Souris

Les souris qui dépassent les points limites fixés après l'opération sont tuées par dislocation cervicale. 62 souris sont utilisées dans ce projet, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une chirurgie crânienne de vingt minutes pour recevoir une injection de thrombine qui bouche l'artère cérébrale moyenne, puis quatre heures seule en cage sous argon ou sous air, puis deux passages en IRM à un et cinq jours. Le porteur écrit qu'"aucune douleur n'est à prévoir" pendant ces examens et juge "indispensable" de trouver de nouvelles stratégies, moins d'un patient sur dix pouvant aujourd'hui recevoir le traitement existant.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester les effets d’un gaz, l’argon sur les volumes lésionnels post AVC. L’argon est susceptible d’agir sur la diminution de l’activation des macrophages et donc d’induire une neuro protection. Nous utiliserons donc un modèle d’infarctus cérébral thromboembolique qui reproduit au mieux la physiopathologie de l’AVC permettant une meilleure transposabilité des résultats obtenus vers la clinique. Les effets seront observés par IRM à J1 et J5 post AVC.

Bénéfices attendus

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter de la murine alpha-thrombine, provoquant ainsi l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM). Cet acte chirugical durera 20 minutes. Les animaux traités à l'argon seront placé en cage individuelle afin de recevoir de l'argon pendant 4 heures post AVC. A J+1 et +5, la moitié de ces animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 11 minutes. La seconde moitié seront aussi passés à l’IRM dans les mêmes condtions pour une durée totale de 26 minutes. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang sera réalisé avant perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. Néanmoins, le modèle utilisé ici affecte une région du cerveau ne causant pas d’effets délétères sur le long terme. Les animaux seront sous anesthésie générale pour les examens IRM, aucune douleur n’est à prévoir.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. Le nombre d’animaux utilisés est fixé à 26 souris par groupe (+ 20%), ce qui nous permettra de déceler des différences significatives. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris seront en groupes sociaux avec plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et demi-sphère de cellulose), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique administrée en sous-cutanée. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Sur le cadre stéréotaxique, pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles au niveau du conduit auditif, une anesthésie locale de lidocaïne est appliquée. La température corporelle de l’animal est maintenue grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée, et une couverture isothermique sur son dos limite les pertes de chaleur. Lors de la phase de réveil, les animaux seront placés dans une cage individuelle pendant 4 heures sous 100% Air ou 70% argon / 30% O2 ; avant d’être remis dans leur cage. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil (4 heures). Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivants l’opération. Il pèsera chaque animal et veillera à ce que les points limites ne soient pas dépassés.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la protection, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par un AVC ischémique. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids de 35g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.

4 332 souris vont être utilisées, chacune subissant selon la procédure jusqu'à douze prélèvements d'urine sous contention manuelle, cinq prises de sang, quatre injections, puis une injection létale. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et durent dix à douze semaines par animal. Une partie des souris est génétiquement modifiée pour vieillir plus vite, ce qui les fait mourir plus tôt, et le projet leur inflige une maladie auto-immune du rein pour observer comment l'âge en accélère l'installation. Le porteur écrit que le développement de cette glomérulonéphrite "n'est pas douloureux pour l'animal", tout en déclarant l'ensemble des procédures en gravité modérée.

Objectifs

L’altération progressive et irréversible du rein est une caractéristique du vieillissement chez l’homme conduisant à terme à l’insuffisance rénale chronique (IRC) puis à l’insuffisance rénale terminale nécessitant la mise en place de dialyse ou de greffe rénale Tandis que les fonctions immunitaires déclinent avec l’âge, le vieillissement est aussi caractérisé par une une augmentation du risque d’être atteint de maladies auto-immunes. Dans ces maladies, notre propre système immunitaire se retourne contre nous et produit des anticorps attaquant nos propre cellules. Parmi elles, la glomérulonéphrite extra-membraneuse (GEM) est une maladie auto-immune où des anticorps cible des cellules du rein. Bien que des avancées significatives aient été réalisées dans la compréhension de cette maladie, les facteurs favorisant son initiation restent peu compris, que ce soit du point de vue de l’induction de l’auto-immunité ou de la progression de la maladie. De plus, malgré un pic d’incidence de la GEM autour des 55-60 ans, l’influence du vieillissement sur la physiopathologie de la maladie n’a jamais été étudiée. Notre projet vise donc à déterminer les mécanismes par lesquels le vieillissement, au niveau rénal mais aussi immunologique, favorise l’induction et la progression de cette maladie rénale.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra une meilleure compréhension de l’impact du vieillissement sur l’induction et la progression de la GEM. Ceci permettra à terme de proposer de nouveaux outils diagnostiques ou pronostiques en identifiant des marqueurs de prédisposition à la GEM mais aussi d’ouvrir de nouvelles perspectives de voies thérapeutiques pour les patients atteints de cette maladie.

Procédures

Au cours de la procédure 1, par animal sur tous les animaux du projet (12 semaines) : - 4 injections sur animaux vigiles. 10 secondes par injection. - 3 prélèvements sanguins sur animaux vigiles. 30 secondes par prélèvement. - 12 prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle. 20 secondes par prélèvement. - 1 injection lethale. Au cours de la procédure 2, par animal sur tous les animaux du projet (10 semaines) : - 1 injection sur animaux vigiles. 10 secondes par injection. - 5 prélèvements sanguins sur animaux vigiles. 30 secondes par prélèvement. - 10 prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle. 20 secondes par prélèvement. - 1 injection léthale.

Impact sur les animaux

Certaines des souris utilisées sont génétiquement modifiées pour avoir une accélération du vieillissement, ce qui entraine une mortalité à des âges plus précoces. Lors des expériences, les souris pourraient être sujettes à un stress et angoisse liées à leur manipulation voire des douleurs liées aux injections, prélèvements d’urine et de sang effectuées sur ces souris. Des complications éventuelles peuvent survenir suite à l’utilisation de seringue notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement, une infection du site de l'injection/prélèvement. Le développement de la glomérulonéphrite extra-membraneuse n'est pas douloureux pour l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d'effectuer une cinétique d'induction ou de progression de la maladie.

Remplacement

L’analyse des altérations au cours du vieillissement peut être étudiée in vitro sur modèles de cellules en 3D. La mise au point dans notre équipe de ce protocole in vitro, est à un stade précoce. De plus, bien que ces modèles cellulaires aient un potentiel important pour remplacer et réduire l'utilisation de l'animal, ils ne permettent pas de reproduire les interactions physiologiques et les mécanismes physiopathologiques intégrés à l'ensemble de l'organisme. La GEM étant une pathologie où le système immunitaire produit des anticorps ciblant les cellules du rein, seul un modèle animal permettra de caractériser et surtout d'établir une cinétique permettant de mieux comprendre les mécanismes favorisant au cours du vieillissement l’induction et la progression de la maladie.

Réduction

Les souris disposant de deux reins, nous optimiserons l’utilisation de ces souris en effectuant différentes méthodes d’analyses sur chaque rein. Des statistiques prédictives ont également été réalisées dans le but d'utiliser le minimum d'animaux nécessaires à ce projet en prenant en compte les effets attendus et le type de tests statistiques effectués.

Raffinement

Pour limiter la douleur modérée que notre procédure expérimentale pourrait induire, nous avons établi une grille d’observation visant à définir les points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et qui indique les mesures, tels que les traitements, que nous prendrons à l’apparition des premiers signes de douleur, de complications ou de perte de poids. D'autre part, en plus du personnel de l’animalerie, un suivi sanitaire une fois par semaine sera réalisé par les membres de l’équipe (expérimentateurs) à l’aide d’une feuille de suivi adaptée au modèle.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est un modèle de choix en raison de similarités génétiques et physiologiques avec l'homme, ce qui nous permettra d'extrapoler les résultats et d'en tirer des conclusions valables pour l'homme. La souris est un modèle qui nous permet d'obtenir assez de matériel biologique pour réaliser de nombreuses analyses nécessaires au déroulé de ce projet de recherche. De plus, des études au sein de nombreuses équipes, dont la nôtre, montrent que les méthodes d’induction de la maladie utilisées reproduit l’ensemble des symptômes observés chez les patients GEM. Ceci permet d’établir ce modèle de souris comme un bon modèle de la maladie humaine. Enfin, les souris génétiquement modiiées pour avoir un vieillissement prématuré sont un modèle qui est déjà disponible et nous avons les expertises nécessaires pour diriger un modèle murin.

De la collagénase bactérienne est injectée dans le striatum de chaque souris pour y provoquer une hémorragie cérébrale, opération de quinze à vingt minutes suivie de la pose d'un cathéter dans la veine de la queue. 1 232 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune passe jusqu'à cinq séances d'IRM sous anesthésie et une batterie de tests sensorimoteurs répartis sur trois semaines, le porteur précisant que les déficits provoqués restent "légers" et que l'animal peut "aisément" continuer à s'alimenter et à se fabriquer un nid. La mise à mort passe par une ouverture de l'abdomen et du thorax pour ponctionner le cœur, puis par une perfusion transcardiaque qui fixe le cerveau avant son prélèvement.

Objectifs

En clinique, les hémorragies intracérébrales spontanées (HICS) ou AVC hémorragiques, non traumatiques, résultent d'une irruption plus ou moins importante de sang dans le tissu cérébral faisant suite à la rupture d'un vaisseau cérébral. À ce jour, aucune stratégie thérapeutique pharmacologique permettant de réduire les effets délétères d'un hématome sur le parenchyme cérébral n'est disponible. L'objectif de ce projet préclinique longitudinal est de tester des stratégies thérapeutiques innovantes dans un modèle d'AVC hémorragique chez la souris afin d'étudier leur impact sur les volumes hémorragiques et lésionnels observables à différents temps grâce à l’IRM, ainsi que sur la récupération fonctionnelle au fil du temps. Pour ce faire, nous utiliserons un modèle d'AVC hémorragique consistant en l'injection latéralisée de collagénase bactérienne dans le striatum cérébral. Cette chirurgie, bien documentée, reproduit fidèlement la physiopathologie de l'AVC hémorragique, permettant une meilleure transposabilité des résultats obtenus vers la clinique. L'AVC sera induit sur des souris âgées de 10 à 12 semaines, chez des individus femelles et mâles, afin de reproduire la diversité clinique.

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie ne repose sur aucun traitement pharmacologique. Ainsi, il est indispensable depuis des décennies de développer des stratégies thérapeutiques innovantes dans le domaine de l’AVC hémorragique. C’est l’objectif fondamental de ce projet qui consiste en l'exploration de diverses approches thérapeutiques, en employant différents modes d'administration distincts, sur des animaux de sexes et de souches différentes, afin d'évaluer leur incidence sur les aspects cruciaux de l’AVC explicités dans les paragraphes précédents. En cas de résultats défavorables, les différents tests thérapeutiques auront contribué à élargir le champ des connaissances scientifiques dans le domaine de l'accident vasculaire cérébral hémorragique, offrant des enseignements précieux pour orienter de futures recherches et guider le développement de stratégies thérapeutiques novatrices. En présence de résultats encourageants, les molécules fournies par les partenaires industriels seront soumises à des essais cliniques, avec pour objectif ultime la mise sur le marché dans les années à venir. Ces résultats auront également un impact sur la communauté scientifique, stimulant la collaboration entre le secteur public et privé. Les résultats bénéfiques permettront non seulement d'offrir un nouvel espoir aux patients victimes d'AVC, mais également d'encourager la poursuite des travaux de recherche sur des axes thérapeutiques spécifiques. Cette collaboration renforcée entre public et privé favorisera un échange continu d'idées et d'expertise, créant ainsi un environnement propice à l'innovation et à la progression des connaissances dans le domaine. Pour finir, en obtenant l'approbation réglementaire, certaines des thérapies que nous souhaitons tester pourront donc bénéficier à un grand nombre de patients, marquant ainsi une avancée importante dans la prise en charge de l'AVC hémorragique.

Procédures

Les 1232 animaux de cette DAP seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin d’injecter de la collagénase dans le striatum cérébral droit des souris dans le but d’obtenir un AVC ischémique. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera 15 à 20 minutes et l’animal restera endormi environ 30 minutes. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un traitement en intraveineux. La pose de cathéter prendra environ 5 minutes. À J0, J1, J2, J5 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 20 minutes. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux ayant pour but de contrôler les déficits sensorimoteurs après AVC et la récupération fonctionnelle au cours du temps. Ces tests se dérouleront jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J2, J3, J5, J7, J14 et J21. Chaque animal passera moins de 15 minutes pour chacun des tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition et à l’ensemble des tests. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC hémorragique, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales due à l’hématome et à l’œdème au niveau cortical et striatal. Les déficits fonctionnels sont considérés comme léger à court et moyen terme dans ce modèle d’AVC, mais peuvent occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. A long-terme les déficits fonctionnels ne sont plus que légèrement perceptibles. Les tests comportementaux réalisés par du personnel entraîné ne sont pas destinés à induire de la souffrance animale, mais leur répétition fréquente au fil du temps peut engendrer du stress chez les animaux. Un animal trop stressé et incapable de réaliser un test particulier sera exclu de celui-ci. Tout au long de l’étude l’animal peut aisément continuer à s’alimenter, s’abreuver et se fabriquer un nid avec les enrichissements mis à disposition dans la cage.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC hémorragique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous les bruits extérieurs. Au sein de chaque cage, les animaux auront toujours accès à divers types d’enrichissements : sizzle-dri kraft, coton et demi-sphère de cellulose ainsi qu’accès ad libidum à la nourriture et à l’eau pendant toute la durée de stabulation. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Durant toute la durée de l’étude, les animaux seront également régulièrement pesés (2 fois par semaine au minimum). Pendant l’opération chirurgicale conduisant à l’AVC hémorragique, l’animal sera anesthésié (3 minutes à 5% d’isoflurane, 30% d’O2 et 70% de N2O) et aura une couverture analgésique à base de buprénorphine (0.05 mg/kg) administrée en sous-cutanée 15 minutes avant la première incision expérimentale. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil à hauteur de 2 % d’isoflurane (30% d’O2 et 70% de N2O). Sur le cadre stéréotaxique, pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles proches du conduit auditif de la souris, une anesthésie locale sera appliquée avec de la lidocaïne à appliquer en spray. De plus, chaque site d’incision de peau sera précédé d’une tonte préalable du pelage et d’une désinfection à la chlorhexidine. La température corporelle de l’animal sera maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée et à une couverture isothermique placée sur le dos de la souris qui limite les pertes de chaleur. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. En cas de constatation post-opératoire de dépassement des points limites fixés et détaillés plus bas dans cette DAP, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivants l’opération.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, ainsi que la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC hémorragique, l'utilisation de la souris devient incontournable. En effet, elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats obtenus avec ceux de la littérature, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen de entre 25g et 35g selon les souches. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.

Des souris porteuses de mutations qui leur causent des douleurs, des difficultés à se déplacer et parfois la mort avant terme sont élevées ici pour d'autres projets. 7 500 d'entre elles sont concernées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la seule intervention décrite étant une biopsie de quelques secondes pour le génotypage. Le porteur affirme que l'élevage de ces lignées ne peut pas être remplacé, ces animaux constituant selon lui "le cœur même" des projets des utilisateurs. Celles dont le génotype n'intéresse aucun projet sont transférées vers un autre établissement quand c'est possible, tuées sinon, tandis que les autres partent en expérimentation ailleurs ou servent de reproducteurs.

Objectifs

Dans le cadre de la production de modèles murins génétiquement modifiés, l'objectif du projet est de décrire la prise en charge des pathologies induites par les mutations de ces modèles.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de raffiner la production de souris génétiquement modifiées et de gérer l'apparition de pathologies induites par ces modèles en anticipant leur prise en charge et en permettant ainsi une réaction immédiate et adaptée. Il y a également un bénéfice indirect, car les modèles précliniques génétiquement modifiés permettent de reproduire chez l’animal des pathologies humaines.

Procédures

Des mutations chez des souris génétiquement modifiées peuvent entrainer des nuisances (phénotype dommageable) durant l’élevage chez l’animal. La biopsie pour génotypage ne prend que quelques secondes.

Impact sur les animaux

En fonction du modèle de pathologie, les mutations entrainant un phénotype dommageable induisent en général et à des degrés divers des douleurs, de l’inconfort, des difficultés à se déplacer et pour certaines des mortalités selon le génotype. Le génotypage des animaux requiert un prélèvement qui peut occasionner une gêne de très courte durée.

Devenir

Les animaux d'intérêt sont utilisés dans des procédures epxérimentales dans d'autres établissements utilisateurs (utilisation continue) ou peuvent servir en tant que reproducteurs. Les animaux dont le génotype n'a pas d'intérêt pour les projets expérimentaux initiaux peuvent être soit utilisés pour d'autres projets expérimentaux dans d'autres établissements utilisateurs si c'est possible, soit euthanasiés s'l n'y a pas de possibilité de les utiliser dans d'autres procédures.

Remplacement

Différentes stratégies de remplacement peuvent être appliquées par les chercheurs en amont de l'élevage des souris (expériences préparatoires in vitro, modélisations, veille scientifique) ou en aval des expérimentations (modélisation, raffinement des méthodes statistiques). Pour ce projet précis, il n'est pas possible de remplacer l'élevage de lignées de souris car ces animaux correspondent au coeur même des projets des utilisateurs.

Réduction

La réduction en pratique d'élevage nécessite une optimisation de l'âge des animaux géniteurs afin d'obtenir la plus grande descendance avec un minimum de cages d'accouplement. Elle nécessite aussi un choix approprié des génotypes des géniteurs (choix du mâle vs femelle; utilisation hétéro/homozygote, etc). La production sera rationnalisée par l’établissement de programmes d’élevage afin de ne pas produire plus d'animaux que nécessaire pour la production de lots expérimentaux.

Raffinement

Le raffinement concernant l'évaluation et l'entretien de lignées à phénotype dommageable ou potentiellement dommageable est obtenu en appliquant scrupuleusement les consignes des chercheurs concernant l'apparition des points limite attendus ou supposés pour chaque lignée considérée. Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par un enrichissement des cages de production et de stabulation des animaux (par exemple : batonnets de coton, maison en carton si besoin, frisottiss si besoin,mise à disposition de l'aliment et/ou de la source hydratée sur la litière si besoin , etc... adaptation du nombre d'animaux / Cage au phénotype). Les conditions environnementales sont très élevées afin de protéger les animaux d'infections.

Choix des espèces

La souris est un animal permettant un grande variété de techniques génétiques permettant d'établir des relations entre gènes, fonctions, comportements et pathologies. Tout âge : animaux jeunes à âgés selon le type de procédures expérimentales dans lesquelles ces animaux sont par la suite utilisés en utilisation continue.

3 750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection dans l'œil sous anesthésie, puis est placée jusqu'à quatre mois sous lumière intense, avec jusqu'à cinq électrorétinogrammes de trente à quarante-cinq minutes et dix-sept séances d'imagerie de la rétine. Le porteur affirme que les cultures de cellules isolées ne reproduisent pas la maladie dans un "organisme entier" et retient la souris comme espèce la plus appropriée. Il décrit par ailleurs des conditions d'hébergement inchangées pendant l'illumination, à ceci près que les cotons sont retirés des cages pour empêcher les souris de se cacher de la lumière.

Objectifs

La dégénérescence maculaire liée à l'âge est une maladie oculaire provoquée par une dégénérescence progressive de la macula, partie centrale de la rétine, qui apparaît le plus souvent à partir de 65 ans. En France, environ 1,5 millions de personnes seraient atteintes de DMLA. Dans cette pathologie, un processus inflammatoire, caractérisé par l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires, participe de manière importante à la dégénérescence de la rétine. Notre projet vise à tester différentes molécules pouvant réduire ce processus inflammatoire et ainsi briser le cercle vicieux inflammation/dégénérescence. Nous étudierons l’effet de ces molécules sur des modèles murins adaptés.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre d’aider à la mise au point d’une thérapie pour rétablir à long terme l’immunosuppressivité sous rétinienne et empêcher l’accumulation de cellules inflammatoires pathogéniques, freinant ainsi significativement l’évolution de la DMLA.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de molécules thérapeutiques par voie intraoculaire (1 fois par animal anesthésié, durée de l’intervention : moins de 5 minutes). Ils iront en stabulation sous une lumière intense (jusqu’à 4 mois). Des explorations fonctionnelles de la rétine seront réalisées sous anesthésie : par enregistrement d’électrorétinogrammes (30 à 45 minutes, maximum 5 fois par animal) et de méthodes d’imagerie rétiniennes (durée 10 minutes pour les 2 examens, maximum 17 fois par animal).

Impact sur les animaux

Lors des anesthésies, il y a un risque de mauvaise réaction à l’anesthésiant (difficultés respiratoires, anxiété) et un risque d’hypothermie. Lors de l’injection dans l’œil, il y a un risque d’inflammation localisée (œil rouge) et de micro saignements. Lors de le procédure d’illumination, les animaux peuvent ressentir un stress lié à l’exposition à la lumière intense (animaux agités), et leurs fonctions visuelles peuvent baisser. Lors des explorations, les animaux peuvent également ressentir un stress lié à la contention lors de l’administration des collyres (animaux agités).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem. Cela implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux, car nous avons besoin de prélever des organes entiers pour les analyser dans leur globalité.

Remplacement

Les études in vitro ou sur les animaux invertébrés ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie de l’œil en particulier ; la souris est une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Ces modèles permettent d’étudier la maladie dans un organisme entier, qui ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus.

Réduction

Nous prévoyons 3750 animaux pour réaliser cette étude. Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables au regard de nos précédentes expériences d’autres projets de recherche (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 5 animaux défini par groupe est le minimum requis pour l'application de tests statistiques de significativité fiables et l'obtention de résultats interprétables et fiables, selon nos expériences antérieures. Nous prévoyons d’injecter le traitement dans un œil et le contrôle dans le deuxième œil de chaque animal pour limiter la variabilité entre animal et réduire ainsi le nombre d’animaux de l’étude.

Raffinement

Une période d'acclimatation de 5 jours sera prévue avant tout début d'expérimentation. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées standard avec enrichissement : 1 bâton en bois, coton. Les animaux sont hébergés avec alimentation et abreuvement à volonté. Lors des expériences de d’illumination, les animaux sont placés dans une pièce différente, mais restent dans leurs cages de stabulation normale, selon les mêmes conditions, hormis la luminosité et les cotons qui sont retirés pour éviter que les animaux ne se cachent de lumière. Ils auront accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Les animaux bénéficieront si besoin d’une anesthésie générale et d’une anesthésie locale. L’animal est placé sur tapis chauffant durant pour prévenir le risque d’hypothermie.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour étudier la réponse inflammatoire participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine. Nous utilisons des modèles génétiquement modifiés qui sont plus susceptibles à l’induction d’une inflammation pathogène, mimant la DMLA. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines minimum à leur entrée dans la procédure expérimentale. C’est l’âge à partir duquel le système immunitaire et vasculaire de la souris est mature et donc à partir duquel elle est susceptible de développer la maladie étudiée.

Gavées ou injectées dans l'abdomen une fois par jour pendant une à trois semaines, 480 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour que leurs organes soient prélevés. Elles relèvent d'un modèle murin que le porteur présente comme validé par la littérature et sans phénotype dommageable, reproduisant deux traits associés à l'autisme, la baisse de sociabilité et les mouvements répétitifs. L'objectif déclaré est de tester des substances déjà administrées à des rongeurs, pour un trouble humain sans traitement approuvé. Le porteur annonce trois tests comportementaux, répétés jusqu'à trois fois par animal sur six semaines, sans jamais dire lesquels.

Objectifs

Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de traitements contre des déficits comportementaux présentant des analogies avec les troubles du spectre autistique. Pour cela, un modèle murin déjà validé par la littérature va être utilisé. Les troubles du spectre autistique se manifestent principalement par 2 composantes : une altération de la sociabilité et des comportements répétitifs, qui sont retrouvées dans le modèle choisi. Il n’y a pas encore de traitements approuvés des troubles autistiques. Nous proposons ici de tester des traitements chroniques avec des substances ayant déjà été administrées chez le rongeur, sans montrer de toxicité aux doses qui seront testées.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d’évaluer l’efficacité de différents traitements contre les troubles autistiques à l’aide d’un modèle murin validé par la littérature. Ce modèle ne présente pas phénotype dommageable. Les traitements actuels de l’autisme étant limités, cela permettra d’envisager de nouveaux traitements chez l’humain.

Procédures

Les animaux seront administrés quotidiennement (une fois par jour) par voie intrapéritonéale (injection) ou voie orale (gavage) pendant 3 semaines concernant 160 animaux ; ou entre 1 semaine et 3 semaines concernant 320 animaux. Le comportement des animaux sera évalué en individuel dans 3 tests comportementaux : à 3 occasions pour la 160 animaux; et à 1 occasion pour 320 animaux. Les tests durent entre 10 min et 20 min/jour, le tout sur 6 semaines pour 160 animaux et 2 semaines pour 320 animaux. Ces procédures seront effectuées par du personnel expérimenté pour limiter le stress de l’animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : 1) une sociabilité diminuée le modèle d’autisme lors des tests comportementaux 2) un stress dû à l’isolement des animaux lors des tests comportementaux (maximum 15 min) 3) un stress et une douleur dus aux administrations répétées par gavage ou injection.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes, pour compléter cette étude.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est justifiée car le comportement (social, mouvements répétitifs, motricité) ne peut être étudié au niveau cellulaire (in vitro) ou par modélisation (in silico). De plus, nous utiliserons un modèle murin déjà validé dans la littérature comme modèle d’autisme.

Réduction

Nous ferons aussi une planification rigoureuse des expériences, en réalisant d’abord une étude longitudinale évaluant les mêmes animaux à différents temps, afin de définir la meilleure chronologie pour l’étude contrôlée par rapport à un groupe traité avec un véhicule. De plus, selon les résultats des substances testés lors de la première partie, nous ne retesterons que ceux aux résultats positifs lors la deuxième partie. Enfin, l’utilisation d’un modèle murin déjà validé comme modèle d’autisme nous permet de ne pas passer une procédure de validation du modèle. Le calcul du nombre des animaux est fait selon une approche statistique, sur la base de la variabilité du comportement des souris modèle d’autisme qui est décrite dans la littérature, nous estimons qu’il nous faut au minimum 10 animaux par groupe pour pouvoir évaluer leur phénotype comportemental.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe. Les tests comportementaux (3 au total) seront effectués par du personnel expérimenté afin de limiter le stress des animaux. Les administrations (intrapéritonéale ou par gavage à l’aide de sondes souples) seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté. Les animaux seront observés quotidiennement pendant la durée des procédures, avec un suivi des points limites adaptés avec des critères d’arrêt appropriés si une souffrance est détectée.

Choix des espèces

L’espèce (souris) correspond au modèle animal que nous avons choisi reproduisant au mieux les troubles du spectre autistique, selon la littérature. Les animaux seront testés à l’âge adulte (à partir de 6 semaines).