Souris
Evaluation d’agonistes inverses du GPER dans la neuropathie chimioinduite
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Rendues douloureuses par administration répétée d'un anticancéreux, les souris de ce projet portent une neuropathie chimio-induite depuis la mise en place du modèle jusqu'à leur mort, soit deux semaines. Elles sont 552, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La douleur est mesurée par application d'un filament sur la patte, 64 animaux subissant en plus l'immersion de la patte dans un bain thermostaté et 16 une chirurgie de trente minutes sous anesthésie. Le porteur qualifie cette douleur de modérée, quand le projet déclare l'ensemble des 552 souris en souffrance sévère. Toutes seront tuées, la souffrance de l'animal ne pouvant pas être supprimée selon le porteur.
Objectifs
Le cancer du sein triple négatif, qui représente environ 17% des cancers du sein, a un pronostic très défavorable. Plus de 50% des patientes recevant une chimiothérapie développent des douleurs dites douleurs neuropathies induites par la chimiothérapie. De telles douleurs imposent des réductions de dose et des interruptions de traitement qui affectent inévitablement la survie. Il a été montré qu'un composé modulant le récepteur GPER (pour "G protein-coupled estrogen receptor") était doté d'une action anticancéreuse sur des cancers triple négatif chez la souris. Plus récemment, il a été montré chez l’animal que ce composé exerçait une action antalgique et anti-inflammatoire. Cela suggère qu'il serait possible de contrôler en même temps et chez un même sujet la croissance tumorale et la douleur en ciblant ce récepteur GPER. Ce projet s’intègre dans une collaboration avec une équipe de chimiste qui réalise la synthèse et la sélection de molécules modulatrices du GPER. Les meilleurs composés sont testés in vitro sur la croissance tumorale. Ainsi, nous souhaitons, chez des souris, évaluer l’action des meilleurs molécules précédemment identifiées sur la douleur neuropathique induite par la chimiothérapie.
Bénéfices attendus
Le produit attendu est un nouvel antalgique et antitumoral permettant non seulement de lutter contre la progression du cancer mais aussi les douleurs neuropathiques induite par la chimiothérapie. L’utilisation d’animaux est indispensable dans ce contexte d’interaction entre système nerveux, diffusion sanguine et système immunitaire. Le marché visé est principalement celui des cancers du sein triple négatif, permettant d’améliorer non seulement le pronostic vital de nombreuses patientes, mais aussi leur qualité de vie.
Procédures
L’ensemble des animaux (552 souris) subiront des injections pour administrer l’anticancéreux et des composés à tester. Une injection dure quelques secondes sur animal vigil. L’évaluation de la douleur sera réalisée par l’application d’un filament au niveau de la patte de l’animal. La douleur chez certains animaux (64 animaux) sera évaluée par le test d’immersion de la patte. Ce test consiste à immerger la patte de l’animal dans un bain thermostaté. Ces deux tests sont susceptibles d’entrainer une douleur de quelques secondes chez l’animal. L’animal est libre de retirer sa patte. 16 animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale qui durera environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
L’ensemble des animaux du projet présenterons une douleur neuropathique induite par la chimiothérapie à l’exception des animaux contrôles. L’induction de cette douleur neuropathie chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. Elle sera induite par administrations répétées d’anticancéreux. Elle peut être associée à une diminution du gain de poids des animaux. La douleur est modérée et sera ressentie de la mise en place du modèle jusqu’à sa mise à mort, c’est-à-dire 2 semaines. Les animaux de l’ensemble du projet subiront des injections pour administrer les composés testés. La piqure d'aiguille pour l’injection entraîne une douleur légère de courte durée. L’application d’un filament au niveau de la patte de l’animal ou l’immersion de la patte de l’animal dans un bain thermostaté est susceptible d’entrainer une douleur de quelques secondes chez l’animal. L’animal est libre de retirer sa patte. Après la chirurgie de certains animaux, ils seront isolés pendant environ 30 minutes pour la vérification du bon déroulement de l’étape de réveil.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort puisque la souffrance de l’animal ne peut être supprimée.
Remplacement
Les composés synthétisés seront, avant tout passage sur modèle animal, testé in silico pour leur capacité à interagir avec le récepteur GPER, ainsi que in vitro sur culture cellulaire pour évaluer et comparer leur effet avec le peptide de référence. Seuls les composés possédant une meilleure activité pharmacologique que le peptide de référence seront étudiés chez l’animal. S'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux. Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Ces approches alternatives ne permettent pas de prendre en compte l’organisme vivant dans sa totalité et ne peuvent, à l’heure actuelle, se substituer à l’utilisation de modèles animaux. Ce type d'étude sur modèle animal est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.
Réduction
Ces travaux seront précédés par des études in vitro permettant de sélectionner les molécules les plus prometteuses à des doses adaptées. Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les tests comportementaux et modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. De plus, le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. Si les résultats de la 1ère procédure sont négatifs (pas d’effet antalgique de chaque composés) alors l’étude s’arrête et les procédures suivantes ne seront pas réalisées.
Raffinement
Pour les animaux subissant une chirurgie, une anesthésie adaptée sera mise en place ainsi qu’une analgésie post-opératoire. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Après leur arrivée à l’animalerie, une période de repos d’une semaine est observée afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils sont habitués à la contention dès leur arrivée à l’animalerie et à l’appareillage des tests comportementaux pendant 3 jours avant le test. Afin de limiter la souffrance liée au prélèvement de queue et de phalangectomie des animaux issus de croisement génétiques, l’identification de l’animal se fera par tatouage à l’âge d’une semaine et l’évaluation du génotype se fera sur prélèvements de follicules pileux. Une grille de score adaptée au modèle utilisé a été réalisée et fournie en pièce jointe. Des points limites ont été définis pour cette étude et seront mis en place. Ils sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la douleur à son minimum.
Choix des espèces
La souris est habituellement utilisée pour ces travaux portant sur les CIPN. D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, la souris possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 9 semaines est communément choisi pour ce type de projet.
Etude des conséquences du diabète sur la réactivité vasculaire chez la souris 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Gavées et pesées chaque jour pendant six semaines, après une biopsie de la queue, 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Quarante d'entre elles seulement passent l'analyse des vaisseaux sanguins, les autres étant mises à mort faute de porter la mutation recherchée. Le projet porte sur l'atteinte des vaisseaux au cours du diabète, avec l'espoir déclaré d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Le produit administré 42 fois par gavage n'est pas nommé, pas plus que le modèle de diabète et d'obésité auquel le porteur attribue une cardiopathie et une irritation cutanée.
Objectifs
Le diabète est la quatrième cause de décès dans la majorité des pays développés, notamment par suite de maladies cardiaques et d'accident vasculaire cérébral. Dans ces pays, le diabète est aussi la principale cause de cécité, d'amputation des membres inférieurs et d'insuffisance rénale. La dysfonction endothéliale est un marqueur précoce du développement de la pathologie métabolique et du risque cardiovasculaire. Cette dysfonction doit par conséquent être évaluée tôt dans l’histoire naturelle du diabète. Les stimuli à l’origine des lésions des vaisseaux sanguins induites au cours du diabète ne sont pas complètement connus. L'objectif principal est d'identifier si la modulation pharmacologique de certains mécanismes d'atteinte délétère des vaisseaux sanguins permettrait de limiter les lésions des vaisseaux sanguins au cours du diabète. Le projet se déroulera sur 2 établissements utilisateurs, EU1 qui élèvera les animaux et EU2 qui fera les analyses fonctionnelles sur les vaisseaux sanguins.
Bénéfices attendus
A terme ce projet conduira à une meilleure compréhension de la progression de la dysfonction endothéliale dans le diabète et pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des complications vasculaires du diabète.
Procédures
Biopsie à la queue (EU1, 1 fois 10 secondes), préhensions quotidiennes et gavage (EU1 et EU2, 42 fois 1 minute), pesées quotidiennes (EU1 et EU2, 42 fois 30 secondes).
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, inconfort lié au gavage. Effet indésirable lié au modèle de diabète et d'obésité: cardiopathie, irritation cutanée.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort. Les 40 utilisés dans la procédure verront leurs organes prélevés pour analyse. Les animaux qui n'ont pas la mutation d'intérêt seront également mis à mort.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte vasculaire liés au diabète incluant les cultures cellulaires (in vitro). Ici nous étudions les propriétés de vasoconstriction et vasodilatation des artères en réponse à différents signaux moléculaires et mécaniques. Ces propriétés des vaisseaux sont essentielles pour assurer le bon fonctionnement des organes. Elles dépendent des différents types cellulaires qui composent les artères et également des molécules sécrétées par différets organes de l'organisme. La culture cellulaire ne peut pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours du diabète comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. Il n'existe pas de modèle de remplacement in vitro ou in silico à l'heure actuelle pour ces raisons.
Réduction
Le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait sur un logiciel en ligne et donnait 8 animaux par groupe requis. 2 animaux de plus sont prévus par groupe pour pallier aux risques du modèle expérimental et des analyses post-mortem. Le schéma d'accouplement est optimisé pour permettre d'obtenir le meilleur rendemeent possible d'animaux d'intérêt.
Raffinement
Les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris diabétiques urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux diabétique par cage est limité à 2 et les cages sont changées plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle permettant de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère. De plus, le modèle de diabète utilisé au cours de ce projet est établi et validé par la communauté scientifique. Les animaux sont utilisés du sevrage (identification) à l'âge adulte. Les reproducteurs pourront être utilisés jusqu'à 1 an de vie. Les souris d'intérêt sont gavés de 6 à 12 semaines de vie.
Evaluation de l’efficacité d’actifs cicatrisants sur deux modèles murins de cicatrisation
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une plaie est créée par excision ou par brûlure sous anesthésie, puis pansée quatre fois en quatorze jours, avec mesure des dimensions et de la température de la plaie, prélèvement des exsudats et trois prises de sang. L'enjeu déclaré est de montrer que des actifs cicatrisants font mieux que le Bepanthen, une crème déjà vendue en pharmacie. Le porteur écrit que le recours à l'animal est "inévitable" et qualifie l'expérimentation animale de "jalon nécessaire" dans la conception de nouveaux médicaments.
Objectifs
Le but de la cicatrisation des plaies à la suite d’une blessure est de former un tissu régénéré dont la fonctionnalité et l’aspect visuel sont aussi proches que possible de la peau d’origine. La cicatrisation des plaies, en tant que processus biologique normal dans le corps humain, est obtenue par le biais de quatre phases précisément et hautement programmées. Pour qu’une plaie guérisse avec succès, les quatre phases doivent se dérouler dans le bon ordre et dans le bon délai. De nombreux facteurs peuvent interférer avec une ou plusieurs phases de ce processus, provoquant ainsi une altération de la cicatrisation des plaies. Pour remédier à l’altération du processus de cicatrisation, des dispositifs médicaux tels que l’application de crèmes cicatrisantes ou de pansements ont été développés. Ces dispositifs accélèrent la cicatrisation, soulagent la douleur induite par l’inflammation, aident à prévenir les infections et améliorent la régénération tissulaire. L’objectif de notre projet est de montrer l’efficacité accrue de nouveau composés, utilisable sous forme de crème ou en association avec un pansement, sur la cicatrisation cutanée suite à des blessures.
Bénéfices attendus
Au terme de cette étude nous espérons apporter la preuve d’une meilleure efficacité de nos actifs cicatrisants par rapport au contrôle positif (Bepanthen) largement utilisé pour améliorer la cicatrisation.
Procédures
Interventions sur animaux : 1) Génération des plaies : Chirurgie réalisée sous anesthésie générale et locale avec utilisation d’analgésiques. Une chirurgie de 10 minutes pour chaque souris. 2) Administration des dispositifs médicaux : Sous anesthésie générale et locale avec utilisation d’analgésiques. 4 fois car l’expérimentation dure 14 jours (Tous les 3,5 jours). Durée de l’administration des dispositifs médicaux, 10 minutes pour chaque souris. 3) Mesures des dimensions et de la température des plaies (Tous les 3,5 jours, soit 4 fois) : Sous anesthésie et analgésie, en même temps que l’application des dispositifs médicaux. Durée 2 minutes pour chaque souris. 4) Prélèvements des exsudats de plaies (Tous les 3,5 jours, soit 4 fois) : Sous anesthésie et analgésie. Durée 3 minutes pour chaque souris. 5) Prélèvements sanguins (Tous les 7 jours) : 3 fois, durée 2 min, pour chaque souris sous anesthésie générale. Toutes les souris (120) du projet sont concernés par cette procédure.
Impact sur les animaux
Un des effets indésirables de l’application de plaies est la douleur induite par l’inflammation. Ces plaies pourraient aussi induire une déshydratation des animaux. Enfin, les prélèvements sanguins répétés sur les souris (1 fois par semaine) lors de nos expérimentations pourraient engendrer des nuisances telles que l'anémie, l’apparition d’hématomes et une déshydratation des souris.
Devenir
À la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever leurs organes à des fins d'analyses d'immunohistochimie, de biochimie et de biologie moléculaire. Ces analyses approfondies sont essentielles pour élucider les mécanismes thérapeutiques de nos agents cicatrisants.
Remplacement
L’utilisation de l’animal est inévitable pour notre projet car nous cherchons à caractériser l’effet bénéfique d’actifs cicatrisants au niveau systémique. Actuellement, aucun modèle in vitro ne permet de mimer le phénomène étudié dans son ensemble et dans sa complexité.
Réduction
L’utilisation de l’animal est réduite au maximum. Dans cette optique, nous utiliserons des groupes de 10 souris par groupe expérimental afin de rendre nos résultats exploitables. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo.
Raffinement
Les souris seront logées en groupes de quatre dans des cages respectant les normes réglementaires, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Après l’intervention chirurgicale, des mesures seront prises pour éviter un isolement complet, telles que l'utilisation d'adhésifs pour protéger les plaies et maintenir les animaux en groupe. L'anesthésie et l'analgésie seront systématiquement administrées lors de la génération des plaies et tout au long de l'expérimentation. Nous accordons une attention particulière à la gestion de l'inflammation induite par les plaies. En cas de dépassement des critères définis, comme par exemple une perte de poids dépassant 10-15% de leur poids initial, des mesures seront prises pour restaurer leur santé et pour éviter toute souffrance inutile. Pour atténuer l'angoisse des animaux qui seraient isolés en post-opératoire, nous enrichirons leur environnement en leur fournissant davantage de coton, d'igloos et de roues d'exercice, et nous les nourrirons avec une gelée alimentaire enrichie en nutriments. Cette alimentation spécifique sera également distribuée après chaque prise de sang. Un suivi attentif des animaux sera effectué en conformité avec les recommandations du comité de suivi du bien-être animal de notre établissement.
Choix des espèces
L’utilisation d’animaux vivants est un jalon nécessaire dans la conception de nouveaux médicaments, en particulier pour obtenir la preuve de l’efficacité thérapeutique des produits que nous avons développés. Ce projet a pour but de démontrer que des actifs cicatrisants sont efficaces dans deux modèles de cicatrisation (Excision/Brûlure). Les rongeurs, et en particulier les souris, sont fréquemment utilisés pour modéliser les maladies humaines, ainsi des modèles de cicatrisation utilisant des souris ont été développés. Ces modèles induisent une plaie sur la peau de l’animal. Les souris présentent, dans ce cas, bon nombre des signes physiopathologiques caractéristiques des processus de cicatrisation observable chez l’humain (Inflammation, synthèse d’exsudats, ré-épithélialisation des lésions cutanées, etc…). Les animaux seront utilisés à l'âge adulte car nos actifs cicatrisants seront prescrits chez l'adulte et que ce stade de développement est plus stable d'un point de vue physiologique.
Développement et évaluation de l’effet thérapeutique de cellules immunitaires modifiées pour l’immunothérapie dans des modèles de tumeurs solides chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
7 969 souris vont être utilisées, 7 744 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune recevant une greffe de cellules tumorales dans le cerveau ou dans le vitré des deux yeux. Après une chirurgie d'une heure trente sous anesthésie, certaines portent un dispositif intracérébral relié à une pompe implantée dans le dos, et toutes passent deux à trois séances d'imagerie par semaine, avec trois ponctions de liquide céphalorachidien de trente minutes et une prise de sang toutes les deux semaines. La perte de vision provoquée par les tumeurs oculaires est présentée comme sans conséquence, la vue n'étant pas l'organe sensoriel prédominant chez les rongeurs, et les deux yeux sont greffés pour diviser par deux le nombre d'animaux. Les bénéfices annoncés pour les patients atteints de lymphome cérébral primitif ou de glioblastome restent renvoyés à des travaux précliniques que le porteur reconnaît nécessaires, toutes les souris étant tuées pour des analyses post-mortem.
Objectifs
Le système immunitaire est l’ensemble des éléments du corps qui surveillent et détruisent les cellules anormales. Malheureusement les cellules cancéreuses arrivent souvent à passer outre ce système. L’immunothérapie a été développée ces dernières années afin de réactiver le système immunitaire contre les tumeurs et de très bons résultats cliniques ont été rapportés. En utilisant une technique appelée thérapie cellulaire adoptive, nous permettons à certaines cellules du système immunitaire de reconnaitre spécifiquement la tumeur. Elles sont ensuite perfusées chez les patients cancéreux dans le but de reconnaître, de cibler et de détruire les cellules tumorales. L'immunothérapie cellulaire a montré récemment des résultats extrêmement prometteurs en utilisant des cellules modifiées et particulièrement dans le cas des cancers hématologiques (certains lymphomes et leucémies). Cependant, des résultats moins encourageants ont été observés dans certains cancers. Dans ce projet, nous allons génétiquement modifier les cellules immunitaires afin de les rendre plus efficaces et élargir leur utilisation à d’autres cancers. Les expériences proposées vont permettre d’identifier de nouveaux mécanismes anti-tumoraux et de nouvelles méthodes de traitement qui seront directement applicables dans le domaine d’immunothérapie des cancers.
Bénéfices attendus
De façon générale, la thérapie cellulaire adoptive correspond à l’expansion in vitro de cellules qui reconnaissent spécifiquement les tumeurs avant leur réinjection chez les patients. Ce nouveau type de stratégie thérapeutique anti-cancéreuse a montré des résultats prometteurs dans les essais cliniques récents mais des améliorations doivent encore être apportées pour notamment augmenter l'activité et la persistance des cellules immunitaires modifiées en évitant les effets indésirables tels l'épuisement (rendant les cellules insensibles à une activation ultérieure) Dans notre laboratoire, nous avons identifié un gène agissant comme un régulateur clé de la différenciation et formation de la mémoire immunologique de ces cellules. Nous avons observé que des cellules modifiées où ce gène a été génétiquement désactivé, sont beaucoup plus efficaces pour éradiquer des cellules tumorales dans un modèle de leucémie aigüe. Dans ce projet, nous souhaitons étudier les bénéfices de ces modifications, dans des modèles de tumeurs solides. Dans un premier temps, nous travaillerons sur des tumeurs associées à un mauvais pronostic chez les patients : comme le lymphome cérébral primitif (LCP) et le glioblastome. Les cellules modifiées que nous allons développer dans cette étude représentent une option thérapeutique intéressante pour ces patients mais des travaux précliniques restent nécessaires. Le projet permettra de faire des avancées majeures dans le domaine de la thérapie cellulaire adoptive dans le but d’améliorer le pronostic des patients atteints par ces cancers.
Procédures
Dans un premier groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectés dans le cerveau des animaux anesthésiés (durée anesthésie 30min). Ces animaux seront ensuite traités par voie intraveineuse (injection unique sur animal vigile – durée du geste inf à 20sec) Dans un second groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des animaux anesthésiés. Au cours de cette chirurgie, un dispositif intracérébral sera installé (durée de l’anesthésie environ 1h30). Une semaine après l’intervention, les souris vigiles recevront des traitements directement dans le cerveau grâce au dispositif intracérébral (injection unique – durée du geste 5 min) Dans un troisième groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des animaux anesthésiés. Au cours de cette chirurgie, un dispositif intracérébral relié à une pompe sous-cutanée implantée au niveau du dos de l’animal seront installés (durée de l’anesthésie environ 1h30). Ces animaux seront ensuite traités par voie intraveineuse (injection unique sur animal vigile – durée du geste inf à 20sec) Les trois groupes d’animaux seront suivis par imagerie à raison de 2 à 3 imageries/semaine. Les imageries seront réalisées sur animaux anesthésiés et dureront environ 15 min. De plus, nous prélèverons du liquide céphalorachidien sous anesthésie générale (3 prélèvements à au moins deux semaines d’intervalle, durée du geste 30 min) ainsi que du sang sur animal vigile (1prélèvement toutes les deux semaines, durée du geste inférieur à 20sec) Concernant les greffes intraoculaires de cellules tumorales, les cellules seront injectées dans le vitré, sous anesthésie générale et avec antalgie adaptée. La procédure dure entre 10 et 15 minutes par œil. L’évaluation de la croissance tumorale sera réalisée de façon non invasive, soit par examen ophtalmologique (ophtalmoscopie indirecte ou par photographie du fond d’œil, quotidiennement pendant 3 jours après la greffe puis 1 fois par semaine, durée de l’examen 15 min) soit par bioluminescence (2 fois par semaine, durée de l’examen 15 min), sous anesthésie. Le traitement sera délivré 1 fois par voie intraveineuse sur animal vigile (durée du geste inf à 20 sec), ou par injection intravitréenne sur animaux anesthésiés ((durée 15 min). L’évaluation de la réponse au traitement sera réalisée de façon identique à l’évaluation de la croissance des cellules tumorales greffées.
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales au niveau du cerveau vont développer des tumeurs. Les souris peuvent perdre du poids dans les jours qui suivent la chirurgie et/ ou présenter, dans de rares cas, des troubles moteurs (comportement rotatoire et/ou troubles de l’équilibre). Le traitement des souris par voie intraveineuse provoque uniquement la douleur de l’aiguille utilisée pour l’injection. Dans certains cas, des dermatites peuvent se développer 3 semaines après l’injection provoquant une perte de poils à long terme. Le traitement des souris par voie intracérébrale peut provoquer des douleurs ainsi qu’une légère perte de poids durant 2-3 jours. Le prélèvement sanguin provoque la douleur de l’aiguille et dans de rares cas une perte de poids de l’animal. Le prélèvement de liquide céphalo-rachidien peut provoquer des douleurs ainsi qu’une légère perte de poids durant 2 jours. Les animaux greffés au niveau de l’œil développeront une tumeur dont la croissance n’est pas douloureuse mais qui entrainera une baisse de la vision. Cette baisse de la vision n’aura pas de conséquence sur les animaux (sociabilisation, alimentation), ni sur le poids de l’animal, la vue n’étant pas l’organe sensoriel prédominant chez les rongeurs. Dans de rares cas, des réactions inflammatoires ou infectieuses pourront être observées suite à la greffe ou l’administration de traitements
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide de lignées cellulaires en culture. En résumé, on a découvert que certaines modifications comme l’inactivation d’un gène spécifique induit une survie prolongée de certaines cellules immunitaires, appelés les lymphocytes T. L’association de plusieurs modifications génétiques sur ces cellules devrait améliorer l’effet antitumoral des cellules modifiées. D’autre part, un grand nombre d’études ont montré l’effet délétère de certains messagers, appelés cytokines, sur le système immunitaire . Le fait de bloquer certains de ces messagers, en ajoutant des inhibiteurs de cytokines au traitement, devrait améliorer, in vivo, l’effet antitumoral des cellules modifiées. Pour valider cette hypothèse, le modèle animal est nécessaire. En effet, après la validation in vitro des bénéfices de ces traitements par différents types de cellules, il est nécessaire de les évaluer dans un système plus physiologique avant d'envisager une application clinique chez l'homme en thérapie cellulaire. A ce stade, l’utilisation d’animaux est indispensable pour valider les mécanismes de régulation et d’action de ces traitements, ainsi que la toxicité éventuelle de cette thérapie cellulaire.
Réduction
Le nombre de souris par groupe est de 10 afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante, car de notre expérience, il y a toujours une certaine hétérogénéité entre souris. Ce nombre d’animaux tient compte de la nécessité d'utiliser le moins de souris possible et de pouvoir effectuer des statistiques fiables pour valider les effets biologiques observés. Pour finir, le suivi de croissance tumorale et évaluation de la réponse au traitement se fait in vivo, par imagerie de façon longitudinale et répétée, ce qui évite de devoir prévoir des animaux pour différents time points précis. Les deux yeux sont greffés afin de diminuer par deux le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, un délai minimal de 7 jours est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place. Toutes les expérimentations sont réalisées sur tapis chauffant, et le réveil est réalisé sur tapis chauffant ou sous lampe chauffante. Pour les animaux ayant subis une chirurgie cérébrale ou une injection intraoculaire des soins pré et post-opératoires sont appliqués pour prévenir et/ou gérer la douleur. Un supplément alimentaire hydratant est mis à disposition dans les cages jusqu’au rétablissement complet de la souris (récupération du poids, absence de signes extérieurs de souffrance, absence de troubles moteurs). Pour limiter les effets secondaires dus à l’injection des cellules modifiées, comme les dermatites, nous étudierons l’effet de la délétion d’un gène potentiellement responsable de ces effets secondaires. Ces animaux sont surveillés quotidiennement pour évaluer leur état général et deux à trois fois par semaine pour mesurer la taille de la tumeur afin d'appliquer les points limites décrits dans une grille bien définie. Cette grille de score permet d’évaluer, de façon objective et spécifique, l’état global de l’animal (poids, état physique général, comportement moteur). Elle est adaptée à chaque type de procédure. En cas d’atteinte d’un point-limite tel que décrit dans la grille de score, l’animal est mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie anti-cancéreuse car la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt ainsi qu’un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées.
Rôle du tissu adipeux périvasculaire dans la pathologie d’anévrisme aortique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Génétiquement modifiées pour rapprocher leur aorte de la pathologie humaine, 960 souris que le porteur décrit comme des "outils spécifiques" vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une mini-pompe délivrant de l'angiotensine II leur est implantée sous la peau sous anesthésie, en quinze minutes, et 192 d'entre elles passent jusqu'à trois échographies. Associé à un régime riche en cholestérol ou en graisse pendant vingt-huit jours, ce traitement provoque des dissections et des ruptures de l'aorte abdominale qui tuent environ 15 % des souris sous régime gras et 40 % sous régime enrichi en cholestérol, mortalité que le porteur présente comme rapide et non douloureuse. Les survivantes sont systématiquement tuées pour récupérer le tissu adipeux périvasculaire et l'aorte.
Objectifs
Les dissections et anévrismes aortiques sont des pathologies qui touchent les gros vaisseaux. Elles touchent principalement l’aorte thoracique pour les dissections et l’aorte abdominale pour les anévrismes. La rupture de l’aorte est le principal risque lié à ces pathologies avec un taux de mortalité de 80%. La seule solution thérapeutique pour pallier ce risque de rupture est une intervention chirurgicale. Cependant, aujourd’hui, le seul paramètre d’anticipation est la taille de l’anévrisme. Mieux comprendre les mécanismes mis en jeu va permettre de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques et des facteurs prédictifs. L’anévrisme de l’aorte abdominale est une forme particulière de pathologie aortique hypertensive comme l’athérosclérose avec des caractéristiques similaires. Il est connu que le tissu adipeux périvasculaire influe sur le vaisseau qu’il entoure. En utilisant un modèle murin d’anévrisme aortique abdominal, nous avons montré qu’un régime riche en cholestérol, comparé à un régime riche en graisse, aggravait l’incidence de l’anévrisme aortique en augmentant le nombre de dissections et de ruptures de l’aorte abdominale. Au niveau du tissu adipeux, nos premiers résultats montrent une modulation de sa composition. Nous pensons donc que le tissu adipeux joue un rôle important sur la physiopathologie de l’anévrisme aortique que nous souhaitons approfondir. A partir du même modèle murin d’anévrisme de l’aorte abdominale déjà utilisé, nous allons étudier l’implication du tissu adipeux périvasculaire dans cette pathologie afin de mieux comprendre les mécanismes par lesquels il impacte l’aorte et afin de trouver des biomarqueurs.
Bénéfices attendus
Nos résultats préliminaires laissent penser que le tissu adipeux périvasculaire agit sur l’artère qu’il entoure en exacerbant, lors d’une hypertension associée à un excès de cholestérol, la réponse immunitaire et diminuerait son effet protecteur vis-à-vis du vaisseau. Notre expérimentation vise à approfondir ces données pour identifier précisément les acteurs de ces modifications délétères, acteurs qui peuvent être des cibles thérapeutiques puisqu’à ce jour, aucun traitement curatif n’existe.
Procédures
- Pose d’une mini-pompe d’angiotensine II en sous-cutanée : ce geste est réalisé une fois par animal, sous anesthésie générale couplée à une analgésie. La durée d’intervention est d’environ 15 minutes. 960 animaux concernés. - Echographie : Ce geste est réalisé sous anesthésie générale. Il n’entraîne aucune douleur. 192 animaux sont concernés et au maximum 3 fois par animal (hebdomadaire).
Impact sur les animaux
La pose des pompes osmotiques en sous-cutanée entraîne une légère douleur et du stress en post-opératoire. Les régimes riches en lipide n’entraînent pas d’effets indésirables autre que la prise de poids et ne dure que 28 jours maximum. Cependant, même si elle ne provoque pas de douleur, l’association des régimes HFD ou HCD au traitement à l’angiotensine II entraîne une mortalité (environ 15% pour HFD et 40% pour HCD) due à une augmentation de l’apparition de dissections aortiques et de ruptures de l’anévrisme aortique induit. Dans ce cas, la mort est très rapide et non douloureuse mais doit être limitée au mieux. C’est pourquoi nous prévoyons de suivre les animaux par échographie afin d’anticiper l’accident vasculaire.
Devenir
Les animaux sont systématiquement mis à mort afin de récupérer les tissus d’intérêts pour analyse.
Remplacement
Aucune alternative à l’utilisation d’animaux vivants ne permet d’étudier les mécanismes d’interaction entre 2 tissus (tissu adipeux et Aorte) dans un contexte physiologique et encore moins pathologique. Le modèle prévu est un modèle standard bien documenté dont l’impact sur l’animal est bien maîtrisé.
Réduction
Le nombre d’animaux pour les expériences envisagées a été précisément défini à l’aide d’un logiciel pour s’assurer de la validation statistique. Des tests statistiques sont utilisés pour analyser les résultats. Par ailleurs, nous avons choisi de réaliser une étude globale de l’expression des gènes qui permet d’observer plus de gènes avec moins d’échantillons et donc moins d’animaux.
Raffinement
La pose des pompes osmotiques est un acte chirurgical réalisé sous anesthésie générale et analgésie. La réponse nociceptive des animaux sera régulièrement testée en cours d’intervention. Les éventuelles modifications du rythme cardiaque et respiratoire seront observées pour ajuster au mieux l’anesthésie pendant l’intervention chirurgicale. Durant les 28 jours de cinétique, les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter une éventuelle réaction cutanée ou une douleur même si elle n’est pas attendue. La douleur de l’animal sera évaluée 2 à 3 fois par semaine selon une grille d’évaluation de la douleur et lorsqu'un point limite sera atteint, l'animal sera euthanasié. Une échographie hebdomadaire sera réalisée afin de suivre les anévrismes et dissections aortiques.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées représentent des outils spécifiques dans la plupart des domaines de la recherche médicale. La souris est un excellent modèle pour la maladie humaine, l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme et peuvent être modifiés pour se rapprocher au mieux de la pathologie recherchée. L’ensemble des souris utilisées seront des souris adultes âgées entre 3 et 6 mois, âge qui permet de standardiser le poids de l’animal et la taille des vaisseaux.
Mécanismes l’infection et de la transmission de Plasmodium
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 125
Quinze à trente minutes de piqûres de moustiques sur un animal profondément anesthésié, une ponction cardiaque, ou une perfusion du foie qui tue: 5 025 souris et 125 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 150 d'entre eux anesthésiés et tués avant tout réveil. Infectés par une injection unique, ils subissent ensuite une ponction quotidienne de la queue pendant sept jours au maximum, jusqu'à ce que la parasitémie voulue soit atteinte. L'objet est d'amplifier un parasite du paludisme murin pour étudier ses formes dormantes dans le foie, le porteur écrivant que la souris et le rat servent de "simples flacons de culture cellulaire" à une étape du cycle parasitaire, et reconnaissant que le projet "ne comporte pas de considérations statistiques". Les rats sont retenus pour le volume de sang qu'ils fournissent, et les animaux sont inoculés à trois ou quatre semaines parce qu'ils ne sont pas encore immunocompétents, ce qui favorise l'infection.
Objectifs
Le principal objectif de ce projet est de comprend la biologie du parasite Plasmodium et de ses interactions avec l'hôte, en particulier dans le foie. Le foie est le premier organe humain ciblé par les parasites du Paludisme dès leur entrée dans le corps par la piqûre de moustiques Anopheles infectés, où une première phase d'amplification massive aura lieu avant que les parasites matures ne soient libérés dans le sang pour causer la maladie. Le foie est également le réservoir des formes dormantes du parasite, qui provoquent des rechutes et maladie chronique. Malgré son importance reconnue pour les stratégies d'éradication, le développement de médicaments antipaludiques ciblant les formes hépatiques du parasite est entravé en raison de l'accès limité aux échantillons de parasites et aux moustiques infectés avec des souches humaines. Le modèle murin de paludisme surmonte ces limitations et permet de recréer l'ensemble du cycle de vie du parasite dans un environnement in vivo. Le projet concerne spécifiquement l'utilisation d'animaux de laboratoire.
Bénéfices attendus
En utilisant les parasites produits dans ce projet, nous espérons : 1) identifier les mécanismes moléculaires codés par les parasites impliqués dans l'induction et le maintien de la dormance, de l'activation et de la conversion sexuelle dans le foie, et 2) établir les relations bidirectionnelles entre le métabolisme de l'hôte et les développements cellulaires distincts du parasite et leur impact sur les résultats des traitements. Ce projet révélera les mécanismes moléculaires sous-jacents à la dormance, aux rechutes et à la transmission des parasites du paludisme, et posera les bases du développement futur de biomarqueurs et nouvelles thérapies ciblant les réservoirs d'infection hépatique.
Procédures
Les animaux vigiles sont infectés par une injection unique. Une goutte de sang est prélevée à l'extrémité de la queue par ponction avec une aiguille à usage unique. Ce prélèvement est effectué quotidiennement, sur animal vigile, généralement à partir du troisième jour après l’injection et pour une durée maximale de 7 jours et nécessite moins d’une minute pour être réalisé. Lorsque la parasitémie désirée est atteinte, les animaux pour des prélèvements sanguins (par les moustiques pendant 15 à 30 minutes ou par ponction cardiaque). Les animaux non infectés utilisés pour la perfusion de foie sont profondément anesthésiés avant de procéder à la perfusion qui est létale.
Impact sur les animaux
Au cours de nos expériences, les animaux pourront subir quelques effets indésirables suite à des injections ou à des prélèvements sanguins. Ces effets indésirables sont de sévérité légère de courte durée. Le rongeur vigile ne souffrira que de l'inconfort causé par des injections (intrapéritonéale, sous-cutané et intraveineuse), ainsi que par le prélèvement d'échantillons de sang à la queue. Ces effets seront limités par l’utilisation d’aiguilles à la taille adaptée et à usage unique pour chaque animal. De plus, des analgésiques et un anesthésique local seront utilisés pour réduire les effets indésirables liés à l’injections. Les animaux infectés par le parasite seront mis à mort par des méthodes validées par le CEEA avant que l'infection palustre ne devienne symptomatique. Un prélèvement de sang sans réveil par piqûre des moustiques ou par ponction cardiaque sera réalisé dans l’animal profondément anesthésié. La perfusion hépatique sera réalisée uniquement sur des animaux profondément anesthésiés et constitue une classe sans réveil.
Devenir
Les animaux injectés avec le parasite ne peuvent pas être réutilisés. Les animaux utilisés pour le repas sanguin des moustiques sont anesthésiés puis mises à mort par dislocation cervicale avant leur réveil. Les animaux non infectés utilisés pour fournir des hépatocytes sous mis sous analgésie et profondément anesthésiés avant d’être perfusés ce qui est un acte létal.
Remplacement
Le modèle animal ne sera utilisé qu'à trois fins : 1) démontrer la transmission précoce des formes parasitaires sexuelles issues du foie, 2) générer des lignées de parasites transgéniques exprimant les régulateurs de la dormance ou de l'activation, et 3) produire des cellules hépatiques sauvages et transgéniques exprimant des biosenseurs métaboliques. Dans le cas où une nouvelle méthodologie est établie et devient disponible pour produire des lignées de parasites transgéniques dans le parasite du paludisme humain causant des rechutes (Plasmodium vivax), le modèle animal sera remplacé par des modèles de foie humain in vitro infectés par les lignées de parasites transgéniques humaines.
Réduction
Les animaux seront utilisés uniquement dans les situations où les expériences sur les animaux sont inévitables. Les protocoles de ce projet sont optimisés pour minimiser l'utilisation d'animaux et réduire au maximum la souffrance pendant les procédures expérimentales. Nous sommes conscients de l'impératif de réduire le nombre d'animaux utilisés dans la recherche scientifique et la majeure partie de nos activités de recherche est réalisée in vitro. Cependant, certaines étapes nécessitent encore l'utilisation d'animaux, car il n’existe pas actuellement de système qui permette de reproduire le cycle de vie complet de Plasmodium berghei in vitro. Ce projet ne comporte pas de considérations statistiques, car l'utilisation des animaux se justifie principalement par la nécessité d'amplifier les populations de parasites Plasmodium chez les rongeurs. En termes simples, la souris ou le rat sont utilisés comme de simples "flacons de culture cellulaire" pour accomplir une étape très spécifique du cycle de vie du parasite – la réinfection des globules rouges – qui ne peut être réalisée ni in vitro ni ex vivo. Mis à part cette étape, toutes les autres phases du cycle de vie du parasite seront effectuées in vitro, en accord avec le principe de réduction. Des procédures similaires sont approuvées pour d'autres équipes de recherche à l'Institut Pasteur ainsi que dans des laboratoires à travers le monde. Nous adopterons des protocoles expérimentaux issus de publications largement citées et nous travaillerons à les améliorer en réduisant le nombre d'animaux nécessaires grâce à l'utilisation de nouvelles technologies plus efficaces pour éditer le génome du parasite.
Raffinement
La conception des protocoles prendra toutes les mesures appropriées pour éviter ou soulager la souffrance, la douleur, la détresse et l'inconfort. Nos points limites sont établis de manière à éviter la phase symptomatique du paludisme chez les animaux infectés, ainsi les animaux sont mis à mort avant l'apparition des symptômes et des complications physiologiques potentiellement mortelles. De plus, nous surveillons le comportement des animaux tous les jours en utilisant une échelle de détresse pour détecter d'éventuels problèmes de santé non prévus afin d'améliorer rapidement leur bien-être. Si nécessaire, du dietgel ou un enrichissement supplémentaire seront fournis. Enfin, les interventions potentiellement douloureuses sont réalisées sous anesthésie générale profonde et analgésie, et les animaux sont mis à mort avant leur réveil. Une grille d’évaluation de la douleur, du stress et de l’inconfort sera utilisée. Le poids sera enregistré une fois avant de démarrer l'expérience et ensuite tous les jours dès qu'un score dans l'Apparence ou le poids corporel est >0. Prises de décision : dès qu'un score est à 2, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Les hôtes naturels des parasites P. berghei sont des espèces de rongeurs sauvages telles que Grammomys et Thamnomys, originaires d'Afrique centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et aux rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est largement reconnu dans la communauté scientifique que l'infection des rongeurs par ces parasites constitue un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l'homme. Ainsi, la valeur d'une recherche rigoureuse sur les rongeurs pour éclairer ou orienter la recherche chez l'homme est désormais solidement établie. L’utilisation de rats, tout aussi susceptibles à l’infection que les souris, a essentiellement pour but d’obtenir un volume sanguin important tout en limitant le nombre d’animaux nécessaires pour préparer de grandes quantités d’érythrocytes infectés. Les animaux sont acclimatés pendant une période de 7 jours. Les inoculations de parasites seront effectuées sur des souris et des rats jeunes adultes âgés de 3 à 4 semaines, car ils ne sont pas encore immunocompétents, ce qui favorise l'infection par le parasite.
La sécrétion d’un transgène par le muscle pour traiter l’ensemble de l’organisme
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
366 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit une injection intraveineuse ou intramusculaire, puis cinq prélèvements sanguins sous anesthésie à deux, sept, quatorze, vingt-et-un et vingt-huit jours, avant d'être tuée au bout d'un mois pour prélèvement du foie, du cœur, des muscles et du cerveau. L'objet réel est de comparer des peptides de sécrétion pour qu'un médicament développé au laboratoire diffuse mieux depuis le muscle, l'un des transgènes testés étant déjà engagé dans ce développement. Le porteur affirme qu'un "organisme entier" est nécessaire pour suivre la sécrétion du muscle vers le sang puis l'absorption par les autres tissus, et revendique le "besoin" de mesurer la réponse immunitaire contre le médicament.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de faire sécréter une protéine d’intérêt par le muscle via une approche de thérapie génique. La thérapie génique consiste à introduire du matériel génétique dans un tissu ciblé afin de restaurer une protéine manquante ou non fonctionnelle. Le traitement des maladies musculaires est souvent complexe, car il nécessite des doses élevées de médicaments pour cibler efficacement l’ensemble des muscles, ce qui conduit généralement à une réponse immunitaire élevée ou à des complications cardiaques ou hépatiques. Pour améliorer l’efficacité de la thérapie génique ciblant les muscles, nous souhaitons développer un médicament qui sera exprimé et produit dans un tissu, puis fortement sécrété vers la circulation sanguine pour être réabsorbé par des tissus plus difficiles à atteindre. Cette approche permettra d’améliorer l’efficacité du médicament tout en réduisant les doses injectées. Pour augmenter la robustesse des résultats générés, nous évaluerons les peptides de sécrétion couplés à deux transgènes sécrétés utilisés dans notre laboratoire, dont un médicament est actuellement en cours de développement.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de sélectionner un ou plusieurs peptides de sécrétion efficaces dans le muscle cardiaque ou squelettique afin d’augmenter la sécrétion de notre médicament par le muscle et, par conséquent, d’accroître sa disponibilité pour l’ensemble de l’organisme. Une protéine-médicament plus disponible permettra d’augmenter l’efficacité de notre traitement et de réduire les doses nécessaires ainsi que les effets indésirables potentiels. Dans un cadre plus large, ces peptides de sécrétion seront utilisés pour développer un traitement pour des pathologies étudiées dans notre laboratoire.
Procédures
Pour les deux procédures, chaque animal sera soumis à une injection (intraveineuse ou intramusculaire, en moins de 30 secondes). Chaque animal subira 5 prélèvements sanguins (J2, J7, J14, J21, J28 après l'injection) après anesthésie (en moins de 30 secondes). Chaque animal sera euthanasié après anesthésie, à la fin de l'étude (1 mois).
Impact sur les animaux
Les souris subiront une injection, ce qui induira un stress (contention ou anesthésie) et une douleur due à la piqûre liée à l’injection. Les souris subiront également des prélèvements sanguins répétés (J2, J7, J14, J21 et J28), ce qui induira un stress lié à la contention et une douleur due à la piqûre ; un minimun de sang sera prélevé. Les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude (1 mois), et elles subiront un stress lié à la contention et à l’anesthésie.
Devenir
Après chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin que nous puissions prélever différents tissus (foie, cœur, muscles, cerveau, etc.) pour mesurer la présence du médicament en fonction de la sécrétion.
Remplacement
Le nombre de peptides de sécrétions musculaires a été préalablement été réduit grâce à des tests in vitro, permettant d’éliminer les candidats non fonctionnels. Néanmoins, le modèle animal ne peut être remplacé, car le muscle est un tissu complexe, difficile à reproduire en laboratoire. De plus, nous avons besoin d'un organisme entier pour étudier certains paramètres, tels que la sécrétion du muscle dans la circulation sanguine, puis l’absorption du médicament dans les tissus périphériques. Il est également nécessaire de suivre la réponse immunitaire contre le médicament, ce qui n’est pas possible in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera le minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. Les souris témoins seront mutualisées pour les différentes études.
Raffinement
Les deux procédures seront réalisées uniquement sur des mâles afin de limiter la variabilité des résultats et d’obtenir des données plus robustes. Une période d'acclimatation d’environ une semaine avant de débuter l'étude sera mise en place pour permettre aux souris de s'adapter à leur nouvel environnement. Les prélèvements sanguins seront effectués au niveau de la veine faciale sur des souris préalablement anesthésiées, afin de réduire leur stress. Le nombre de mâles par cage sera limité à 5 souris pour éviter les bagarres et les éventuelles blessures. Si des bagarres sont tout de même observées, les mâles agressifs seront séparés. Raffinements prévus pour l'hébergement : Afin de garantir le bien-être des animaux utilisés dans ce projet, plusieurs mesures seront mises en place pour optimiser leurs conditions d'hébergement. Les souris seront logées dans des cages équipées de litière et de matériel d'enrichissement (roues, tunnels, abris) pour encourager les comportements naturels et réduire le stress. Un accès libre à la nourriture et à l'eau sera assuré en permanence. L'environnement sera contrôlé en termes de température, avec un cycle lumière/obscurité respectant les besoins physiologiques des animaux (12h/12h). De plus, une surveillance régulière permettra de s'assurer du bon état de santé et du confort des animaux tout au long de l'étude.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle murin pour étudier l’efficacité de nos peptides de sécrétion car c’est un modèle facile d’accès et pour lequel nous avons déjà démontré la capacité de sécrétion de notre médicament en utilisant une approche par le foie. En utilisant le même modèle, nous pourrons comparer l’efficacité de la sécrétion par le muscle versus le foie en utilisant nos données internes. Les animaux seront injectés à l’âge de jeune adulte (environ 6 semaines).
Etude du rôle d’une hormone sur la gestion du fer lors de la gestation chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Évaluer une hormone comme "possible médicament" dans les pathologies de grossesse, tout en entretenant une colonie de souris génétiquement modifiées: 2 490 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont tatouées, subissent un prélèvement de queue pour le génotypage, trois prises de sang submandibulaires sur animal vigile et de neuf à treize injections intrapéritonéales chacune. Le régime enrichi en fer, peu apprécié des souris, peut provoquer un trouble de l'alimentation et une perte de poids, et l'isolement des mâles reproducteurs est reconnu comme un facteur de stress. Les souris soumises à une expérimentation sont tuées à l'issue de chaque procédure, sans que le texte suive le sort de celles que mobilise l'entretien de la colonie, et le porteur justifie l'espèce par le nombre d'organes qu'implique l'étude de la gestation, du duodénum au placenta.
Objectifs
Nous étudions le rôle d'une hormone dans un contexte de gestation. Si cette hormone est bien connue dans de nombreuses fonctions de notre organisme, son rôle lors d'une grossesse est encore mal connue. Ce projet a pour but de préciser son rôle au niveau du développement de l'embryon et du placenta ainsi que d'évaluer son rôle comme un possible médicament dans diverses pathologies de grossesse.
Bénéfices attendus
L’étude permettra de comprendre le rôle d'une hormone dans la gestation, et d’évaluer l’intérêt thérapeutique de cette molécule dans un contexte de gestation chez des femmes dont le taux de fer est perturbé.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tatouages pour identification et subiront un prélèvement de queue pour être génotypés. Sur animaux vigiles il sera effectué trois prélèvements sanguins, temps estimé par souris : 1 minute (contention et prélèvement) Injection : temps estimé : 15s par souris (contention et injection) avec entre 9 et 13 injections intra-péritonéale par souris.
Impact sur les animaux
Il peut exister un stress lors de la contention de la souris ou de l’injection du produit. Le prélèvement sanguin réalisé en état d’éveil au niveau submandibulaire est aussi inducteur d’un stress et de douleur légère pour la souris. La modification du régime alimentaire de la souris altère l'état général de la souris. Notamment le régime riche en fer qui est peu apprécié des souris et peut engendrer, au début du régime, un trouble de l’alimentation associé à une perte de poids. Enfin l’isolement des mâles reproducteurs sera également facteur de stress pour ces derniers.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux soumis à une expérimentation seront mis à mort à la fin de cette dernière
Remplacement
L’altération de la gestion du fer par la modification du taux de l'hormone d'intérêt a déjà été étudiée sur des modèles cellulaires in vitro. Nous continuerons en parallèle des expériences sur modèle murin, nos études in vitro, notamment pour préciser le mécanisme d’action sur des modèles cellulaires de placenta. Le principe actif testé a été choisi parmi un panel de molécules testé in vitro.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la robustesse de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée.
Raffinement
Les souris vivront en groupes sociaux. Elles seront élevées dans le respect des règles du bien-être animal en limitant au maximum leur douleur et leur stress. Nous effectuerons toutes nos manipulations de l’animal en s’efforçant de maximiser notre efficacité et réduire le risque d’induire stress et douleur à l’animal. Des scores ont été établis pour surveiller au mieux les animaux et entraîner la fin de l’expérimentation plus précoce si nécessaire.
Choix des espèces
Nous utilisons un modèle de souris car l’étude de la gestation implique de nombreux organes clefs (duodénum, foie, placenta…). Ce modèle murin nous permettra de modéliser une gestation en situation de déficience dans notre hormone d'intérêt dans tous les organes de l’organisme. Les souris seront utilisées autour de 3 mois au stade adulte, une fois arrivée à maturité sexuelle.
Effet de drogues sénolytiques sur un nouveau modèle de glioblastome murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
812 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyser la tumeur de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de 30 à 40 minutes pour recevoir dans le cerveau un lentivirus qui déclenche un glioblastome, puis des injections cinq jours de suite, deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie, jusqu'à cinq cycles de traitement et des anticorps bloquants toutes les deux semaines. Le projet doit tester sur ces tumeurs des drogues dites sénolytiques, qui visent à éliminer les cellules sénescentes, et la mise à mort intervient notamment à une variation de poids de 10 à 15 % en 48 heures ou quand la tumeur gêne la mobilité. Le porteur annonce 18 souris par type d'expérience, un nombre "qui peut paraître élevé" et qu'il dit "nécessaire" à des résultats reproductibles.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer l'effet de drogues dites sénolytiques (drogues qui éliminent les cellules sénescentes) seules ou en combinaison avec d'autres traitements, dans un nouveau modèle immunocompétent de tumeur cérébrale de type glial appelée glioblastome. Le modèle de glioblastome de type mésenchymateux proposé dans le projet récapitule au mieux les altérations moléculaires identifées chez les patients en utilisant une nouvelle technologie d'invalidation de l'expression de gènes.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est la tumeur cérébrale adulte primaire la plus fréquente et agressive dont les patients ne survivent pas plus de 15 mois en moyenne à ce jour. Ce projet devrait générer un modèle préclinique immunocompétent de glioblastome de type mesenchymateux qui récapitule au plus près les altérations moléculaires des glioblastomes de patients. En effet, afin de traduire de façon efficace nos résultats de recherches fondamentales à la clinique il est indispensable de se rapprocher au plus près de la pathologie humaine. Nos résultats devraient permettre de proposer des nouvelles aprroches thérapeutiques pour la prise en charge des patients avec un glioblastome.
Procédures
La procédure expérimentale sera réalisée sur des souris adultes agées de 6-8 semaines et comprend 6 actes techniques incluant une injection intra-crâniale de lentivirus nécessitant un acte chirurgical, une série d'injections, un suivi de la croissance tumorale par utilisation d’imagerie par bioluminescence, des traitements, des prélèvements sanguins puis finalement une euthanasie. La chirurgie prendra environ 30-40min sur animal anesthésié et analgésié en pré et post-opératoire. Les injections d'une durée de 10-20 secondes, seront réalisées 1 fois par jour pendant 5 jours consécutifs sur animal vigil. La quantification de bioluminescence sera réalisée deux fois par semaine, toutes les semaines sur animal anesthésié. Cette mesure est indolore et dure selon l'intensité de la bioluminescence entre 1 et 4 min. Les traitements d'une durée de 10-20 secondes, seront administrés sur souris vigiles pendant 5 jours consécutifs et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines. Les animaux recevront au maximum 5 cycles de traitement. L'administration d'anticorps bloquants se fera en 4 injections espacées de deux jours et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines sur souris vigile. Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigil (durée de quelques secondes, 4 fois par animal).
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables sont attendus lors de cette procédure. L'acte chirurgicale est invasive, il s'agit d'une injection de lentivirus dans le cerveau effectué sous anesthésie/analgésie mais qui entraîne des nuisances (risques anesthésiques, douleur post-opératoire, risque infectieux). Concernant la charge tumorale, les nuisances sont une variation du poids corporel notamment une perte de masse musculaire, le développement d'une masse tumorale gênant la mobilité ou les fonctions normales de l'animal, une dégradation de l'état général de l'animal (signes cliniques généraux parmi lesquels posture et état de vigilance, prostration ou décubitus, déshydratation, lésions cutanées). Lors des injections des traitements, une inflammation locale déterminée par palpation délicate de la zone d’injection peut avoir lieu. Nos mesures de croissances tumorale par imagerie de bioluminescence, sont sujet à de risques anesthésiques. De la douleur légère de courte durée peut être ressentie lors des prélèvements sanguins. Dans de très rares cas un hématome ou une perte de sang hémorragique peut être observée. De la douleur légère de courte durée peut être ressentie lors des injections.
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées en fin de procédure. En effet, l'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever le cerveau des souris et d'analyser la tumeur cérébrale induite pendant la procédure, au niveau moléculaire et histologique.
Remplacement
En parallèle de ce projet in vivo, nous caractériserons des prélèvements chirurgicaux de glioblastomes de patient collectés avant et après traitement. Ce matériel est rare car la survie des patients après diagnostic est inférieure à 15 mois. Cette étude fondamentale demeurera néanmoins descriptive ; pour avancer dans le développement de nouveaux traitements nous devons réaliser des études fonctionnelles dans un modèle animal. Dans un souci de remplacement et réduction, nous projetons de générer des organoides à partir de glioblastomes de patient afin de tester de nouveaux traitements in vitro. Cependant, l'environnement tumoral, et notamment le système immunitaire, est essentiel à la réponse aux traitements et à ce jour, il n'existe pas encore de modèle d'organoides conservant le microenvironnement global (notamment, la microglie, les monocytes et les cellules T infiltrants, les cellules endothéliales et les péricytes). Un projet collaboratif visant à générer des organoides de glioblastomes incluant de la microglie et des monocytes infiltrants est en cours. Selon les résultats obtenus sur ce projet, nous pourrons remplacer une partie de nos expériences in vivo par des expériences réalisées sur ces organoides.
Réduction
Nous veillerons à utiliser le moins d’animaux possible pour l’ensemble de nos expériences, leur nombre est de 812 pour cette prodédure. Nous utiliserons pour chaque type d’expérience 18 animaux. Ce nombre, qui peut paraître élevé, est nécessaire pour l’obtention de résultats reproductibles et statistiquement significatifs car les gliomes sont par nature très hétérogènes. Afin d'éviter l'euthanasie séquentielle d’animaux au cours du temps pour évaluer l’apparition de la tumeur, son volume et sa croissance, nous utiliserons la méthode de suivi in vivo par bioluminescence grâce à l'expression de la luciférase dans les cellules tumorales. A chaque euthanasie des animaux afin d'éviter tout double emploi des animaux, nous collecterons divers tissus sur un même animal (cerveau, ganglions, rate, sang). De plus, la tumeur fluorescence sera localisée dans le cerveau disséqué à la loupe binoculaire. Immédiatement après son prélèvement, la tumeur sera séparée en deux parties, une pour les analyses histologiques et immunologiques et une autre pour les analyses moléculaires et biochimiques.
Raffinement
Afin de réduire le stress post-opératoire, les animaux, des femelles, seront logées par groupes déterminés pendant une période d'acclimatation de 7 jours minimum avant la procédure chirurgicale. L'enrichissement initial de la cage est composé bandes de papier kraft pliées en accordéon. Les animaux seront analgésiés et anesthésiés avant et pendant toute la procédure chirurgicale. Pendant la chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de prévenir l'hypothermie et nous appliquerons un gel ophtalmique sur les yeux pour éviter leur déshydratation. Post-chirurgie, les animaux seront placés dans une salle de réveil chauffée, la qualité du réveil sera observée pour détecter toute anomalie potentielle de la procédure anesthésique. Pendant 48 heures post-chirurgie, nous administrerons un analgésique. Les animaux seront surveillés quotidiennement et euthanasiés dès que les points limites seront atteints. Ceux-ci comprennent une variation relative du poids corporel comprise entre 10 et 15 pourcents en 48h, une masse tumorale gênant la mobilité ou les fonctions normales de l’animal et une dégradation de l’état général de l’animal comprenant des signes cliniques généraux parmi lesquels posture et état de vigilance, prostration ou décubitus, déshydratation, lésions cutanées. Nous avons établi dans l’équipe une grille de suivi post-opératoire pour les animaux pouvant développer des tumeurs cérébrales. Cette grille est consultée et une fiche de suivie est remplie à chaque examen. Nous analyserons la croissance tumorale par bioluminescence et le poids des animaux deux fois par semaine. En fin de processus d’expérimentation, si une souris est isolée nous regrouperons cet animal avec des animaux sujets au même traitement et lorsque cela ne sera pas possible nous apporterons de l’enrichissement supplémentaire dans la cage sous forme de maisonnette. Lors des prélèvements sanguins, il est possible que le saignement ne se stoppe pas rapidement. Une compression plus longue avec un papier essuie tout propre sera directement effectuée sur le point de prélèvement afin de stopper l'écoulement de sang. En cas d'apparition de prostration et de difficulté à récupérer (anomalie cardiorespiratoire), l'animal sera pris en main pour effectuer des frictions afin de le stimuler. De la nourriture hydratée sera déposé à côté de lui dans la cage. Si cet état perdure plus que quelques minutes, alors l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Les nombreux outils génétiques développés et caractérisés chez la souris font de cette espèce un modèle de choix pour l’étude in vivo des tumeurs. De plus, les modèles les plus représentatifs de la biologie et de la génétique des tumeurs humaines sont établis chez la souris. Nous utiliserons des souris adultes de 6-8 semaines pour induire de novo des glioblastomes. En effet ce type de tumeur est diagnostiqué chez des sujets adultes d'âge médian de 59 ans, cette tumeur se développe donc à l'âge adulte. Notre projet, qui vise à évaluer l'effet de drogues sénolytiques dans un nouveau modèle immunocompétent de glioblastome, utilisera uniquement des souris femelles. En effet, les modèles de glioblastomes murins se développent de façon similaire chez les mâles et les femelles. De façon plus importante dans une étude récente, nous avons montré que l’enrichissement de la signature murine de sénescence chez les patients avec un glioblastome est un facteur de mauvais pronostique quel que soit le sexe. Ces résultats montrent donc que l’étude de la sénescence dans le contexte des glioblastomes peut être réalisée sur un seul sexe. Nous avons choisi pour ce projet de travailler sur des femelles.
Caractérisation d’un modèle murin de trouble bipolaire par injection chronique de roténone à faible dose
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une souris placée sous surveillance dont l'état ne s'améliore pas en 48 heures est mise à mort. 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour récupérer leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, modéré ou sévère, pour reproduire chez elles des comportements proches des phases du trouble bipolaire. Elles reçoivent une injection sous la peau chaque jour pendant huit semaines, de roténone pour les souris traitées, un inhibiteur de la chaîne mitochondriale, et passent trois fois chaque test comportemental, à quatre semaines d'intervalle, sans que le porteur nomme ces tests. Il décrit une "légère douleur" au point d'injection, un "stress modéré" lié aux manipulations, à la contention et parfois à l'isolement, et des effets de la roténone sur l'anxiété, alors que le projet déclare aussi un niveau de souffrance sévère.
Objectifs
Le trouble bipolaire est une cause d’invalidité majeure dans le monde avec plus de 45 millions de personnes atteintes. Il est caractérisé par une alternance entre des phases dépressives similaires à la dépression majeure et des phases maniaques présentant une élévation anormale de l’humeur ainsi que des altérations cognitives allant de la distractibilité à des comportements à risque. L’espérance de vie des patients est réduite en moyenne de 10 ans à cause du risque élevé de mort par suicide (1 patient sur 10) et de comorbidités (par exemple les troubles de l’addiction et de l’anxiété, mais aussi des troubles somatiques telles que les maladies cardiovasculaires). Cependant, les mécanismes neurobiologiques ainsi que les éléments précipitant les différentes phases restent largement méconnus, à tel point qu’il n’existe pour l’instant pas de modèle expérimental récapitulant les principaux aspects de la maladie. L’objectif de ce projet est à d’établir des méthodes d’étude des phases maniaques et dépressives du trouble bipolaire au niveau comportemental, puis de se focaliser sur les transitions entre phase, un aspect méconnu de la maladie qui pourrait amener à une meilleure compréhension de sa biologie et à de nouvelles pistes thérapeutiques. Pour cela, nous avons besoin d’un modèle de la maladie récapitulant les deux phases à l’échelle individuelle. Notre laboratoire dispose déjà de l’expertise nécessaire pour étudier les phénotypes anxiodépressifs, et nous sommes en train de mettre au point des tests pour évaluer les phénotypes maniaques inhérents au trouble bipolaire. Nous proposons donc ici d’établir et de caractériser un modèle récent de trouble bipolaire basé sur une des hypothèses majeures du domaine, à savoir l’hypothèse mitochondriale. Celle-ci se base sur un ensemble de données suggérant qu’une dysfonction mitochondriale légère serait au centre de cette pathologie. La première phase de caractérisation est de reproduire et d’étendre les résultats comportementaux suite à un traitement chronique de roténone, un inhibiteur de la chaîne mitochondriale.
Bénéfices attendus
Les études précliniques sont peu nombreuses sur le trouble bipolaire et sont critiques pour mieux comprendre sa neurobiologie et de nouvelles thérapies. Cette étude permettra d’évaluer la reproductibilité d’un modèle murin prometteur de la pathologie, et de développer de nouvelles pistes de compréhension de la maladie avec un suivi longitudinal et individuel des animaux.
Procédures
Une injection sous-cutanée est réalisée quotidiennement pendant 8 semaines. Les tests comportementaux ont pour objectif d'évaluer les comportements se rapprochant de la phase maniaque ou dépressive du trouble bipolaire. Chaque test comportemental a lieu 3 fois (une fois pendant la phase sans symptômes, une fois en phase maniaque et une fois en phase dépressive) à 4 semaines d'intervalle. Ils ne durent que 5 à 10 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les injections sous-cutanée (7 fois par semaine sur 8 semaines), sont espacées de 24h. Les doses de roténone sont modérées par rapport à celles utilisées dans la littérature. Elles peuvent provoquer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux sont couramment utilisés et peuvent provoquer un stress modéré en lien avec la manipulation, les contensions et l’isolement dans certains cas. La roténone en elle-même ne semble pas induire de phénotypes comportementaux à court terme (au moins jusqu’à deux semaines) d’après la littérature. A un mois, la roténone semble induire une hypoanxiété, puis de l’anxiété à 2 mois.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les cerveaux seront récupérés pour des études ultérieures
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs sont optimisés, les analyses comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n = 20 sujets en tenant compte de cette variabilité). La stratégie des 8 groupes avec deux groupes (contrôles et traités) se base sur un effet attendu relativement important. Nous faisons le choix de travailler chez les animaux des deux sexes en accord avec les directives d'intégrer le sexe comme variable biologique dans les recherches : en effet, les troubles psychiatriques dont le trouble bipolaire sont un facteur majeur d'invalidité dans le monde et peuvent s'exprimer différemment chez les hommes et les femmes. Il est donc essentiel de s'intéresser aux deux sexes pour une meilleure compréhension du trouble et développer des approches thérapeutiques adaptées.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. En complément, une friandise (sous la forme d'un morceau de gâteau) sera distribuée après chaque injection et après les tests comportementaux afin de diminuer le stress en faisant associer les manipulations à un événement positif. En cas de blessure, les animaux recevront un traitement analgésique jusqu’à la disparition des signes de douleur . En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Les éxpérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites gradés sont appliqués : les animaux surveillés sont pesés et oscultés quotidiennement (hydratation, température, état de la blessure si blessure). La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout de 48h. Dans ce cas, une euthanasie sera réalisée afin d'éviter toute souffrance supplémentaire.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation de modèles de troubles de l’humeur, ainsi que la possibilité d’utiliser des vecteurs viraux permettant l’utilisation de l’optogénétique font de la souris le modèle le plus pertinent. Les techniques précédemment mentionnées seront mises en œuvre ultérieurement une fois les modèles mieux caractérisés. Les souris seront adultes, âgées de 7 semaines ou plus. Le modèle roténone ayant été développé chez des animaux adultes et les patients étant typiquement diagnostiqués à l’âge adulte, nous nous focalisons sur le stade adulte dans un premier temps.
Modèles rongeurs de fragilisation de la barrière intestinale et de translocation bactérienne appliqués à l’évaluation d’efficacité de composés innovants dans des modèles de défaillance hépatique chroniques (ACLF)
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 3850
Barrière intestinale fragilisée par des agents chimiques, absorptions chroniques ou massives d'alcool, fonction du foie altérée: 4 150 souris et 3 850 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 5 900 d'entre eux en gravité sévère. Les animaux peuvent présenter des diarrhées parfois hémorragiques, une perte de poids, un état de choc et une détresse cardio-respiratoire avec des troubles de la régulation de leur température. Le porteur décrit des gestes "peu invasifs ou traumatisants" et affirme écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important, tout en indiquant que dans les études de survie la mort constitue le point final expérimental et qu'aucun point limite anticipé ne pourra alors s'appliquer. Il ajoute que les moyens de lutte contre la douleur peuvent introduire un biais expérimental, et vise une gravité "sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique".
Objectifs
Notre laboratoire est engagé dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la décompensation aigue de la cirrhose hépatique et dans le développement de solutions thérapeutiques visant à protéger les patients qui la subissent. La cirrhose du foie est le stade terminal courant des maladies chroniques du foie provenant de différentes étiologies. L’aggravation de la maladie hépatique déclenche une cascade d’événements avec une prolifération bactérienne intestinale et une dysbiose comme événements centraux. Les toxines bactériennes peuvent directement provoquer la mort des hépatocytes, tandis que la dysbiose affecte également la fonction de barrière intestinale et augmente la translocation bactérienne, ce qui entraîne des épisodes inflammatoires, des infections systémiques, une vasodilatation et contribue à une décompensation aiguë accompagnée de défaillances de plusieurs organes. Les patients qui montrent des signes similairesou qui sont atteints de ces symptômes présentent une inflammation systémique élevée, qui est principalement précipitée par une infection bactérienne avérée et/ou une hépatite alcoolique sévère. Au cours de l’évolution de la cirrhose, les modifications du microbiote (dysbiose) sont aggravées par des modifications de la motilité intestinale, de la perméabilité, de la fonction de barrière envers le compartiment lymphatique et sanguin, de l'hypertension portale et du système immunitaire. Le rôle du microbiote semble crucial chez les patients atteints de cirrhose décompensée, car de nombreux événements déclencheurs sont liés aux microbes ou à leur interaction avec l’hôte. Ce projet de recherche sur cette maladie hépatique met l’accent sur les mécanismes associés au microbiote qui sont impliqués, de manière à pouvoir les cibler ou pour identifier des paramètres permettant d’évaluer les propriétés de composés en développement. Nous mettrons en place des modèles expérimentaux conçus pour fragiliser la barrière intestinale et induire une translocation bactérienne, ces modèles induits par des actions directes d’agents chimiques ou par des absorptions chroniques ou massives d’alcool pourront également être combinés à des modèles pathologiques où la fonction hépatique est altérée de manière à reproduire les caractéristiques de la pathologie.
Bénéfices attendus
Lors d’épisodes de défaillance hépatique et par voie de conséquence d'autres organes, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour les défaillances multiples le plus précocement possible pour préserver le capital hépatocytaire qui subsiste, et qui peut se révéler être vital lors de la survenue d’un second évènement aigu. Aujourd’hui les traitements employés agissent sur les symptômes tels que la pression portale, l’infection, l’hémorragie digestive ou le syndrome hépato-rénal à l’aide de corticoïdes par exemple de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons proposer visent aussi à agir sur les mécanismes à l’origine des effets fulminants observés. (Infection, inflammation, et immunité). L’action régulatrice de composés sur la translocation bactérienne par une action directe sur la barrière ou indirecte sur le microbiote pourrait avoir un impact important sur la réduction des effets déclencheurs de la défaillance aigue du fonctionnement du foie.
Procédures
Au cours des procédures expérimentales qui constituent ce projet conduit sur des rats ou des souris, nous serons amenés à effectuer des gestes peu invasifs ou traumatisants, il s’agit d’administrer aux animaux par des moyens classiques d’injection des agents qui vont conduire à l’apparition de la pathologie souhaitée ou à contrario des produits destinés à en limiter ou réduire les symptômes. Ces administrations seront dans certains cas répétées de manière quotidienne sur des périodes courtes (une semaine) , ou de manière bi-hebdomadaire au cours de période plus longues ( 10 semaines max) Dans les cas ou une immobilisation est plus confortable, pour l’opérateur et pour l’animal, et de manière systématique pour les prélèvements, une légère anesthésie de quelques minutes (3min) sera pratiquée par exposition des voies respiratoires à un agent anesthésiant.
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet dont la finalité est le développement de modèles permettant de mener des évaluations de propriétés thérapeutiques de composés dans le traitement des patients dans un état ACLF dont la survie est engagée. La relation entre le foie et l’intestin joue un rôle primordial lors des phases qui précèdent le déclenchement de l’ACLF, l’altération de la fonction barrière et la translocation bactérienne sont des éléments que nous avons considérés et que nous devons reproduire dans nos modèles. Les modèles développés chez les rongeurs pourront présenter des troubles de la fonction digestive, associés à des diarrhées parfois hémorragiques et une perte de poids. Au cours de l’épisode ACLF, nous pourrons observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé lorsqu’il sera possible de les appliquer par exemple lors de la mise à mort à un temps fixe précoce prédéterminé. En revanche, dans les situations d’études de survie où la mort est le point final expérimental, il ne pourra pas y avoir recours à des points limites anticipés. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et cerveau) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global », capable de métaboliser les principes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique isolé ou cellulaire qui quel que soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/répression de gènes, effets histologiques etc) doivent être relevants. Nous écartons les paramètres dont la pertinence serait trop faible pour être statistiquement décelable qu'avec des effectifs trop importants. Nous disposons de données expérimentales ou publiées dans la littérature sur les paramètres biologiques ou biomarqueurs les plus pertinents et "robustes". La connaissance de la variance de ces biomarqueurs permet de définir un effectif théorique à l'aide du test statistique de Welsh qui associe variance et probabilité d'atteinte d'un seuil de significativité. Cette approche statistique permet d'affiner les effectifs et de réduire donc les nombres d'animaux qui seraient surévalués et non nécessaires à l'obtention d'un résultat biologique relevant. Les administrations par voie veineuse de manière répétées peuvent présenter des difficultés techniques qui obligent parfois à augmenter les effectifs des groupes (échec des injections à combler), la possibilité des injections multiples ou continues sur es des animaux cathétérisées est de ce point un avantage car cela permet de réduire le nombre d'animaux au strict nécessaire.
Raffinement
Les rats sont hébergés par paire , les souris par trio , l’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de rongeur (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teinté en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rats. Nous avons opté pour la pose de cathéters qui offrent un accès à l’aide d’un bouton métallique bouché par un obturateur aimanté qui présente l’avantage de pouvoir faire cohabiter les animaux dans une même cage sans crainte d’arrachage du cathéter par les congénères, cela constitue une amélioration significative du bien-être des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental de défaillance hépatique nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur peut introduire un biais expérimental ; une étape de validation s’impose pour chaque situation.
Choix des espèces
La littérature scientifique, est riche sur la cirrhose du foie, les rongeurs sont de bons répondeurs aux stimuli métaboliques, (condition importante dans ce projet.), mais il faut noter que la réponse du rat à l’induction de la fibrose (composant nécessaire à l’apparition de la cirrhose) est meilleure que celle de la souris. Dans le cas où il n’y a pas de différences majeures entre les espèces, le choix de l’espèce peut être strictement économique. L’hébergement des souris de petite taille est plus aisé. La souris nécessite 10 fois moins de réactifs ou médicaments parfois rare et précieux ou onéreux que le rat. La contrainte de la souris de petite taille est que les volumes d’échantillons biologiques obtenus sont limités, et on obtient moins d’informations scientifique à partir d’un seuil animal. Le recours dans ce cas au rat peut présenter des avantages.
Rôle des circuits thalamo-corticaux dans les déficits d’attention dans l’autisme
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Maintenues à 90 ou 95 % de leur poids initial par un rationnement alimentaire pouvant durer deux mois, les souris doivent rester assez affamées pour travailler contre une récompense. 560 souris porteuses d'une mutation modélisant l'autisme vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie d'entre elles subit une chirurgie cérébrale d'environ une heure pour l'injection d'un virus et l'implantation de fibres, avec inconfort, fatigue et parfois douleur dans les jours qui suivent. Ce rationnement, dont le porteur juge l'impact très faible, accompagne une "claire perspective translationnelle" annoncée pour le trouble du spectre autistique, quand l'expérience consiste à faire exécuter une tâche d'attention une heure par jour pendant deux mois.
Objectifs
Les déficits attentionnels affectent une large proportion des autistes (jusqu’à 80%). De récentes études suggèrent que les difficultés sensorielles et attentionnelles des autistes seraient étroitement liées. Ainsi, les autistes auraient des difficultés à sélectionner les stimuli sensoriels appropriés, ce qui entrainerait une surcharge cognitive. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle que joue l’attention dans le trouble du spectre de l’autisme. Plus précisément, ce projet examinera l’implication de différentes régions du cerveau et leur interaction lors d’une tâche comportementale permettant d’évaluer la capacité de transition attentionnelle dans un modèle transgénique d’autisme chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure connaissance des structures et circuits impliqués dans l’attention ainsi qu’une meilleure compréhension de l’implication des déficits attentionnels dans un modèle animal d’autisme. Ce projet fondamental a donc une claire perspective translationnelle, en particulier pour le trouble du spectre autistique.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une tâche comportementale d'environ 1h/jour pendant 2 mois maximum ainsi qu'à un rationnement alimentaire léger qui n'exédera pas deux mois. Les animaux de la procdure 2 subiront une chirurgie cérébrale qui dure en moyenne 1h.
Impact sur les animaux
Les chirurgies d’injection intra cérébrale de virus et d’implantation de fibres présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Afin de garantir la motivation des animaux pour la tâche comportementale ils seront mis en rationnement alimentaire léger (pour les maintenir à 90-95% de leur poids corporel initial) ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire). Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour l’analyse des marqueurs biologiques et les vérifications anatomiques.
Remplacement
Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives ne peut, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche cognitive chez l’humain n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.
Réduction
Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs et exploitables. Le nombre d’animaux par groupe est le minimum requis pour que nos tests conservent assez de puissance en tenant compte des pertes inévitables. Le recours à des méthodes réversibles (inactivation transitoire de certaines voies anatomiques par la technique d’optogénétique) permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales exploitables dans notre recherche, toute souffrance sera évitée. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté (matériel de nidification, maisonnette) et seront hébergés en cage collective. Les protocoles de chirurgie ont été optimisés afin de garantir des conditions optimales (analgésie centrale, locale, gel oculaire, tapis chauffant, scoring post-opératoire). Le suivi post-opératoire sera effectué quotidiennement pendant 7 jours pour s’assurer de la récupération complète des souris. Des points limites généraux et spécifiques ont été identifiés afin de permettre une prise en charge optimale de la douleur et de l’inconfort. Tous les expérimentateurs et soigneurs sont formés et compétents dans les procédures requises pour ce projet et ont suivi les formations obligatoires.
Choix des espèces
D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez la souris des aptitudes cognitives complexes que l’on retrouve chez l’humain. Enfin, la souris permet l’utilisation de modèles transgéniques, dans notre cas un modèle induisant un phénotype autistique. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes âgés de 6-8 semaines au début des expérimentations. Ils atteindront 10-12 semaines avant le début des chirurgies et des protocoles comportementaux afin de limiter la variabilité de taille. Cet âge a également été choisi pour être cohérent avec les données de la littérature.