Souris

Tester des extraits de plantes en complément d'immunothérapies anticancéreuses, dans un contexte où "les industriels cherchent sans cesse à approfondir leur expertise sur les propriétés des végétaux" : 3 744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou directement dans le rein par chirurgie, des injections d'immunothérapie tous les trois jours pendant deux semaines, et des gavages d'extraits de plantes trois fois par semaine pendant trois à quatre semaines. Le porteur qualifie la croissance de la tumeur rénale de "bien tolérée" et le gavage de "contrainte légère". Les extraits testés se trouvent déjà en pharmacie de proximité, et le projet vise à documenter ce qu'ils ajoutent à des immunothérapies existantes.

Objectifs

Les végétaux offrent une action globale au sein de l’organisme en agissant à plusieurs niveaux et en régulant différentes fonctions. Ces dernières années, les progrès en chimie ont permis l’extraction et la mise en évidence de principes actifs de certaines plantes, permettant d’accompagner la santé des individus (sommeil, digestion, stress, etc…). L’impact du régime alimentaire sur la modulation de notre microbiome intestinal a déjà été établit chez la souris comme chez l’Homme. Au sein de notre laboratoire, nous avons démontré l'association entre le microbiote intestinal et l'efficacité des traitements immunothérapeutiques dans le traitement du mélanome, du fibrosarcome et du carcinome rénal à cellules claires. Cet environnement intestinal est un haut lieu d’échange où communiquent les cellules épithéliales et le système immunitaire de l’individu avec un milliard de micro-organismes. De nos jours, les individus souhaitent de plus en plus se tourner vers l’emploi de produits dits naturels afin de renforcer leur microbiote intestinal et leur système immunitaire tandis que les industriels cherchent sans cesse à approfondir leur expertise sur les propriétés des végétaux. C’est dans cette optique que nous nous intéresserons à l’impact de la prise d’extraits de plantes sur la réponse immunitaire dans un contexte oncologique, en association avec des traitements immunothérapeutiques. Le but de ce projet est d’étudier le potentiel thérapeutique des extraits de plante afin d’améliorer le parcours thérapeutique des patients avec ceux-ci tout en approfondissant nos connaissances sur les propriétés de certains végétaux.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’étudier l’effet de la bioactivité de certains extraits de plantes et/ou composés actifs sur la croissance tumorale, la réponse immunitaire et l’efficacité anti-tumorale des traitements immunothérapeutiques. Ainsi, nous pourrions approfondir nos connaissances concernant certains végétaux et ainsi, utiliser leurs propriétés afin de répondre aux besoins médicaux des patients. Cela se traduirait par l’accompagnement de la prise de traitements immunothérapeutiques par des extraits de plantes ou composés actifs, que l’on retrouve déjà dans nos pharmacies de proximité, permettant l’amélioration de la réponse anti-tumorale dans des cancers reconnus comme agressifs (rein et mélanome). Aussi, nous pourrions moduler positivement la balance « bonnes » bactéries/ « mauvaises » bactéries au sein du microbiote intestinal, au bénéfice des patients atteints de ces cancers.

Procédures

Les animaux auront des injections de tumeurs, réalisés sous anesthésie (durée 2 minutes, une par souris), ou des injections orthotopiques (injection chirurgicale dans l'organe) sous anesthésie générale (durée 10 minutes, une par souris). Les injections des traitements immunothérapeutiques se feront tous les 3 jours pendant 2 semaines, durée 2 minutes. Nous réaliserons également des gavages d’extraits de plantes ou de composés actifs issus de ces plantes, 3 fois par semaine pendant 3 à 4 semaines, durée 2 minutes. Des prélèvements sanguins seront également effectués sur les animaux, sous anesthésie générale (n=5, durée 5 minutes au maximum).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress léger lié aux manipulations (préhension). Ils auront des injections en sous-cutanées ou par voie chirurgicale au niveau rénal, et des gavages d’extraits de plantes ou de composés actifs issus de ces plantes. Les injections sous-cutanées et intrapéritonéales provoquent une douleur transitoire légère et seront donc faites sous anesthésie. Les gavages provoquent une contrainte légère. La croissance des tumeurs dans le rein est bien tolérée et provoque des conséquences au maximum modérées.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin d'effectuer des analyses sur divers organes et tissus.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le microbiote, l’immunité anti-tumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse anti-tumorale dans un contexte tumoral, avec toutes les intéractions nécessaires. Il est actuellement impossible de reproduire toutes ces interactions in vitro ou ex vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous regrouperons les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Nous mènerons cette étude de façon séquetielle pour que chaque procédure fasse suite à la validation de l’hypothèse précédente. Chaque expérimentation concluante sera répétée une seconde fois, afin d’éliminer le biais d’expérimentation et de s’assurer de la validité de nos observations. Dans le cas où la procédure s’avère non concluante, l’expérimentation ne sera pas répétée et le protocole sera arrêté, ce qui diminuera le nombre de souris. Le calcul du nombre d'animaux par groupe a été réalisé grâce à un test statistique, ce qui nous a permis d'établir un nombre de 8 souris par groupe.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : régime alimentaire adapté et une eau stérile correspondant à leurs besoins, ainsi qu’un enrichissement adapté à l'espèce utilisé. Les animaux seront mis en quarantaine pendant une semaine avant le début de l’expérimentation, afin de leur permettre de s'acclimater à leur nouvel environnement. Dès le début des procédures, les souris auront un examen clinique quotidien afin de s’assurer de leur bien-être tout au long des procédures, suivant des critères pré-définis (poids, aspect du pelage et de la dentition, comportement social, taille et aspect de la tumeur). Des points limites ont ainsi été définis et seront strictement appliqués. Les injections et prélèvements sanguins se feront sous anesthésie. Les souris faisant partie des groupes nécessitant une chirurgie bénéficieront d'un suivi post-opératoire spécifique durant lequel nous leur administrerons des analgésiques.

Choix des espèces

La génétique de la souris est proche de celle de l’Homme et bien décrite au niveau de la littérature scientifique, ce qui rend comparable les voies de signalisation immunologiques des tumeures entre l'Homme et la souris.Les modèles de tumeur que nous utiliseront sont issus de lignées cellulaires murines. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 8 semaines, ce qui nous permettra d'étudier le système immunitaire à un stade de développement optimal et fonctionnel.

Injections dans l'abdomen tous les deux jours de un à quatre mois, test de force trois fois par jour chaque mois, vingt-quatre heures d'enregistrement de l'activité locomotrice répétées jusqu'à quatre fois, prélèvement de sang mensuel : 660 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent l'une des deux mutations les plus fréquentes chez les patients atteints de myopathie à agrégats tubulaires, et présentent une faiblesse musculaire dès l'âge de deux mois. Le porteur signale aussi une douleur et un stress liés au poinçonnage de l'oreille et au tatouage de la queue. La mesure finale de la force musculaire dure jusqu'à trente minutes sous anesthésie, sans réveil, et les souris sont tuées pour que leurs muscles soient prélevés.

Objectifs

La myopathie à agrégats tubulaires (TAM) est une maladie rare caractérisée par une faiblesse musculaire progressive, des crampes et des myalgies. La majorité des patients présentent également des anomalies de la peau, des os, des plaquettes, et de la rate. La présentation complète de ces signes multisystémiques est appelé syndrome de Stormorken (STRMK). TAM et STRMK forment un spectre de la même maladie. Nous avons précedemment généré et caractérisé deux modèles murins portant les deux mutations TAM/STRMK les plus communes chez les patients, localisées sur des gènes différents. Les souris présentent les principaux signes cliniques des patients. A ce jour, aucun traitement n’est disponible ni pour prévenir ni pour atténuer ces signes cliniques. A partir d'une librairie de médicaments approuvées pour le traitement médical chez l'homme, nous avons identifier deux médicaments capables d'inverser les défauts associés à la maladie in vitro. Une autre molécule est actuellement entrée en Phase II en essais cliniques pour la pancréatite aïgues mais cible la même voie dérégulée chez nos patients. Nous avons l'intention de traiter nos modèles souris TAM/STRMK avec les deux médicaments et la molécule en Phase II afin de tester la prévention mais également la réversion des symptômes observés chez les souris. Nous espérons ici trouver une nouvelle indication thérapeutique à des médicaments utilisés pour le traitement d'autres maladies. Cette méthode permet d'offrir une solution thérapeutique plus rapide aux patients et également peu toxique. Cette méthode est particulièrement intéressante pour les maladies rares comme TAM/STRMK où le nombre de patients diagnostiqués n'est pas suffisant pour réaliser des essais cliniques sur cette maladie.

Bénéfices attendus

Il est attendu que cette étude apportera une preuve de concept pharmacologique pour un traitement efficace de TAM/STRMK.

Procédures

Les animaux seront injectés par injection intrapéritonéale tous les deux jours entre 1 et 4 mois pour la stratégie de prévention, et entre 4 et 6 mois pour la stratégie de réversion. L'injection est réalisée en moins de 30 secondes. Le test de comportement permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour toutes les mois entre 1 et 4 mois pour la stratégie de prévention et entre 4 et 6 mois pour la stratégie de réversion. Chaque test dure 60 secondes avec repos minimal de 5 minutes entre chaque test. Le test permettant de mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 24h, et sera répété 4 fois dans la vie de la souris pour la stratégie de prévention et 2 fois pour la stratégie de réversion (1 fois par mois). Le prélèvement du sang sera répété 1 fois par mois, soit 4 fois dans la vie de la souris pour la stratégie de prévention et 3 fois pour la stratégie de réversion, et durera 1 minute. La mesure de la production de force du muscle est une procédure sans réveil, qui durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera mis à mort. Des injections péritonéales seront réalisées pour administrer le traitement. La procédure prendra environ 1 minute par souris.

Impact sur les animaux

Les souris malades manifestent des problèmes dans le muscle, la rate, et les plaquettes, tout comme pour l'homme. Le modèle murin est un outil approprié pour étudier le développement de la maladie et l'effet thérapeutique attendu des traitements étudiés. Les tests de comportement peuvent induire du stress chez l'animal. Les injections du traitement peuvent causer douleur chez l'animal. Une douleur et un stress physique sont attendus suite au poiçonnage de l'oreille et au tatouage consécutif de la queue lors de l'identification de l'animal.

Devenir

Les animaux seront mis à morts à l’issu des tests pour prélever les muscles nécessaires aux analyses moléculaires.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.

Réduction

Pour la partie expérimentale, les tests phénotypiques réalisés de manière non invasive offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui permet de s’affranchir de générer une nouvelle cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. L’organisation de nos procédures vise à utiliser le plus possible de tissus différents provenant de la même souris afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un maximum d’un test par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en veillant à obtenir une puissance statistique suffisante. Ainsi, nos précédentes études montrent que 15 souris au maximum par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu'au sevrage. La couleur de leur peau et la présence d'une poche de lait seront évaluées tous les 2 à 3 jours. Après le sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante, la qualité de l'air sera assurée par une ventilation et un cycle de lumière de 12 heures jour/nuit sera respecté. Les animaux auront accès à volonté à de l'eau et de la nourriture. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire pour maintenir les animaux propres et au sec. Le milieu sera enrichi avec des nids et un tube. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. En cas de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l'aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo, ce qui limite le développement de la douleur. Afin de réduire le stress lié aux différents tests, une phase de familiarisation sera effectuée pour chaque test avant le début du suivi longitudinal. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante pendant toute la procédure afin de maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. Des points limites pour nos souris incluent des signes de difficultés motrices majeurs tels que la perte de poids et une immobilité prononcée des membres postérieurs avec l’apparition d’une cyphose (dos arrondi). Si l'un des points limites est atteint, les souris seront euthanasiées. Les sites d'injections seront surveillés quotidiennement pour prévenir une infection.

Choix des espèces

Le modèle souris nous permet d’étudier la possible amélioration du phénotype musculaire et notamment du phénotype observé sur d’autres organes dans ce modèle murin d’une maladie multisystémique. Nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo chez la souris. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure du muscle est plus différente. C'est pourquoi nous proposons de réaliser ces techniques sur des lignées de souris disponibles dans nos laboratoires. Les tissus de la souris peuvent alors être utilisés pour effectuer d'autres analyses, maximisant ainsi les résultats obtenus par souris et minimisant le nombre total d'animaux utilisés. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Stim1R304W/+, caractérisé par de la faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît au bout de 2 mois et s’accentue avec l’âge présentant un phénotype modéré à 9 mois. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Orai1V109M/+, caractérisé par de la faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît également au bout de 2 mois. Les souris seront utilisées à l’âge adulte après 4 semaines (pour la prévention de la maladie) jusqu’à 4 mois, et des souris après 4 mois jusqu’à 6 mois (pour la réversion de la maladie), pour observer le développement des souris après le traitement. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Stim1R304W/+, caractérisé par de la faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît au bout de 2 mois et s’accentue avec l’âge présentant un phénotype modéré à 9 mois. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Orai1V109M/+, caractérisé par de la faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît également au bout de 2 mois. Les souris seront utilisées à l’âge adulte après 4 semaines (pour la prévention de la maladie) jusqu’à 4 mois, et des souris après 4 mois jusqu’à 6 mois (pour la réversion de la maladie), pour observer le développement des souris après le traitement.

Pour tester des inhibiteurs de canaux calciques contre la leucémie aiguë lymphoblastique et le neuroblastome, 150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules cancéreuses en boîte de contention, puis des molécules dans l'abdomen une fois par jour pendant cinq jours, et passent deux séances d'imagerie par semaine pendant quinze jours. Le porteur indique que les souris témoins surtout, mais aussi les souris traitées, vont développer le cancer, avec une restriction des mouvements des pattes arrière et une perte d'appétit pour la leucémie, une tumeur sous-cutanée qui progresse pour le neuroblastome. Une échelle de gravité fixe le seuil à partir duquel la souffrance doit être arrêtée, et la mise à mort intervient quand ce seuil est atteint ou quand les prélèvements l'exigent.

Objectifs

Bien que la prise en charge des patients atteints de cancer soit considérablement améliorée au cours des dernières décennies, les patients qui rechutent deviennent résistants à un certain nombre des traitements par chimiothérapies. Ces derniers reposent sur un ou une combinaison de plusieurs traitements (chirurgie, chimiothérapie, immunothérapie ou traitement ciblé). L'enjeu d'identifier l'origine et les mécanismes de cette résistance pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques reste aujourd'hui un objectif stratégique. Le cancer se caractérise par une survie accrue des cellules cancéreuses et une résistance à leur mort. Ces deux mécanismes sont associés à des défauts de régulation de la signalisation du calcium. Dans des études récentes, il a été mis en évidence des perturbations de la signalisation calcique dans deux types de cancer : le neuroblastome et la leucémie aiguë lymphoblastique (LAL). Par exemple dans la LAL, il a été observé une augmentation du niveau de base du calcium dans les cellules résistantes en comparaison aux cellules sensibles aux traitements. Ces études in vitro ont permis d'identifier des molécules qui sont responsables de cette dérégulation calcique pour ce type de cancer et que leur inhibition étaient efficaces pour rétablir l'équilibre calcique. Ce projet a pour objectif principal de proposer une alternative thérapeutique en utilisant des inhibiteurs ou anticorps spécifiques qui ciblent ces molécules responsables de cette dérégulation calcique dans ces cancers. Et l’objectif secondaire est de déterminer l'efficacité thérapeutique de ces anticorps ou inhibiteurs spécifiques en combinaison avec les agents pharmacologiques conventionnels utilisés en première ligne de traitement.

Bénéfices attendus

Il est attendu une efficacité des différents inhibiteurs ou modulateurs avec un effet bénéfique sur le ralentissement de la progression tumorale et, le pouvoir de ces inhibiteurs à ameliorer la sensibilité des drogues. Le but est de permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-cancéreuse.

Procédures

Prélèvement sanguin sur animaux anesthésiés (anesthésie générale gazeuse) : 1 prélèvement, moins de 10 secondes. Injection en intra-veineuse sur souris vigile maintenue en boite de contention : 1 injection de cellules, moins de 10 secondes par injection. Injection de molécules thérapeutiques en intra-péritonéal sur souris anesthésiée : 1 fois par jour sur 5 jours, moins de 10 secondes par injection. Suivi du développement des tumeurs sur souris anesthésiée par utilisation d'un bioimageur, acquistion du signal durant 2 minutes, 2 fois par semaine sur 15 jours.

Impact sur les animaux

Les souris contrôles surtout mais également celles traitées vont développer un cancer, leucémie ou neuroblastome. L'avancée de la maladie va conduire dans le cas de la leucémie à une restriction des mouvements des souris notamment des pattes arrière, une perte d'appétit et de poids et pour le neuroblastome une tumeur qui va progesser en sous-cutané. Une échelle de gravité des symptômes observés permet d’établir un point limite dans l’ensemble des expériences. Ces points limites permettant d’identifier le moment à partir duquel la souffrance et /ou la détresse de l’animal doit être arrêtée. Lors des 2 procédures les animaux recevront des injections et seront soumis à des prélèvements de sang, source de légère douleur liée à la piqure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort , car point limites atteints et/ou nécessité de prélevements (sang, organes)

Remplacement

Au préalable, plusieurs screening et évaluations (efficacité, cytotoxicité, etc.) in vitro des différents traitements ont été effectués sur des lignées cellulaires. Cependant, pour se rapprocher des conditions physiologiques chez le patient, une étude de l'efficacité dans un modèle in vivo reste indispensable et incontournable avant leur utilisation en thérapeutique clinique. Le choix de la souris repose sur la connaissance du système immunitaire de cette espèce, sur l’abondance des outils d’analyse des réponses immunitaires à disposition et par sa proximité phylogénétique avec l'homme qui permet d’envisager la transposition en clinique des stratégies évaluées.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux en expérimentation, ne seront utilisés que les inhibiteurs ou modulateurs des canaux calciques ayant démontré une efficacité dans une étude de non-toxicité cellulaire in vitro (dans un modèle cellulaire préalablement validé). Le nombre d’animaux nécessaire est réduit au minimum en tenant compte de la variabilité des mesures entre les souris du même groupe permettant une analyse statistique significative. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement. La croissance tumorale sera suivi en ayant recourt à de l'imagerie non invasive rendu possible grâce à l'utilisation de cellules tumorales bioluminescentes. Un tel suivi longitudinal sur l'animal permet une réduction du nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, statut SPF (Specific Pathogen Free) : ce statut SPF considère les principaux pathogènes chez les rongeurs et permet donc d’établir un état sanitaire pour des animaux « en bonne santé » et indemnes des principaux pathogènes. Les conditions d’hébergement sont contrôlées quotidiennement. Les souris seront élevées en communauté dans des cages avec enrichissements. Pour les animaux présentant des difficultés de locomotion, la nourriture et l’eau seront apportés directement dans la cage sous forme de gel. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse en respiration spontanée. Toutes les interventions sur les souris seront réalisées sous hotte à flux laminaire pour éviter tout risque d'infection. Afin de répondre au principe de raffinement les prélèvements de sang seront effectués en sub-mandibulaire sous anesthésie générale. Les volumes de sang prélevés aux différentes étapes seront réduit au strict minimum. Nous avons optimisé notre procédure en définissant des points limites permettant d’identifier le moment à partir duquel la souffrance et /ou la détresse de l’animal doit être arrêtée. Le suivi de la croissance tumorale se fera par un système d'imageur par bioluminescence, suivi longitudinal non invasif pour l'animal.

Choix des espèces

Le modèle animal le plus couramment utilisé dans le développement et dans l’évaluation thérapeutique en oncologie est la souris, en effet elle constitue un modèle préclinique implantable ou de greffe, dans lesquels la culture de cellules humaines sont greffés sur des animaux immunodéficients ou immunocompétents. Ce modèle constitue donc un outil pour des études physiopathologiques et le développement thérapeutique expérimental susceptibles d’améliorer le diagnostic, les connaissances physiopathologiques et nosologiques. Les souris utilisées seront agées au minimum de 6 semaines au début du protocole. Les tests débutent classiquement à 8 semaines de vie.

Un mois de doxycycline dans l'eau de boisson, pour éteindre un gène dans les fibres musculaires : 42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend de cette délétion un déclin progressif de la fonction musculaire, sans mort prématurée ni dystrophie, et prévoit une échelle de douleur de 0 à 3 pouvant conduire à une mise à mort anticipée. La question posée relève de la biologie fondamentale, savoir si les cellules musculaires éliminent leurs noyaux par autophagie, les retombées sur les maladies musculaires et le vieillissement étant annoncées comme un impact futur. Il compte 42 souris privées du gène et 42 témoins, soit 84 animaux, quand l'effectif déclaré est de 42.

Objectifs

Dans nos cellules, les organites ne sont pas permanents et subissent des dommages constants. Ces dommages déclenchent un mécanisme de nettoyage appelé autophagie, qui permet à la cellule d'éliminer les éléments endommagés. Contrairement aux autres organites, la plupart des cellules n'ont qu'un seul noyau, qui n'est donc pas considéré comme jetable. Cependant, les cellules musculaires squelettiques ont la particularité d'avoir des centaines de noyaux, ce qui pourrait faire du noyau un organite jetable. Nos recherches antérieures ont en effet montré que les cellules musculaires éliminent constamment les noyaux préexistants. Cependant, le mécanisme à l'origine de ce processus reste inconnu. Dans ce projet, nous explorons la possibilité que l'autophagie soit impliquée en suivant les noyaux marqués dans les fibres musculaires grâce à des outils génétiques développé chez la souris.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet apporteront un éclairage totalement nouveau sur la façon dont nous concevons l'homéostasie du tissu musculaire. Elles auront à leur tour un impact important sur la compréhension des maladies musculaires et du vieillissement, où de nombreux noyaux musculaires aberrants s'accumulent.

Procédures

Administration de doxycycline par voie orale dans l’eau de boisson pendant 1 mois pour induire la délétion de notre gène d’intérêt dans les myofibres.

Impact sur les animaux

La doxycycline est un antibiotique largement utilisé et son administration n'entraîne aucune gêne. La conséquence de son administration est le marquage des noyaux musculaires qui n'induit pas, non plus, de gêne. La perte de notre gène d'intérêt dans les myofibres a été signalée, dans une autre étude, comme provoquant une gêne modérée : les souris ne meurent pas prématurément et ne développent pas de dystrophie, mais elles présentent un déclin progressif de la fonction musculaire au fil du temps. Cette gêne modérée ne sera présente que chez les animaux délété du gène d'intérêt dans les myofibres après induction par la doxycycline soit 42 animaux. Les 42 animaux contrôles ne sont pas impactés, ils ne subiront aucune gêne.

Devenir

Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons, post mortem, tous les tissus musculaires pertinents de tous les animaux à la fin de la procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.

Remplacement

Notre projet porte sur la dynamique cellulaire et nécessite donc la présence de plusieurs structures cellulaires complexes. Il est important de noter qu'il n'existe actuellement aucun modèle de culture cellulaire permettant d'éliminer les noyaux musculaires préexistants (nous n'avons obtenu que récemment des données montrant que cela peut se produire chez les animaux dans notre propre équipe). Nous ne connaissons aucune méthode pour induire l'élimination des noyaux des cellules musculaires cultivées, ce que nous devrons comprendre en utilisant des modèles de souris. Enfin, nous souhaitons souligner les limites des cellules musculaires différenciées in vitro. Ces cellules sont extrêmement immatures et incomplètes car elles manquent de nombreuses caractéristiques des cellules musculaires matures : par exemple, absence de jonction muscle-neurone, absence de jonction muscle-tendon, absence de sarcomères matures, noyaux ne se déplaçant pas vers la périphérie de la cellule et se regroupant plutôt au centre de la cellule, etc. Si un chercheur étudie des mécanismes impliquant des événements de différenciation très précoces (par exemple, la sortie du cycle cellulaire, l'expression de gènes de différenciation précoce, la fusion musculaire, etc. ), les modèles in vitro existants peuvent s'avérer utiles. Cependant, pour toute question scientifique concernant des cellules musculaires entièrement matures et leurs structures (comme les nôtres), ces modèles de culture ne peuvent malheureusement pas remplacer les modèles animaux. Les modifications génétiques que nous utilisons ne sont possibles que chez la souris. Elles nous permettent d'étudier la fonction des gènes dans des conditions biologiques appropriées.

Réduction

Notre étude du renouvellement des noyaux musculaires dans le temps reprend des points temporaux déjà établis dans des études précédentes. De plus nous collecterons tous les tissus musculaires pertinents de chaque souris, ce qui réduira considérablement le nombre de souris utilisées. La puissance statistique a été utilisée pour calculer le nombre de souris nécessaire afin de déterminer si une différence statistiquement significative existe entre 2 groupes. Il a été déterminé que le nombre optimal de souris par groupe pour ce projet est de 7 femelles et 7 males afin d'obtenir une différence statistiquement significative.

Raffinement

Au cours de notre projet nous attendons un déclin progressif de la fonction musculaire au fil du temps chez les animaux délété pour notre gène d’intérêt dans les myofibres. Ce déclin sera très modéré néanmoins tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère (exemple : inconfort léger au niveau d’un membre type légère boiterie), dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente (exemple : douleur manifeste d’un membre entrainant un problème de déplacement), dans ce cas un analgésique sera administré à la souris. Niveau 3 : douleur intense (exemple : paralysie des membres), dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré et les animaux seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Les souris seront surveillées régulièrement. Le suivi de nos souris comprend une observation visuelle du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés). Si des souris devaient présenter des difficultés à se déplacer et donc des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage.

Choix des espèces

Nous utilisons des outils génétiques pour le suivi des noyaux musculaires, qui sont établis dans des modèles de souris. La lignée de souris permettant la délétion de notre gène d’intérêt, et donc de la protéine, après croisement avec une lignée exprimant la protéine Cre recombinase est également établie. La souris est donc le meilleur choix pour mener cette étude. Comme notre projet se concentre sur la régulation de la dynamique cellulaire dans les muscles matures, nous devons utiliser des souris dont le développement est terminé. Nous utiliserons donc des animaux adultes, mâles et femelles, âgés d’au moins 10 semaines.

Une injection dans le cerveau, à l'âge d'un jour, sur des souriceaux éveillés retirés de leur mère : 50 nouveau-nés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le geste dure quinze secondes, après application d'une crème anesthésiante sur la peau du crâne. Le projet porte sur l'apprentissage de ce geste par le praticien, avec une solution colorée, la thérapie génique du syndrome de Prader-Willi restant l'objet d'un projet ultérieur. Chaque souriceau est tué deux minutes après l'injection pour que son cerveau soit prélevé et la diffusion du colorant vérifiée.

Objectifs

Nos travaux préliminaires ont permis d’identifier le rôle d’une famille de gènes dont l’absence est une cause principale du syndrome de Prader Willi. Il s'agit d'une maladie génétique rare sans traitement curatif qui réduit drastiquement l’espérance et la qualité de vie des patients - le syndrome de Prader Willi est suspecté après la naissance par des signes caractéristiques de faible tonicité, de difficulté de tétée puis des troubles de la croissance et comportementaux ; en cas de suspicion un test génétique permet de confimer ou infirmer la pathologie. Nos travaux sur cultures cellulaires ont permis de développer une molécule de thérapie génique qui semble capable d’exécuter les rôles des gènes manquants. Avant d'envisager des tests chez l'humain, il convient maintenant de tester cette thérapie sur la souris chez qui une modification génétique reproduit le syndrome de Prader Willi. Ces études sont indispensables avant d’envisager des essais chez l’humain. Pour être efficace, le traitement par notre thérapie génique doit se faire rapidement après la naissance. Cependant, du fait qu'elle ne peut être injectée dans le système sanguin, elle doit être injectée directement dans le cerveau des souris nouveau-nées. Le présent pré-projet vise à acquérir et valider dans notre structure le geste technique d’injection de solution chez la souris nouveau-née de un jour.

Bénéfices attendus

Acquisition d’un geste expérimental permettant l’injection d'une thérapie génique chez la souris nouveau-née, ce qui représente un intérêt pour les projets qui visent à la compréhension/correction de mécanismes cérébraux normaux et pathologiques.

Procédures

Une intervention : les souris subiront une injection intracrânienne à l'âge de 1 jour. Cette injection s'effectuera sur une durée de 15 secondes.

Impact sur les animaux

- Stress lié au retrait transitoire des souriceaux nouveau-nés de la portée - Stress léger maternel - Stress lié à la contention et douleur lié à l'injection intracranienne chez souriceaux nouveau-né vigile

Devenir

Deux minutes après l'injection intracrânienne, chaque nouveau-né sera mis à mort pour prélèvement du cerveau et observation de la bonne diffusion de la molécule colorée dans le cerveau.

Remplacement

Des études préalables sur modèles cellulaires ont permis de développer une thérapie génique du syndrome de Prader Willi. Il convient maintenant de l’administrer sur le souriceau nouveau-né chez qui l’efficacité du traitement sera évaluée en mesurant plusieurs paramètres biologiques et comportementaux, qui ne sont pas évaluables sur modèle non-animal. Ce pré-projet vise à acquérir et valider le geste expérimental d’administration intracranienne de cette thérapie génique chez le souriceau agé de un jour.

Réduction

Pour ce projet, il est prévu d’utiliser au maximum 50 nouveau-nés issus de 4 à 10 femelles souris. Nous estimons que deux vagues de dix nouveau-nés séparées d’au moins une journée seront nécessaires à la bonne acquisition du geste technique par le praticien. Si le rendement afin de valider le geste est de 90% dès la 2ième cohorte de 10 animaux (minimum 20 animaux en tout, vagues 1 et 2), le projet sera arrêté. Dans le cas contraire, une ou deux nouvelles vagues seront réalisées jusqu’à 50 animaux maximum avant de conclure au succès ou à l’échec de l’acquisition du geste.

Raffinement

Les mères seront hébergées avec des éléments d’enrichissement et de nidification (igloo en carton, bloc de coton) jusqu’à la mise bas, puis avec des éléments d'enrichissement classiques (buchettes; frisures de papier kraft) une fois le sevrage des nouveau-nés surnuméraires atteint. Pour les nouveau-nés utilisés, l’injection sera précédée d’une application sur la peau du crâne d'une crème anesthésiante. Dans le cas ou des juvéniles manifesteraient une agitation désordonnée continue considérée comme point limite, leur mise à mort sera réalisée sans attendre les 2 minutes de diffusion de la solution colorée.

Choix des espèces

La souris est l’animal pour lequel des modèles du syndrome de Prader Willi existent. Le développement pathologique chez la souris est proche de l’humain. Dans notre modèle animal, les animaux seront injectés dès le lendemain de leur naissance, afin de mimer le traitement précoce des patients SPW. En effet, le SPW implique des troubles neurodéveloppementaux dont les premières manifestations prennent place à la naissance.