Souris

Un fragment de peau est retiré du dos de chaque souris sous anesthésie générale, un anneau de silicone fixé autour de la plaie, puis le pansement changé et la plaie mesurée tous les jours sous anesthésie gazeuse. 114 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le porteur indiquant que des infections peuvent apparaître et que des signes de douleur peuvent se manifester pendant toute la durée de l'expérience. Le mécanisme étudié, une sénescence déclenchée par la rupture de l'enveloppe du noyau sous contrainte mécanique, a été découvert sur des cellules en culture, ce qui n'empêche pas le porteur d'affirmer que ni les modélisations mathématiques ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire les paramètres en jeu. L'effectif de 114 animaux n'est justifié que par le recours à des "outils statistiques", et toutes les souris sont tuées pour analyse des plaies après leur mort.

Objectifs

Comprendre et exploiter les mécanismes de réparation des plaies cutanées pourrait avoir des implications importantes dans le développement de thérapies visant à optimiser le processus de cicatrisation survenues dans des épisodes cliniques aigus (brûlure, choc mécanique,) et chroniques (eczéma, psoriasis…) qui touchent une grande partie de la population. Malgré l’importance des processus de réparation tissulaire, ceux-ci sont encore mal connus. Des données chez l’homme et chez la souris décrivent le rôle central de la sénescence pour la réparation tissulaire. La sénescence est un phénomène biologique qui se produit lorsque les cellules de notre corps cessent de se diviser et de fonctionner correctement. Cependant, il a été montré que la sénescence favorise la régénération tissulaire en limitant la prolifération cellulaire excessive, en éliminant les cellules endommagées et en créant un environnement favorable à la cicatrisation. Récemment nous avons découvert un nouveau mécanisme d’induction de la sénescence cellulaire. Ce mécanisme est déclenché à la suite de la rupture de la membrane du noyau en réponse à des forces mécaniques appliquées sur les cellules. L'objectif du projet est alors de déterminer si ce mécanisme d’induction de la senescence est impliqué dans la réparation des plaies cutanées.

Bénéfices attendus

Jusqu'à présent, il a été décrit qu’à la suite d’une blessure, des cellules sénescentes se forment. Ces cellules jouent un rôle crucial dans la cicatrisation des plaies. Cependant, on ne sait pas encore clairement ce qui déclenche le mécanisme " de sénescence". L'étude du rôle potentiel de la protéine TREX1 dans l'induction de la sénescence après une blessure pourrait dévoiler une nouvelle cible thérapeutique pour améliorer la réparation tissulaire survenue, par exemple, à la suite de brûlure ou choc mécanique.

Procédures

Quelques jours avant l’excision cutanée, les animaux seront manipulés quotidiennement afin de limiter le stress dû au contact avec l’expérimentateur. Un fragment de la peau sera retiré sous anesthésie générale et un anneau de silicone sera fixé autour de la plaie (durée de l’anesthésie : 20 min). Les souris seront ensuite surveillées, les pansements changés et les plaies mesurées tous les jours sous anesthésie gazeuse (durée de l’anesthésie : 10 min).

Impact sur les animaux

À la suite de l’excision tissulaire, des infections peuvent apparaitre au niveau des plaies et des signes de douleurs peuvent se manifester tout au long de l’expérience.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Lorsqu’une plaie survient, des cellules sénescentes tels que les myofibroblastes (des cellules spécialisées qui jouent un rôle crucial dans la cicatrisation des plaies et la réparation des tissus se forment aux alentours. Ces cellules devenues sénescentes sécrètent des signaux et des facteurs qui inhibent la prolifération des cellules voisines. Tous ces facteurs élargissent le champ d'attraction de l'état de cicatrisation orchestré par plusieurs types cellulaires. Chaque organe, voire chaque partie d'organe, présente un microenvironnement particulier lié à la fois aux cellules qui y sont présentes, la façon dont elles communiquent ensemble, et surtout de tout ce qu'il s'est passé depuis la formation de cet organe (infections, lésions…). Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire tous ces paramètres, ce qui nous oblige donc à utiliser des animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires pour ce projet a été calculé à l’aide d’outils statistiques pour limiter au maximum le nombre d’animaux en permettant l’obtention de résultats statiquement significatifs.

Raffinement

Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de limiter leurs stress. Lors de la chirurgie, les animaux seront anesthésiés et recevront des anesthésiques locaux pour gérer la douleur. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de surveiller leur bien-être et de surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Les plaies seront mesurées tous les jours pour contrôler la vitesse de cicatrisation et l’état général de celles-ci (propreté, aspect...). Les pansements recouvrant la plaie seront changés tous les jours afin de limiter les risques d’infection. Toutes ces mesures ainsi que le nettoyage de la plaie nécessitant d’anesthésier les souris, elles seront espacées d’au moins deux jours si les premières expériences montrent que cela est possible. Une grille de score a été établie afin d’évaluer quotidiennement l’état des souris et des points limites adaptés ont été définis. Si la souris présente des signes de douleur de la buprénorphine sera administrée. Si une infection de la peau est détectée, celle-ci sera d’abord traitée à l’aide d’antibiotique et d’antiseptique, ce qui ne devrait pas impacter le processus de fermeture de la plaie. Si aucune amélioration ou à l’inverse qu’une aggravation de l’aspect de la plaie est observée, cela constitue un point limite. Ce suivi des souris s’applique à toute procédure.

Choix des espèces

Le rôle de la sénescence dans la réparation tissulaire a été bien décrit chez la souris. Les mécanismes de sénescence sont similaires chez la souris et l’homme. En plus, des données de notre laboratoire montrent que le mécanisme de sénescence induit par la protéine d’intérêt est conservée chez les cellules de souris comme chez les cellules humaines. De plus, le modèle d’excision cutanée murin utilisé dans ce projet a été montré comme mimant le processus de réparation cutanée humain, ce qui pourrait déboucher sur des données applicables cliniquement.

Pour humaniser leur foie, des souris d'une souche immunodéficiente, porteuse d'une mutation qui permet de faire mourir leurs propres cellules du foie, reçoivent des cellules hépatiques humaines. 7 850 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux injections d'un composé qui tue leurs hépatocytes, une greffe de cellules ou d'implants, des candidats médicaments administrés par voie pulmonaire, digestive, cutanée, tumorale ou par injection, des prises de sang, et parfois des jeûnes jusqu'à 12 heures par semaine. L'effectif permet par exemple 80 études de 50 souris, l'humanisation ne réussissant que chez la moitié des souris environ, et le porteur indique l'avoir fixé en anticipant une croissance annuelle "en accord avec le plan commercial". 200 souris sont déclarées réutilisées dans une formation interne aux gestes techniques, sous réserve d'un avis vétérinaire favorable, et les 7 650 autres sont tuées, le porteur estimant qu'elles ne recouvreront pas leur état de santé.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d'insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Les cellules hépatiques humaines pourront ensuite par exemple être infectées par des virus humains spécifiques et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de recréer, dans la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. De plus les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente pourront également être exploitées pour l’étude de l'insuffisance hépatique.

Procédures

1 ou 2 injections(s) de composé induisant la mort des hépatocytes. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection SC d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie pulmonaire, tumorale, dermique, digestive ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire et figurera dans le protocolé d’étude.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes, la greffe des cellules, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 7850 souris seront utilisées, couvrant une période 5 ans et permettant de réaliser par exemple 80 études précliniques de 50 souris sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%. Ce nombre a été déterminé sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série et sur base des données historiques collectées par l’entreprise. De plus, 50 souris seront utilisées dans le cadre de l’implantation du patch correspondant à une étude pilote de 5 souris et une première étude de 45 souris pour l’évaluation de l’efficacité du patch.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, les fréquences sont limitées et définies dans le protocole d’étude. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. De plus, la souche immunodéficiente présente une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins. Cela permet non seulement de greffer des hépatocytes humains en vue d’humaniser le foie, mais également d’évaluer des solutions thérapeutiques indiquées dans le cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.

Toutes tuées pour prélever leurs organes, 80 souris juvéniles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quarante d'entre elles reçoivent pendant cinq semaines un régime pauvre en protéines qui reproduit la malnutrition infantile. Chaque souris subit une biopsie du bout de la queue, cinq anesthésies pour la mesure de taille, un jeûne de six heures suivi d'un gavage de glucose, puis dix prélèvements de sang à la queue après incision et deux ponctions de 50 microlitres dans la veine sous-mandibulaire. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'un "organisme dans son entier" en contexte de malnutrition, et conclut à la "nécessité" de l'expérimentation animale.

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur à travers le monde. Elle entraîne un retard de croissance, ainsi qu’un métabolisme altéré (problèmes de glycémie et de production d'insuline par exemple) chez les enfants. Des études récentes ont suggéré que la réponse à la malnutrition infantile pourrait être différente en fonction du sexe, les garçons étant plus susceptibles d'être malnutris que les filles. En accord avec cela, des études précédentes ont permis de montrer qu’un régime alimentaire mimant la malnutrition impactait différemment les souris juvéniles mâles et femelles. De plus, une hormone produite par le foie en réponse à un manque de protéines dans l’alimentation est différemment affectée par la malnutrition chez les mâles et les femelles juvéniles. Cela incite donc à comprendre plus précisément les mécanismes liés à ces différences entre les sexes dans la réponse à la malnutrition juvénile, et en particulier à explorer le rôle potentiel de cette hormone. En combinant l’utilisation de souris ne produisant pas cette hormone avec un modèle de régime alimentaire faible en protéines et induisant une malnutrition, l’objectif de ce projet est de caractériser le rôle de cette hormone dans la réponse différentielle des mâles et des femelles à la malnutrition juvénile.

Bénéfices attendus

Les altérations physiologiques induites pas la malnutrition dans un contexte juvénile sont encore mal connues, de même que les différences entre les sexes dans ce contexte. Ce projet permettra d’élucider le rôle d’une hormone produite par le foie dans les adaptations physiologiques à la malnutrition juvénile, ainsi que dans la réponse différentielle entre les sexes. Cela permettra de comprendre comment optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition juvénile, et notamment d’adapter le traitement en fonction du sexe.

Procédures

8 lots de 10 souris seront utilisés dans cette procédure. 4 lots seront nourris avec un régime contrôle et 4 lots de souris seront soumis à un régime nutritionnel pauvre en protéines, mimant la malnutrition infantile, pendant 5 semaines. Tous les lots de souris seront mesurés chaque semaine sous anesthésie générale pendant 3 minutes puis pesés (< 1 min) pendant 5 semaines. Pour faire des analyses génétiques, toutes les souris auront un prélèvement d’une biopsie au bout de la queue sous anesthésie (3 minutes d’anesthésie, moins de 5 secondes de prélèvement). Dans le cadre d’un test métabolique, toutes les souris seront mises à jeun pendant 6 heures puis gavées avec du glucose, suite à une contention (environ 10 secondes). Elles auront ensuite une incision à la queue (environ 1 seconde) puis subiront 7 prélèvements à la queue d’environ 3 µL de sang (environ 5 secondes par prélèvement) et trois prélèvements additionnels à la queue d’environ 20 µL par prélèvement pour mesurer le taux d’insuline (environ 1 minute). A deux autres moments de la procédure, toutes les souris auront un prélèvement de 50 µL de sang en veine sous-mandibulaire sous anesthésie (3 minutes d’anesthésie, 30 secondes de prélèvement).

Impact sur les animaux

La biopsie du bout de la queue pour l’analyse génétique induira une douleur ainsi qu’un léger stress. La mesure de la taille des animaux (une fois par semaine pendant 5 semaines) n’induira qu’un léger stress lors de l’induction de l’anesthésie. Les pesées et la caractérisation de la maturation sexuelle induiront un léger stress associé à la contention de l’animal. Le jeûne de 6 heures induit un stress léger sur la souris. Le test de tolérance au glucose induira un stress modéré lié à la contention et au gavage des souris, ainsi qu'une douleur liée à l'incision d’un bout de queue d’environ 1 mm et au prélèvement de gouttes de sang au niveau de la queue. Le gavage des animaux ne devrait entraîner qu’un léger stress lié à la contention et un inconfort lors du gavage, ainsi que la possibilité d’irritation ou de fausse route. Les deux prélèvements de sang en veine sous-mandibulaire sous anesthésie générale induiront un stress modéré ainsi qu’une douleur.

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d'intérêt.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires et à l’invalidation d’un gène, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition et pour l'étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C'est pourquoi cette étude nécessite l'expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres étudiés. Chaque groupe expérimental contient 10 animaux. Des tests statistiques seront utilisés. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, tissu adipeux par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Les mères, qui n'auront pas subi de procédure expérimentale, seront réformées dans l'animalerie et pourront être réutilisées.

Raffinement

La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine. Les animaux seront suivis du lundi au dimanche, du lundi au vendredi par les expérimentateurs habituels, et les week-ends par une astreinte formée et expérimentée. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Des points limites suffisamment prédictifs seront établis pour anticiper tout stress et toute souffrance animale. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental, et le test de tolérance au glucose oral ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale. L’invalidation du gène étudié dans le foie a été décrit dans la littérature et n’entraîne pas de modification du bien-être animal (phénotype non délétère).

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de sa physiologie, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin d’étudier l’effet d’une hormone dans une étude nutritionnelle. * L'objectif du projet est d'étudier les effets d’une invalidation d’un gène sur le métabolisme et la puberté pendant la période juvénile. Pour cela, les animaux doivent être inclus dans la procédure dès le sevrage, qui est une période clé pour la croissance, la maturation sexuelle et la maturation métabolique.

Pour tester sur la peau des molécules dont l'établissement dit ignorer la composition, celles de ses clients, 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de tissus. Une inflammation de l'oreille leur est provoquée par injections répétées d'interleukine 23, puis les produits sont appliqués une ou deux fois par jour pendant seize jours. Huit mesures d'épaisseur de peau au pied à coulisse ou par imagerie, et une prise de sang hebdomadaire sous anesthésie gazeuse, complètent le protocole. Les points limites retenus donnent la mesure des atteintes possibles, perte de plus de 20 % du poids sur 72 heures, hypothermie persistante, plaie nécrosée ou purulente, arrêt de l'alimentation pendant 24 à 48 heures.

Objectifs

La dermatite atopique, encore appelée eczéma atopique, est une des maladies les plus fréquentes de l'enfant qui peut apparaître dès les premiers mois de la vie. L’origine de cette pathologie est principalement allergique. Il n’existe pas de traitement curatif efficace à ce jour. Les traitements utilisés sont symptomatiques et permettent de réduire les signes cliniques. Il est donc important d’avoir un modèle préclinique pertinent permettant de tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro de dermatite atopique pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). De ce fait, il est important d’avoir un modèle préclinique prédictif de la dermatite atopique afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques (non cosmétiques) qui permettront dans un futur proche d'apporter au patient plus de confort au quotidien.

Bénéfices attendus

Ces études permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traiements contre la dermatite atopique. Si une molécule se révélait efficace, elle permettrait d'améliorer la prise en charge des patients atteints de cette pathologie.

Procédures

Les interventions réalisées au cours de l'étude sont les suivantes: manipulation quotidienne (1 minute), contention pour administrations (une ou deux fois par jour pendant seize jours, durée d'environ trente secondes), anesthésie gazeuse pour l'induction et mesures au pied à coulisse ou par imagerie non invasive par tomographie de cohérence optique ou OCT (à huit occasions, tous les deux jours, environ 5 minutes), prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (une fois par semaine maximum, durée d'environ trois minutes).

Impact sur les animaux

L'injection répétée d'IL23 (interleukine 23) induit une inflammation locale au niveau de l'oreille. Il est possible également que des effets indésirables liés aux molécules testées apparaissent, mais ceux-ci sont difficiles à anticiper car il s'agit des molécules de nos clients dont nous n'avons pas connaissance. Le suivi clinique et la mise en place d'un scoring permettra de les détecter le plus précocément possible et d'adapter les traitements (dose, fréquence...) en conséquence.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés pour analyses.

Remplacement

L'utilisation du modèle animal de dermatite atopique ne sera utilisé qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle in vitro de dermatite atopique pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme)

Réduction

La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale) par observation répétée avec ou sans procédure d’imagerie. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (seuil de significativité alpha de 5% dont le critère principal sera l'épaisseur de la peau du dos et des oreilles en fonction du temps) et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle car une observation est réalisée avant d’initier les phases de traitement. Le nombre d’animaux sera de 8 répartis en 5 groupes (un groupe induit mais non traité, un groupe induit et traité avec une molécule de référence, un groupe induit traité avec l'escipient de la molécule à tester, 2 groupes d’animaux devant recevoir la molécule à tester à deux différentes doses ou recevant 2 molécules à tester). Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées afin d’obtenir le plus d’informations possibles relatives à l’efficacité des molécules administrées sur les animaux. L'utilisation d'imagerie OCT permet également de réduire le nombre d'animaux utilisés de 50% du fait du suivi longitudinal de chaque animal. Une procédure d’évaluation de la dermatite atopique en imagerie est prévue et cette approche permettra de réduire le nombre d’animaux de 50 %. Dans le cadre d’une approche classique (approche en groupes parallèles, sans utilisation d’imagerie et sans application d’un plan en mesures répétées), le nombre d’animaux par groupe de traitement serait supérieur dans le cas où l'on voudrait suivre l'évolution de la pathologie au cours du temps (au moins 16 animaux par groupe, par exemple 8 animaux mis à mort à un temps intermédiaire et 8 animaux mis à mort à la fin de l'expérimentation dans le cas où une approche histologique classique serait envisagée).

Raffinement

Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des lésions induites au niveau des oreilles et de la peau du dos...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, buchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation - Perte de poids >20 % du poids normal maintenue sur 72h - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication sur le site d’application de la molécule topique. Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris immunocompétentes) sont d’excellents modèles de dermatite atopique. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l’évaluation de la dermatite atopique induite dans ces espèces. De plus, ces animaux développent des symptômes de dermatite atopique très semblables à ceux observés chez l’humain. Ils présentent aussi certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~8-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants (maturité). Tous les animaux auront le même âge.

Des candidats médicaments fournis par des clients, de nature et d'effets secondaires inconnus du laboratoire qui les teste, vont être administrés à des souris dont un uretère est ligaturé pour provoquer une fibrose du rein. 1 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de tissus. Après la chirurgie de 5 minutes sous anesthésie, elles reçoivent les molécules jusqu'à 14 jours, selon une voie et un rythme propres à chaque protocole, et subissent des prises de sang, avec ou sans anesthésie, puis un prélèvement terminal sous anesthésie. Le porteur indique qu'elles vont "ressentir les symptômes" de la fibrose, un rein perdant sa fonction pendant que l'autre compense. Aucun test statistique ne fixe l'effectif, et l'équipe dit retenir 12 souris par groupe en s'appuyant sur des publications et sur sa "forte expérience en expérimentation animale".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur la fibrose rénale dans un modèle d’obstruction urétérale unilatérale (UUO) chez la souris.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de fibrose rénale.

Procédures

Les animaux vont subir une chirurgie très rapide (5 min) sous anesthésie pour induire le modèle pathologique d’insuffisance rénale (ligature urétérale). Ils vont également être traités par des candidats médicaments pendant 14 jours maximum (voie, fréquence dépendantes de chaque protocole expérimental). Ces gestes étant réalisés par du personnel qualifié seront très rapides (30 sec-1 min). Les animaux pourront avoir des prélèvements de sang intermédiaires sur animal vigile ou non et un prélèvement plus important terminal sur animal anesthésie.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). Les animaux vont subir une chirurgie qui peut provoquer des nuisances à ces derniers (douleurs, gène dans les mouvements…). De plus, nous induisons une fibrose rénale aux animaux donc ces derniers vont ressentir les symptômes de cette pathologie à savoir perte de la fonction rénale sur un rein et compensation de la filtration par l’autre.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et des prélèvements tissulaires seront réalisés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de la fibrose rénale. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Ce modèle se faisant sous anesthésie, cela permet de réduire la douleur et le stress chez l’animal. Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience en expérimentation animale, les publications scientifiques publiées, un nombre minimum de 12 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. Des tests seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre les groupes.

Raffinement

En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type igloo, aspen brick, carré de coton…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères et un antalgique sera administré avant toute chirurgie ainsi que l’utilisation d’un gel oculaire pour éviter la sécheresse des yeux pendant les anesthésies. De plus, après la chirurgie, des croquettes seront directement mises dans la cage des animaux afin de faciliter leur alimentation. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Ce modèle expérimental chez la souris est largement décrit dans la littérature et est considéré comme un bon modèle expérimental de fibrose rénale. Des souris adultes entre 7 et 12 semaines seront utilisées. Si les souris sont utilisées trop jeunes le développement des néphrons n’étant pas achevé le développement de la pathologie UUO serait différente et ne correspondrait plus au timing que nous recherchons.

Infectées par instillation directe dans la trachée sous anesthésie, 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles passent ensuite neuf à dix-sept fois en tube de contention pour une mesure de composition corporelle, et quatre à neuf tests de tolérance au glucose, chacun précédé de cinq heures sans nourriture et suivi de sept prélèvements de sang à la queue. L'objectif est de mesurer ce qu'une infection bronchique chronique de trente à quatre-vingt-dix jours fait aux os, aux muscles et au métabolisme du glucose. Le porteur écrit que la perte de poids n'excède jamais 5 % et que les souris reprennent une activité normale en deux jours, tout en indiquant que l'infection peut se compliquer du décès de l'animal dans moins de 5 % des cas.

Objectifs

Notre projet a pour but d’étudier les effets de l’infection bronchique chronique au niveau extra-pulmonaire. Les infections pulmonaires chroniques sont une complication fréquente des maladies bronchiques chroniques et ont un lourd impact pronostic. Elles sont responsables d’un déclin plus rapide et plus marqué de la fonction respiratoire et d’une augmentation du nombre d’exacerbations respiratoires (aggravation aigue de la maladie chronique). De plus, les maladies respiratoires chroniques s'accompagnent souvent de comorbidités ou de manifestations extra-respiratoires telles que l'ostéoporose, la perte de muscles, la dénutrition, le diabète, et les maladies cardiovasculaires. Le rôle de l’infection pulmonaire chronique dans la survenue de ces manifestations extra-respiratoires n’est à ce jour pas connu et n’a jamais fait l’objet d’études spécifiques dans le cadre de modèles animaux. Le modèle murin d’infection bronchopulmonaire chronique développé dans notre laboratoire est particulièrement adapté à la réalisation d'études longitudinales. L’objectif de ce projet est donc d’étudier les effets de l'infection bronchique chronique sur la composition corporelle et musculaire, l'architecture osseuse, l'inflammation sanguine, et le métabolisme du glucose.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à faire progresser les connaissances scientifiques afin de générer des bénéfices substantiels en santé humaine. Les infections pulmonaires chroniques, complications fréquentes des maladies bronchiques chroniques, ont un lourd impact sur la santé des patients et sont souvent associées à des comorbidités graves comme l'ostéoporose, la sarcopénie, la dénutrition, le diabète et les maladies cardiovasculaires. Cependant, le lien entre ces manifestations extra-respiratoires et les infections pulmonaires chroniques demeure largement inexploité scientifiquement, notamment dans les modèles animaux. Les bénéfices attendus de cette recherche sont multiples. Premièrement, elle permettra d'élucider les mécanismes reliant les infections bronchiques chroniques aux anomalies musculo-squelettiques et métaboliques, ainsi qu'à l'inflammation systémique. Ces connaissances pourraient conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter ou prévenir ces complications chez les patients atteints de maladies bronchiques chroniques. Une meilleure compréhension de l'interaction entre l'infection chronique et le métabolisme du glucose pourrait offrir des pistes pour des interventions visant à réduire le risque de diabète chez ces patients. Deuxièmement, cette étude pourrait modifier les pratiques cliniques en améliorant le suivi et la prise en charge des patients. L'identification de biomarqueurs spécifiques d'inflammation systémique et d'infection chronique permettrait une meilleure surveillance de la progression de la maladie et d'ajuster les traitements en conséquence, ralentissant ainsi la progression des comorbidités et améliorant la qualité de vie des patients. Enfin, ce projet a le potentiel d'enrichir la littérature scientifique en fournissant des données précises et inédites sur les effets systémiques des infections pulmonaires chroniques. En résumé, ce projet permettra d'approfondir notre compréhension des infections pulmonaires chroniques et de leurs effets systémiques, tout en fournissant des bases solides pour le développement de stratégies thérapeutiques innovantes, avec des bénéfices à long terme pour les patients et le système de santé.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d'interventions. Tout d'abord, ils seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) puis infectés par vvoie intra-trachéale directe. Cette intervention sera réalisée une fois pour chaque animal et devrait durer quelques minutes (anesthésie + infection). Des mesures de la composition corporelle des souris seront réalisées de manière répétée tout au long de l'étude (9, 13 ou 17 mesures selon le temps d’infection qui sera de 30, 60 ou 90 jours). Cette procédure implique la pesée des souris suivie d'une analyse par scanner à résonance magnétique nucléaire pour évaluer la masse grasse et la masse maigre de chaque animal. Le scan se fait en contention dans un tube adapté pour les rongeurs pendant 3 minutes (animal vigile). Enfin, seront effectués des tests métaboliques tels que l'IPGTT (test de tolérance au glucose intrapéritonéal). Pour évaluer les profils glycémique et insulinémique après une charge en glucose (IPGTT), les souris subiront une restriction alimentaire de 5 heures (de 9h à 14h), puis recevront du glucose en fonction de leur poids. Les mesures de glycémie seront prises à t=0’, 5’, 10’, 15’, 30’, 60’ et 120’ (prélèvement sanguin de 5 microlitres). Des prélèvements sanguins (environ 40 microlitres) seront effectués à t=0’, 15’, 30’ et 60’ pour doser l’insuline. La glycémie est mesurée en premier pour éviter tout impact de stress sur la valeur initiale. Durant tout le test, les animaux ont accès uniquement à l’eau, et la nourriture leur est remise à la fin du test. Les animaux sont laissés au repos pendant au moins une semaine entre chaque test. Ce test sera réalisé 4, 6 ou 9 fois sur chaque animal selon le temps d’infection (30, 60 ou 90 jours). Enfin, au terme de l'infection, les animaux seront mis à mort selon un protocole établi, impliquant une injection intrapéritonéale de d'anesthésiques et d'analgésiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux dans le cadre de ce projet sont : 1° Stress et inconfort liés aux manipulations : Les animaux seront soumis à des mesures régulières de poids et de composition corporelle, ainsi qu'à des prélèvements sanguins, ce qui peut causer du stress et de l'inconfort. 2° L'infection bronchique peut causer un stress initial (manipulation, anesthésie) et des difficultés respiratoires temporaires (résolutives en moins de 30 minutes suivant l'instillation généralement). Dans de rares cas (

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort au terme des différents temps expérimentaux.

Remplacement

Dans le domaine de la recherche en santé respiratoire, les alternatives non animales les plus fréquemment utilisées sont les modèles in vitro (cultures cellulaires) et les organoïdes. Ces méthodes présentent cependant des limitations significatives lorsqu’il s’agit d’étudier des systèmes complexes comme par exemple les réponses physiopathologiques mises en jeu au niveau systémique en réponse à une infection pulmonaire chronique. En effet, les modèles in vitro et les organoïdes ne permettent pas de reproduire de manière fidèle les interactions entre différents systèmes corporels ni de simuler l'inflammation systémique et les réponses immunitaires globales de l'organisme. Par conséquent, l'utilisation d'animaux vivants, en l'occurrence des modèles murins d'infection bronchopulmonaire chronique, est essentielle pour atteindre les objectifs de ce projet. Les souris offrent un modèle biologique pertinent en raison de leurs similarités physiologiques et immunologiques avec les humains, ce qui permet une évaluation détaillée et intégrée des effets systémiques des infections chroniques. Cela inclut l'étude des interactions entre l'infection pulmonaire et les réponses musculo-squelettiques, métaboliques et inflammatoires à l'échelle de l'organisme entier. En utilisant des modèles murins, nous pourrons obtenir des données précises et transposables, cruciales pour comprendre les mécanismes physiopathologiques et développer des stratégies thérapeutiques efficaces pour les patients. Enfin, les règles de l’éthique médicale ne nous permettent pas de réaliser ces études sur l’homme.

Réduction

Grâce à nos expériences passées sur des modèles animaux similaires, nous avons déterminé qu'un groupe de 8 animaux est généralement suffisant pour obtenir des résultats statistiques robustes. Toutefois, en raison de la variabilité inhérente à la qualité des instillations et du risque de décès par insuffisance respiratoire aiguë lors de ces procédures, nous avons décidé d'augmenter la taille des groupes à 10 souris. Cette approche a été validée par des études antérieures. Les autres mesures prises pour appliquer le principe de réduction ont été les suivantes : 1. Optimisation des techniques d’instillation : Nous avons raffiné et standardisé nos techniques d’instillation endotrachéale pour maximiser la consistance et minimiser les pertes animales. Une formation rigoureuse et continue des opérateurs est mise en place pour garantir la qualité des procédures. 2. Optimisation et maximisation du nombre et des types de prélèvement afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires aux différentes analyses du projet. 3. Analyse en temps réel : L’utilisation d’analyses statistiques en temps réel permettra d'arrêter l’expérience dès que les données suffisantes auront été recueillies, évitant l’utilisation de plus d'animaux que nécessaire. Analyses statistiques : • Études de survie : Les courbes de Kaplan-Meier seront utilisées pour analyser la survie des animaux, permettant une visualisation claire des différences potentielles entre les groupes. • Données quantitatives : Les données seront initialement analysées à l’aide du test de Kruskal-Wallis, qui est adapté aux échantillons non paramétriques et permet de détecter les différences globales entre les groupes. • Comparaisons multiples : Si le test de Kruskal-Wallis révèle une différence significative, des comparaisons multiples seront effectuées à l’aide du test de Dunns, pour identifier spécifiquement quelles paires de groupes diffèrent.

Raffinement

Toutes les procédures invasives seront effectuées par un expérimentateur entraîné. L’instillation des billes se fera sous anesthésie générale. Nous prévoyons une surveillance clinique quotidienne des animaux dans les 5 jours suivant l'instillation. Un score de douleur et de confort respiratoire sera établi en observant quotidiennement le comportement des animaux. Si nécessaire une analgésie sera mise en place ou si ce score est considéré comme trop important, l’animal sera mis à mort. Les souris seront hébergées à 5 par cages au maximum et du matériel d’enrichissement (nidification, jeux…) sera mis à disposition dans les cages. Elles bénéficieront d’une période d’adaptation minimale de 7 jours entre leur arrivée dans l’animalerie et le début des expérimentations. Tout animal présentant des signes de détresse respiratoire ou moribond sera mis à mort.

Choix des espèces

L'utilisation des souris dans ce projet présente plusieurs avantages significatifs. Leur petite taille facilite leur hébergement en animalerie, permettant de maintenir un grand nombre d'animaux dans un espace réduit tout en assurant leur bien-être. Les manipulations, y compris l'anesthésie, sont relativement simples à mettre en œuvre, ce qui minimise la souffrance et l'inconfort des animaux tout au long des procédures expérimentales. La physiopathologie de l'infection broncho-pulmonaire chronique chez la souris est remarquablement similaire à celle observée chez l'homme. Cette similitude permet une transposition pertinente des résultats aux conditions humaines, ce qui est crucial pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. De plus, notre modèle d’infection broncho-pulmonaire chronique chez la souris a été validé par la communauté scientifique, en particulier dans le cadre de la recherche sur la mucoviscidose (Martin et al., European Respiratory Journal, 2011). L'utilisation continue de ce modèle nous permettra de fournir des données novatrices sur les infections respiratoires chroniques et leurs effets systémiques. En résumé, les souris représentent un modèle idéal pour notre étude en raison de leur gestion pratique, de la simplicité des procédures expérimentales, et de leur pertinence biologique pour comprendre les mécanismes des infections broncho-pulmonaires chroniques et leurs comorbidités associées.

Pour corriger l'hyperexcitabilité cérébrale associée à la maladie d'Alzheimer, 918 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune subit un prélèvement d'oreille pour le génotypage, une chirurgie cérébrale de vingt minutes suivie d'une heure de pose d'électrodes, puis quatre jours d'électroencéphalogramme enregistré vingt-quatre heures sur vingt-quatre. Des tests sont répétés chaque mois pendant une semaine, dix minutes trois fois pour la mémoire et une heure en arène pour les mouvements, sans que le porteur nomme les épreuves employées. Il annonce de nombreux critères permettant de détecter une détresse et d'arrêter la procédure, sans en citer un seul.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer demeure à ce jour incurable. Il y a une urgence à approfondir nos connaissances sur les mécanismes et à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Parmi l’ensemble des symptômes retrouvés chez les patients, le plus connu est la perte de mémoire qui s’aggrave au cours du temps. Il y a une hyperexcitabilité du cerveau, fréquemment associé à de l'épilepsie qui aggravent la pathologie. Notre étude a pour objectif de développer une nouvelle stratégie thérapeutique afin de corriger cette hyperexcitabilité. Cette approche de thérapie génique pourrait être envisagée en clinique humaine. Nous induirons chez l'animal l'expression d'une protéine qui est altérée chez les patients,et nous analyserons l’activité cérébrale, et la mémoire. L’analyse des cerveaux permettra de mesurer l'efficacité sur les différents marqueurs de la pathologie.

Bénéfices attendus

Nous pourrons valider l’efficacité de la thérapie pour corriger l’hyperexcitabilité cérébrale dans le cadre de la maladie d’Alzheimer dans un but préventif ou curatif. Nous pourrons comparer aux techniques utilisées par d’autres laboratoires qui, ne sont pas envisageables en clinique humaine., Nous émettons l’hypothèse que notre thérapie génique pourra être effectuée sur les personnes à risque avant que les premiers symptômes ne se déclarent et que la pathologie ne soit trop avancée. Enfin, cette étude permettra de mieux connaître les mécanismes sous-jacents à l’hyperexcitabilité cérébrale présente dans la maladie d’Alzheimer

Procédures

les animaux pour le génotypage auront unprélèvement d'un bout d'oreille (3mm maximum). Les animaux auront 2 injections ( moins d'une minute) pour l'anesthésie et l' analgésie suivie d' une chirurgie cérébrale (durée 20 minutes) et en parallèle mise en place d'électrodes (1 heure). Les électroencéphalogrammes seront enregistrés 24h sur 24h pendant 4 jours sur les animaux se déplaçant librement. Les animaux seront testés en comportement tous les mois sur une durée maximum d'une semaine pour laisser un temps de repos entre 2 tests de comportement. Les tests durent environ 10 minutes et sont renouvelés 3 fois pour les tests de mémoire et pour l'étude des mouvements, la durée est d'une heure en libre circulation dans une arène. En fin de procédure les animaux seront euthanasiés sous analgésie avec une dose létale d'anesthésique.

Impact sur les animaux

Les nuisances lors d'un prélèvement de tissus pour le génotypage sont essentiellement un léger stress lors de la contention et une douleur légère pendant le prélèvement. Les tests de comportement peuvent engendrer un léger stress. Les chirurgies cérébrales peuvent engendrer des douleurs post-opératoires, une perte d’appétit menant à une perte de poids, ou encore à un stress de l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue chaque procédure

Remplacement

Notre étude portant sur l’hyperexcitabilité cérébrale, et ayant des mesures de mémoire et d’activités épileptiques, il est indispensable de travailler sur des modèles in vivo de la maladie d’Alzheimer. En effet, des lignées cellulaires ou des échantillons de cerveaux de patients ne nous permettrait pas de valider la stratégie thérapeutique que nous souhaitons développer.

Réduction

Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisqées précédemment au laboratoire. Nous avons également eu recours à notre service de statistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant une taille pertinente pour répondre à notre hypothèse biologique.

Raffinement

Nous avons planifié rigoureusement et optimisé les procédures expérimentales afin de minimiser les contraintes pour les animaux. Les expériences réalisées précédemments au laboratoire montrent que les procédures expérimentales réalisées sous anesthésie et analgésie impactent peu le bien-être animal. Les effets post opératoires sont traités par une analgésie dès le réveil de l'animal et le lendemain de l'opération. De nombreux critères ont été mis en place afin de détecter/évaluer toute forme de détresse des animaux qui entraineront l'arrêt de la procédure si nécessaire

Choix des espèces

Nous choisissons de travailler avec la souris en raison des nombreuses simililtudes au niveau des processus physiologiques avec l’Homme. Par ailleurs, de nombreux modèles génétiquement modifiésont été développés afin de récapituler certains des changements pathologiques et cognitifs associés à la maladie d'ALzheimer. Pour savoir si les animaux sont porteurs du gêne d'intérêt, une biopsie d'oreille sera faite entre 7 jours et 15 jours après la naissance Notre étude comprend l’utilisation de deux modèles à des âges pour lesquels ils présentent des symptomes plus ou moins avancés. Les animaux (mâles et femelles) utilisés sont âgés de 3 ou 5 mois au début du protocole. - 3 mois : correspond à l’âge où la pathologie commence à se déclarer au niveau cérébral de par la production de peptides amyloïdes. De plus, nos expériences réalisées précédemment au laboratoire démontrent une efficacité de notre thérapie à cet âge. Le début du protocole à cet âge permet donc de tester l’effet préventif de notre traitement. - 5 mois : c’est un âge où la pathologie au niveau cérébrale est bien implantée et où les animaux présentent des déficits cognitifs. Le début du protocole à cet âge permet donc de tester l’effet curatif de notre traitement.

Placées dans un appareil stéréotaxique après craniotomie pour recevoir un virus dans le cerveau, parfois équipées d'une fibre optique ou d'un émetteur télémétrique implanté dans l'abdomen, 4 404 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Certaines sont isolées pendant sept jours avant injection, pour les besoins des tests de comportement moteur. Le projet consiste à les exposer à "des situations menaçantes imitant le danger dans leur environnement naturel" pour observer si elles fuient ou se figent, et mesurer le rôle des récepteurs CB1 dans ce basculement. Le porteur écrit par ailleurs qu'"un stress mineur est attendu compte tenu des tests comportementaux utilisés".

Objectifs

Les comportements adaptatifs consistent en des actions et des réactions qui reflètent des réponses spontanées ou apprises qui maximisent les chances de survie. Les organismes peuvent adopter des stratégies défensives actives (par exemple, la fuite) ou passives (par exemple, le « congélation ») pour réagir en conséquence et l'équilibre entre ces réponses peut être défini comme l'équilibre actif-passif. Étant donné le rôle récemment découvert du système endocannabinoïde dans les comportements d'adaptation à la peur, cette proposition élucidera l'implication des récepteurs CB1 dans le contrôle de l'équilibre actif-passif des réponses adaptatives. Si l'activation des récepteurs CB1 entraîne généralement l'inhibition du circuit, il est possible qu'ils soient nécessaires lorsque des réponses actives ou passives sont exécutées. Notre nouvelle hypothèse est que les récepteurs CB1 striataux sont des modulateurs neuronaux clés dans l'exécution de différentes réponses comportementales adaptatives, représentant des commutateurs critiques entre des stratégies d'adaptation distinctes et sous-jacentes à plusieurs troubles psychiatriques. Pour ce faire, nous exposerons des souris dépourvues de récepteurs CB1 dans des régions cérébrales spécifiques à des situations menaçantes imitant le danger dans leur environnement naturel et nous utiliserons des outils moléculaires et comportementaux de pointe pour caractériser les mécanismes sous-jacents médiés par les récepteurs CB1.

Bénéfices attendus

Le récepteur CB1 est la cible endogène des molécules psycho-actives du cannabis. Au niveau endogène, ce récepteur est activé par des molécules lipidiques (endocannabinoïdes) qui jouent un rôle crucial dans les mécanismes de protection et régénération neuronale. De plus, l’administration de drogues dérivées du cannabis a été suggérée comme un outil thérapeutique pour plusieurs maladies du système nerveux central et des ganglions de la base. Ce projet nous aidera à mieux comprendre le mécanisme physiologique par lequel les cannabinoïdes régulent l'activité de ce circuit neuronal et vise donc au développement d’outils thérapeutiques pour les troubles associés à un comportement inadapté, y compris les maladies neurodégénératives et neuropsychiatriques.

Procédures

Les injections intra-péritonéales (i.p) se font dans quelques procédures. Cette technique se caractérise par l'injection de substances dans la cavité intrapéritonéale de la région abdominale de l'animal et dure environ 20 secondes (effectuée par une personne expérimentée). Pour la chirurgie et l’injection d’un virus (durée 45 minutes environ), les animaux seront placés dans une boîte contenant de l’anesthésique pour l'induction d'une anesthésie générale. Après tous les soins analgésiques systémiques et locaux, les animaux seront placés dans un appareil stéréotaxique (avec un débit d'anesthésie constant) et une craniotomie sera pratiquée afin d'injecter le virus dans le cerveau à l'aide d'une seringue fixée à une micropompe. Dans le cas de l’implantation d’une fibre optique en verre pour l'enregistrement de l'activité neuronale, une fibre optique sera implantée après craniotomie et injection de virus (durée 60 minutes environ). Certains animaux seront soumis à une autre chirurgie pour l'implantation d'un dispositif télémétrique dans l'abdomen afin d'évaluer les réponses physiologiques associées. Cette intervention ne devrait pas entraîner de complications post-opératoires majeures. Après la chirurgie, les animaux seront placés dans une armoire chauffante (30°C) pendant environ 30 min, puis remis dans leur cage d'hébergement avec de la nourriture humide placée à l'intérieur. Un suivi sera assuré tous les jours pendant 5 jours puis tous les deux jours pendant 1 semaine puis toutes les semaines. Les animaux recevront également un traitement analgésique par injection sous-cutanée une fois toutes les 24 heures pendant 3 jours après la chirurgie. Trois à quatre semaines aprés les chirurgies, les souris seront soumises à des tests comportamentaux afin d’évaluer leurs réponses défensives ainsi que leur locomotion (durée totale de 5-30 minutes).

Impact sur les animaux

Il n’y a pas de risque majeur lié à l’acte chirurgical et la douleur associée est traitée par une anesthésie appropriée et des analgésiques. Il n’y a pas de signe perceptible des douleurs après l'opération, durant la récuperation et lieés au procedures d’injection. Un stress mineur est attendu compte tenu des tests comportementaux utilisés. Néanmoins, il y a des points limites bien décrit dans les procédures. Le taux d’apparition des signes d’infection de la plaie suite à la chirurgie est très faible.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des toutes les procédures pour prélèvement des cerveaux pour analyses.

Remplacement

A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés qui possèdent un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale.

Réduction

Les animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux n'excèderont pas 14 animaux, c'est à dire le nombre minimal d'échantillons permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine et aussi décrit dans la literature scientifique sur le sujet. Au regard du faible nombre d'individu par groupes expérimentaux, les analyses statistiques basées sur des tests non paramétriques seront privilégiées par rapport aux tests paramétriques. De cette facon, les nombres prévus permettent de garantir une bonne interprétation des résultats. Néanmoins, si l’expérience démontre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.

Raffinement

Un protocole de surveillance et un suivi quotidien et rigoureux seront mis en place par l’experimentateur et le personnel zootechnicien. En cas de blessure légère, un protocole de soins et désinfection sera mis en place (antiseptique topique et antiinflammatoire systémique) jusqu’à la guérison. En cas d’atteinte du point limite terminal, l’animal sera mis à mort. Pour les traitments pharmacologiques, les injections IP sont bien maitrisées dans le laboratoire et ils n’induisent pas de mal-être chez l’animal. En plus les produits utilisés (et leurs doses) sont bien tolérés chez les animaux. Les souris seront néanmoins bien observées à la suite des injections, par un personnel qualifié ainsi que par l’expérimentateur, et ce, afin que des mesures d’analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaires. Pour certaines experiences de comportement moteur, les souris seront isolées pedant 7 jours avant injection. Toutes les mesures afin de reduire l'impact de ce type d'hébergement seront mise en place (congénères à proximité et enrichissement approprié). Les animaux seront hébergés dans des cages collectives avant et après manipulation, sauf pour certaines experience de comportement moteur nécessitant une semaine d'isolement. Les souris seront hébergées avec un milieu enrichi (matériel de nidification en coton et 2 tunnels par cage), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière pour les souris. Les souris seront observées quotidiennement par un personnel qualifié ainsi que par des expérimentateurs, formés selon la règlementation en vigueur et ce, afin que des mesures d’analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaires. La mise en place des points limites repose sur une évaluation de l'état général et du comportement des animaux comme expliqué dans la procédure. Toutes les procédures chirurgicales, pré- et post-opératoire, prévoient aussi l’utilisation d’analgésiques pour la prise en charge de la douleur. Elles seront effectuées par des experimentateurs formés à la chirurgie chez les rongeurs, selon la règlementation en vigueur.

Choix des espèces

A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés qui possèdent un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale. La souris représente le modèle idéal pour ces trois raisons : 1) Possibilité d’étudier des mutants pour une protéine donnée (ici le récepteur CB1), 2) Pour une reproductibilité et comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et la communauté scientifique plus large. 3) Les infrastructures sont équipées pour être destinées à l’étude des rongeurs. L'age des animaux sera de 8-16 semaines car les protocoles que nous avons établis seront développés à l'âge adulte des souris en évitant les problèmes de développement et la variabilité associée. Cela nous permettra également de comparer avec d'autres études sur le domaine.