles que la mémoire. Il nous permet, grâce à des techniques invasives, de tester par la manipulation et la visualisation in vivo les dynamiques neuronales qui sous-tendent la formation et le rappel de la mémoire, et ce à différentes échelles. A court terme, le projet permettra d’élucider le fonctionnement de la formation et du rappel des souvenirs à court et long termes, chez la souris mais également de façon translationnelle chez l’Humain. A plus long terme, ces connaissances pourront conduire à la découverte et au développement de thérapies plus ciblées et efficaces pour lutter contre divers troubles de la mémoire, et donc avoir un impact clinique concret. Nous utilisons le modèle souris en particulier car la reproduction est rapide et mène à un grand nombre d’animaux dans chaque portée, ce qui facilite l’obtention rapide de résultats statistiquement significatifs. Par ailleurs, l’ensemble de l’équipe est formé sur ce modèle, ce qui permet la réduction maximale du nombre d’animaux utilisés, et la littérature sur la mémoire est très riche pour cette espèce (par comparaison, par exemple, au modèle rat).
Procédures
Au cours de chaque phase de ce projet, les animaux peuvent passer par : - Un régime alimentaire de maximum 5 jours (et de maximum 2 fois par animal, à plusieurs semaines d'intervalle) pendant lequel l'animal reçoit une quantité restreinte de nourriture. Chaque jour, les animaux sont surveillés et si leur poids diminue trop, les quantités de nourriture mises à disposition sont modifiées en conséquence ; - Des tests comportementaux pour étudier leur mémoire et leur niveau de stress. Ces tests sont très courts et durent entre 5 et 10 minutes. - Des opérations chirurgicales sous anesthésie générale qui durent entre 30 et 50 minutes. Si un animal subit plusieurs interventions chirurgicales (dans tous les cas, 3 au maximum par animal), celles-ci sont espacées d'au moins 1 semaine. - Dans certains cas spécifiques, les animaux seront maintenus en isolement depuis l'intervention chirurgicale jusqu'à la fin des expériences comportementales, qui dureront au maximum deux mois à compter de la date de l'opération. Certains animaux recevront une injection d'acide kainique afin de déclencher des crises épileptiques.
Impact sur les animaux
Pour ces études, la technologie de pointe utilisée nécessite des procédures d'implantation invasives à l'intérieur du cerveau de l'animal. Les animaux subiront donc une ou deux craniotomies, suivies d’une injection d’un vecteur viral ou d’une implantation. Cette procédure, douloureuse, sera donc effectuée sous anesthésie générale et durera un peu moins d’une heure. Les implants n'affectent toutefois pas le comportement normal et le bien-être de l'animal une fois implantés. Certains animaux devront subir une privation de nourriture partielle, procédure indispensable à leur motivation pour certaines tâches comportementales. La quantité de nourriture qu'ils ingèrent chaque jour sera limitée, mais de manière à ne pas dépasser une perte supérieure à 10% de leur poids normal afin d’éviter tout stress superflu ou malnutrition, ce qui serait non seulement préjudiciable à l'animal mais aussi contre-productif pour nos expériences, qui exigent que l'animal soit en parfaite santé et non stressé ou même malade, car cela fausserait les résultats de nos recherches. Pour les expériences employant l’électrophysiologie, la fragilité des implants ne permet pas de replacer les souris dans la même cage que leurs congénères, et ceci cause un stress émotionnel modéré à fort. Néanmoins, cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisé, en réduisant au maximum les risques que l’implant ne tienne pas dans la durée. Par ailleurs, cet isolement n’est pas le cas pour tous les autres implants utilisés. Par ailleurs, ce projet étudiant les souvenirs émotionnels, certains animaux devront subir un conditionnement aversif, induisant une douleur moyenne brève, ainsi qu’un stress passager d’intensité modérée. Pour les expériences employant l'acide kainique, l'injection induira des crises épileptiques, occasionnant un stress d'intensité forte mais passager (retournant à la normale après 4 heures en moyenne).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Celle-ci interviendra alors que l’animal sera profondément anesthésié. Ceci est absolument nécessaire pour les études histologiques et immunohistochimiques.
Remplacement
Du fait des approches intégratives de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants reste incontournable. En effet, à l’heure actuelle, il n'existe pas de méthodes substitutives in vitro, ex vivo ou in silico pour obtenir des données sur ces processus cognitifs, bien trop complexes pour envisager toute simulation informatique. Par ailleurs, de par la nature de nos expérimentations (chirurgie, conditionnement aversif, analyse par immunohistochimie), il nous est impossible d’employer directement des sujets humains. Le modèle souris se révèle alors être idéal du fait de la proximité fonctionnelle entre son système nerveux central et celui de l’humain quant à ses capacités à créer des souvenirs émotionnels simples (auxquels nous nous intéressons, type conditionnement pavlovien) et de sa petite taille. Ceci explique également l’impossibilité d’utiliser des modèles animaux invertébrés, trop éloignés de l’humain pour raisonnablement étudier une réponse émotionnelle à un souvenir ainsi que trop éloignés dans la configuration du système nerveux central, critique à notre étude inter-régions.
Réduction
Le nombre d’animaux est limité au nombre minimal permettant de faire des études statistiquement significatives, nombre choisi sur la base d'expériences présentées dans des articles montrant des analyses similaires. Nous utilisons également les tissus après les expériences, maximisant ainsi l’utilisation de chaque animal.
Raffinement
Afin d’améliorer les conditions de vie des animaux, réduire la douleur, le stress et l’anxiété causés lors des différentes procédures, un certain nombre de mesures sont mises en place : - Les cages seront enrichies d’un tube en carton qui permettra de manipuler les souris sans les soulever par la queue. - Les animaux seront habitués plusieurs jours avant les expériences aux branchements et débranchements de leurs implants afin de réduire leur stress. - Nous avons amélioré la technique d’implantation des optrodes et des plaques de base du miniscope afin de ne plus avoir à isoler les animaux après implantation. - En plus de l’utilisation d'anesthésiques adaptés et d’anti-inflammatoire, nous appliquons également un anesthésique local ainsi qu’un analgésique lors de la chirurgie et après la chirurgie en cas de signes de douleurs. Nous appliquerons également des points limites spécifiques aux chirurgies (saignement trop important pendant la chirurgie, perte de poids trop importante ou signes de douleur ne s'améliorant pas malgré l'administration d'analgésiques en postchirurgie, etc.) et aux procédures expérimentales (en particulier, le non retour à la normale des animaux de la procédure 5 suite à l'épilépsie induite) employées, au delà desquels les animaux seront euthanasiés (cf. partie 4.2., où les points limites sont détaillés pour chaque procédure.
Choix des espèces
Les comportements que nous souhaitons étudier sont trop complexes pour justifier de l’utilisation d’espèces non-mammifères (drosophile, poisson-zèbre, etc.). De même, les méthodes in silico et in vitro ne sont pas assez développées pour modéliser ni la mémoire, ni le fonctionnement du cerveau à si grande échelle. Par ailleurs, eu égard au nombre d’animaux requis, les rongeurs (et plus particulièrement les souris) s’imposent de par la facilité et la stabilité de leur élevage. La souris a également été préférée au rat pour deux principales raisons: - La littérature relative à la mémoire, incluant tous nos précédents travaux, est bien plus riche chez la souris que chez le rat. - Notre équipe est déjà formée sur la souris, notamment pour la réalisation des chirurgies. Ne pas changer de modèle nous permettra de conserver ce savoir-faire, et ainsi de ne pas euthanasier d’animaux supplémentaires pour adapter les chirurgies à un nouveau modèle animal. Les souris étudiées seront adultes (plus de 7 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.
Implantation de sondes télémetriques ECG et pression artérielle au niveau de la carotide chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
L'opération vise à former quatre personnes à la pose d'un capteur de pression artérielle sur la carotide. 20 souris de 5 à 6 semaines vont être utilisées, opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Chacune reçoit deux injections d'analgésique, une anesthésie de trente minutes maximum, puis l'implantation d'une sonde sur la carotide gauche et d'un transmetteur sous la peau du flanc, avec un risque d'hémorragie. Le porteur compte une souris par personne et par demi-journée sur deux jours de formation, sans autre justification de ce total de vingt animaux.
Objectifs
L'hypertension artérielle est la principale cause des maladies cardiovasculaires et des décès prématurés dans le monde. Malgré les diverses options thérapeutiques disponibles, de nombreux patients hypertendus gardent une tension artérielle non contrôlée. Il a été montré que, dans ces cas d’hypertensions résistantes et/ou réfractaires aux traitements médicamenteux, les mécanismes de régulation de la pression artérielle sont affectés. Ces mécanismes réflexes modulent le diamètre des veines et des artères, ainsi que le rythme et la contractilité cardiaque, afin de contrôler la pression sanguine. La détection de la pression artérielle est initiée par des neurones dont les terminaisons, sensibles à l’étirement des vaisseaux sanguins, se situent dans des structures particulières des grosses artères : les sinus carotidiens (au niveau du cou) et la crosse aortique (à la sortie du cœur). Notre projet vise à caractériser les paramètres modulés par ces mécanismes reflexes chez la souris en conditions physiologiques. Pour cela, nous devons nous former à la pose d'un capteur, en sous cutané, afin de collecter un ensemble de données (température, pression artérielle et rythme cardiaque) sans stress dans un souci du bien-être animal. Les mesures physiologiques peuvent être collectées en continu ou en séquentiel dans différents protocoles, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cette formation nous permettra par le biais d’une nouvelle demande d’autorisation d’étudier ces paramètres chez des souris transgéniques présentant une hypertension artérielle.
Bénéfices attendus
L’ensemble des personnes compétentes impliquées dans le projet sera formé à la pose chez l'animal vigile d'un capteur, en sous cutané, afin de collecter un ensemble de données (température, pression artérielle et rythme cardiaque) sans stress dans un souci du bien-être animal. Cela permettra par la suite d’étudier les paramètres modulés par ces mécanismes reflexes chez la souris dans des conditions physiologiques et pathologiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux injections d'analgésiques en sous cutanée, une anesthésie soit par voie gazeuse ou en intrapéritonéal qui durera 30min maximum, durée de l'intervention chirurgicale qui consistera en la pose d'un capteur au niveau de la carotide et d'un transmetteur au niveau du flanc gauche de l'animal. A la fin de la procédure chirurgicale, les animaux seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Les risques sont liés à 1) l’anesthésie : stress de la manipulation, déshydratation, détresse respiratoire; 2) à la pose de de la sonde télémétrique au niveau de la carotide gauche : risque d’hémorragie.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure ne pouvant être réutilisés.
Remplacement
La pose de capteur en sous-cutanée pour l’étude de la pression artérielle et du rythme cardiaque ne peut se faire que sur des animaux vivants. C’est une méthode validée et utilisée à la fois chez le rat et chez la souris. Il n’y a pas d’alternatives non animales.
Réduction
Ce projet a pour but de former les personnes compétentes à la pose de capteurs en sous-cutanée chez la souris. C’est une technique largement décrite dans la littérature et utilisée couramment pour analyser la pression artérielle, le rythme cardiaque, la température corporelle et l’activité locomotrice chez des animaux vigiles. Le système d'enregistrement que nous utiliserons nous permet d’analyser ces paramètres sur 8 animaux en simultanée. La formation aura lieu sur 2 jours et il y aura 5 participants : 1 formateur et 4 formés. Nous estimons qu'il faudra au maximum 1 souris par demi-journée et par personne, c'est-à-dire, 20 souris au total au maximum.
Raffinement
La pose de capteur se fera sous anesthésie. Pour éviter toute douleur liée à la procédure, nous administrerons un analgésique par voie sous-cutanée. Les souris seront placées sur une plateforme chauffante permettant le suivi des paramètres cardiorespiratoires et de la température. Pour éviter un dessèchement oculaire, nous appliquerons un gel pour les yeux. L'animal fera l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de l'examen. Cette procédure sera de classe sans réveil et les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle souris car ce modèle est largement décrit dans la littérature et nous pourrons par la suite avoir accès à des modèles de souris transgéniques. Les souris qui seront utilisées dans ce projet seront âgées de 5 à 6 semaines ce qui correspond à un stade jeune adulte. Pour une pose optimale du capteur et une bonne transmission du signal, les souris doivent faire un poids minimum de 19g et un poids moyen de 22g.
Création et évaluation du bien-être animal d’une nouvelle lignée à visée de recherche sur le rôle du gène X chez la souris dans le domaine cardiovasculaire.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris de cette nouvelle lignée n'ont jamais été générées, et les effets de leur modification génétique restent inconnus. 90 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Chacune subit un prélèvement d'un millimètre au bout de la queue pour identification génétique, en vigile ou sous anesthésie, et une pesée hebdomadaire pendant quatorze semaines. L'évaluation porte sur leur bien-être, de la naissance jusqu'à 48 semaines d'âge, et s'achève par leur mise à mort.
Objectifs
L’objectif est de créer et d’évaluer le bien-être animal d'une nouvelle lignée de souris et d’identifier génétiquement celle-ci via une méthode de génotypage invasif. La production de ces animaux est nécessaire pour nos projets de recherche sur les mécanismes cellulaires et moléculaires de calcifications vasculaires en contexte d'insuffisance rénale chronique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont attendus à la fois dans le domaine de la recherche fondamentale et dans le domaine médical. L’utilisation de cette lignée de souris permettra de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sont à l'origine des symptômes observés en phase tardive de l'insuffisance rénale chronique. Le génotypage permet la caractérisation génétique de la lignée pour optimiser la gestion des élevages et la production des animaux pour les projets scientifiques.
Procédures
1 prélèvement (1mm) à l'extrémité de la queue - pesée des animaux une fois par semaine - phénotype dommageable possible mais peu probable
Impact sur les animaux
Le stress ressenti par l’animal est limité lors des pesées qui sont rapides et par l’utilisation d’un tunnel pour prendre la souris (1 fois par semaine pendant 14 semaines). Cette lignée n'a jamais été générée, les effets de leur modification génétique ne sont donc pas connus. La biopsie au niveau de la queue peut entrainer de la douleur et du stress chez l'animal.
Devenir
mis à mort à la fin de l'évaluation du bien-être animal
Remplacement
Nos projets de recherche visent à comprendre le rôle d’une protéine connue pour transporter du phosphate du milieu extracellulaire vers l’intérieur de la cellule. La régulation des concentrations de phosphate et de calcium dans le sang et au niveau d’un organe est une composante importante pour notre problématique, ce qui nécessite de travailler sur l’organisme entier. D'autre part, nous nous intéresserons aux réponses de cette lignée de souris dans un contexte d'insuffisance rénale chronique, qui est une maladie impliquant une communication entre plusieurs organes. L’expérimentation sur animal entier est indispensable pour évaluer le rôle des différents organes impliqués dans cette pathologie
Réduction
Les croisements sont élaborés pour obtenir un nombre suffisant d’animaux permettant d’obtenir des résultats robustes et fiables pour l’évaluation du bien-être animal (au moins 14 animaux par génotype selon les recommandations européennes). Leur nombre est adapté aux besoins de l’évaluation du bien-être chez les deux sexes.
Raffinement
Pour la mesure de poids hebdomadaire, les expérimentateurs sont entraînés à ne pas tenir les souris par la queue. Ce geste limite le stress des animaux. La biopsie de queue est réalisée lors du baguage soit en vigile soit sous anesthésie générale. Cette méthode est approuvée, précise, rapide (quelques secondes), standardisée et réalisée par du personnel formé, ce qui limite les effets de stress et douleurs chez les animaux. L’anesthésie permet de favoriser la bonne pose de la bague et le prélèvement de queue dans un environnement plus confortable pour le manipulateur et l’animal.
Choix des espèces
Les souris mutantes générées dans ce projet n’ont jamais été caractérisées. Nous évaluerons le bien-être de ces animaux selon les recommandations européennes, de la naissance jusqu’à l’âge de 48 semaines. L’identification de leur modification génétique sera effectuée à l’âge de 21 jours. Dans ce projet, 6 mâles géniteurs et 12 femelles génitrices seront utilisés pour générer des groupes d’animaux contrôles et mutants nécessaires (au moins 14 animaux par groupe) pour apporter des conclusions robustes sur l’évaluation du bien-être animal.
Etude computationnelle longitudinale du vieillissement physiologie et pathologie de l’aorte de souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
640 souris vont être utilisées, toutes tuées, dont 180 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles ne subissent aucune manipulation avant le jour de leur mise à mort, hormis une échographie sous anesthésie de vingt minutes et un jeûne de quelques heures. Le protocole consiste surtout à les laisser vieillir, jusqu'à 24 mois pour les souris normales et 10 mois pour les souris obèses et diabétiques, avant le prélèvement de l'aorte et son passage au scanner haute résolution. Le porteur affirme que des souris de 24 mois se comportent comme des souris de 2 mois et que la nuisance liée au vieillissement "pourrait ne jamais être atteinte", tout en prévoyant la mise à mort de celles qui perdent plus de 20 % de leur poids.
Objectifs
Le projet vise à analyser ex vivo, l'évolution de très petites structures de la paroi aortique au cours du vieillissement de la souris normale ou obèse par une approche technologique innovante, un scanner à très haute résolution. Notre but est de reconstruire en 3D, grâce à l'outil informatique, l'évolution de l'aorte durant la vie des souris. Cette reconstruction se basera sur les paramètres anatomiques, fonctionnels recueillis chez ces souris à différents âges (souris normales: 2 à 24 mois, souris obèses: 2 à 10 mois). Nous pensons que le suivi du vieillissement de ces animaux permettra de distinguer les altérations associées au vieillissement vasculaire normal de celles liées à un vieillissement altéré pouvant aboutir à des maladies vasculaires majeures, augmentant les risques de décès prématurés. L’objectif de ce projet est double. 1- Pour la clinique humaine, fournir des indices sur le vieillissement aortique qui pourraient guider les cliniciens dans leur choix chirurgicaux et/ou thérapeutiques. 2- Pour la clinique vétérinaire, fournir des indices sur le vieillissement aortique des animaux de laboratoire, de rentes, domestiques, …et de favoriser les décisions thérapeutiques à prendre afin de garantir le bien-être de l’animal et son bien-vieillir. Cependant, avant d'en arriver à une prévention efficace, que ce soit en clinique humaine ou vétérinaire, notre hypothèse doit être testée par des explorations précliniques. Pour des raisons éthiques, l'utilisation d'échantillons humains est impossible tant que nous n'avons pas prouvé que notre hypothèse est solide et peut fournir des informations pertinentes pour la santé humaine.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont de quatre ordres. 1- D’un point de vue scientifique, les données obtenues permettront de contribuer aux connaissances générales sur les mécanismes du vieillissement physiologique et pathologique de la paroi artérielle. L'apport de l'image et notamment sur le remodelage de la paroi artérielle inflammatoire dans l'obésité et leur potentiel résolution thérapeutique. 2- La disponibilité de ces données aidera à identifier les caractéristiques/les marqueurs critiques du vieillissement chez l'homme pour prédire une maladie vasculaire. 3- Ce transfert de la modélisation du vieillissement chez la souris à l'homme peut être également étendu, du point de vue vétérinaire. En effet, les animaux de compagnie et dans une moindre mesure les animaux de rentes, sont confrontés au vieillissement plus ou moins accéléré par des problèmes d'obésité ou de diabète. Le bien vieillir de ces animaux est une préoccupation majeure des propriétaires et des vétérinaires. La prévention des maladies vasculaires est donc primordiale. Par conséquent, le transfert de notre étude de souris aux chats, chiens , ... pourrait ainsi favoriser la prévention et la mise en place précoce de thérapies. 4- Enfin cette étude pourrait servir de bases à des logiciels de simulation qui pourraient etre utilisées en enseignement des sciences biologiques.
Procédures
Dans ce projet, les animaux ne subiront aucune manipulation avant le jour de l'euthanasie. En effet, après une période d'acclimatation, les animaux seront anesthésiés pendant 20 minutes maximum pour l'enregistrement des paramètres hémodynamiques et cardiovasculaires, effectués par échographie, examen non invasif et indolore. Un jeûne de quelques heures est envisagé en amont de l'examen d'échographie et avant l'euthanasie, afin de réaliser une analyse sanguine (prélevement post-mortem) du cholestérol, du glucose et autres molécules, témoignant de l'état de santé de la souris. Ce jeûne de courte durée ne devrait pas induire de nuisance chez les souris.
Impact sur les animaux
Les démarches expérimentales ne comprennent pas de chirurgie ou autre geste invasif susceptible de causer de l'inconfort aux animaux. Un inconfort lors de la locomotion, expliqué par la prise régulière de poids chez la souris diabétique, pourra être observé. A noter, que nous avons priviligié l'échographie, un examen non invasif, sans douleur ni danger pour l'animal, répandu en medecine vétérinaire. Cette technique n'induit aucune nuisance à l'animal. Les nuisances dues au vieillissement, sont extrêmement restreintes puisque les livraisons des animaux sont prévues en fonction de la date de mise à mort, et donc au plus proche de celle-ci. Les nuisances liées à l’âge pourraient se traduire par une diminution progressive du poids, de la mobilité et de l'appétit. A noter que l'expérience des manipulateurs sur ces souris et des partenaires travaillant depuis longue date sur le modèle de rongeurs âgés, fait qu'ils peuvent affirmer que des souris de 24 mois ont un comportement locomoteur, d'anxiété, ou nutrionnel totalement relativement comparable à celui de souris jeunes (2 mois). Cette nuissance dûe au vieillissement pourrait ne jamais être atteinte.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort, afin de pouvoir réaliser les prélèvements tissulaires de chacun des individus et de les analyser par le scanner à très haute résolution.
Remplacement
Préalablement à ce projet, nous avons réalisé des études de mise au point méthodologique sur le scanner à haute résolution. Les tissus aortiques ont été prélevés de souris (normales ou obèses) issues de protocoles APAFIS précédents, avant que celles-ci soient incinérées. Ces analyses préliminaires nous ont permis de démontrer la faisabilité et de découvrir des altérations de la paroi vasculaire qui ne peuvent etre observées par des méthodes d'imagerie conventionnelle. Les approches in vivo ne peuvent être envisagées comme méthode alternative en raison de la complexité cellulaire et extracellulaire. Aujourd'hui, seul les modèles murins permettent de reproduire de manière fidèle les conditions in vivo, offrant ainsi une compréhension plus complète du vieillissement tissulaire et des maladies cardiovasculaires en résultant. La simplification de l'étude en utilisant des systèmes in vitro ou ex vivo, comme les modèles 3D par exemple est actuellement non adaptée. Les modèles murins permettent de prendre en compte cette complexité et d'analyser comment différents organes et tissus interagissent pour déterminer et faire progresser la maladie. Il n'existe actuellement aucune alternative non animale satisfaisante pour répondre à nos questions. Ainsi, les modèles murins restent la meilleure option pour générer des données pertinentes qui pourraient ultérieurement avoir un impact translationnel chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux dans le projet est estimé selon des calculs statistiques considérant la nécessité de réduire l’utilisation d’animaux à un nombre minimum mais suffisant pour obtenir des résultats biologiquement et statistiquement valides et significatifs pour les objectifs de cette étude. La taille de chaque groupe d’animaux est de n = 20 souris. Elle a été calculée en tenant en compte des risque de décès prématurés. Une logique d’arrêt de la procédure est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe des points limites, la procédure sera interrompue pour la totalité des animaux. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique, un nombre minimum d’animaux sera utilisé. L'expérimentation sera réalisée en 4 fois afin que scientifiquement nous ayons 4 expériences indépendantes (soit 5 animaux/âge/ expérimentation). Cette façon de procéder nous permettra de travailler avec des petits effectifs faisant qu'en cas des points limites atteints, d'arrêter la procédure, de la revoir, de discuter avec la structure du bien-être animal... voire de stopper définitivement la procédure. Dans le but de renforcer les données statistiques, l’étude sera randomisée (tirage au sort de l’ordre des groupes pour les injections et clause d’ignorance) et contrôlée. Enfin toujours dans le but de réduire le nombre d'animaux, les tissus issus de nos différents groupes seront prélevés pour être utilisés dans d'autres projets en cours ou futurs.
Raffinement
La litière sera changée 2 fois à 3 fois / semaine selon la quantité d'urine produite par les souris. Au cours des phases de stabulation, plusieurs animaux seront hébergés dans la même cage. En revanche, lors des phases d’expérimentation les animaux seront isolés (1 souris/boîte) afin de limiter la transmission du stress entre individus. La manipulation se fera en dehors du champ de vision des animaux en attente d’expérimentation. Nous surveillerons régulièrement les souris pour détecter tout signe de douleur ou d'anomalie. Ainsi l'isolement, l’anxiété, la perte d'appétit ou des difficultés de déplacement peuvent indiquer des problèmes de santé. Si une souris perd plus de 20% de son poids maximal ou montre des signes de difficulté à se déplacer ou à manger, nous la retirons de l'étude et sera mise à mort. Nous réalisons également des tests de réflexes pour évaluer la santé des animaux. Si une souris échoue à ces tests, cela peut indiquer un problème de santé grave, et elle est alors retirée de l'étude. En résumé, nous prenons toutes les mesures nécessaires pour garantir le bien-être des souris tout en réalisant nos recherches sur le vieillissement. Les souris diabétiques seront âgés de 2 à 10 mois afin que l'impact négatif sur leur santé et bien-être soit modéré. Au moment du sacrifice, par l'expérience que nous avons de ce modèle, nous estimons que les souris diabétiques ne devraient pas atteindre un poids de 45 g. Si c'est le cas avant la date de mise à mort initialement déterminée, alors nous interromprons l'ensemble du protocole pour la totalité des souris. Ces dernières seront alors sacrifiées pour l'analyse tissulaire. Pour limiter les douleurs des animaux, les procédures ne comprennent ni injection, ni manipulation, avant le jour du sacrifice. 30 - 20 minutes avant la mise à mort des souris, ces dernières seront pesées et la glycémie mesurée puis elles seront anesthésiées afin de réaliser une échographie cardiovasculaire.
Choix des espèces
Les souris ont un génome très proche de celui de l’Homme, et leur système physiologique récapitule assez bien les observations faites chez l’Homme. Aujourd’hui, la souris représente le meilleur modèle pour la compréhension des phénomènes physiologiques comme le vieillissement et les maladies cardiovasculaires sous-ajacentes. Deux type de souris seront nécessaires à l'étude: des souris normales (non diabétiques, non obèses) qui représenteront le vieillissement normal de l'aorte et serviront également de référence par rapport aux souris obèses et diabétiques qui présenteront un vieillissement accéléré de l'aorte et un développement de pathologie comme l'hypertension, l'athéroclérose... en accord avec l'évolution pathologique humaine. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 2 mois à l’initiation des procédures . Elles seront agées de 24 et 10 mois à la fin dess procédures pour les souris normales et obèses/diabétiques, respectivement.
Évaluation in vivo de l’efficacité anticancéreuse d’un traitement à base de nanocapsules lipidiques pour le glioblastome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Deux chirurgies crâniennes espacées de quatorze jours, la première pour greffer des cellules de glioblastome dans le cerveau, la seconde pour y injecter des nanocapsules chargées de deux médicaments. 50 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec perte de poids liée à la progression tumorale et troubles neurologiques possibles aux stades avancés. Celles qui n'ont atteint aucun point d'arrêt cent vingt jours après la greffe seront "considérées comme guéries" et tuées elles aussi. Le RNT annonce une échelle d'évaluation de la souffrance et des points d'arrêt sans préciser lesquels, et ne nomme pas les deux médicaments associés.
Objectifs
Le glioblastome est une forme très grave de cancer du cerveau, avec un pronostic difficile. Malgré des traitements comme la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie, l'espérance de vie moyenne est d'environ 15 mois. Deux grands obstacles rendent ces traitements moins efficaces : d'abord, une barrière protège le cerveau et empêche les médicaments d’atteindre facilement la tumeur, et ensuite, certaines cellules cancéreuses sont résistantes à la chimiothérapie et continuent de se propager dans le cerveau. Après une chirurgie, la plupart des patients font face à des rechutes agressives près de l'endroit où la tumeur a été retirée. Pour améliorer la survie de patients, il est essentiel d'empêcher ces rechutes. Deux approches prometteuses sont en développement : l'administration directe de médicaments dans le cerveau à l'aide d'implants ou de gels, et l’utilisation de nanomédicaments. La première permet d'amener les traitements directement à la tumeur, en contournant la barrière protectrice du cerveau, tandis que la seconde utilise des particules minuscules pour cibler les cellules cancéreuses, dépasser la résistance du cancer et limiter les effets secondaires. Dans ce projet, des nanoparticules ont été développées pour transporter deux médicaments qui, bien qu'ils n'aient jamais été testés ensemble pour traiter le glioblastome, se sont révélés très efficaces contre les cellules cancéreuses en laboratoire. L’objectif est maintenant de vérifier leur efficacité en les administrant directement dans le cerveau de souris porteuses de tumeurs. Cinquante souris seront utilisées pour évaluer cette nouvelle combinaison de traitements.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de vérifier l’efficacité anticancéreuse d’un nouveaux traitement combinatoire véhiculant des agents chimio-thérapeutiques pour les tumeurs cérébrales très agressives. Les retombées de ce projet pourraient permettre de répondre à un besoin médical non pourvu dans le traitement de ces tumeurs qui n’a pas bénéficié d’innovation thérapeutique depuis 2005.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux chirurgies à 14 jours de distance: 1) greffe tumorale de cellules; 2) administration intratumorale d'un traitement anti-cancéreux. La durée approximative des chirurgies ou tout acte nécessitant une anesthésie de l’animal ne dépassera pas les 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances anticipées dans ce projet concernent la greffe, le traitement intracérébral et les actes chirurgicaux. Les sources de stress potentielles avant/pendant ces actes sont la manipulation, contention des animaux, les injections d'anesthésiques, l’incision de la peau. La perte de poids reflétant la progression tumorale des tumeurs intracrâniennes est aussi un effet indésirable attendu dans ce projet. Il est également possible, quoique rare, que les animaux développent des troubles neurologiques lors de stades avancés de la pathologie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, lorsque l'un des points d'arrêts est atteint. Si les animaux n'ont pas atteint ces points au jour 120 post-greffe tumorale, ils seront considérés comme guéris et seront mis à mort.
Remplacement
L'objectif de ce projet est de tester l'efficacité d'un traitement combiné, administré localement, qui délivre des agents chimiothérapeutiques pour traiter des tumeurs cérébrales très agressives. Les équipes de recherche ont élaboré les différentes étapes de l'expérimentation en s'appuyant sur des résultats obtenus précédemment. La validation de l'efficacité du traitement chez des animaux vivants (in vivo) est une étape cruciale avant d'envisager des essais cliniques chez l'humain. Actuellement, il n'existe aucune autre alternative à l'expérimentation animale pour ce type de recherche.
Réduction
Le nombre total d'animaux requis pour ce projet est de 50. Ce chiffre a été déterminé en se basant sur des protocoles déjà établis : nous avons utilisé une méthode statistique pour calculer le nombre nécessaire d'animaux afin d’obtenir des différences statistiquement significatives entre les groupes étudiés (n = 10 animaux par groupe x 5 groupes expérimentaux = 50 animaux). L'étude de survie durera environ 22 jours pour les animaux témoins et pourra s'étendre jusqu'à 120 jours pour les animaux traités. Les jours de décès après la greffe seront analysés à l'aide d'un logiciel statistique, afin de comparer la survie entre les différents groupes.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupes de 5 par cage, avec des mesures d'enrichissement de leur environnement pour assurer leur bien-être. Cela inclut l'utilisation de litière à base de cellulose, de petits dômes stérilisables, et des morceaux de bois à ronger dans chaque cage. Les animaux seront observés quotidiennement, et des efforts seront faits pour les habituer aux situations potentiellement stressantes afin de minimiser leur inconfort. Une échelle d'évaluation de la souffrance sera utilisée pour mesurer leur niveau de douleur ou de détresse, en tenant compte de critères comme la perte de poids, les changements physiques ou comportementaux, la réaction aux stimuli, et l'apparition de signes cliniques de souffrance. En fonction du score obtenu, des mesures seront prises pour soulager la détresse (comme fournir de l'eau gélifiée, de la nourriture dans la cage ou des enrichissements supplémentaires) et pour gérer la douleur, notamment avec des analgésiques.
Choix des espèces
Le modèle souris (avec le modèle rat) représente le modèle le plus étudié dans le traitement des tumeurs cérébrales. Le modèle de tumeur que nous étudions est un des modèles les plus utilisé dans la littérature pour des études des mécanismes immunitaires et la délivrance des médicaments pour le traitement des tumeurs cérébrales agressives. Les différents travaux scientifiques dans ce domaine ont utilisé très majoritairement des souris de 5 à 8 semaines : afin de pouvoir confronter nos résultats avec la littérature nous avons choisi d’utiliser des souris de 7 semaines.
Modèles de neuropathie pour évaluation de traitements
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 3780
La stimulation tactile ou thermique d'une patte douloureuse s'arrête au moment où l'animal retire sa patte. 1 552 souris et 3 780 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 4 872 d'entre eux, modéré pour 460. Une neuropathie leur est provoquée par jusqu'à dix injections d'un réactif ou par une chirurgie nerveuse, puis ils reçoivent des substances candidates une à deux fois par jour pendant une à six semaines avant d'être soumis aux tests de douleur. 5 232 seront tués parce que leurs lésions nerveuses "affecteront leur maintien en vie dans de bonnes conditions", 100 témoins non lésés étant réutilisés, sans que l'effectif total de 5 332 animaux soit justifié autrement que par la puissance statistique attendue de chaque test.
Objectifs
La douleur neuropathique ne résulte pas d'une stimulation des récepteurs de la douleur, mais d'une lésion ou d'un dysfonctionnement du système nerveux central ou périphérique. Ainsi, les douleurs neuropathiques, dont souffrent 7 % de la population générale, doivent conduire à l’emploi d’un arsenal thérapeutique différent de celui des douleurs nociceptives. Le traitement repose souvent sur les adjuvants plutôt que sur les antalgiques (p. ex., antidépresseurs, antiépileptiques, baclofène, médicaments topiques) ou sur des traitements non médicamenteux (p. ex., kinésithérapie, neuromodulation). Les causes de ces douleurs sont multiples, et incluent des polyneuropathies périphériques (notamment celles du diabète), des lésions nerveuses traumatiques (par exemple après une fracture), des lésions de la moelle osseuse, des AVC, ou encore la sciatique. Des douleurs neuropathiques séquellaires faisant suite à une intervention chirurgicale peuvent également exister. Il n'existe à ce jour pas de traitement 100% efficace des douleurs neuropathiques, dont la prise en charge peut s'avérer complexe (douleurs chroniques, très durables dans le temps, d'où l'impossibilité de donner des antalgiques puissants tels que les opioïdes du fait de leurs effects secondaires), avec un accès inégal de la population aux spécialistes adaptés à la prise en charge de ces pathologies. Ce projet permettra de tester, dans des modèles de douleur neuropathique chez le rongeur, des candidats traitements permettant de diminuer les signes de douleur.
Bénéfices attendus
Il n'existe à ce jour pas de traitement permettant de soigner l'ensemble des douleurs neuropathiques, dont la prise en charge peut s'avérer complexe (douleurs chroniques, durables dans le temps), avec un accès inégal de la population aux spécialistes adaptés à la prise en charge de ces pathologies. Ce projet permettra de tester, dans des modèles de douleur neuropathique chez le rongeur, des candidats traitements permettant de diminuer les signes de douleur, dans le but de développer de nouvelles thérapies présentant une bonne efficacité dans la prise en charge de la douleur et l'amélioration de la qualité de vie des patients, le tout sans effet secondaire marqué .
Procédures
Une phase d'administration (durée de l'ordre de la minute) sera réalisée (principalement 1 fois (2 fois max) par jour; pendant 1 à 6 semaines en fonction de la spécificité du traitement). En cas de nécessité d'implanter un cathéter, la chirurgie dure environ 30 à 60 minutes. L'induction de la neuropathie sera réalisée par administration d'un réactif (environ 1 minute, sous contention ou sous anesthésie; fréquence dépendante du réactif : de 1 à 10 injections en standard) ou par chirurgie (5 à 10 minutes, sous anesthésie). Le comportement général des animaux sera évalué (observation avec ou sans manipulation, de l'ordre de quelques minutes) et des tests comportementaux (réaction à des stimuli tactiles ou thermiques, de l'ordre de quelques secondes à 5 minutes). Chaque test sera, en général, limité à 1 à 3 occurrences par jour. En standard un produit étudié pour ses effets aigus sera évalué sur 1 journée. Un produit étudié pour ses effets chroniques sera étudié maximum 3 fois/semaine (en général 1/semaine), le plus souvent sur 1 à 2 semaines. Des prélèvements sanguins (en général 2 maximum par animal) pourront être réalisés (durée de l'ordre de la minute, sous anesthésie légère ou non).
Impact sur les animaux
Les animaux dans ce projet (à l'exception des animaux témoins, sans induction de pathologie) vont développer une neuropathie, qui peut se manifester par une hypersensibilité à la douleur ou une douleur spontanée, de manière chronique. Les manipulations réalisées au cours des procédures peuvent entraîner un stress le temps de l'administration de réactif, de substance, ou lors du test (e.g. stimulation tactile au niveau d'une patte) ou du prélèvement sanguin, notamment du fait de la contention. Malgré les soins péri-opératoires (incluant un analgésique), il est possible que la chirurgie (le cas échéant) entraîne une douleur post-opératoire au site concerné. Les tests comportementaux basés sur la stimulation tactile ou thermique d'une zone potentiellement douloureuse peuvent entraîner une douleur aigue au moment du test (la stimulation est arrêtée dès la réaction de retrait de l'animal).
Devenir
Les animaux présentant une neuropathie seront euthanasiés, car ils présenteront des lésions nerveuses qui affecteront leur maintien en vie dans de bonnes conditions. Les animaux témoins, sans lésion, pourront être maintenus en vie pour réutilisation s'ils ont bien récupéré des tests (observation par un vétérinaire et par le personnel compétent), et s'ils n'ont pas été soumis à des prélèvements de tissus pour analyse de biomarqueurs notamment (par exemple, prélèvement de structures nerveuses, ce qui rendrait impossible leur maintien en vie).
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction au sein du corps entier, ce qui est un point particulièrement important dans ces modèles car les lésions nerveuses induites entraînent des effets à différents niveaux de 'organisme, avec notamment une intégration centrale, et induisent des douleurs aussi bien au niveau de la zone lésée, qu'à l'extérieur de cette zone. Ces conditions spécifiques ne peuvent actuellement pas être reproduites in vitro, et l'étude de l'efficacité des traitements (analgésiques, notamment) nécessite l'utilisation d'animaux présentant une douleur neuropathique. Cependant, dans la majorité des cas les traitements médicamenteux étudiés dans le cadre de ce projet ont été sélectionnés au cours d'études in vitro et/ou in silico avant leur évaluation chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés, les tests paramétriques ou non paramétriques pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites spécifiques clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). Pendant la phase chirurgicale, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets. Si pertinent, une anesthésie légère sera appliquée pour certaines administrations ou prélèvements sanguins.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des modèles largement employés pour étudier une grande variété de douleurs neuropathiques, que ce soit des modèles de lésion, de neuropathie consécutive à une maladie, ou encore à un traitement par chimiothérapie. Principalement rongeurs sevrés (à partir de 21 jours, jusqu'à l'âge adulte) car les douleurs neuropathiques étudiés dans ce projet ne sont pas des maladies pédiatriques.
Modèles d’insuffisance hépatique aiguë induit chez la souris et traitement par une approche de cellules hépatiques dérivées de cellules souches pluripotentes.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Une hépatite fulminante leur est provoquée par intoxication au paracétamol ou au thioacétamide, suivie pour une partie des animaux d'une laparotomie avec injection dans la veine porte ou dans la rate. 1 890 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, la survie attendue dans le groupe non transplanté étant inférieure ou égale à 30 %. Le porteur écrit que l'induction de l'hépatite "n'est pas un acte sévère" et que les animaux ont "totalement récupéré" au bout de cinq jours, tout en décrivant un état comateux possible. Aucune souris ne sort vivante du projet, la procédure étant classée sévère et de ce fait "non réutilisable".
Objectifs
La greffe de foie est le traitement reconnu pour de nombreuses maladies du foie au stade terminal mais il y a pénurie de foies donneurs. La transplantation d’hépatocytes isolés de foies donneurs est une alternative prometteuse mais limitée par cette même pénurie et l’incapacité à amplifier les hépatocytes in vitro. Un nouveau concept thérapeutique a émergé visant à utiliser des cellules souches pluripotentes (CSP) comme une source illimitée de cellules du corps. C’est cette capacité que nous utilisons pour produire des quantités illimitées de cellules hépatiques dérivées de CSP (StemHep) mais également des vésicules extracellulaires (VeHep). Actuellement, la physiopathologie de l’insuffisance hépatique et la régénération hépatique ne sont pas modélisées in vitro. Seuls les modèles in vivo, qui permettent de mesurer les capacités thérapeutiques de cellules, sont validés par les instances réglementaires. Nous devons donc valider l’effet thérapeutique des différents protocoles de productions de StemHep et des VeHep sur des modèles d’hépatite fulminante chez la souris avant de pouvoir les utiliser en phase clinique. De plus, nous devons pouvoir suivre la distribution de nos cellules en fonction du site d’injection et montrer qu’elles n’ont pas de capacité tumorigène dans un modèle murin immunodéficient bien établi et reconnu au sein des instances réglementaires.
Bénéfices attendus
A ce jour, dans le cas d’insuffisance hépatique, il n’existe aucune alternative à la greffe de foie. Notre projet se positionne en recherche translationnelle pour développer de nouvelles biothérapies à partir de cellules souches pluripotentes pour répondre aux besoins médicaux urgents non satisfaits dans le domaine des maladies du foie, et éviter la greffe de foie. Ce projet innovant permettra une avancée majeure en thérapie cellulaire et son succès permettra d’envisager le lancement d’une première phase clinique pour lutter contre une maladie dont la prévalence mondiale, déjà très élevée, risque d’augmenter fortement dans les années futures.
Procédures
Injection intrapéritonéale sur animaux vigiles (1min/animal, une fois) Laparotomie et injection intraportale ou intrasplénique sur animaux anesthésiées (20min/animal, une fois)
Impact sur les animaux
Ce projet portera sur l’étude des paramètres biologiques et biochimiques dans des modèles d’hépatite fulminante. L’induction de l’hépatite par voie intrapéritonéale n’est pas un acte sévère mais l’ensemble de ce projet est classé en protocole sévère puisqu’il est attendu une survie inférieure ou égale à 30% dans le groupe non transplanté et les animaux transplantés subissent une laparotomie justifiant ce classement. L’hépatite fulminante peut induire un état comateux des souris et la chirurgie engendrera douleur et stress aux animaux. Cette sévérité est restreinte à une durée de 4-5 jours post opératoire, les animaux ayant totalement récupérés au bout de 5 jours.
Devenir
Procédure sévère donc non réutilisable.
Remplacement
Modèles d’hépatite : malgré des avancées récentes, notamment dans la mise en place d’organoïdes, il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro permettant de mimer la complexité d’une structure hépatique. La toxicité de diverses molécule peut être étudiée dans quelques modèles développés in vitro mais ceux-ci ne permettent pas de valider un effet thérapeutique. Seuls les modèles in vivo peuvent montrer la capacité thérapeutique de notre médicament. Nous avons cependant pu obtenir de réaliser ces études chez la souris avant de passer en clinique sans avoir besoin de développer un modèle chez les gros animaux. Modèle de tumorigénicité : nous mettons en place des techniques prédictives de tumorigénicité in vitro. Ces techniques nous permettrons de limiter les études faites in vivo mais actuellement seules les études in vivo sont validées par les instances réglementaires avant le lancement d’une phase d’étude clinique.
Réduction
Notre expérience précédente et la simulation statistique nous permet de conclure qu’il nous faut 10 souris par groupe d’étude pour obtenir un test statistique acceptable. Nous avons essayé de diminuer ce nombre à 5 souris par groupe mais cela diminuerait énormément la force de l’étude puisque la différence de survie serait alors statistique uniquement si toutes les souris du groupe transplanté survivent, ce qui ne peut être considéré comme plausible scientifiquement.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux avec enrichissement dans les cages. L’utilisation d’un tableau de scoring de points limites nous permet d’évaluer de manière précise la nécessité de mise à mort rapide des animaux si nécessaire afin de limiter au maximum leur souffrance. Il prend en compte l’aspect des animaux (poils, yeux, posture), leur comportement (mobilité, isolation, réaction aux stimuli) et leur poids. Il permet d’homogénéiser le suivi et la prise de décision entre les utilisateurs. Afin de minimiser stress et douleur, nous utilisons des traitements pré et post-opératoires adaptés. L’ensemble de la procédure chirurgicale est réalisé en condition stérile et la mise en place, au sein de la pièce dédiée à la chirurgie, de postes isoflurane automatiques permet un meilleur contrôle des paramètres d’anesthésie.
Choix des espèces
Les souris intoxiquées au paracétamol ou au thioacétamide sont des modèles de choix et de référence dans la littérature scientifique pour l’étude de la physiopathologie de l’IHA induite chez l’Homme. Comme ce qui est décrit dans la littérature, les animaux seront âgés de 6-10 semaines au moment du début du protocole.