Souris
Développement et caractérisation des effets thérapeutiques de l’administration de nano-anticorps anti-tau et anti-amyloïde beta dans des modèles murins de maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 280 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre elles subissant sept séances d'ouverture de la barrière sang-cerveau par ultrasons et quatorze injections intraveineuses sous anesthésie. S'y ajoutent, pour d'autres, une chirurgie cérébrale de trente minutes, un prélèvement de queue vers le dixième jour de vie, et vingt et un essais de nage de quatre-vingt-dix secondes dans un bassin circulaire répartis sur six jours. Le porteur reconnaît que ces souris développent vers sept ou huit mois une paralysie partielle des membres postérieurs et un amaigrissement lié aux difficultés d'accès à la nourriture, et que l'épreuve de piscine peut provoquer une hypothermie. Les retombées annoncées pour les malades d'Alzheimer restent au conditionnel et à long terme, quand la paralysie, elle, est programmée par le génotype des animaux.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative incurable qui, en raison du vieillissement croissant de la population, est devenue un problème majeur de santé publique. La maladie d’Alzheimer est caractérisée par l’accumulation anormale de différentes protéines dans le cerveau des patients, qui se propagent d’une région cérébrale à l’autre. Une de ces protéines est nommée Abéta et se dépose sous forme de plaques appelées plaques amyloïdes. L’autre protéine, la protéine tau, s’accumule également dans le cerveau des patients et s’agrège à l’intérieur des neurones. Un obstacle majeur au développement de thérapies efficaces dans la maladie d’Alzheimer repose sur l’existence d'une barrière « sang-cerveau » qui contrôle les entrées et sorties entre le cerveau et l’extérieur. Cette barrière a pour rôle de protéger le cerveau. Cependant, la barrière sang-cerveau rend aussi difficile la pénétration des molécules thérapeutiques dans le tissu cérébral. Ces dernières années, une technologie de molécules thérapeutiques de petites tailles, appelée « nano-anticorps » a été développé, avec un potentiel plus élevé pour traverser cette barrière, diffuser et atteindre ces cibles dans le tissu cérébral. Par ailleurs, un moyen d’ouvrir cette barrière a récemment été décrit par l’utilisation d’ultrasons appliqués sur la surface du crâne, permettant de distendre, de manière transitoire et sans effet secondaire, les parois de la barrière et ainsi autoriser la pénétration de molécules thérapeutiques. De plus, le développement des thérapies géniques a aussi ouvert de nouvelles opportunités pour surmonter les limitations dues à la présence de cette barrière sang-cerveau. En conséquence, ce projet vise à combiner ces technologies pour le traitement de la maladie d’Alzheimer. En particulier, l’utilisation de nano-anticorps visant les agrégats de protéines Abéta et tau, associés à une ouverture transitoire de la barrière sang-cerveau ou à l’emploi d’une thérapie génique, pouvant permettre de freiner la propagation de ces agrégats d’une aire cérébrale à une autre. Ce projet sera réalisé sur des souris génétiquement modifiées pour reproduire les accumulations de protéine Abéta et tau, caractéristiques de la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer une stratégie thérapeutique innovante combinant les technologies de nano-anticorps visant les agrégats des protéines Abéta et tau, et celles des thérapies géniques. L’efficacité de cette première stratégie sera comparée avec l'utilisation de nano-anticorps associés à une ouverture transitoire de la barrière sang-cerveau pour faciliter leur passage. Les multiples tentatives d’utilisations d’anticorps classiques dirigés contre les protéines Abéta et tau pour traiter la maladie d'Alzheimer ont montrées, jusqu'à présent, une efficacité clinique limitée. Cela est dû à la grande taille des anticorps et à l’existence de la barrière sang-cerveau qui réduit leur efficacité. Les nano-anticorps sont beaucoup plus petit que des anticorps classiques et ont un potentiel plus élevé de traverser cette barrière et atteindre des cibles thérapeutiques dans le tissu cérébral. Par ailleurs, plusieurs études récentes chez l’animal ont montré des effets bénéfiques de l’ouverture de la barrière via l’association des ultrasons et de microbulles, favorisant le passage d’anticorps anti-Abéta et montrant une diminution des dépôts dans le cerveau. De plus, plusieurs équipes de recherches ont récemment montrées que l’utilisation de thérapies géniques pouvait permettre de libérer à long terme des molécules thérapeutiques ciblant les agrégats de protéine tau directement dans le cerveau. L’utilisation de nano-anticorps en combinaison avec l’ouverture de la barrière sang-cerveau ou produits dans le cerveau par thérapie génique pourrait donc être une stratégie probante afin de délivrer des molécules thérapeutiques pour la maladie d’Alzheimer. Au long terme, ces recherches pourraient permettre le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques innovantes et, parallèlement, une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Les animaux transgéniques sont des modèles de maladie d’Alzheimer avec des lésions cérébrales et des signes cliniques (paralysie, perte de poids) qui peuvent être précoces (entre 5 et 7 mois selon les souris). Pour cette raison, les animaux feront l’objet d’un suivi rapproché pendant toute la durée du projet (examen et pesée 1-2 fois par semaine). -Tous les animaux produits auront un prélèvement d'un fragment de queue à l'âge de 7 à 10 jours pour définir leur génotype (patrimoine génétique) (moins d’une minute par animal, une fois) -Pour une partie des animaux une chirurgie cérébrale sera réalisée sous anesthésie générale pour une durée de 30 minutes environ et associée à une prise en charge de la douleur (analgésiques). -Pour une partie des animaux des séances d'ultrasons seront effectuées pour ouvrir transitoirement et sans effets secondaires la barrière sang-cerveau et faciliter l’accès des thérapies au cerveau. 7 séances d’ouveture (10 minutes par séance) couplée à deux injections intraveineuses (14 injections au total, durée de chaque injection : 30 secondes), le tout sous anesthésie générale et associée à une prise en charge de la douleur (analgésiques). -Pour une partie des animaux, on procédera à des tests de mémoire non-invasifs sur une durée de 9 jours : 1) une observation du comportement spontané dans une enceinte carrée (3 essais de 10 minutes répartis sur 3 jours) et 2) une observation d’un comportement inné de nage dans un bassin circulaire (21 essais de 90 secondes max. distribués sur 6 jours de tests). Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse vigile (1 minute par animal, une fois) A la fin des expériences les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques utilisées dans cette étude présentent des signes cliniques et développent vers l’âge de 7-8 mois (parfois plus tôt) des lésions cérébrales entraînant une paralysie partielle des membres postérieurs. Ce tableau clinique s’accompagne d’un amaigrissement lié aux difficultés d’accès à la nourriture et à la boisson. Les animaux ressentiront une légère et brève douleur au moment du prélèvement du fragment de queue pour définir leur génotype. Les chirurgies sous anesthésie générale sont associées aux risques anesthésiques habituels. Ceux-ci comprennent le risque d’hypothermie lors de l’anesthésie, le risque de déshydratation et le risque d’anomalies cardiaques et respiratoires liées au produit anesthésique. La chirurgie d’inoculation intra-cérébrale pourrait de plus provoquer une douleur pendant et après la chirurgie. L’inoculation intra-cérébrale de matériel accélérant la propagation des lésions neuropathologiques pourrait également favoriser l’apparition d’effets indésirables à un âge où ils ne sont normalement pas observés (entre 4 et 6 mois). Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur un comportement spontané et inné de l’animal, impliquant un stress modéré lors de la manipulation (sortie de la cage) et du placement dans un nouvel environnement et un stress plus important lors de l’épreuve de nage en piscine, pouvant également induire une hypothermie.
Devenir
A l’issue de toute les procédures, l’ensemble des animaux seront euthanasiés d’une part pour le prélèvement de leurs cerveaux à visée d’analyse et d’autre part parce qu’ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés du fait de leur modification génétique.
Remplacement
L’étude préclinique, fondamentale ou appliquée de la maladie d’Alzheimer, nécessite le recours aux modèles animaux, seuls à même de reproduire le contexte physiologique de cette pathologie neurodégénérative complexe. Il n’est donc pas possible de substituer aux souris transgéniques une alternative non-animale. En effet les études « vitro », dans des cellules, ne permettent pas d’évaluer l’effet de thérapies sur des fonctions complexes (comme la mémoire ou d’autres fonctions mentales). Par ailleurs les travaux sur les modèles souris qui miment les lésions et les symptômes de la maladie humaine ont permi ces dernières années des avancées importantes dans le domaine thérapeutique, notamment le développement d’anticorps qui ont ensuite été testés avec succès chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux produits (1280) et maintenus sur site est réduit au maximum. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaire pour nos lots expérimentaux et nos recherches. La taille des groupes d’animaux utilisés pour les études a été définie en fonction de nos expériences antérieures et des données de la littérature.
Raffinement
L’établissement utilisateur où sont hébergés les animaux étant agréé, les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées quotidiennement. Les animaux sont hébergés par groupes ou en trio (cages de reproducteurs) et bénéficient également d’un enrichissement matériel (coton ou kraft pour faire un nid, maisons en cellulose). Nous avons déjà mis en place un programme de suivi rapproché de nos lignées de souris modèles de maladie d’Alzheimer afin de détecter l’apparition de symptômes dommageables. Ce suivi sera réalisé à partir de 4-5 mois et permettra de détecter les animaux avec des signes cliniques et de prendre des mesures adaptées (prise en charge de la douleur, aménagement environnement, euthanasie). Le suivi rapproché des animaux au cours de la phase d’élevage et d’expérimentation permettra d’identifier l’atteinte de points limites et d’intervenir pour minimiser toute souffrance animale. Les étapes chirurgicales du projet (inoculations intracérébrales et ouvertures de la barrière « sang-cerveau ») sont associées aux risques anesthésiques habituels (hypothermie, déshydratation, sur- ou sous-dosage) pour lesquels plusieurs mesures seront mises en place (tapis chauffant, réhydratation avant la chirurgie, surveillance rapprochée de la sédation). Une surveillance post-opératoire sera également mise en place. Les chirurgies d’inoculation intra-cérébrale pourraient de plus provoquer une douleur pendant et après la chirurgie chez l’animal mais nous avons prévu de prévenir celle-ci par l’administration d’anti-douleurs (analgésiques) avant et après la chirurgie associée à l’anesthésie. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour cette chirurgie. Concernant les étapes d’ouverture de la barrière « sang-cerveau » il n’est pas attendu d’effet indésirable supplémentaire à ceux de l’anesthésie. Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur des comportements spontanés et innés de l’animal, n’impliquant à priori pas de stress majeur. Nous réaliserons des périodes d’habituation à l’expérimentateur et au nouvel envirronnment avant les tests pour minimiser le stress induit.). Pour l’épreuve de nage les essais seront espacés pour minimiser la fatigue motrice (pas d’épuisement des animaux) et le risque d’hypothermie sera minimisé par le séchage régulier des souris. En fin d’étude toutes les souris seront euthanasiées par des méthodes réglementaires.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris transgéniques qui développent des lésions similaires à celles des patients atteints de maladie d’Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèle autre que ces souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du présent projet. Les animaux reproducteurs pour générer nos lots expérimentaux seront utilisés de 2 mois à 8 mois maximum. Toutes les expérimentations seront réalisées sur l’animal à l’âge adulte. Les injections intracrâniennes seront effectuées sur les animaux jeunes adultes (âgés de 3 à 6 mois). Les traitements thérapeutiques seront eux aussi initiés à 3 ou 4 mois (début des lésions) sur une durée de 6-7 semaines avant évaluation comportementale. L’euthanasie des animaux sera réalisée à l’âge de 5 ou 7 mois. L’évolution des lésions pourra ainsi être évaluée et leur régression après traitement mesurée.
Evaluation de l’efficacité de plusieurs vecteurs AAV dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
Tuées à l'issue des procédures, mais aussi en fin de période de reproduction ou simplement pour avoir hérité du mauvais génotype, 1 327 souris vont être utilisées, dont 398 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Une partie reçoit une injection intracérébrale sous anesthésie de quatre-vingt-dix à cent vingt minutes, avec mise en barres d'oreilles, craniotomie et risque de saignement, une autre une injection intraveineuse rétro-orbitaire. Suivent des tests d'alternance spontanée, d'apprentissage et de mémoire étalés sur quatre à huit jours d'entraînement, puis un prélèvement de liquide céphalo-rachidien de quarante-cinq minutes sous anesthésie, sans réveil. Le porteur affirme que seules les souris transgéniques permettent aujourd'hui de "mimer suffisamment fidèlement" la maladie d'Alzheimer.
Objectifs
Aucun traitement n'étant aujourd'hui en mesure de combattre de façon efficace la progression des maladies neurodégénératives, nous avons pour objectif de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Comment ? En nous tournant vers la thérapie génique, qui consiste à introduire du matériel génétique (ADN) dans des cellules du cerveau dans le but de limiter la progression de la maladie. Cette approche s’est révélée efficace dans la maladie d'Alzheimer (MA) dans un modèle murin de la maladie. Des preuves de concepts ont été établies par des injections intracérébrales (directement dans le cerveau) d’un virus modifié (AAV Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) permettant de délivrer l’ADN au cœur même des cellules. Cependant, dans l’optique d’une application clinique chez l’Homme, l’administration intracérébrale peut induire des risques additionnels dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie. Dans ce projet nous avons développé des nouveaux AAV modifiés de façon à les rendre plus efficaces à passer la barrière protégeant le cerveau (la barrière hématoencéphalique) après une injection intraveineuse et ainsi permettre d’atteindre les cellules du cerveau. Le but est de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale en la remplaçant par une injection intraveineuse chez un modèle murin de la maladie MA. Les objectifs de l’étude sont : 1) Démontrer la fonctionnalité de l’AAV et donc de confirmer l’efficacité thérapeutique de l’administration intracérébrale. 2) Comparer l’efficacité thérapeutique de deux AAV par administration intracérébrale ou intraveineuse. L’objectif final est de poursuivre toutes les étapes précliniques permettant de proposer cette approche thérapeutique chez les patients atteints de la MA.
Bénéfices attendus
Le bénéfice recherché est de remplacer la voie intracérébrale (connue pour être efficace chez la souris) par l’administration intraveineuse de vecteurs AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) codant pour la protéine X, afin de pouvoir l’appliquer à l’Homme, et plus précisément chez les patients atteints de maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux modèles de la maladie d’Alzheimer avec phénotype dommageable seront utilisés. Ils seront issus de couples reproducteurs commerciaux. Les animaux seront injectées une seule fois : soit par voie intraveineuse (5 minutes d’anesthésie gazeuse), ou par voie intracérébrale (90-120 minutes sous anesthésie gazeuse avec injection d'analgésique en pré-opératoire, application d'analgésique sur le site incisé et injection d'analgésique en post-opératoire). Des études comportementales (consistant à évaluer l’alternance spontanée, l’apprentissage et la mémoire des souris) seront réalisées afin d’évaluer les effets des vecteurs injectés sur les déficits cognitifs. Le test mesurant l’alternance spontanée sera réalisé en une session d'une journée. Le test mesurant l’apprentissage et la mémoire comprend des sessions d'entrainement de 4 à 8 jours, puis un test effectué en une journée, juste après la session d'entrainement. Le jour d'euthanasie, un prélèvement du liquide céphalo-rachidien et sanguin sera réalisé (45 minutes) sous anesthésie après injection d’un anti-douleur. Ces prélèvements sont réalisés juste avant l’euthanasie des animaux (sans réveil après les actes).
Impact sur les animaux
Parmis les effets indésirables attendus sur les animaux nous pouvons noter les éléments suivants : 1)Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, 2) Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. 3) Un risque de traumatisme mécanique locale relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le cerveau des souris. 4) Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal. 5) Un risque d’infection oculaire peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro-orbitale. 6) Une perte de poids dûe à l’injection d'AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adeéno-associés) pourrait être observée (5 à 7pourcent du poids de référence total de l’animal, selon nos précédentes études), bien que les concentrations des AAVs utilisées soient déjà évaluées in vitro dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité chez la souris.7) un stress lié à la manipulation de des animaux lors des tests comportements
Devenir
l’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des actes prévues que ce soit pour l’élevage (sans prélèvement) de la lignée en cas de mauvais génotype ou en fin de période de reproduction ou à l’issue des procédures (avec prélèvement pour répondre à la question scientifique).
Remplacement
Remplacement: Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir résultats statistiquement pertinents. Leur nombre (1327) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. La taille des effectifs a donc été établie grâce à un calcul de puissance. Afin de limiter le nombre total d’animaux essentiels au projet, les tests de comportement et les analyses histologiques, biochimiques et moléculaires post-mortem seront dans la mesure du possible réalisés sur les mêmes animaux. Le design expérimental a pour but d’obtenir un maximum d’informations en utilisant un minimum d’animaux. Les différents paramètres (comportementaux, biochimiques, histologiques, etc) seront analysés grâce à des essais appropriés en fonction des demandes/exigences expérimentales.
Raffinement
Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’injection locale d’analgésique et par protocole analgésique pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Un gel ophtalmique sera appliqué immédiatement après l’injection. Une surveillance particulière de l’œil sera faite en post opératoire pour vérifier l’absence d’infection oculaire. Le geste de l’injection intraveineuse est maitrisé par l’applicateur. L’anesthésie générale sera assurée par une anesthésie gazeuse. L’application de critères d’arrêts standards en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. Le suivi est renforcé la semaine suivant la chirurgie puis celui-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites qui auront été définis préalablement. A partir de 9 mois d'âge les animaux seront pesés deux fois par semaine, observés attentivement lors de chaque pesée et de la nourriture sera également ajoutée sur le fond de la cage de façon systématique à chaque pesée. De plus, les tests comportementaux étant réalisés de façon hebdomadaire sur plusieurs jours, favorisent un suivi renforcé et une habituation des souris à la salle et à l’utilisateur. Un environnement enrichi constitué d’un nestlet pour la fabrication du nid et d'un igloo sera ajouté dans chaque cage. Les animaux seront hébergés en groupe.
Choix des espèces
Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèle. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la maladie d'Alzheimer permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie. C’est pourquoi nous les utilisons dans des études d’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques, comme l'évaluation de la surexpression de la protéine X. Dans ce projet des animaux adultes seront utilisés (entre 4 semaines et 14 mois d'âge). Chez ce modèle murin, les défauts neuropathologiques apparaissent dès 6 semaines puis ces défauts progressent ensuite de manière exponentielle. Nous réaliserons les injections stéréotaxiques ou intraveineuses chez des souris à différents stades (entre 4 semaines à 7 mois d'âge) et évaluerons les effets du traitement (entre 8 semaines à 14 mois d'âge) à différents âges et stades de la neuropathologie et comportement en fonction des deux voies d'administration.
Etude du rôle de CD99 dans les cellules immunitaires et endothéliales au cours de l’insuffisance rénale aigue et chronique (EU2/2)
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
Clampage de l'artère rénale sous anesthésie, irradiation du corps entier, reconstitution de moelle osseuse, injections rétro-orbitaires : 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à six prélèvements sanguins et six prélèvements d'urine, et jusqu'à quatre mesures du débit de filtration glomérulaire de quarante-cinq minutes chacune, réparties sur un mois. Une partie d'entre elles voyage entre deux établissements utilisateurs installés sur des sites différents. Sur le remplacement, le porteur se contente d'une phrase, l'insuffisance rénale aiguë serait "impossible à reproduire in vitro".
Objectifs
Récemment, nous avons identifié un peptide CD99 prédictif du développement d'une insuffisance rénale aigue (IRA) dans les urines obtenues 4h après un pontage cardiaque provenant d’une cohorte humaine. Ce peptide est également différentiellement représenté dans les urines pré-opératoires des patients développant une IRA post-opératoire. CD99 est une protéine transmembranaire principalement identifiée sur la membrane des cellules endothéliales et immunitaires. Dans la cohorte de patients utilisée pour identifier le ratio CD99 (peptide/protéine entière) comme nouveau biomarqueur de l'insuffisance rénale aiguë, l'expression du CD99 sur les cellules immunitaires circulantes (monocytes, neutrophiles, cellules B, cellules T) était similaire chez les patients ayant développé ou non une insuffisance rénale aiguë. Il est donc nécessaire de caractériser la façon dont les CD99 « rénal » (c’est à dire à la surface des cellules endothéliales et immunitaires résidentes) modulent le risque de développer une insuffisance rénale aiguë avant de mettre en œuvre une approche thérapeutique ciblant les CD99. Ce projet est un projet multisite qui se déroule deux EU (EU1 et EU2)
Bénéfices attendus
Mieux caractériser le rôle respectif de CD99 endothélial et immunitaire dans le développement d’une insuffisance rénale aiguë et chronique afin de développer ensuite une approche thérapeutique ciblant CD99.
Procédures
1/prélèvements sanguins à la queue (sous anesthésie) avant chirurgie et avant mise à mort (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 6 prélèvements seront réalisés (J0, J2, J7, J14, J21 et M1). Chaque rélèvement dure environ 2min par animal (anesthésie et prélèvement compris) 2/prélèvement d'urine lors de la contention de l'animal avant chirurgie et avant la mise à mort (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 6 prélèvements seront réalisés (J0, J2, J7, J14, J21 et M1). Chaque prélèvement dure environ 2min par animal. 3/Mesure du Débit de Filtration Glomérulaire avant chirurgie et avant sacrifice (placement du capteur et injection en retro-orbitaire sous anesthésie) (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 4 mesures seront réalisées (J0, J7 ou J14 J21 et M1). Chaque mesure dure environ 45min par animal (placement du capteur, injection en retro-orbitaire sous anesthésie et mesure) 4/irradiation (EU2). Une seule irradiation par animal est réalisée, la totalité de la procédure ne dépasse pas 2h (mise en cage, irradiation et retour en cage animalerie) 5/Induction d’une agression rénale (chirurgie, régime spécifique, injection de drogues) (EU1). Une seule chirurgie est effectuée par animal, la procédure dure entre 30 et 45min (anesthésie, chirurgie, clampage d'aorte rénale (le temps varie en fonction du sexe et de la souche) et souture).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront : 1/Une irradiation sans geste invasif suivi d’une reconstitution de leur moelle osseuse. Les effets indésirables possibles sont une légère baisse de l'alimentation avec légère perte de poids. osseuse. Les effets indésirables possibles sont une légère baisse de l'alimentation avec légère perte de poids. Les animaux peuvent avoir un léger stress du fait de l'enfermement et du bruit, mais ce stress est de courte duréee. L'irradiation ne procure aucune douleur. 2/Une agression rénale (chirurgie, régime spécifique, injection de drogues) résultant en une détérioration de leur fonction rénale. Les effets indésirables possibles sont une baisse de l'alimentation liée à l’agression rénale et dans peu de cas, des complications suite à l'acte chirurgical. C'est pour cela que les souris sont surveillées attentivement pendant les heures qui suivent l'intervention. Les animaux ne doivent pas resentir de stress mais pourraient ressentir une douleur lors de l'acte chirurgical et après réveil, c'est pour cela que nous injectons en sous cutanée un analgésique avant chirurgie et après. 3/ Une mesure du débit de filtration glomérulaire (DFG) n'est normalement pas suceptible d'induire de douleur. L'anesthésie permet de faciliter la procédure pour l’expérimentateur et en particulier d’être sûr que l’animal est complètement immobile pour l’injection rétro-orbitaire afin d’éviter toute blessure. Notre expérience de ce système montre que la plupart des animaux tolèrent très bien le dispositif et se comportent normalement pendant la période de mesure. Cependant, certains animaux peuvent être gênés, si des signes de stress importants sont observés (agitation), le dispositif est retiré.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure ou si l'un des points limites était atteint. A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever de l’urine, du sang et différents organes (dont le rein) en vue de leur analyse.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable car l’insuffisance rénale aiguë est impossible à reproduire in vitro.
Réduction
Les modèles expérimentaux sont bien maitrisés par les expérimentateurs impliqués, ce qui évite les étapes de mise au point couteuses en animaux. Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre principal et chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 960 Souris.
Raffinement
Les études sont optimisées d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère, par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie et les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Des points limites ont été définis : 1) Perte de poids supérieure à 25% du poids initial ; 2) Posture de prostration ou léthargie au-delà de 24 heures après l’agression rénale ; 3) Signes de souffrances (comportement ou apparence anormaux, présence de lésions, absence de toilette…) sans amélioration pendant plus de 24h. Si un de ces points est atteint au cours du protocole, les animaux concernés seront mis à mort. Concernant le transport des animaux entre l'EU1 et l'EU2, il sera effectué sur des animaux aptes à supporter le voyage qui sera effectué dans des conditions telles qu'ils ne puissent être blessés ou subir des souffrances inutiles. Le transport sera effectué par une société agrée qui effectue de manière régulière la navette entre l'EU2 et l'EU1.
Choix des espèces
L’espèce utilisée permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines au début de l'expérience, à cet âge les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes.
Evaluation nouveaux ligands en imagerie TEP sur modeles de tumeurs
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Toute perte de poids, tout signe de douleur ou toute détresse cardiaque ou respiratoire déclenche l'arrêt de la procédure et la mise à mort. 480 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Des cellules tumorales leur sont implantées dans l'organe dont elles proviennent, avec pour les tumeurs cérébrales une craniotomie de trente à cinquante minutes, puis viennent des séances d'imagerie deux à trois fois par semaine et des examens TEP de deux à quatre heures sous anesthésie. Le porteur admet que les molécules testées peuvent provoquer des chocs anaphylactiques, des réactions allergiques et des détresses cardio-respiratoires, l'objet du projet restant de mettre au point de nouveaux traceurs de diagnostic.
Objectifs
Un des problèmes majeurs de nombreuses pathologies, parmi lesquelles les cancers, est le diagnostic tardif ainsi qu’une localisation difficile d’accès et parfois multiple qui rendent leur traitement difficile. Parallèlement à la recherche de nouveaux traitements, la recherche en imagerie médicale permet de développer de nouveaux outils permettant de détecter l’apparition de pathologies plus précocement et de manière plus précise ce qui permet un meilleur diagnostic et à un meilleur suivi. Pour developper ces nouveaux outils l'identification de récepteurs exprimés à la surface des cellules tumorales est indispensable. L'accrochage de ces nouveaux outils sur des tumeurs implantées en sous-cutanée a déjà été validé in vivo dans plusieurs modèles. Le but de ce projet est d’utiliser différentes techniques d’imageries pour répondre à deux objectifs : i) visualiser la croissance de tumeurs implantées dans l'organe dont sont issues ces cellules, et ii) le développement de nouveaux outils d'imagerie en médecine nucléaire afin d’améliorer le diagnostic et le traitement des tumeurs.
Bénéfices attendus
En ce qui concerne la partie expérimentale, notre procédure met en avant la sensibilité d’action de nos molécules d'imagerie et les faibles quantités administrées, ce qui réduit également les risques de toxicités pour les animaux. D'un point de vue médical, le potentiel de reconnaissance de la cible de nos molécules constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.
Procédures
Les implantations des cellules tumorales se font sur l’animal anesthésié. Concernant les tumeurs cérébrales la procédure de chirurgie se fait sous anesthésie générale, l’opération dure entre 30 et 50 minutes pendant laquelle la suspension cellulaire tumorale est injectée. L'injection de la suspension cellulaire se fait par une aiguille maintenue en place pendant 3 minutes, puis lentement retirée avant de suturer la peau. Pour les autres types d'implantations une injection de suspension cellulaire tumorale sera réalisée dans l'organe d'intérêt. Pour la Bioluminescence une injection intraperitonéale de luciferine sera réalisée 10-15 minutes avant l’imagerie. Nous effectuerons des images le jour de l'implantation, 1 fois par semaine pendant les 2 premières semaines, puis 2 à 3 fois par semaine ensuite. Chaque image dure une dizaine de minutes. Concernant les études des nouveaux ligands ils seront injectés dans la veine de la queue dans les souris endormies. L'imagerie tomographique par Emission de Positon (TEP/CT) dure ensuite de 2h à 4h.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pour les souris sont principalement le stress causé par la capture, l'implantation des cellules tumorales en orthotopique (cellules implantées dans l'organe dont elles sont issues), les injections en intraveineux (I.V) et intrapéritoneale (I.P) des molécules, les anesthésies répétées, ainsi que le développement de la tumeur chez l’animal. Les nouveaux outils de diagnostic peuvent (éventuellement) causer des effets secondaires observés post-administration comme des chocs immunitaires (anaphylactique), des réactions allergiques, des détresses cardio-respiratoires et des troubles comportementaux.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour caractériser ex-vivo les tumeurs.
Remplacement
Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos molécules d'imagerie ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement en mesurer le bénéfice.
Réduction
Le nombre total de souris pour cette étude s'élève à 480 souris, 200 souris pour la procédure 1 et 280 souris pour la procédure 2. Il tient compte du suivi des modèles expérimentaux développés dans le projet et de la variabilité de développement des tumeurs qu’il peut exister dans les différents modèles. L’optimisation de nos ligands in vitro nous permet aussi de limiter le nombre d’individus au sein de chaque procédure.
Raffinement
La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et/ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal. Nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Dès leur arrivé les souris sont placées dans une pièce cyclée (12h/12h), insonorisée, portoir ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), un maximum de 5 individus par cage, litières (copeaux de bois) et alternance d'enrichissement, dômes, tubes, fibres pour faire des nids. De plus les conditions d'hébergements sont adaptées à leur phénotype d'immunodéficience. Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Une personne compétente (formation en expérimentation animale + chirurgie) réalisera les injections des cellules tumorales qui se feront sous anesthésie gazeuse. Une observation hebdomadaire des animaux (poids, douleurs/souffrance) sera faite ainsi qu'une surveillance du volume des tumeurs par imagerie fluorescente/bioluminescente. Toute perte de poids (sur la durée d'expérimentation le poids de la tumeur représente moins de 2% du poids de la souris), signe de douleur (analgésiques prévus en cas de nécessité) ou souffrance notable (cardiaque, respiratoire) de l'animal éveillé après anesthésie ou au cours du développement tumoral constituera un point d'arrêt.
Choix des espèces
- Facilité d'utilisation en général, espèce immunodéficiente comme modèle in vivo, pour faciliter la mise en place et la prise de tumeurs solides (facilité et maîtrise de l’injection, déficience du système immunitaire), ainsi que pour le suivi de leur croissance. Il s'agira d'adultes âgés de 6 semaines au moment de l’implantation de la lignée tumorale et 10 à 12 semaines au moment du traitement (injection du candidat imagerie) en fonction de la taille des tumeurs. - Modèle d’injection de lignées tumeurs en sous-cutanée bien décrit dans la littérature et déjà utilisé dans le passé par des membres du laboratoire ou membres du projet collaboratif.
Etude de la biodisponibilité et biodistrubution de la clusterine libre et complexée chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit une seule injection dans la veine de la queue, sous anesthésie gazeuse, avant d'être tuée pour le prélèvement d'organes à l'un des douze temps prévus par le plan expérimental. L'enjeu est de savoir où va et combien de temps circule une protéine radiomarquée, la clusterine, développée comme candidat médicament contre le sepsis. Le porteur écrit à deux reprises que cette molécule "répond à un besoin médical non satisfait", là où le projet se limite à mesurer une biodisponibilité chez des souris saines.
Objectifs
Ce projet regroupe une partie des études de recherche et développement qui seront conduites chez la souris pour déterminer où et pour combien de temps la molécule étudiée, la clusterine radiomarquée, circule suite à son injection. La clusterine est en cours de développement pour des applications thérapeutique de pathologies caractérisées par une mort cellulaire massive, tels que le sepsis et répond à un besoin médical non satisfait dans ce domaine. Cette étude est essentielle pour affiner l’efficacité de cette molécule et, ne pouvant être testée in vitro, le recours aux modèles animaux est donc nécessaire.
Bénéfices attendus
Ce travail ouvre des perspectives thérapeutiques pour le traitement avec la clusterine des pathologies associées avec une mort cellulaire massive et répond à un besoin médical non satisfait dans ce domaine.
Procédures
Les souris recevront une injection intraveineuse dans la veine caudale (durée 2minutes) sous anesthésie sans traumatisme et sans douleur.
Impact sur les animaux
La procédure d’injection de la CLU seule ou complexée radiomarquée en intraveineuse n’induisent pas d’inconfort de l’animal ni de modification de son état général, cependant nous envisageons l’anesthésie gazeuse pour faciliter l’expérimentation et limiter des biais liés à celle-ci.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour prélèvement d'organes post mortem.
Remplacement
Des approches in vitro sur de cellules murines et humaines ont été effectués pour déterminer l’efficacité du radiomarquage. Pour réaliser ce projet, la biodisponibilité et la biodistribution de la clusterine seule et complexée seront évaluées chez la souris, car c’est l’espèce la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments. A ce jour, aucun modèle alternatif (moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour permettre de reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques qui sont impliqués dans les mécanismes de dégradation, de transport et d’élimination des composés susceptibles d’affecter l’activité des molécules. C’est pour cette raison, qu’une approche in vivo est nécessaire pour déterminer la biodisponibilité des nouveaux candidats-médicaments avant de poursuivre leur développement.
Réduction
Le projet sera réalisé sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux. Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude a été défini en fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement interprétables et fiables. Le calcul d’effectifs a été réalisé avec un logiciel specifique. Deux groupes de souris seront évalués. En considérant pour chaque groupes 12 temps et 6 souris (dont 3 mâles et 3 femelles), 72 souris par groupe seront utilisées, pour un total de 144 souris nécessaires à ce projet.
Raffinement
Afin de tenir compte des besoins quotidiens des animaux et d’améliorer leur bien-être, les souris bénéficieront d'une période d'acclimatation de 7 jours avant toute manipulation, auront une nourriture adaptée, de l’eau de boisson à volonté et seront stabulées en groupe de 3. Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce (en cage en portoir ventilé) avec un enrichissement du milieu (cabanes, papier, tunnel, tubes en carton, morceau de bois). Le protocole expérimental comprend un suivi quotidien des animaux, des indicateurs comportementaux (fuite ou défense a la manipulation) et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, terne, suivi pondéral de l’animal) qui seront évalués, et constitueront les points limites de l’expérience (euthanasie de l’animal). Lors de l’injection intraveineuse et de l’euthanasie par élongation cervicale, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie pour ces études est la souris de type sauvage, lignée de souris dans laquelle la clusterine a été utilisée précèdemment. Les souris utilisées seront âgées de 6 à 10 semaines, jeunes adultes.
Etude des effets d’un facteur de croissance sur le muscle de la souris âgée.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
Six semaines de probiotiques dans l'eau de boisson, deux passages en tube de contention pour mesurer la composition corporelle, un test d'agrippement de quatre-vingt-dix secondes sur une grille retournée : 30 souris âgées de 21 mois vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le jour de la mise à mort, elles reçoivent un antidouleur sous la peau puis, trente minutes plus tard, un mélange d'anesthésiques dans l'abdomen avant un prélèvement sanguin, et sont tuées dans la foulée. Aucune n'est gardée vivante, les tissus étant collectés puis stockés pour des questions à venir. Le porteur justifie l'effectif par quinze souris par groupe et annonce que "cette procédure utilisera 45 animaux", quand le projet en déclare 30.
Objectifs
Le but du projet est d’étudier la capacité de probiotiques (bactéries non pathogènes) à transmettre la séquence ADN d’une molécule d’intérêt aux cellules de l’intestin de souris âgées, puis la capacité de ces cellules à produire la molécule d’intérêt, et enfin la capacité de celle-ci à agir sur les muscles des souris âgées pour augmenter leur masse musculaire et leur force musculaire.
Bénéfices attendus
Seuls les travaux menés précédemment chez des souris obèses ont permis une première validation des capacités de la molécule d’intérêt à augmenter la masse musculaire dans un modèle animal de sarcopénie. Si les résultats de cette étude chez les souris âgées sont positifs cela permettra de confirmer ces premières données et ainsi renforcer le potentiel de cette molécule comme candidat pour la prise en charge de la sarcopénie. Un essai clinique chez la personne âgée pourra ensuite être sérieusement envisagé. Ceci constitue une avancée non négligeable dans le domaine car il n’existe à l’heure actuelle aucune solution thérapeutique pour les personnes âgées atteintes de sarcopénie.
Procédures
Les 30 souris recevront des probiotiques dans l’eau de leur biberon (durée= 6 semaines). Deux analyses de la composition corporelle des 30 souris seront réalisées (souris vigiles, contention dans un tube placé dans l’appareil de mesure pendant moins de 2 minutes par souris). Une mesure de la force musculaire des 30 souris sera réalisée grâce à un test d’agrippement (souris vigiles se déplaçant librement sur une grille inversée pendant 90 secondes maximum). Avant la mise à mort, les 30 animaux recevront un antidouleur par injection sous la peau (durée=30 sec contention comprise/animal) puis trente minutes plus tard un mélange d’anesthésiques par une injection dans l’abdomen (durée=30 sec contention comprise/animal) pour effectuer un prélèvement sanguin (20 secondes). Toutes les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement (2 secondes).
Impact sur les animaux
Cette procédure entraînera des nuisances légères sur les animaux. La mesure de la composition corporelle et le test de force musculaire entraîneront un léger stress chez les animaux. Les injections d’antidouleur et d’anesthésiques nécessaires pour le prélèvement de sang final peuvent générer une douleur et un stress chez l’animal. Aucun effet néfaste lié à l’ingestion des probiotiques n’est attendu.
Devenir
Les 30 animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Le but du projet est d’étudier la capacité des probiotiques à transmettre les séquences ADN aux cellules de l’intestin des souris, puis la capacité de ces cellules à produire la molécule d’intérêt, et enfin la capacité de celle-ci à agir sur les muscles des souris âgées. Il s’agit d’une problématique complexe impliquant une cascade d’évènements et la communication entre plusieurs organes. Aucune alternative non animale n’est disponible pour répondre à une telle problématique. Ainsi ce projet requiert l’utilisation d’animaux vivants. Il est important de mentionner que la molécule d’intérêt a été testée en amont sur des cellules de muscle en culture afin de valider ses propriétés.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Il est basé sur des études précédentes chez des souris injectées avec une molécule similaire. Pour observer une différence significative dans la taille des muscles, compte tenu de la variabilité et de la fragilité des muscles, il faut compter 15 souris/groupe. Cette procédure utilisera 45 animaux. Un maximum de tissus seront récoltés lors de la mise à mort des animaux puis stockés. Ces tissus seront disponibles pour répondre à d’autres questions qui pourront émerger ou pourront être partagés avec d’autres équipes. Cela permettra de ne pas répéter inutilement l’expérience.
Raffinement
L’état général des animaux et leur comportement seront étroitement observés 3X/semaine. Les animaux seront pesés 1X/semaine. La prise alimentaire sera contrôlée 1X/semaine également. Les probiotiques seront administrés dans l’eau de boisson et non par gavage pour éviter manipulation quotidienne, stress et douleur liés au gavage. Afin de limiter le stress des animaux au cours de la mesure de la composition corporelle et du test de force musculaire, les tests seront réalisés le matin (l’après-midi l’animalerie est plus calme et les animaux sont donc beaucoup plus enclins à dormir que le matin) et les animaux seront amenés dans la salle d’expérimentation 30 minutes avant les mesures et seront immédiatement replacés dans leur cage d’hébergement dès la fin des mesures. Pour limiter encore d’avantage le stress induit par la mesure de la composition corporelle, le temps nécessaire sera laissé à chaque animal pour qu’il entre volontairement dans le tube d’analyse. Une injection d’antidouleur puis une injection d’anesthésiques seront réalisées en amont du prélèvement de sang final pour éviter toute douleur. Tous les animaux seront immédiatement mis à mort à la suite du prélèvement de sang. Surveillance des animaux, pesées et tests fonctionnels seront réalisés uniquement par deux personnes pour limiter le stress. Des points limites suffisamment précis, prédictifs et précoces ont été définis afin d’éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Les connaissances relatives aux effets des probiotiques chez la souris ainsi qu’aux effets d’une molécule similaire sur le muscle de la souris font de cette espèce un modèle de choix pour répondre à la question posée. La physiologie de la souris âgée étant proche de celle de l’Homme sur plusieurs aspects (sarcopénie, ostéoporose, ralentissement du métabolisme), utiliser la souris âgée dans ce projet permettra d’obtenir des informations importantes pour transférer la technologie chez l’Homme dans un essai clinique. L’administration des probiotiques sera réalisée chez des souris âgées de 21 mois. A ce stade, les souris présentent une sarcopénie marquée et constituent donc un modèle idéal pour étudier les effets de la molécule sur le muscle et la force musculaire et évaluer son potentiel à être utilisée en clinique chez des personnes âgées présentant une sarcopénie.
Evaluation d’une thérapie génique basée sur l’utilisation d’un lentivirus dans le modèle souris de la glycogénose de type 3
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
Les souris utilisées portent la glycogénose de type III, une maladie qui leur vaut à l'âge adulte une faiblesse musculaire et une fibrose du foie évoluant, dans un tiers des cas, vers des tumeurs. 522 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit une biopsie de la queue pour le génotypage, une injection intraveineuse du vecteur viral sous contention ou sous anesthésie selon l'âge, puis un prélèvement sanguin mensuel par voie mandibulaire. Le foie devant être analysé pour mesurer la correction apportée par la thérapie génique, aucune souris n'est gardée vivante.
Objectifs
La glycogénose de type III (GSDIII), également connue sous le nom de maladie de Forbes-Cori, est un trouble génétique rare qui affecte la façon dont notre corps stocke et utilise le glucose, qui est le principal carburant de notre corps. Normalement, le corps stocke du glucose sous forme de glycogène, une sorte de réservoir d'énergie, pour pouvoir l'utiliser lorsqu'il en a besoin, comme lorsqu'on fait de l'exercice ou on saute un repas. Dans la GSDIII, il y a un problème avec une enzyme spéciale, appelée GDE, qui aide à décomposer ce glycogène en glucose pour que le corps puisse l'utiliser. Sans cette capacité à bien décomposer le glycogène, le corps manque d'énergie au moment où il en a besoin. Le glycogène s'accumule alors de façon anormale dans les muscles et le foie, conduisant à une faiblesse musculaire et des problèmes hépatiques. Il n’existe pas de traitement permettant de guérir cette maladie. Notre projet est de corriger l’atteinte hépatique de cette maladie, grâce à l’utilisation d’un virus modifié, pour transporter le gène de la GDE jusqu’aux cellules du foie, afin qu’elles soient de nouveau capable de fabriquer cette GDE et d’utiliser le glycogène comme énergie. Avant qu’une telle stratégie ne puisse être utilisée pour traiter des malades, il est indispensable de tester son pouvoir thérapeutique sur le modèle animal de la GSDIII, ici la souris. Ce projet décrit les procédures expérimentales qui seront réalisées chez ces souris afin de déterminer l’efficacité du virus médicament. Dans un plus long-terme, une optimisation devra lui être apporter, afin de traiter en même temps le foie et les muscles.
Bénéfices attendus
Une des limites majeures pour le traitement de l’atteinte hépatique dans la GSDIII est le développement progressif de fibrose et la dégénerescence des cellules du foie au cours du temps. Notre projet peut répondre à cette problématique grâce à une stratégie thérapeutique basée sur l’utilisation d’un virus médicament intégratif pour transporter le gène manquant jusqu’aux cellules du foie. En effet, le gène transporté par ce type de virus s’intègre dans l'ADN de la cellule cible et permet ainsi une expression stable au cours du développement cellulaire, un réel avantage pour corriger à long-terme le défaut héptatique dans GSDIII, en particulier chez les patients pédiatriques, dans lesquels le foie subit une forte croissance.
Procédures
La gestion de l'élevage des souris GSDIII nécessite une biopsie (queue) afin de confirmer le défaut génétique des souris qui entreront en protocole ( réalisé une fois par animal, geste qui dure moins d'une minute). Ce projet décrit l'évaluation d'un traitement injecté par voie intraveineuse, sur animal vigile, placé sous contention: 1 seule injection par animal, ce geste dure 1 minute. Un bilan sanguin mensuel sera réalisé ches les souris, grâce à un prélèvement réalisé sous anesthésie générale (ce geste dure 1 minute)
Impact sur les animaux
Les souris GSDIII présentent à l'âge adulte une faiblesse musculaire, mais pas de difficulté motrice évidente ni essoufflement. Ces souris sont capables de s’alimenter et de se déplacer normalement. Elles développent, également à l'âge adulte une fibrose hépatique, pouvant entrainer, dans un tiers des cas, des tumeurs, vers l'âge de 14-15 mois. Nous utilisons des virus médicaments non dangereux et à des doses non toxiques, de ce fait aucune toxicité n’est attendue. Seuls les gestes techniques pourront provoquer d'eventuelles nuisances aux souris. Ces gestes comprennent une biopsie de la queue pour confirmer le défaut génétique, l’injection du virus (intraveineux) ainsi que de prélèvements sanguins mensuels. Ces actes de gravité légère seront réalisés à l’aide d’outils appropriés et auront des répercussions mineures pour l’animal.
Devenir
Afin de pouvoir évaluer la correction de la glycogénose de type III grâce au virus médicament, le foie doit être prélevé et analysé. Tous les animaux seront donc euthanasiés à l'issue de chaque procédure afin de pouvoir récupérer cet organe.
Remplacement
Afin de sélectionner le virus médicament le plus performant, l’idéal serait de pouvoir le tester sur des cellules. Néanmoins, une fois dans l’organisme, le virus doit échapper au système immunitaire, traverser la paroi des vaisseaux sanguins et pénétrer dans le foie afin d’apporter le gène manquant. Malheureusement, ces étapes ne sont pas encore réalisables dans des cellules. Il est donc indispensable de devoir recourir à des animaux pour se rapprocher le plus possible de ce qu’il se passera chez l'humain.
Réduction
Afin d’utiliser un minimum d’animaux, nous avons utilisé une approche statistique nous permettant de définir le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir un résultat fiable nous permettant de répondre aux problématiques posées. De plus, des analyses post mortem seront effectuées sur les tissus de tous les animaux afin de s'assurer que le maximum d'informations possible est recueilli sur chaque animal.
Raffinement
Les souris utilisées lors de ce projet ne présentent pas de signes de douleurs évidents. En cas de biopsies à la queue, l'hémostase sera vérifiée en appliquant une pression sur la partie coupée de la queue avec de la gaze jusqu’à ce que le saignement se soit arrêté. L'animal sera ramené dans sa cage et surveillé pendant au moins 5 minutes pour détecter la réapparition d'éventuels saignements. Pour réaliser les injections par voie intraveineuse, les souris seront positionnées sous une source chaude pour favoriser la vasodilatation des veines. Selon l'âge des souris, elles seront réalisées dans la veine temporale, sous anesthésie (souriceaux) ou dans la veine de la queue sur animal vigile (adultes). Ces voies d’administration ont été choisies pour leur efficacité et leur rapidité. Ces injections seront réalisées lentement pour éviter toute augmentation brutale de la volémie. Un éventuel saignement sera stoppé par l’application d’une compresse au niveau du point d’injection. Après l’injection des différents vecteurs, les souris seront surveillées pour vérifier l’absence de signes de souffrance (souris prostrée, diminution d’activité locomotrice spontanée, poil piqué). Dès les premiers signes de souffrance, la souris sera pesée et surveillée quotidiennement. En absence d’amélioration sur une semaine, ou en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial, la souris sera euthanasiée. Les prélèvements de sang mensuels seront réalisés par voie mandibulaire, sous anesthésie gazeuse (Isoflurane).
Choix des espèces
Les souris atteintes de la glycogénose de type III présentent les différentes caractéristiques de la pathologie observée chez l’humain. C’est un modèle validé par la communauté scientifique, prédictif de l’efficacité du traitement qui sera utilisé en clinique. Par conséquent, nous allons optimiser notre traitement dans cette espèce animale. Pour répondre à notre objectif, les souris seront traitées à différents stade de sévérité de la maladie (de la naissance à l’âge adulte), afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique de notre vecteur. Nous souhaitons comprendre si ce traitement sera capable de (i) prévenir la maladie chez les plus jeunes souris (traitement avant l’apparition de fibrose) et maintenir une correction sur le long-terme malgré la croissance du foie, et (ii) corriger la pathologie chez les souris plus âgées et donc plus sévèrement atteintes (traitement de foies fibrotiques).
Impact thérapeutique de l’administration de probiotiques humains sur le développement de la maladie inflammatoire aiguë du rejet du greffon chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Tuées à la fin de chaque procédure pour que leurs organes soient étudiés, 742 souris vont être utilisées, dont 672 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les trois quarts sont irradiées puis reçoivent une greffe de moelle osseuse par injection rétro-orbitaire sous anesthésie, et les trois quarts sont gavées à la sonde, vigiles. Une réaction inflammatoire du système digestif est attendue, avec des injections de morphinique déclenchées selon le score obtenu à la grille de points limites. Sur l'effectif, le porteur écrit avoir réduit le nombre de souris "au minimum (n=5)", sans expliquer comment ce chiffre conduit aux 742 animaux déclarés.
Objectifs
Une modification du microbiote (flore bactérienne) a été reportée au cours de maladies inflammatoires intestinales aigues. Afin de lutter contre l’émergence de bactéries multirésistantes, il a été montré un très fort intérêt dans la modulation de cette flore par une approche de transplantation fécale du microbiote (en lieu et place de l’utilisation d’antibiotiques). L’enrichissement du microbiote en certaines espèces bactériennes est associé à une diminution des symptômes inflammatoires dans l’intestin. L’objectif du projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique (anti-inflammatoire) de probiotiques dans la souris dans le contexte d’une maladie inflammatoire aiguë.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont : - une meilleure compréhension du rôle du microbiote dans les maladies inflammatoires - l’identification d’espèces bactériennes utilisées comme probiotiques pour le contrôle des maladies inflammatoires. - la détermination de cocktail(s) de bactéries comme médicaments potentiels.
Procédures
Trois-quarts des animaux seront soumis à une irradiation (de quelques minutes) suivie d’une reconstitution en moëlle osseuse par voie (IV) intraveineuse rétro-orbitaire sous anesthésie générale. Afin d’éviter le stress et la potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, nous réaliserons une injection sous cutanée de morphinique juste avant le geste. Trois-quarts des animaux recevront une administration par voie orale (gavage). Ce geste est réalisé sur animaux vigiles avec une sonde de gavage de 24 gauge solide. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanée (SC) de morphinique pourraient être réalisées sur animaux vigiles. Tous les gestes IV, SC, gavage sont très rapides et ne durent au maximum que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pour les animaux sont une réaction inflammatoire modérée du système digestif avec une modification de l’aspect et de la composition des selles. Le modèle d’irradiation avec reconstitution de moelle osseuse est un modèle expérimental modéré sans développement de pathologies. Du stress et une potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, peuvent être observés.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin d’étudier leurs organes.
Remplacement
Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indispensable. Les multiples interactions entre types cellulaires différents et le microbiote nous oblige à utiliser les modèles animaux pour appréhender ces phénomènes dans leur globalité. Des études in vitro /bio-informatique ont été réalisées en amont de ce projet afin d’identifier un panel d’espèces bactériennes candidates pour la réalisation des cocktails de probiotiques.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=5) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites a été mis en place. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de morphinique seront réalisées. Afin d’éviter le stress et la potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, nous réaliserons une injection sous cutanée de morphinique juste avant le geste.
Choix des espèces
L’humanisation des souris avec un microbiote (flore intestinale) humain est un très bon modèle préclinique, donnant des résultats pouvant être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance. Les animaux utilisés au cours de ce projet auront entre 7 et 14 semaines de vie. A ce stade, le système immunitaire est mature.
Régulation de l’expression de PABPN1 dans le muscle squelettique de souris dystrophiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Pour comprendre comment une protéine impliquée dans la maturation des ARN messagers est régulée dans le muscle, 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Réparties en trois lots de 140, elles reçoivent une injection intramusculaire, une injection intraveineuse, ou deux injections suivies d'un transfert de gène localisé, chaque fois sous anesthésie. Le jour de la mise à mort, une mesure de contractilité musculaire de quinze minutes est pratiquée sous anesthésie, sans réveil, avant les prélèvements. Le porteur indique que les deux muscles tibialis antérieurs sont injectés chez chaque animal pour réduire l'effectif, et que toute souris montrant un signe de détérioration de sa santé est tuée immédiatement.
Objectifs
Une expansion anormale d’acides aminés dans une protéine impliquée dans la maturation des ARN messagers cause une maladie génétique musculaire appelée la dystrophie musculaire oculopharyngée (OPMD, prévalence de la pathologie 1/100 000 personnes en Europe). Le niveau de cette protéine est très bas dans le muscle mais très peu de choses sont connues concernant la régulation de cette protéine dans le muscle. Ce projet consiste à étudier sa régulation dans le muscle squelettique in vivo. Dans ce projet, nous modulerons plusieurs facteurs décrits comme régulateurs de cette protéine, afin d’étudier leurs effets sur l’expression de la protéine dans le muscle in vivo. Cette étude permettra de mieux comprendre sa régulation et d’envisager des approches thérapeutiques pour prévenir et limiter les conséquences de l'atteinte musculaire de l'OPMD.
Bénéfices attendus
L’étude de la régulation de l’expression d’une protéine mutée dans la dystrophie musculaire oculopharyngée (OPMD, prévalence de la pathologie 1/100 000 personnes en Europe) nous permettra de trouver des solutions pour restaurer un niveau fonctionnel suffisant de cette protéine dans les muscles atteints dans la maladie. Le bénéfice attendu est l’arrêt ou la diminution de la progression de la maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis à trois interventions réalisées sous anesthésie. Le lot1 (140 animaux) sera soumis à une injection intramusculaire (sous anesthésie). Il s'agit d'une intervention de très courte durée (l'injection elle même ne dure que quelques secondes et la manipulation de la souris ne demande que quelques minutes). Les souris sont ensuite replacées dans leur cage d'origine. En fin de procédure, le jour de l'euthanasie, les souris sont soumises à une mesure in situ de la contractilité (acte sans réveil effectué sous anesthésie et sous analgésie) d’une durée de 15 minutes suivie de l'euthanasie e et des prélèvements. Le lot2 (140 animaux) sera soumis à une injection intraveineuse (sous anesthésie). Il s'agit également d'une intervention de très courte durée (l'injection elle même ne dure que quelques secondes et la manipulation de la souris ne demande que quelques minutes). Les souris sont ensuite replacées dans leur cage d'origine. En fin de procédure, le jour de l'euthanasie, les souris sont soumises à une mesure in situ de la contractilité (acte sans réveil effectuée sous anesthésie et sous analgésie) d’une durée de 15 minutes suivie de l'euthanasie et des prélèvements. Le lot3 (140 animaux) sera soumis à deux injections intramusculaires (sous anesthésie), suivi par un transfert de gène localisé dans le muscle (sous anesthésie et sous analgésie). Il s'agit également d'une intervention de très courte durée (l'injection elle même ne dure que quelques secondes et la manipulation de la souris ne demande que quelques minutes). Les souris sont ensuite replacées dans leur cage d'origine. En fin de procédure, le jour de l'euthanasie, les souris sont soumises à une mesure in situ de la contractilité (acte sans réveil effectuée sous anesthésie et sous analgésie) d’une durée de 15 minutes suivie de l'euthanasie et des prélèvements.
Impact sur les animaux
Dans notre projet, nous injectons des AAV (virus adéno-associés) en intramusculaire (dans le muscle tibialis anterior) et en systémique (dans la veine de la queue) et nous réalisons un transfert de gène localisé dans le muscle. L'effet indésirable qui peut se produire sur les animaux est une inflammation/infection de la peau au site d’injection, l'animal pourrait alors ressentir une douleur locale au niveau du site d'injection. Lors des anesthésies effectuées pour l'ensemble des gestes techniques, les risques/contraintes peuvent être les suivants: effets sur les variables physiologiques (température, tension, oxygénation) pendant l'anesthésie. Après la mesure de la contractilité du muscle squelettique réalisée sous anesthésie/analgésie (durée d'environ 15 minutes), les animaux sont euthanasiés avant la fin de l'anesthésie générale afin d'éviter tout effet indésirable ou douleur.
Devenir
Tous les animaux des procédures sont euthanasiés à la fin de chaque procédure. L’analyse des muscles injectés et des autres organses (foie, etc) est indispensable pour ce projet. L'euthanasie de l’ensemble des animaux est donc requise
Remplacement
L'expression d’une protéine impliquée dans la maturation des ARN messagers dans le muscle squelettique est étroitement contrôlée. Les modèles de culture in vitro disponibles ne permettent pas de récapituler la complexité présente in vivo et ne permettent pas d’arriver à une maturation comparable à celle in vivo justifiant le choix d’utilisant la souris comme modèle
Réduction
Chaque groupe sera constitué de 10 animaux pour obtenir des résultats statistiques. Dans le respect de la règle des 3R, une première série d’ expériences sera réalisée sur 5 souris. Le nombre sera incrémenté exclusivement si besoin. En outre, afin de réduire le nombre de souris utilisées (dans le respect de la règle des 3R) pour chaque souris nous injecterons le muscle Tibialis Anterior de la patte gauche et de la patte droite. Au maximum un total de 420 souris seront utilisées dans ce projet. Des études préliminaires ont montré la faisabilité de cette approche (il n’y a pas d’interférence expérimentale entre l’injection de deux Tibialis Anterior). Afin de comparer les groupes de sujets, nous réaliserons une analyse statistique.
Raffinement
Pour le raffinement, les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons ou tunnel en carton ou carré de coton compacté. Suite à l’acte chirurgical, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant toute la durée de l’expérience afin de déceler des signes de douleur. Pour les injections en intramusculaire et en systémique, les souris sont anesthésiées. Les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la perte de poids, des plaies au site d’injection, une croissance excessive des dents seront évalués régulièrement. Les animaux qui montrent un signe quelconque de détérioration de leur santé seront euthanasiés immédiatement.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus commun utilisé dans des études de régénération musculaire et de compréhension des mécanismes physiopathologique du muscle squelettique. Nous utiliserons des souris d’âge adulte (8-40 semaines) : cela nous permettra d’analyser les changements de la régulation de notre protéine d’intérêt en modulant des protéines décrites dans la littérature comme ses régulatrices, dans un environnement contrôle adulte.
Analyse de l’effet de vésicules extracellulaires modifiées sur la croissance tumorale et les réponses immunes.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Des cellules tumorales leur sont injectées, puis la tumeur est mesurée au pied à coulisse une à deux fois par semaine. Jusqu'à 14 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent deux injections de traitement par semaine pendant neuf semaines, une injection de produit d'imagerie dix minutes avant chaque séance, et un prélèvement sanguin sous anesthésie toutes les deux semaines, l'objet du projet étant de tester des vésicules extracellulaires modifiées comme piste d'immunothérapie. Le porteur décrit pourtant des modèles qui "nécessitent un minimum d'intervention" et ne demandent "pas l'administration d'anti-douleurs", chez des souris porteuses de tumeurs pendant neuf semaines.
Objectifs
Le cancer est actuellement la deuxième cause principale de décès à l'échelle mondiale. L'immunothérapie a révolutionné le traitement de certains patients mais dans environ 70% des cas, cette approche s’avère inefficace. Pour améliorer les traitements, il est essentiel de comprendre comment le cancer communique avec notre système immunitaire. Une partie de cette communication se fait via de petites vésicules lipidiques appelées "vésicules extracellulaires", porteuses d’informations génétiques et protéiques, sécrétées par les cellules tumorales mais aussi les cellules du microenvironnement tumoral. Elles peuvent moduler la croissance des tumeurs, notamment en interagissant avec la surface des cellules immunitaires ou après capture par ces mêmes cellules. Il existe une grande variété de vésicules, certaines semblent aider le cancer à se développer en empêchant le système immunitaire de reconnaître le cancer, alors que d’autres semblent aider l’organisme et son système immunitaire à se débarrasser du cancer. Il est nécessaire de comprendre quelles vésicules renferment l’activité anti-tumorale et quelles vésicules contiennent l’activité pro-tumorale, afin de pouvoir créer de nouveaux traitements anti-cancéreux efficaces. De récentes études ont montré qu’on peut changer la composition des vésicules extracellulaires en modifiant les cellules qui les sécrètent. Nous avons identifié quelques molécules cibles ou produits pharmacologiques, qui changent les propriétés des vésicules extracellulaires in vitro, en particulier quand elles interagissent avec des cellules du système immunitaire. Nous devons donc évaluer l’effet in vivo de ces vésicules modifiées ou de leur sécrétion in situ sur la croissance des tumeurs et leur reconnaissance, voire leur destruction par le système immunitaire. L’objectif de ce projet est de caractériser un nouveau mode de communication entre les cellules cancéreuses et le système immunitaire pour identifier des vésicules extracellulaires capables de diminuer la croissance et la progression des tumeurs. Il pourrait ouvrir la voie au développement de futures thérapies anticancéreuses utilisant ces vésicules modifiées ou leur sécrétion locale.
Bénéfices attendus
Le cancer est la seconde cause de décès dans le monde, malgré les récentes innovations thérapeutiques. Les immunothérapies visant à reprogrammer le système immunitaire contre le cancer présentent une efficacité spectaculaire chez certains patients, mais très variable et le bénéfice n’est observé que sur un nombre limité de patients. Il est donc essentiel de développer de nouvelles approches ou combinaisons d’approches pour bénéficier à un plus grand nombre de patients. Les vésicules extracellulaires permettent une communication entre les cellules tumorales et le système immunitaire, et peuvent aussi interférer avec les traitements d’immunothérapies. Ce projet étudie l’utilisation de vésicules extracellulaires modifiées par les chercheurs, comme nouveaux outils de thérapie anti-tumorale, permettant d’augmenter l’activité du système immunitaire contre les cellules cancéreuses. Il découle de résultats obtenus in vitro à l'aide notamment de lignées cellulaires en culture. Avant d'envisager toute application clinique ou thérapeutique chez l'Homme, l’étude de ce processus dans un modèle de tumeur in situ chez la souris est une étape cruciale. Nous prévoyons d'atteindre ces objectifs dans les cinq prochaines années. Les résultats que nous recueillerons grâce à ce projet peuvent ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques utilisant la modification de la sécrétion des vésicules extracellulaires par les chercheurs, seule ou en combinaison avec d’autres traitements.
Procédures
Des cellules tumorales seront injectées aux souris vigiles (1 fois par expérience – durée du geste inf à 10 sec). Les animaux seront suivis, à raison de 1 à 2 fois par semaine soit sur animaux vigiles pour mesurer la tumeur au pied à coulisse soit par imagerie sur animaux anesthésiés (durée de l’anesthésie 10 min). Dix minutes avant chaque séance d’imagerie, les animaux seront injectés avec un produit spécifique pour l’imagerie (durée du geste inf à 10sec) Certains animaux recevront également des traitements par injection à raison de 2 fois par semaine pendant 9 semaines maximum (durée du geste inf à 10 sec) ou à raison de 2 injections au cours de l’expérience (9 semaines max) (durée du geste inf à 10 sec) Un prélèvement sanguin est effectué une fois toutes les 2 semaines sur les animaux anesthésiés(durée de l’anesthésie inf à 5 min).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors des injections de cellules tumorales seront celles liées à injection elle-même (gêne de courte durée et de faible intensité due à l’introduction d’une aiguille). Suite à ces injections les animaux développeront des tumeurs. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection elle-même (gêne de courte durée). Ces types de traitement n’induisent pas d’effets secondaires négatifs connus. Pour le suivi des réponses immunitaires, des prélèvements sanguins pourront être effectués. Ces prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux anesthésiés pour réduire le stress lié à la contention et la douleur liée à la piqûre elle-même.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide de lignées cellulaires en culture, ayant permis la caractérisation des vésicules extracellulaires modifiées et de leur mode d’interaction avec les cellules cibles, tumorales et immunitaires. Le projet, ayant pour objectif final d’identifier des traitements ciblant les vésicules extracellulaires permettant l’activation des réponses immunes anti-tumorales, nécessite l’utilisation d’un modèle préservant la complexité de la composition du tissu tumoral, notamment de l’infiltration des cellules immunitaires, et de l’organisme entier. A notre connaissance, aucun modèle in vitro (co-culture, organoïde) ou in silico ne peut se substituer à un modèle animal. Le modèle murin est le plus adapté compte tenu de l’organisation de son système immunitaire, proche de celle de l’Homme.
Réduction
1. Nous utiliserons de façon générale 10 souris par groupe expérimental. Ce nombre prend en compte la variabilité intrinsèque à nos modèles, notamment le taux d’obtention de tumeur suite à l’injection de cellules tumorales. Il se base aussi sur nos connaissances de ces modèles tumoraux et de leur cinétique et variabilité de développement. Les lignées tumorales modifiées pour sécréter des vésicules extracellulaires différentes, et l’absence de conséquence directe sur la multiplication des cellules ont toutes été validées in vitro. 2. le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe sera défini à l’aide d’outils statistiques. 3. Pour chaque procédure et chaque molécule, 2 expériences montrant une absence d’effet sur la croissance tumorale seront utilisées comme point d’arrêt de l’expérience, afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. 4. Si les 2 premières modifications testées s’avèrent avoir l’effet recherché, nous ne continuerons pas avec les autres molécules. Le nombre total d’animaux utilisés sera réduit de 14160 (nombre maximum) pour 5 molécules testées à 7446 pour 2 molécules.
Raffinement
Les modèles développés pour ce projet nécessitent un minimum d’intervention sur les souris, réduisant le stress et la douleur potentielle, et ne nécessitent pas l’administration d’anti-douleurs. Les animaux greffés seront contrôlés deux à trois fois par semaine afin de vérifier que le développement de la tumeur n’ait pas d’effet notable sur le bien-être général, ni sur leur poids (en prenant en compte le poids additionnel de la tumeur). Une grille de score sera utilisée pour évaluer leur état de manière objective. Si un état général compromis est observé, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Comparé à d’autre modèles animaux, la souris est le modèle de choix pour les recherches en immunologie et cancérologie pour sa proximité avec l’homme, et nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris. Les modèles de tumeurs transplantées sont de plus couramment utilisés chez cette espèce Les souris seront utilisées à l'âge adulte (8 à 16 semaines) afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.
Identification et caractérisation de molécules ciblant les récepteurs d’aryl hydrocarbone (AHR) chez le rongeur
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 200
2 440 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré pour les souris et menées sans réveil pour les rats. Les souris reçoivent des injections dans la veine du pénis ou de la queue, jusqu'à cinq anesthésies gazeuses et cinq séances d'imagerie de deux heures réparties sur cinq semaines. Les rats subissent une chirurgie de trente minutes pour la pose de cathéters dans la veine et l'artère fémorales, puis deux heures d'imagerie ponctuées de six prélèvements sanguins, sans jamais se réveiller. Le porteur écrit qu'après la sélection in vitro de dix molécules, il est "nécessaire" de les tester sur "l'animal vivant (organisme entier)", ni la barrière hémato-encéphalique ni la fonction d'entrée artérielle ne pouvant selon lui être modélisées autrement.
Objectifs
Récemment, l’étude de cette protéine s’est intensifiée car un dysfonctionnement de l’activité et de l’expression de cette protéine a été retrouvé en cancérologie (glioblastome, cancer du côlon, etc…) et dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Dans ces pathologies, cette protéine est fréquemment sur-exprimé et/ou sur-activé, ce qui fait de cette protéine une cible d’intérêt pour le développement de nouveaux radiotraceurs à visée thérapeutique et/ou diagnostique. In vitro, des tests d’activation et d’inhibition de cette protéine ont permis de sélectionner 10 molécules candidates. Ces molécules ont toutes la spécificité de pouvoir être marquées au fluor 18. Les résultats obtenus sont très encourageants. Il est maintenant nécessaire de les tester sur l’animal vivant (organisme entier) pour valider leur potentielle utilisation à visée diagnostique et/ou thérapeutique. La validation de l’utilisation d’une molécule candidate consiste à démontrer que cette molécule sera un outil performant permettant de quantifier l’expression de cette protéine .
Bénéfices attendus
Différentes études ont montré que cette protéine joue un rôle fondamental dans le développement et le fonctionnement de notre organisme. Plusieurs études ont montré que des dysfonctionnements liés à cette protéine étaient impliqués dans des maladies auto-immunes (polyarthrite rhumatoïde, lupus érythémateux), dans des maladies inflammatoires du tube digestif (maladie de Crohn, rectocolite hémorragique…), les pneumopathies obstructives chroniques, ou encore différents types de cancers . Disposer d’un radiotraceur permettant de quantifier cette proteine in vivo serait un atout important pour les patients atteints de ces maladies afin d’aider à l’amélioration de leur prise en charge. De même, de nombreuses équipes de recherche sont en cours de développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant cette protéine dans ces maladies. Dans ce contexte, disposer d’un traceur radioactif spécifique de cette protéine permettra de mieux caractériser les mécanismes d’action de ces médicaments et de définir les doses nécessaires à leurs potentiels effets thérapeutiques.
Procédures
Pour une expérimentation concernant l'injection d'un produit qui durera au total 125min: elle sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale (induction, maintien lors de l'injection) pendant 5 min sur des souris, injection dans la veine du pénis ou veine caudale 1 fois pendant 30 secondes. Pour une autre procédure concernant l'injection de 2 produits , d'une durée totale d'environ 150min , les souris auront 2 anesthésies gazeuses pendant 5 min lors de injection en intra-veineux (IV) (induction, maintien lors de l'injection) et injection en intraveineux 2 fois pendant 30 secondes à 20min d'intervalle. Pour l'expérimentation de l'imagerie: les souris auront 5 anesthésies gazeuses durant 130min à la fréquence d'une fois par semaine sur une durée totale de 5 semaines (induction, maintien pendant imagerie de l'animal) , 5 fois une pose de cathéter en intra-veineux, d'environ 10 min et ou 5 fois une injection intrapérionéale pendant 10 secondes et 5 imageries pendant 120min d'une fréquence 1 fois/semaine pendant 5 semaines. Pour la procédure des rats, cette expérimentation durera environ 2h30, elle sera réalisée une seule fois sur l'animal sous anesthésie générale. les animaux seront soumis à une chirugies d'environ 30 minutes pour la mise en place des cathéters à la veine et l'atrère fémoral. les rats seront ensuites imagés pendant 120 min. au cours de l'imagerie , des prélèvements sanguins seront réalisés pendant l'imagerie à 1min, 5 min, 15 min, 30 min, 60 min et 120 min).
Impact sur les animaux
La manipulation avant l'anesthésie entraine un léger stress chez l'animal. La contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Une douleur au point d’injection du radiotraceur ou de l’antagoniste peut-être ressentie jusqu’à la mise à la mort. Un hématome associé à une douleur au niveau de la queue à la pose ou au retrait du cathéter peut apparaitre. Une injection intrapéritonéale peut provoquer de la douleur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour des études ex-vivo
Remplacement
Cette étude in-vivo fait suite à de nombreuses étapes de mise au point et de caractérisation in vitro. La caractérisation in vivo et la validation d’un radiotraceur ne peuvent s’effectuer sans l’utilisation de modèles animaux. En effet, la fixation d’un radiotraceur dans les différents organes d’intérêt, ainsi que le passage de la barrière hémato-encéphalique ne peuvent être modélisés in vitro/in silico. De plus, la fonction d’entrée artérielle ne peut-être substituée par une modélisation mathématique car l’objectif final est d’obtenir la vérité terrain de la distribution systémique et la fixation du radiotraceur au sein de l’organisme entier vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux détaillé dans ce document est maximal est sera revu à la baisse en fonction de la quantité de molécules qui passeront l’étape de biodistribution froide, donc ayant montré une fixation spécifique. Ce projet sur 5 ans pour 10 molécules nécessite l’utilisation de 2 espèces : - 2160 souris sauvages (non transgéniques) et 280 souris transgéniques pour la protéine concernée - 200 rats Wistar. Des tests statistiques seront réalisés à la suite de ces études.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les animaux seront observés une à deux fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit lors de ce projet. Pendant le protocole, si nous constatons des bagarres dans les cages, nous procéderons à une séparation des individus. En cas de blessures, nous appliquerons un nettoyant et un désinfectant sur la plaie jusqu’à la cicatrisation complète. La posture de l’animal et sa réactivité à des stimuli externes seront monitorés chaque jour. Pendant les expérimentations, l’induction d’anesthésie gazeuse sera réalisée à 3% et les animaux seront maintenus à 2%, une protection oculaire sera appliquée. Si au cours du projet, les animaux présentent des signes de souffrance (poils hérissé, prostration…) la décision de la mise à mort sera prise par une personne habilitée à ce geste. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations d’imagerie sur tapis chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés. Une grille de score sera utilisée pour évaluer les expressions faciales une fois par semaine, le lendemain des expérimentation d'imagerie. Lors du protocole de la chirurgie, l’induction d’anesthésie sera réalisée en gazeux à 4% et les animaux seront maintenus à 3%, une analgésie sera injectée durant tout la chirurgie et un anesthésique local sera appliqué au niveau du site d'incision. Une protection oculaire sera également appliquée. Durant cette manipulation, l'animal sera maintenu sur un tapis chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés.
Choix des espèces
Le seul moyen de s’assurer de la spécificité d’un radiotraceur envers sa cible est d’utiliser des animaux qui n’expriment pas cette cible, soit des animaux transgéniques (souris) pour le gène désiré. En revanche pour la fonction d’entrée artérielle, dont le but est de caractériser la pharmacocinétique du radiotraceur, le rat sera utilisé car cette procédure n’est pas à l’heure actuelle réalisable chez la souris. Nous utiliserons des souris adultes afin d'avoir une taille de cerveau compatible avec la technique d'imagerie utilisée dans ce protocole et des rats adultes qui ont la taille adaptée pour la réalisation de la chirurgie.
Etude de l’efficacité de nouvelles molécules pour traiter ou prévenir l’inflammation intestinale
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Une colite est induite par voie orale au DSS chez 1 200 souris, dont 900 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 300 d'un niveau modéré. Le porteur annonce dès l'induction une perte de poids, de la diarrhée, des pertes de sang et des douleurs intestinales. Le détail des procédures ne porte pourtant que sur les prélèvements sanguins, jusqu'à 0,2 mL par semaine à la veine caudale ou jugulaire, sans revenir sur l'induction elle-même. Toutes les souris sont tuées à la fin de chaque procédure, pour prélever des tissus et mesurer la motilité intestinale post mortem.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), touchent chaque année des milliers de personnes en France, avec des phases inflammatoires suivies de rémissions. Les symptômes incluent diarrhée, fièvre, douleurs abdominales, fatigue et perte d’appétit, rendant leur traitement complexe. L'objectif thérapeutique et préventif évolue vers la recherche d'une "rémission physiologique". Malgré les avancées des thérapies biologiques, leur coût élevé et leur efficacité parfois limitée nécessitent le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les effets pléiotropiques des molécules et les enjeux thérapeutiques sous-jacents rendent indispensables l’utilisation de modèles in vivo. Le modèle d’inflammation intestinale est indispensable pour étudier les effets d’une molécule sur un organisme entier et pour accélérer le passage en clinique chez l’homme. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou préventives pour les MICI chez la souris. Dans ce modèle préclinique, l'inflammation est induite oralement par le DSS chez la souris. En ce qui concerne le choix d’un modèle aigu ou chronique, il dépendra d’une part du mécanisme d’action de la molécule à tester et d’autre part de la cible thérapeutique. De la même façon, la fréquence, la voie et le volume des administrations seront variables puisque dépendants des molécules. Celles-ci seront effectuées en total respect de la directive européenne 2010/63/UE.
Bénéfices attendus
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) touchent chaque année des milliers de personnes en France, avec des phases inflammatoires suivies de rémissions. Les symptômes incluent diarrhée, fièvre, douleurs abdominales, fatigue et perte d’appétit, rendant leur traitement complexe. Malgré les avancées des thérapies, leur coût élevé et leur efficacité parfois limitée nécessitent le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et préventives. La validation de molécules anti-inflammatoires dans des modèles de MICI murins serait un premier pas vers des tests chez l'humain et la possible commercialisation de molécules pouvant soulager ces millers de personnes en France atteintes de MICI.
Procédures
Selon la molécule à tester, un prélèvement sanguin pourra être réalisé au cours ou à la fin de la procédure expérimentale. La fréquence et le volume dépendront de l'étude. Cependant, les prélèvements seront effectués en total respect de la réglementation internationale et européenne. A savoir, pour une souris de 25 g, un volume inférieur à 0.2 mL (10% du volume sanguin circulant) sera prélevé 1 fois par semaine ou bien un volume inférieur à 0.3 mL (15% du volume sanguin circulant) sera prélevé 1 fois toutes les 3-4 semaines. Le site de prélèvement sera soit la veine caudale soit la veine jugulaire (sous anesthésie gazeuse : 3% pour induction-1.5% pour maintien). Un prélèvement tissulaire post-mortem, à la fin de l’expérience, sera réalisé.
Impact sur les animaux
Dès l’induction de la pathologie, les animaux pourront avoir une perte de poids, de la diarrhée, perte de sang, douleur intestinales.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanaisés à la fin de chaque procédure afin de réalisé des prélèvements tissulaires et l'étude de la motilité intestinale post-mortem.
Remplacement
Le modèle murin de colite induite au DSS est très proche de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales. De plus, la douleur et l'inflammation sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité.
Réduction
Une veille bibliographique est/sera effectuée pour éviter de refaire des expérimentations déjà réalisées par d'autres équipes. De plus, le nombre d'animaux a été consciencieusement établit avec le minimum nécessaire pour l'obtention de résultats statistiquement signfiicatifs (en prenant en compte la variabilité interindividuelle). Tout au long des différentes procédures les animaux seront observés et pesés. La présence de sang dans les selles et le comportement/aspect général de l'animal seront également analysés. Cette méthode non-invasive permettra donc de suivre au cours du temps, sur un même animal, l'évolution de la pathologie. Ce projet permettra de réaliser 30 études sur 5 ans.
Raffinement
De la ouate et des igloos seront ajoutés, permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par jour. Pour chaque procédure des points limites ont été défini pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées.
Choix des espèces
Les méthodes alternatives, permettant une évaluation de l’inflammation au niveau du colon sont peu représentatives de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques et préventive pour les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. De plus, l'inflammation est une réaction intégrée de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans son intégralité. Le modèle murin a été choisit de part la prédominance de cette espèce dans les publications concernant les MICI et la validité des modèles utilisés dans cette étude. Nous utiliserons des souris âgées d’au moins 8 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures. De plus, c'est l'âge utilisé classiquement dans la litterature pour ces modèles.