Souris
Effet des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma sur le développement à long terme de pathologies cardiovasculaire (coeur/poumon) et troubles du rythme associé chez la souris âgée 3/3
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Irradiées au rayonnement gamma sur le corps entier à l'âge de 15 mois, transportées entre trois établissements, 375 souris subissent des échographies mensuelles sous anesthésie, des courses sur tapis, des mesures de pression à la queue en tube de contention, une stimulation transœsophagienne et une ouverture du thorax sans réveil. Les procédures vont d'un niveau de souffrance modéré à sévère, et toutes les souris sont tuées pour prélever cœur et poumons. Le projet vise à alimenter les normes de radioprotection en simulant l'exposition de personnes âgées vivant en territoire contaminé après un accident nucléaire. Le porteur écrit que l'irradiation "n'entraine ni douleur ni brulure" et que l'hypertension induite "sera indolore", dans le même texte où il signale un risque d'hémorragie lors de la chirurgie thoracique et un arrêt cardiaque possible sous anesthésie.
Objectifs
La présente demande concerne un projet préalablement autorisé pour lequel nous devons effectuer une étape nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté ici par rapport au projet principal déjà autorisé. Actuellement, des résultats préliminaires ont mis en évidence un effet des doses faibles à modérées (inférieur ou égal à 500mGy) sur le développement d’arythmies atypiques à long terme et également l’observation d’un remodelage des vaisseaux pulmonaires. Il parait alors intéressant de vérifier le rôle du système nerveux sympathique et de l’hypertension artérielle pulmonaire sur la physiologie et le maintien de la fonction cardiaque. L’impact de l’âge au moment de l’irradiation sera évalué à partir de la dose 100mGy pour laquelle il y a le début de développement de maladies cardiovasculaires et également des troubles du rythme dans le contexte de l’exposition faible. L’objectif de ce projet sera d’évaluer la potentialisation ou non de l’âge sur un modèle expérimental d’exposition externe unique aux rayonnements gamma corps entier. Les effets des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma à long terme sur le coeur et les vaisseaux du poumon seront évalués afin d’apporter des réponses très attendues quant aux questions des effets biologiques pouvant induire des pathologies non-cancéreuses comme les pathologies cardiovasculaires pour permettre d’alimenter le système de radioprotection. En mimant une exposition à des doses faibles à modérées, ce projet sera complémentaire aux études épidémiologiques et permettra d’apporter des réponses notamment dans les gammes de doses où les études épidémiologiques manquent de puissance statistique. Ce projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances d’un point de vue mécanistique sur l’impact de l’âge au moment de l’exposition et les effets à long terme d’une exposition de doses faibles à modérées sur le système vasculaire (pulmonaire et cardiaque), le système nerveux sympathique cardiaque et sur le développement de troubles du rythme radio-induite afin d’améliorer et d’actualiser les connaissances et participer à la détermination des normes en radioprotection pour des institutions du domaine de la radioprotection.
Procédures
Tous les animaux seront transportés pendant 5 min de l’EU1 à l’EU2. Certains animaux seront exposés aux rayonnements gamma (EU2) pendant 3 min à 1h. L’irradiation aux doses utilisées dans le projet n’entraine ni douleur ni brulure que ce soit pendant l’irradiation ou après. Seules des modulations d’expression des protéines et une légère diminution de la fonction cardiaque ont été observées à long terme, sans conséquence clinique pour les animaux. Tous les animaux seront transportés pendant 5 min de l’EU2 à l’EU1. Certains animaux subiront des échographies (20 min) effectuées sous anesthésie (EU1) avant, 5 jours après irradiation puis tous les mois jusqu’au transport vers l’EU3. Certains animaux seront soumis à deux expériences de course sur tapis (EU1) pendant 10 min suivies d’une échographie d’environ 6 min qui seront réalisées à une semaine d’intervalle par rapport à l’échographie cardiaque. Les animaux auront donc 2 fois 2 anesthésies à une semaine d’intervalle. Pour ces animaux, la pression artérielle sera aussi mesurée à la queue (EU1) sur animaux vigiles (procédure indolore de 10 min) après accoutumance à la contention pendant 5 jours ce qui permet de limiter autant que possible le stress de la manipulation. Les animaux seront placés 10 minutes, 1 fois par jour pendant 5 jours dans un tube à contention. Cette mesure sera prise 5 fois : 1 fois par mois à une semaine d’intervalle avec les échocardiographies. L'hypertension induite dans les modèles utilisés n'est pas très forte et sera indolore pour les animaux. Ces souris seront ensuite transportées (30 min) vers l’EU3 et une semaine d’acclimatation sera réalisée. Ils seront anesthésiés et analgésiés à 4 jours d’intervalle une fois pour des stimulations transoesophagiennes de 5 min (EU3) et une fois pour la prise de pression artérielle pulmonaire, procédure chirurgicale sans réveil (EU3). Tous les animaux subiront un prélèvement de sang effectué sous anesthésie/analgésie avant l’euthanasie par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
L’irradiation à de faibles doses n’entraine pas de douleur ni de brulure aux animaux, seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque a été observée à long terme. L'hypertension induite dans les modèles utilisés n'est pas très forte et sera indolore pour les animaux. Néanmoins un stress (peur ou détresse) des animaux est possible lors de la mise en boite d’irradiation (375 animaux) et lors des mesures de de pression artérielle (125 animaux) même s’il y a habituation au tube à contention. Les procédures avec aiguille (375 animaux) peuvent potentiellement conduire à une douleur, à une peur et à des infections. Le transport animaux (375 animaux) entre les sites peut engendrer une peur temporaire et un stress thermique de courte durée. Les animaux subiront certains actes chirurgicaux qui pourront entrainer de la douleur palliée par une administration préalable d’analgésique. Lors de la procédure chirurgicale sans réveil, il peut y avoir une hémorragie. Ces actes chirurgicaux sont réalisés sous anesthésie et seront suivis de l’euthanasie de l’animal, sans qu’il ne reprenne conscience. L’anesthésie peut aussi entrainer un arrêt cardiaque.
Devenir
A la fin de la procédure toutes les souris seront euthanasiées pour prélever des organes (coeur et poumons) qui permettront une analyse histologique complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.
Remplacement
Pour mimer l’exposition corps entier de résidents âgés vivants en zone contaminée après un accident nucléaire par exemple celui de Tchernobyl, il est nécessaire d’avoir recours à une exposition externe à des doses faibles de rayonnements ionisants gamma (imitant les rayonnements ionisants du CS137) sur un modèle intégré (cardiomyocytes et fibres nerveuses). De plus, les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique comme la régulation de la pression artérielle ne peuvent être évalués qu'in vivo, tout comme l’évaluation de la fonction cardiaque, c'est pourquoi ce projet nécessite des modèles murins. Néanmoins pour une partie du projet, dès que possible, les voies et les molécules impliquées seront étudiées in vitro sur des cellules en culture. Néanmoins, il est très difficile d’obtenir des cellules de provenant de souris âgées et de maintenir ces cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules.
Réduction
Au total, 375 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre de 25 animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude et avec notre expérience concernant ce type d'analyses et ces modèles murins pour être au minimum. De plus on considère une mortalité possible due à la longévité des souris âgées pour nos groupes qui seront gardés pendant 3 mois post-irradiation, on constituera des groupes de 25 animaux pour obtenir un nombre d’animaux suffisant pour nos analyses statistiques. Si nous n’observons pas de mortalité tous les animaux seront pris en compte pour nos résultats.
Raffinement
Les volumes injectés sont les plus petits possibles en accord avec le poids de l’animal. Les animaux sont pesés en début de procédure et avant la chirurgie. Un analgésique est administré en sous cutané pour atténuer la douleur de l’ouverture du thorax. Lors des différents protocoles, un arrêt cardiaque durant l’anesthésie sera traité par massage cardiaque. La profondeur de l'anesthésie sera vérifiée en testant l'absence de réflexe de retrait de la patte (après pincement). Les infections ou blessures éventuelles seront traitées localement par application d’antiseptique, crème antibiotique ou par administration d’antibiotique. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs et le milieu est enrichi avec des lanières de papier, morceau de bois et maison en carton. En cas de bagarres, les animaux pourront être isolés. Les souris seront suivies de façon hebdomadaire. Elles seront pesées régulièrement une fois par mois. Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues aux bagarres entrainera l’euthanasie anticipée. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée par les zootechniciens et hebdomadaire par le porteur de projet. Le transport des animaux (entre EU1 et EU3) se fera dans un véhicule climatisé et les animaux seront placés dans des boites de transport avec litière et gel hydrique. La durée de transport srea de 30 min. Si avant ou après le transport un animal montre des signes de souffrance (locomotion, isolement, apparence) lié, il sera euthanasié. Les EU1 et EU2 étant dans le même bâtiment, le transport se fera dans des boites de transport avec litière.
Choix des espèces
Ce projet vise à déterminer l’impact de l’âge sur le développement de pathologies cardiovasculaires (hypertension artérielles pulmonaire, cardiomyopathies) et également des troubles du rythme cardiaque chez des souris irradiées en corps entier avec des rayonnements gamma à faible dose et ce afin de mimer des effets secondaires à long terme de l’exposition des personnes âgées en territoire contaminé post accident nucléaire. Les souris seront âgées de 15 mois au moment de l’irradiation car ça correspond au début de la vieillesse chez la souris. Des souris C57BL/6 males âgés seront utilisées pour ce projet afin de pouvoir comparer avec les études déjà effectuées sur des souris mâles jeunes. Il est prévu par la suite d'évaluer les effets de l'irradiation faible dose sur des souris femelles jeunes et âgées.
Evaluation in vivo de l’impact d’une bithérapie anticancéreuse innovante sur le système immunitaire et recherche d’applications en immunologie clinique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau une pompe implantée en dix minutes de chirurgie, puis des injections dans le ventre ou sous la peau, avec une douleur pouvant durer quarante-huit heures après l'opération. L'effectif se déduit d'un montage, cinq groupes, six moments de mise à mort, cinq souris par point d'analyse, plus 10 % pour les décès imprévus. Les souris sont tuées à chacun de ces moments parce que les analyses réclament un volume de sang qu'on ne peut pas prélever sur un animal vivant, le porteur présentant cette mise à mort comme un moyen de limiter le nombre total de souris.
Objectifs
Objectif principal : Evaluation de la tolérance d’un traitement anticancéreux sur le système immunitaire chez des animaux. Objectifs secondaires : Evaluation de l’efficacité d’un traitement innovant pour inhiber l’activation de certaines cellules du système immunitaire en vue d’une application dans des situations où ces cellules sont sur-activées (maladies auto-immunes et auto-inflammatoires), évaluation des mécanismes permettant cet effet.
Bénéfices attendus
Ce projet présente 2 bénéfices attendus principaux. Le premier est la poursuite du développement d’un traitement qui pourrait être utilisé chez l’Homme pour le traitement de cancers. La preuve d’efficacité sur des souris a été réalisée en amont, mais l’évaluation de l’effet du traitement sur les défenses immunitaires est indispensable (rôle important de celui-ci dans le cancer) et n’a pas pu être réalisée précedemment (absence de système immunitaire chez les souris étudiées précedemment). Le deuxième objectif est le développement potentiel d’un traitement luttant contre les maladies du système immunitaire, par exemple les maladies auto-immunes.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 types d’interventions : - Mise en place d’une pompe sous cutanée : Le geste sera réalisé sous anesthésie générale et sous traitement contre la douleur, et dure environ 10 minutes par souris. Ce geste sera réalisé sur l’ensemble des animaux (220 animaux), à une seule reprise. Cette pompe sous-cutanée est nécessaire à l’administration continue d’un des traitements à l’étude. - Injections intrapéritonéales et sous-cutanées : Une injection d’un faible volume par seringue sera réalisée au niveau du ventre des souris (injection intrapéritonéale) ou sous leur peau (injection sous-cutanée) afin de leur administrer un autre traitement. Il s'agit d'une procédure vigile durant moins d'une minute par souris. Cette intervention sera appliquée à 220 animaux. - Les souris seront euthanasiées à la fin de l’experimentation (durant 0 à 21 jours), sous anesthésie générale. Cela est nécessaire pour permettre un recueil de sang suffisant pour les analyses qui répondront aux objectifs de l’étude. Immédiatement après la mise à mort, les souris seront autopsiées et leurs organes conservés.
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient subir les nuisances et effets indésirables suivants : - Douleur légère à modérée pouvant durer 48h suivant la chirurgie de pose de la pompe sous-cutanée. Chirurgie réalisée sous anesthésie générale puis administration systématique d’antalgiques suivant la chirurgie. - Douleur légère de quelques secondes lors des administrations médicamenteuses par injections sous-cutanées ou intrapéritonéales. - Des effets indésirables des traitements étudiés sont possibles, mais une étude préliminaire a permis de s’assurer de l’absence d’effet indésirable dans les 24 premières heures de traitement, et un ajustement de dose est prévu si un effet indésirable est constaté à forte dose. - Stress léger lors des manipulations quotidiennes (pesées et contentions). - Aucun inconfort n’est prévu au moment de la mise à mort, celle-ci étant réalisée sous anesthésie générale.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de permettre le prélèvement d’un volume de sang suffisant pour la réalisation des analyses. Cela permet de limiter le nombre de souris nécessaires en optimisant le volume prélevé à chaque souris lors de la mise à mort. Par ailleurs, un prélèvement sanguin si important ne serait pas possible du vivant de la souris. Le stress de l’animal est réduit au minimum par le biais d’une anesthésie générale profonde.
Remplacement
Une étude chez l’animal est nécessaire pour plusieurs raisons : - Aucun modèle experimental en laboratoire ne reproduit avec fiabilité la complexité du système immunitaire, qui est très complexe et interagit avec de nombreux facteurs. L’animal est pour l’instant irremplaçable dans ce champ de la recherche. - La tolérance de l’association thérapeutique à l’épreuve sur le système immunitaire n’est pas connue, et l’objectif final est un transfert à l’Homme de cette bithérapie.
Réduction
Nous avons déterminé le nombre minimal d’animaux pour ce projet en tenant compte de plusieurs exigences : - Le traitement étudié comporte deux composantes, qui doivent être associées pour que le traitement fonctionne, avec une notion de synergie. L’évaluation scientifique d’un traitement synergique nécessite d’évaluer individuellement les deux composantes en plus de les étudier associées, afin de démontrer l’effet synergique entre les deux. - Nous avons choisi d’administrer un agent connu et utilisé couramment, comme contrôle positif en ce qui concerne l’action du traitement à l’étude sur un phénomène biologique appelé la « methylation de l’ADN». Cela impose un groupe supplémentaire. - Plusieurs points de suivi sont nécessaires afin d’évaluer une efficacité et une toxicité temps dépendantes. Chacun de ces points de suivi impose une mise à mort de l’animal, car les analyses permettant de répondre aux objectifs principal et secondaires nécessitent un volume de sang supérieur à ce qu’il serait possible de prélever de manière répétée sans compromettre le bien-être de l’animal. Chacun de ces points nécessite un minimum de 5 souris pour réaliser les calculs nécessaires. Enfin, il est également important d’observer les effets d’un traitement lorsque le système immunitaire est activé. Ainsi 15 souris par groupes recevront une injection contenant un composé connu pour activer celui-ci. Au total, en considérant les 5 groupes à l’étude, les 6 points de mise à mort (dont 1 commun à l’ensemble des groupes), avec 5 souris par point statistique, et en considérant un risque de décès non lié aux traitements de 10% des animaux, un total de 225 souris sont nécessaires à l’étude.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour limiter les nuisances attendues ou non liées aux manipulations des animaux et aux procédures. Le bien-être animal fera l’objet d’une évaluation bi-quotidienne tous les jours week end compris. Pour limiter le stress, une période d’acclimatation standardisée de 7 jours sera respectée avant la première procédure sur l’animal. Pendant cette période, les animaux seront habitués au contact humain et aux manipulations par le biais de jeux. Les manipulations auront lieu dans un environnement calme et par un manipulateur qualifié pour l’experimentation l’animale, pour le confort de l’animal et pour limiter la durée des manipulations. En cas de douleur ou d’inconfort modéré, un antidouleur simple sera administré. Si la douleur persistait ou semble plus que modérée, un antidouleur plus puissant sera administré. En cas de signe indiquant une douleur sévère définissant un point limite, la souris sera mise à mort pour éviter toute prolongation inutile de sa souffrance.
Choix des espèces
Les souris utilisées (souche C57Bl6) constituent un modèle animal très bien connu, fréquemment utilisé pour les études portant sur de nouveaux médicaments. Les souris seront accueillies au laboratoire à un âge compris entre 6 et 10 semaine.
Transmission virale inter-espèces chez des animaux vertébrés dans un contexte insulaire
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 20
Autres rongeurs : 60
Autres mammifères : 100
Autres oiseaux : 200
Reptiles : 100
Autres amphibiens : 100
Chauves-souris endémiques de La Réunion, oiseaux, rats, tangues, geckos et amphibiens, le projet cible toute la communauté de vertébrés d'un même site. 600 animaux sauvages vont être capturés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, soit 200 oiseaux, 100 chauves-souris, 100 petits mammifères terrestres, 100 reptiles et 100 amphibiens. Chacun subit en cinq à dix minutes un écouvillon de fèces, un prélèvement d'urine, un écouvillon buccal, une prise de sang et un retrait de parasites, sans anesthésie pour les oiseaux, que le porteur juge plus risquée que les gestes eux-mêmes. La capture peut provoquer hyperthermie, déshydratation, essoufflement et cyanose des muqueuses, et si la plupart des animaux repartent, les individus des espèces visées par un arrêté préfectoral de destruction, rats noirs, rats bruns, souris grises, tangues, musaraignes, agames et geckos verts non indigènes, ne sont pas relâchés.
Objectifs
L’émergence des zoonoses (maladie causée par un agent infectieux pouvant se transmettre entre l’homme et d’autre animaux vertébrés) est liée à un ensemble de facteurs environnementaux, populationnels et intrinsèques aux agents infectieux. L’étude de ces facteurs permet d’évaluer le niveau de menace associé aux agents infectieux, mais également leur risque d’émergence, en particulier dans les populations humaines. Les zoonoses impliquant, par définition, des échanges d’agents infectieux entre des espèces animales vertébrées et l’homme, l’estimation du potentiel de sauts d’espèces de ces agents infectieux est une étape incontournable à l’évaluation du risque. Le franchissement de la barrière d’espèce est cependant conditionné par les contacts, directs ou indirects, entre espèces de vertébrés, mais aussi par les propriétés moléculaires des agents infectieux et leur capacité à se multiplier et se transmettre dans de nouvelles espèces. A La Réunion, quatre familles virales ont été décrites chez le Petit Molosse (Mormopterus francoismoutoui) : les Coronaviridae, les Paramyxoviridae, les Astroviridae et les Rhabdoviridae. Les analyses phylogénétiques réalisées sur ces virus semblent indiquer la possibilité d’échanges entre chauves-souris, rongeurs, et potentiellement oiseaux, en particulier pour les Paramyxoviridae et les Astroviridae. Le sens de ces échanges de virus (chauves-souris vers autres groupes taxonomiques, ou inversement), de même que la fréquence, le mode de transmission (par contact ou transmission environnementale) ou encore la capacité de ces virus à induire une excrétion virale assurant une transmission pérenne chez une nouvelle espèce, sont des aspects pour lesquels nous n’avons pas d’élément de réponse. L’objectif de ce projet est d’estimer le potentiel de changement d’hôtes des virus associés au Petit Molosse. Nous nous focaliserons sur les Coronaviridae, les Paramyxoviridae et les Astroviridae, pour lesquels la présence d’ARN viral a été mise en évidence à de nombreuses reprises. Les Rhabdoviridae ne seront pas inclus dans cette étude, étant donné qu’ils ont été mis en évidence uniquement sur la base d’analyses sérologiques (6), que leur détection sur des chauves-souris vivante est extrêmement rare, et du fait de leur potentiel limité à s’implanter durablement chez de nouveaux hôtes
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de mettre en évidence des échanges des virus entre les chauves-souris et les autres espèces de vertébrés partageant le même habitat, et de déterminer le sens de ces échanges. La prise en compte du statut des espèces à La Réunion, indigènes ou introduites, permettra de confirmer la transmission de virus depuis des espèces synanthropiques (e.g. rats, pigeons) vers le Petit Molosse, seule espèce de mammifère endémique sur l’île. Nous apporterons également des réponses sur le mode de transmission inter-espèces, par l’analyse d’échantillons environnementaux (e.g. guano, terre, eau). Pour les Coronaviridae et les Paramyxoviridae, la faible diversité génétique permettra l’application de systèmes de détection spécifiques, de quantifier la charge virale et de confirmer le statut de réservoir de ces espèces. L’analyse de la diversité génétique des Astroviridae confirmera l’hypothèse d’une circulation « écosystémique » de ces virus. L’ensemble de ces résultats affinera notre évaluation du risque zoonotique associé à ces « virus réunionnais ».
Procédures
Pour chaque animal, les prélèvements suivant seront réalisés : (i) un prélèvement de fèces par écouvillon ou collecte dans le sac de contention, (ii) un prélèvement d’urine pour les mammifères, (iii) un prélèvement de salive (écouvillon oropharyngé ou buccal), (iv) une prise de sang (excepté pour les amphibiens), et (v) des parasites hématophages (pour les oiseaux et mammifères). L'ensemble de ces prélèvements durera environ 5 minutes pour chaque animal. L’anesthésie des oiseaux étudiés dans le projet représente en soit une procédure de classe supérieur à celle qui sera réalisée ici. Afin de limiter le stress des oiseaux nous n'anesthésierons donc pas les animaux dans le cadre de ce projet.
Impact sur les animaux
Les procédures réalisées sur animaux sont toutes légères et courtes, mais le cumul de gestes est à prendre en compte car la durée de capture sera en conséquence plus longue. Nous estimons la durée de marquage et de prélèvements biologique (écouvillons et prise de sang) de 5 à 10 minutes par animal (quel que soit le groupe taxonomique). Toutes les espèces concernées étant des espèces sauvages non captives, l’ensemble des procédures induira un stress sur les animaux. Les nuisances attendues seraient des effets aiguës liés à la manipulation, mais nous n’attendons aucun effet sur le long terme, étant donné le caractère non invasif des procédures réalisées. Même si des mesures de raffinement et des points limites adaptés seront mis en place, nous pouvons observer des effets indésirables en relation avec le stress aiguë lié à la captivité : hyperthermie, déshydratation, essoufflement, cyanose (coloration anormale bleutée de la peau qui indique un manque d’oxygène dans le sang) des muqueuses, fatigue. La procédure de prélèvement sanguin serait la plus invasive. Nous pourrions observer exceptionnellement des hématomes sur les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront replacés, excepté les individus d’espèces soumises à un arrêté préfectoral de destruction ne seront pas relâchés dans l'environnement (Rat noir, rat brun, Souris grise, Tangue, Musaraigne, Agame des roches et geckos verts diurnes non indigènes).
Remplacement
Le projet porte spécifiquement sur la diversité et la transmission des agents infectieux chez des animaux sauvages, dans leur environnement naturel. Les espèces ciblées ne peuvent donc pas être remplacées.
Réduction
Le nombre maximal d'animaux utilisés sera de 100 à 200 par groupe taxonomique, ce qui permettra d'avoir un seuil de détection viral acceptable d'un point de vue statistique. Cette approche est en accord avec les stratégies d'expérimentation que nous avons utilisé dans le passé qui ont permis d'obtenir à la fois des résultats valides d'un point de vue statistique sans pour autant affecter la douleur, la souffrance et l'angoisse infligées aux animaux.
Raffinement
Pour les oiseaux, nous réaliserons les captures principalement à l’aube, pour une durée maximale de 5 heures. Nous éviterons de manipuler des oiseaux par temps de pluie, pour ne pas altérer l’étanchéité des plumes. La pose d'une bague permettra également d'identifier individuellement les oiseaux et de les relâcher immédiatement en cas de recapture. Pour les prises de sang, la vitesse normale de coagulation pour les oiseaux n'est pas connue, mais est habituellement considérée d'une durée d'environ cinq minutes. Le stress et les températures élevées sont susceptibles d'affecter cette durée. La fin de l'écoulement sanguin sera vérifiée avant le relâché des oiseaux. Enfin, l'hydratation des oiseaux sera réalisée de façon systématique avec une solution de glucose. Pour les chauves-souris, les captures se déroulerons le matin lors du retour des chauves-souris dans leur gîte, ou en fin d’après-midi afin de relâcher les individus au moment du coucher du soleil, heure normale à laquelle les chauves-souris partent s’alimenter. Les animaux seront capturés à l’aide d’un filet à papillon, en approchant délicatement les individus accrochés sur les parois de la grotte. Les chauves-souris seront immédiatement hydratées avec de l’eau et placées individuellement dans des pochons propres opaque, suspendus au calme et à l’ombre et recouverts d’un tissu polaire. Pour les petits mammifères terrestres, les animaux seront maintenus dans leur cage-piège à l’ombre recouvert d’un drap pour diminuer le stress avant manipulation. Un biberon d’eau sera proposé à tous les animaux quand ils seront encore dans leurs cages-pièges, avant le début de la contention. Une durée maximum sera fixée pour la réalisation de tous les actes dès lors que l’animal est contenu. Cette durée sera de 10 minutes maximum par individu, de la contention au relâché. L’environnement de l’animal pendant toutes les manipulations sera contrôlé : endroit calme, à l’abri du soleil, en sécurité, propre, avec une faible luminosité. Pour les reptiles et amphibiens, les captures se feront de deux heures après le lever du soleil à deux heures après le coucher du soleil. Cela permettra de couvrir l’ensemble des plages horaires d’activité des différentes espèces. Les animaux capturés seront placés dans des sacs en tissus pour diminuer le stress avant les mesures et seront relâchés sur la zone de captures.
Choix des espèces
Ce projet porte spécifiquement sur un ensemble d’espèces (communauté) partageant le même habitat. Nous ciblerons donc la totalité des espèces de vertébrés identifiées sur notre site d’étude : chauves-souris, oiseaux, petits mammifères terrestres, reptiles et amphibiens. Le nombre précis d’espèce ne peut être indiqué en amont du projet car il dépendra des opportunités de captures des animaux sur le terrain. Nous ciblons cependant : 1 espèce de chauves-souris, 10 espèces d’oiseaux, 5 espèces de petits mammifères terrestres, 11 espèces de reptiles et 2 espèces d’amphibiens. Les animaux seront classés en deux grandes catégories d'age pour ce projet : juvénile et adulte. Tous seront échantillonnés, excepté pour les amphibiens ou seuls les adultes seront capturés. Pour les autres groupes taxonomiques, les jeunes non sevrés ne seront pas capturés (poussins et jeunes mammifères non volant/sevrés).
Etude chez la souris des mécanismes d’action de l’œstradiol dans la régulation hypothalamique de la fonction de reproduction au moment de la puberté.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
Une partie des femelles est ovariectomisée sous anesthésie, avec pose d'un implant hormonal, pour les rendre réceptives lors des tests d'accouplement. 400 souris vont être utilisées, dans des procédures allant d'un niveau de souffrance léger à modéré, une partie d'entre elles étant opérées et tuées sans reprendre conscience. Le porteur nomme les tests, accouplement spontané pendant neuf heures pour les mâles, activité locomotrice en corridor circulaire pendant deux heures, anxiété en labyrinthe à croix surélevé. Il écrit que l'ovariectomie et la supplémentation "n'entrainent pas d'inconfort des animaux" une fois la récupération passée, dans le paragraphe même où il reconnaît que cette chirurgie provoque stress et douleurs, et toutes les souris finissent tuées pour prélèvement du cerveau.
Objectifs
L’infertilité est aujourd’hui un enjeu majeur de santé publique dont les causes et les mécanismes d’action demeurent mal compris. La fertilité repose sur une régulation adéquate par le cerveau des régions impliquées dans les fonctions de reproduction. L'organisation de ces structures cérébrales, en particulier dans l’hypothalamus, est contrôlée par les hormones stéroïdes sexuelles, testostérone et estradiol, pendant des périodes critiques de développement, de la naissance à la puberté. Le but de ce projet de recherche est de comprendre le rôle de l’œstradiol au cours du développement pubertaire dans les changements de plasticité de l’hypothalamus. Des souris seront utilisées afin d’investiguer les mécanismes d’action de l’œstradiol dans l’organisation pubertaire des réseaux neuraux sous-jacents la régulation des fonctions de reproduction. Les données issues de ce projet aideront à mieux comprendre les troubles pubertaires et contribueront à élucider les mécanismes d’actions impliquées dans le contrôle des fonctions de reproduction mâle et femelle. Cela pourrait ainsi conduire à développer des stratégies thérapeutiques spécifiques au sexe et à l’âge pour remédier aux troubles de la fertilité.
Bénéfices attendus
La puberté est une période critique de la vie qui permet d’atteindre la maturité sexuelle et ainsi permettre la reproduction. C’est une période cruciale de transition entre l’enfance et l’âge adulte qui, en plus de l’apparition des caractères sexuels secondaires, s’accompagne d’importants changements psychiques et comportementaux. Néanmoins de manière surprenante les mécanismes cérébraux sous-tendant ces changements sont aujourd’hui encore mal compris. Les données obtenues dans ce projet contribueront à déterminer les mécanismes d’action qui contrôlent l’organisation pubertaire du cerveau par les hormones stéroïdes sexuelles. Ceci est particulièrement pertinent si nous voulons développer de meilleurs traitements pour les troubles de la puberté mais également pour les troubles psychiatriques et comportementaux qui se manifestent souvent pendant cette période.
Procédures
Une partie des femelles subiront un acte de chirurgie afin d’induire la réceptivité par retrait chirurgical des ovaires et pose d’un implant hormonal : procédure chirurgicale d’une durée maximale de 10 minutes sur animaux anesthésiés ayant reçu une injection d’analgésique 20 minutes avant. Le comportement des mâles et femelles sera analysé à l’âge adulte : - comportement spontané d’accouplement (2 tests séparés de 15 jours, d’une durée 9h pour les mâles ; 3 tests séparés de 10 jours d’un durée de 30 minutes pour les femelles, sur animaux vigiles). - test d’activité locomotrice spontanée dans un corridor circulaire (durée de 120 minutes sur animaux vigiles) et test d’anxiété spontanée dans un labyrinthe à croix surélevé (durée de 9 minutes sur animaux vigiles). Une partie des animaux subiront un acte unique de chirurgie terminale effectuée sous anesthésie et analgésique d’une durée de 20 minutes. Les animaux restants seront anesthésiés profondément et euthanasiés. A l’issue de cet acte terminal les prélèvements sont réalisés pour analyse.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales d’anesthésiques et d’antalgiques peuvent générer une douleur légère au point de piqure. L’anesthésie est également associé à certains risques (hypothermie, arrêt cardio-respiratoire…). Un léger inconfort peut être généré par la première introduction des souris dans les dispositifs liés aux tests comportementaux. Un stress peut être lié à l’isolement des mâles avant les tests de comportements. De plus, un stress peut être lié à la chirurgie effectuée chez les femelles. Cette chirurgie peut également entrainer des douleurs. Après la récupération post-opératoire, l’ovariectomie et la supplémentation n’entrainent pas d’inconfort des animaux.
Devenir
L'ensemble des souris sera euthanasié afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses immunohistochimiques et moléculaires.
Remplacement
L'étude du rôle de l’œstradiol dans la neuroplasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire nécessite des modèles animaux pour pouvoir étudier le réseau neuronal complexe au sein de l’organisme entier. Des animaux vivants seront donc nécessaires pour ce projet. Ce projet comporte des analyses neuroanatomiques et neuroendocrines. Il n'est donc pas possible de le développer par des méthodes alternatives et/ou substitutives.
Réduction
Le nombre total d'animaux utilisé est de 400, ce qui permet une analyse combinée des mâles et des femelles et cela à différents stades du développement pubertaire. Des protocoles biologiques différents ne permettent pas d’effectuer toutes les analyses sur les mêmes échantillons. Les effectifs utilisés ont été calculés au plus juste afin de garantir la puissance statistique, compte tenu de la variabilité interindividuelle. Afin de réduire le nombre d'animaux, plusieurs régions du cerveau seront analysées en même temps pour le même animal. Les autres organes (hypophyse, ovaire, dents, squelette...) seront proposés aux collaborateurs de l'équipe comme cela est fait habituellement au sein de l’équipe.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie, sous la supervision de soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L'hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010/63/UE en termes d'espace et d'environnement. Les souris seront soumises à un cycle lumière- obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l'enrichissement, un nid sera placé dans la cage. Avant chaque procédure chirurgicale, une analgésie sera effectuée par l’injection d’un analgésique 20 minutes avant la procédure. Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s'assurer que toute souris présentant un ou plusieurs points limites sera euthanasiée. Toutes les euthanasies des animaux seront effectuées sous anesthésie générale. L'anesthésie profonde de l'animal est vérifiée par le pincement de la patte arrière et l'absence du réflexe de clignement de paupière suite à une stimulation de l'œil. Une analgésie sera effectuée 20 minutes avant la chirurgie terminale.
Choix des espèces
La souris est l'un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et neuroanatomiques grâce à la disponibilité d'outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques...), et de données dans la littérature permettant d'une part de comparer les résultats obtenus avec ceux des autres laboratoires et d'autre part d'implémenter les connaissances sur cette thématique. Des souris mâles et femelles adultes seront utilisés. De plus, des souris mâles contrôles et mutants seront utilisés aux jours postnataux (JPN) 25, JPN30, JPN35 et JPN45 ; et des souris femelles contrôles et mutantes seront utilisées aux jours postnataux JPN35, JPN40, JPN45 et JPN55. Ce projet vise à étudier la neuroplasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire, l’utilisation de ces différents âges permettra d’étudier le plus précisément possible les mécanismes d’action de l’estradiol lors du développement pubertaire.
Modèles préclinques de cancer ovarien.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Greffées de cellules de cancer ovarien humain, 800 souris immunodéficientes reçoivent ensuite un candidat médicament, jusqu'à une fois par jour pendant quatre semaines, avec quatre prises de sang sous anesthésie et une imagerie hebdomadaire. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées à l'issue, pour caractériser l'effet du traitement sur leurs organes et sur la tumeur. Le laboratoire réalise ces essais comme prestataire, pour des partenaires publics ou privés, et met en avant la reproductibilité et la robustesse de ses modèles. Il écrit dans le même paragraphe que ces modèles "demandent à être améliorés" et que les thérapies innovantes qu'ils laissent espérer relèvent d'un "futur proche".
Objectifs
Malgré les progrès de la chirurgie et de la chimiothérapie, le cancer de l'ovaire reste l'une des principales causes de décès par cancer chez les femmes, avec le cancer du poumon et le cancer du sein. Le cancer de l'ovaire développe souvent une résistance aux thérapies conventionnelles, ce qui rend son traitement difficile à un stade avancé. La mise en œuvre de nouvelles approches thérapeutiques est donc nécessaire pour améliorer le traitement de la maladie. Dans ce contexte, nous avons pour objectif de réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments innovants.
Bénéfices attendus
En tant que prestataire de services, nous réalisons ces études pour des laboratoires partenaires publics ou privés. Dans ce projet, nous offrons la possibilité à la communauté scientifique de pouvoir évaluer l’efficacité de nouveaux candidats médicaments à l’aide de modèles précliniques dont nous assurons la reproductibilité et la robustesse nécessaires au développement des projets en immuno-oncologie. Bien que ces modèles demandent à être améliorés, ils ont permis de reproduire chez la souris certains aspects des pathologies humaines et, en complément des autres modèles expérimentaux, ils laissent ainsi espérer le développement dans un futur proche de thérapies innovantes.
Procédures
L’ensemble des animaux subira une transplantation de cellules tumorales ovariennes humaines (1 injection durant 1 min / animal) puis recevra des administrations de candidats thérapeutiques dont la fréquence et la route seront dépendantes de la pharmacocinétique du composé à évaluer. Une partie des animaux subira des prélèvements sanguins (au maximum 4) réalisés sous anesthésie volatile (5 min/souris), en alternant les sites de prélèvement et espacés d’au minimum 7 jours afin de favoriser la cicatrisation. Enfin, le suivi du développement tumoral sera effectué hebdomadairement par imagerie optique par bioluminescence, un procédé non invasif mais nécessitant l’anesthésie des souris (durée= 6 à 10 minutes/souris).
Impact sur les animaux
Les animaux développeront une pathologie tumorale humaine potentiellement grave pouvant engendrer une détresse modérée. La transplantation des cellules cancéreuses et l’administration (voie spécifique de chaque candidat thérapeutique) du traitement à évaluer (au maximum quotidien durant 4 semaines) engendreront une brève douleur légère. Les anesthésies associées aux prélèvements sanguins (au maximum 4) et à l’imagerie optique (hebdomadaire) seront une source potentielle d’un stress de courte durée. L'ensemble des manipulations ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de pouvoir caractériser ex-vivo l’effet de l’administration des candidats médicaments sur les organes et/ou la tumeur.
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d'études in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez les patients. Nous avons besoin d’un modèle permettant de reproduire d’un point de vue phénoménologique toute la complexité de la croissance tumorale. Un organe isolé ou une espèce, autre que les mammifères, ne permettra pas d’évaluer la biodistribution du candidat thérapeutique évalué, ni le role du système immunitaire dans la réponse anti-tumorale ou les éventuels phénomènes de résistance. La souris est alors le modèle rongeur le plus utilisé permettant de modéliser cette pathologie humaine et qui permet en plus de faire un suivi de l’évolution du développement tumoral par des mesures cinétiques non invasives par bioluminescence.
Réduction
Les études in vivo ne seront réalisées que sur les molécules candidates qui auront démontré une efficacité maximale in vitro. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir démontrer que l’effet de nos molécules est significatif par rapport aux groupes contrôles. De plus, lorsque ce sera possible, nous mutualiserons les groupes contrôles. La comparaison de différentes conditions expérimentales se fera par des tests statistiques adaptés aux petits échantillons.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant un procédé non invasif à savoir des acquisitions de bioluminescence par imagerie optique sous anesthésie volatile. L'hébergement des animaux est effectué conformément aux réglementations locales et européennes, sous le contrôle d'un vétérinaire et avec l'aide d'un personnel technique qualifié. Les animaux seront ainsi hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour/12h nuit) et la nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. De plus, afin de respecter leur instinct grégaire et d'assurer une absence de peur et d'anxiété, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de dômes en carton et/ou de coton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne et une pesée à minima bihebdomadaire, par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance, de blessure ou de maladie nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.
Choix des espèces
Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type d’études chez l’homme sans données précliniques solides. Nous avons retenu le modèle murin car l’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de tumeurs humaines chez un individu hôte d’une espèce différente. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature et dans nos propres études, pour ce type de modèle d’injection de cellules tumorales humaines, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.
Comment certains gènes des cellules immunitaires présentes dans le cerveau influencent son fonctionnement et le développement de pathologies comme la maladie d’Alzheimer ?
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Des souris reçoivent jusqu'à cinq chocs électriques par séance, à raison d'une séance de 30 minutes par jour pendant neuf jours, dans un test fondé sur l'évitement du choc. 2 250 souris, dont des lignées génétiquement modifiées qui développent une forme de maladie d'Alzheimer, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leur cerveau. Selon les protocoles, elles subissent aussi cinq injections dans l'abdomen, des séries de quatre tests de 3 minutes chaque jour, cinq jours par semaine pendant deux semaines, que le résumé ne nomme pas, et un isolement temporaire en cage individuelle. Le porteur qualifie le choc de "désagréable mais non douloureux", et écrit que les analgésiques centraux sont "à proscrire pour des raisons scientifiques".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de cinq gènes d’intérêts dans le fonctionnement normal et pathologique des cellules immunitaires du cerveau. Les cellules immunitaires du cerveau et de la moelle épinière et jouent des rôles critiques à la fois dans son fonctionnement en conditions physiologiques et pathologiques. Les études récentes ont permis d’établir que la population de cellules immunitaires du cerveau est hétérogène et existe sous une grande diversité d’états microgliaux. Comment ces différents états sont contrôlés et quels sont leurs rôles dans le fonctionnement physiologique et pathologique du cerveau reste encore à déterminer. Notre équipe s’intéresse à plusieurs gènes qui de par leur localisation et/ou leur fonction dans d’autres cellules immunitaires sont susceptibles de jouer un rôle clé dans le contrôle de ces différents états microgliaux. L’objectif final du projet est donc de comprendre, dans différents contextes physiologiques et pathologiques (en particulier dans le contexte de la maladie d’Alzheimer), le rôle de ces cibles dans le fonctionnement des cellules microgliales. Pour ce faire, nous utiliserons une combinaison de lignées murines permettant de modifier l’expression de ces gènes spécifiquement dans les cellules immunitaires du cerveau. In fine, ce projet permettra de valider l’intérêt thérapeutique des gènes cibles dans les différents contextes envisagés.
Bénéfices attendus
1. Déchiffrer le rôle de gènes d’intérêt exprimés dans des cellules immunitaires dans le fonctionnement physiologique et physiopathologique des cellules immunitaires du cerveau (en particulier dans le contexte du développement de la maladie d’Alzheimer) 2. Valider l’intérêt thérapeutique de ces cibles pour le développement de stratégies thérapeutiques, notamment dans le contexte du développement de la maladie d’Alzheimer
Procédures
Les interventions prévues dans le cadre de ce projet sont : des injections dans l’abdomen (5 injections, à raison d’une injection par jour, sur 5 jours, durée d’une injection environ 10 sec) ; l’enchainement de tests pour évaluer le comportement cognitif des animaux (au maximum 1 série de 4 tests de 3 min (soit 12 min/animal/jour) chacun par jour, 5j par semaine sur 2 semaines ; chacun des tests étant non-invasif et reposant sur la propension des rongeurs à explorer leur environnement) ; un test basé sur l’évitement d’un choc électrique désagréable mais non douloureux (au maximum les animaux peuvent recevoir 5 petits chocs électriques par session, 1 session de 30 min par jour sur 9 jours). L’étude de l’effet de l’impact de la pathologie et/ou des gènes d’intérêt sur l’activité circadienne requiert l’emploi de tests impliquant des procédures potentiellement stressantes pour les animaux, notamment un hébergement isolé temporaire. Néanmoins, toutes les mesures nécessaires seront prises pour assurer le bien-être des animaux tout au long de l'étude.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables découlant des interventions sont les suivants : Douleurs et stress léger de piqure d’aiguille dans le péritoine ; Stress léger et inconfort de certains tests de comportement. Isolement temporaire pour l’évaluation de l’activité circadienne.
Devenir
L'ensemble des animaux contribuant à ce projet sera mis à mort. Les organes, tout particulièrement le cerveau, seront prélevés pour des analyses histologiques, cellulaires et/ou moléculaires.
Remplacement
Les cellules immunitaires du cerveau sont, par nature, des cellules ultra-sensibles à leur environnement. Pour comprendre leur rôle dans le fonctionnement physiologique ou physiopathologique du système nerveux central, il est nécessaire de les étudier dans un environnement aussi proche que possible des conditions natives. Dans ce contexte, les données récentes de la littérature indiquent que les morphologies, les fonctions ou encore le répertoire de gènes exprimés par les lignées cellulaires microgliales ou même les cultures primaires de microglies diffèrent substantiellement de ceux exprimés par les microglies fraichement isolées à partir de cerveaux adultes. L’utilisation d’animaux vivants est donc requise. Par ailleurs, certains des rôles des cibles que nous cherchons à évaluer (i.e. effets sur comportement cognitif, en particulier dans le contexte de la maladie d’Alzheimer) ne peuvent être réalisées que sur animaux vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet (estimé à 2250) a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement pertinent. Par ailleurs, nous avons défini des stratégies de croisement de manière à limiter au maximum la production d’animaux qui ne seraient pas utiles pour l’expérimentation. Il est bien établi qu’il existe un important dymorphisme sexuel dans la biologie des cellules immunitaires du cerveau, les études seront donc réalisées à la fois chez le mâle et la femelle. Par ailleurs, la maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative. Nos données antérieures et celles de la littérature indiquent que les cellules immunitaires du cerveau pourraient jouer des rôles fonctionnels différents en début et en fin de pathologie, les effets des cibles d’intérêts seront donc évalués à deux stades différents, au stade précoce et à un stade plus tardif. Dans la mesure du possible, nous réaliserons l'expérimentation comportementale, et les analyses post-mortem sur les mêmes animaux. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation d'un logiciel permettant de déterminer le nombre d’animaux statistiquement requis en fonction des effets escomptés.
Raffinement
Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera effectué régulièrement. Des points limites spécifiques ont été définis (perte de poids continue et excessive (évaluée de manière visuelle); prostration ; poils ébouriffés, arrêt d’alimentation, etc.) et le raffinement s’appliquera pour une prise en charge adaptée des animaux. Pour les scores les plus importants, cette prise en charge pourra conduire à l’euthanasie de l’animal. En cas de blessures (notamment à la suite de bagarres entre animaux), des analgésiques d’application locale pourront être utilisés. Cependant, notre projet se référant à l’étude de processus neuroinflammatoires, l’utilisation d’analgésiques et d’antalgiques centraux (hors procédure d’euthanasie) est à proscrire pour des raisons scientifiques. . La présence d'une roue d'activité pour mesurer la rythmicité circadienne constitue un enrichissement très apprécié des souris. Ce test nécessite de travailler avec un seul animal par cage, mais les contacts visuels et olfactifs sont maintenus entre animaux de cages voisines.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal le mieux adapté pour étudier les effets des modifications génétiques sur le comportement, les tissus, les cellules et les molécules des cellules immuitaires du cerveau. L'utilisation de la recombinase Cre pour contrôler ces modifications génétiques est particulièrement intéressante. C'est pourquoi les modèles murins, en particulier dans la recherche sur la maladie d'Alzheimer, sont privilégiés. Ces avancées permettent de respecter au mieux les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Refinement). Nous utiliserons des animaux adultes à différents âges en fonction des sous-objectifs du projet : 2-3 mois pour les études en conditions physiologiques ; 4 et 8 mois, correspondant respectivement à un stade précoce et un stade avancé de la pathologie pour les lignées Alzheimer à début précoce; 9 et 12 mois, correspondant respectivement à un stade précoce et un stade avancé de la pathologie pour les lignées Alzheimer à début tardif.
La production intestinale de glucose est-elle capable de moduler les effets délétères du fructose sur la stéatose hépatique ?
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une biopsie de tissu pour génotypage, cinq jours d'injections consécutives, puis seize semaines d'un régime riche en graisses ou d'eau sucrée au fructose, avant six heures de jeûne et un prélèvement de sang terminal. Le porteur attend qu'elles deviennent en surpoids et pré-diabétiques, avec un foie plus gras, et signale que les souris privées de production intestinale de glucose présentent un phénotype anxieux léger. Des organes sans utilité pour ce projet seront aussi prélevés afin de constituer une banque de tissus, le porteur affirmant que l'étude "nécessite l'utilisation d'animaux" parce que la stéatose met en jeu des échanges entre organes.
Objectifs
L’obésité connait une croissance alarmante et représente un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux traitements proposés. Une consommation trop importante en graisses et en sucres est un acteur majeur de l’obésité. Parmi les sucres mis en cause, le fructose, retrouvé dans les fruits ou de nombreux produits issus de l’industrie agro-alimentaire (boissons sucrées notamment) est l’un des plus dangereux. En effet, la surconsommation de fructose conduit à une accumulation de graisses dans les cellules du foie, conduisant à un désordre métabolique appelé stéatose hépatique, ou foie gras. Si la surcharge en graisses se poursuit, la stéatose peut évoluer après plusieurs années en cirrhose, avec un risque de cancer du foie. Ainsi, comprendre comment réduire l’impact de la consommation de fructose sur la santé du foie est primordial. En dehors des périodes de repas, l’intestin est capable de produire du sucre (glucose). Ce glucose spécifique, produit en très petites quantités n’est pas nocif pour l’organisme. A l’inverse, il joue un rôle de molécule signal capable d’informer certaines régions clé du cerveau ; Ainsi il exerce des effets bénéfiques anti-obésité, anti-diabète et anti-stéatose hépatique (foie gras). On sait maintenant que l’activation génétique de la production intestinale de glucose protège des troubles induits par une alimentation trop riche en graisses et en sucres. Et à l’inverse, l’absence de production intestinale de glucose favorise l’apparition de ces troubles, malgré une alimentation saine. Ce projet vise à déterminer si la production intestinale de glucose est capable d’éviter ou de diminuer l’apparition d’un foie gras lors d’une consommation excessive de fructose associée ou non à une alimentation trop riche en graisses. Pour cela, nous allons étudier des souris normales et des souris génétiquement modifiées chez lesquelles l’intestin ne permet pas de produire du glucose ou bien au contraire d’en produire davantage par rapport aux souris normales. Chez ces souris, nous étudierons les effets d’une surconsommation de fructose. Les souris recevront du fructose dans l’eau de boisson ou une alimentation riche en graisses pendant au maximum 16 semaines. La prise de poids sera suivie toutes les semaines. Après 16semaines, les souris seront mises à jeun puis les taux de sucre et de graisses sanguins seront mesurés. Nous évaluerons le niveau de stéatose hépatique (foie gras).
Bénéfices attendus
La prévention et le traitement de l’obésité et de ses complications est un enjeu majeur de santé publique, et une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu est nécessaire. Une consommation excessive de fructose (retrouvé notamment dans les boissons sucrées), est extrêmement néfaste puisque cela conduit à l’accumulation de graisses dans les cellules du foie. En effet, avec un fort pouvoir sucrant à moindre coût, le fructose est de plus en plus utilisé par les industriels et ses effets néfastes sur le corps sont de plus en plus décrits. A l’inverse des sucres issus de l’alimentation, le sucre produit par l’intestin est bénéfique puisqu’il est capable de diminuer l’obésité, le diabète et l’accumulation de graisses dans le foie induits par une alimentaire trop riche en graisses et en sucres. Ce projet a pour but de déterminer si la production de glucose par l’intestin pourrait protéger des effets néfastes de la consommation de fructose sur le foie. Ce projet permettra alors d’élargir encore un peu plus le spectre des effets bénéfiques de la production de sucre par l’intestin, et de pouvoir la proposer comme cible thérapeutique intéressante contre l’obésité et ses complications. Par ailleurs, ce projet permettra pour la première fois de déterminer s’il existe des différences entre les mâles et les femelles en ce qui concerne les effets la production intestinale de sucre ou du fructose sur la stéatose hépatique.
Procédures
- Le projet comporte une partie d’élevage des souris génétiquement modifiées. Par conséquent, il comporte des interventions à visée de génotypage. Ainsi, une biopsie de tissu (geste réalisé en quelques secondes) sera réalisée pour vérifier la modification génétique. - Les souris recevront des injections pendant 5 jour consécutifs. Ce geste est réalisé en quelques secondes. - Les souris recevront pendant 16 semaines, soit une alimentation standard ou une alimentation riche en graisses avec de l’eau normale, soit de l’eau contenant du fructose dans le biberon. - Les souris seront pesées toutes les semaines (geste réalisé en quelques secondes), et la consommation de boisson mesurée 2 fois par semaines. - Après 16 semaines de traitement, une mesure du taux de sucre dans le sang (glycémie à partir d’une goutte de sang et un glucomètre ; réalisé en quelques secondes) et un prélèvement de sang terminal et seront réalisés (en quelques secondes). Cela sera réalisé après une mise à jeun de 6h. - Enfin, les animaux seront mis à mort par une méthode respectant l’éthique animale, afin de prélever leurs organes (dont le foie pour analyser sa teneur en lipides).
Impact sur les animaux
- Après 16 semaines de régime riche en graisses et/ou avec du fructose dans l’eau de boisson, les souris devraient être en surpoids, pré-diabétiques et avec un foie plus gras que celui des souris normales (mais sans impact sur leur mobilité). Dans cette étude, elles seront étudiées à un stade précoce du développement de l’obésité afin de limiter les complications liées à ces maladies. - Lors de la mise à jeun précédent la mise à mort (6h), l’ensemble des souris sont capables de maintenir une glycémie normale pendant ce temps court, ainsi aucun dommage supplémentaire n’est attendu chez les souris génétiquement modifiées par rapport aux souris normales. - Les souris sans production de sucre par l’intestin présentent un phénotype anxieux léger. Néanmoins, les conditions d’hébergement en milieu enrichi (nid, maison pour se cacher) sont suffisantes pour atténuer leur anxiété.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par une méthode éthiquement autorisée pour prélèvement du sang et de différents tissus. Des études moléculaires, histologiques et biochimiques seront réalisées afin d’évaluer l’impact de la production intestinale de sucre sur les effets du fructose et/ou du régime riche en graisses sur l’accumulation de graisses dans le foie. Des tissus non nécessaires à ce projet seront également prélevés afin de constituer une banque de tissus qui permettra à l’avenir de réduire le recours à des animaux supplémentaires.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles animaux puisque la pathologie étudiée, la stéatose hépatique, influence l’ensemble du métabolisme de l’organisme et implique des dialogues entre organes. De plus, le fructose est d’abord transformé par l’intestin en lipides (graisses), susceptibles de s’accumuler ensuite dans le foie. Le second site de transformation du fructose en lipides (graisses) est le foie. Ainsi, puisqu’elle implique de nombreux organes (et une communication entre eux), notre étude nécessite l’utilisation d’animaux. A l’issu des procédures, différents tissus non directement nécessaires à ce projet seront prélevés pour constituer une banque de tissus, commune au laboratoire et utilisable à l’avenir pour certaines analyses moléculaires sans nécessité d’animaux supplémentaires.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes. Ce nombre a été établi sur différents paramètres : La taille de l’effet, la puissance statistique ainsi que la variabilité entre les individus. Les années de pratique du laboratoire et du personnel qualifié nous ont permis de standardiser nos expérimentations le plus possible afin de diminuer les sources extérieures de variabilité inter-individus. Les modèles génétiquement modifiés nécessaires à ce projet sont conçus de telle sorte qu’ils permettent de produire à la fois des souris dont la PIG est réduite ou augmentée, et des souris témoins. Ainsi, l’utilisation des souris témoins issues de ces reproductions limite le recours à d’autres animaux, non génétiquement modifiés. De plus, afin de limiter la génération de souris avec un phénotype dommageable anxieux léger, le mâle ne sera pas constamment hébergé avec les femelles. Ceci évite ainsi une production en continu et permet d’obtenir un maximum d’animaux du même âge. De plus, un seul mâle sera nécessaire pour 2 cages de reproductions (contenant chacune 2 femelles). Enfin, les lots seront traités successivement afin de réduire le nombre de géniteurs nécessaires à l’obtention des groupes expérimentaux. Nous avons fait le choix ici d’étudier les mâles et les femelles afin de déterminer s’il existe une différence mâles/femelles des effets de la PIG et/ou du fructose sur la stéatose hépatique. Ainsi, si aucune différence n’est observée entre les sexes, les mâles et les femelles pourrons à l’avenir être regroupés dans des mêmes groupes expérimentaux, indépendamment du sexe. A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort afin de prélever différents tissus à analyser, mais également de nombreux autres tissus pour constituer une banque de tissus commune au laboratoire et utilisable à l’avenir pour certaines analyses moléculaires sans animaux supplémentaires.
Raffinement
D’après notre expérience, dans les conditions d’hébergement respectant la réglementation (en groupe et avec de l’enrichissement) aucun phénotype dommageable n’est observé chez les souris incapables de produire du glucose dans l’intestin. Cependant, une attention particulière sera portée sur toute manifestation de stress pour l’ensemble des animaux. Pour limiter leur stress, les animaux seront manipulés régulièrement par les personnes en charge des procédures expérimentales. Ils seront observés quotidiennement (état du pelage, mouvements/posture, morsures...) et pesés chaque semaine pour suivre leur prise de poids. L’échelle de grimace des souris sera utilisée quotidiennement pour nous aider à évaluer le bien-être des souris. En cas de petites plaies causées par les souris, une crème aux propriétés cicatrisantes et antiseptiques sera systématiquement appliquée par les zootechniciens. Nous aurons recours à des points limites définis et précoces. Plus précisément, nous serons attentifs au comportement, à l’apparence, et au poids de l’ensemble des souris. En cas d’atteinte d’un point limite, les souris pourront être mises à mort selon les méthodes autorisées par la législation si aucun moyen de traitement ou de prévention n’a été efficace. Les modèles génétiquement modifiés nécessaires à ce projet sont conçus de telle sorte qu’ils permettent de produire à la fois des souris dont la production intestinale de glucose/sucre est réduite ou augmentée, et des souris témoins. Ainsi, les souris témoins utilisées seront des souris issues des mêmes portées que les souris transgéniques, mais avec une production intestinale de glucose/sucre non modifiée. Ainsi, cela permet de maintenir l’ensemble des individus de la même portée, tout en s’affranchissant d’un éventuel effet cage lors de la mise en place des régimes. De plus, les cages seront séparées en fonction de leur traitement (en fonction de l’alimentation et s’ils ont du fructose dans le biberon).
Choix des espèces
Les effets de la production intestinale de glucose (sucre) sur le métabolisme glucidique et énergétique ont été étudiés chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Nos études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Ainsi, le modèle murin est compatible avec notre étude en raison de la disponibilité des souris génétiquement modifiées et des nombreux outils d’analyse. De plus, les phénotypes des souris utilisées dans ce projet ont été largement caractérisés. L’invalidation de la production intestinale de glucose sera faite à l’âge de 7 semaine (chez les souris témoins également) et les différents traitements commenceront 5 semaines après, soit à l’âge de 12 semaines. Ce temps de latence de 5 semaines permet une disparition complète des modifications du métabolisme induits par la molécule injectée. Afin de conserver les mêmes conditions expérimentales dans toute notre étude, les animaux n’ayant pas besoin de cette injection pour activer la production intestinale de glucose seront étudiés au même âge, soit 12 semaines. Par ailleurs, les résultats décrit dans la littérature ne proviennent que de souris mâles. Notre objectif est d’approfondir ces résultats mais également d’étudier si nous observons les mêmes résultats chez les femelles. Nous utiliserons donc à la fois des souris mâles et femelles.
Evaluation de la distribution sanguine et tissulaire de candidat-médicament par imagerie planaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Des entreprises clientes commandent ces études de distribution et le laboratoire leur facture le passage in vivo de leurs candidats médicaments. 1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit une molécule marquée par un élément radioactif, subit jusqu'à dix prélèvements de sang, passe jusqu'à dix séances d'imagerie sous anesthésie et séjourne en cage à métabolisme, un stress que le porteur qualifie lui-même de modéré. Le RNT présente l'imagerie planaire comme un moyen d'évaluer la distribution "sans sacrifice des animaux", avant d'indiquer que tous les animaux de chaque procédure sont mis à mort.
Objectifs
Les études de distribution tissulaire de médicaments biologiques représentent une étape essentielle dans leur développement. Ces études, demandées par les conseils scientifiques des entreprises clientes, ont pour but la compréhension et l’analyse du devenir du médicament dans l’organisme, d’évaluer une potentielle accumulation de ce dernier dans les organes et/ou tissus et ainsi de pouvoir mieux appréhender d’éventuels effets indésirables. Cette distribution est rendue possible par le marquage du médicament avec un élément radioactif non toxique aux doses utilisées, la radioactivité pouvant être suivie dans les tissus animaux après prélèvements ou par imagerie. L’objectif de ce projet est donc de suivre le devenir du médicament par la technique d’imagerie planaire, technique d'imagerie deux dimensions permettant de voir la localisation de la radioactivité du médicament dans l'animal et de faire une évaluation précoce du ciblage des molécules testées et de leur répartition vers les organes cibles et vers d’autres organes non-cibles (majoritairement foie et reins). L'imagerie planaire chez le même animal à différents temps post administration de la molécule radiomarquée permet d'évaluer la distribution de la molécule radiomarquée sans sacrifice des animaux contrairement à la biodistribution classique par prélèvement d'organe/tissus et permet ainsi de faire un screening rapide des molécules sur un nombre réduit d'animaux avant d'entreprendre des études de biodistribution plus poussées pour les molécules prometteuses. Ces études in vivo sont menées à partir de l’administration de médicaments préalablement marqués par un élément radioactif non toxique aux doses utilisées afin de tracer et de suivre par imagerie ces candidats dans les différents tissus et les fluides biologiques d’intérêt. Ces médicaments ont été testées chez nos clients et sont connus pour ne pas présenter d’effets délétères. Ce sont des protéines, des peptides et/ou des anticorps dilués dans des tampons respectant la physiologie de l’animal.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de caractériser la distribution tissulaire des composés thérapeutiques de nos clients dans l’organisme (organes cibles et organes non-cibles où ils pourraient s’accumuler de manière non désirée) et ainsi de sélectionner ceux qui feront ensuite l'objet d'études de distribution tissulaire avec quantification (l’imagerie permettant d’avoir une très bonne idée de la répartition du candidat mais sans quantification précise) et / ou d'efficacité dans le cadre d'autres projets.
Procédures
Sur animal vigile : Pesée (3 fois/semaine, 20 s) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 1 fois /jour et 2 fois, 15 s) ; prélèvements de sang par microsampling (10 fois maximum, 1 min) Sur animal anesthésié : Prélèvement de sang terminal en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois, 15 s) ; Imagerie planaire (jusqu’à 10 fois ; 10 min ou une fois : 2 heures)
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère liés à l’administration des molécules radiomarquées en sous cutanée, gavage oral, voie intramusculaire, voie intra péritonéale ou intraveineuse ; stress lié à l’anesthésie à l’isoflurane ; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ; Stress modéré lié à la mise en cage à métabolisme.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux de chaque procédure lorsque l’une des conditions ci après est remplie : Prélèvement d’organe ; Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animale ; Fin de l’étude
Remplacement
Les molécules testes de nos clients ont fait l’objet d’études d’efficacité in vitro et/ ou in vivo au préalable. Néanmoins, évaluer la distribution tissulaire et l’accumulation d’un composé thérapeutique dans un organisme vivant implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité finale dépendra entre autre de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement, ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.
Réduction
Les groupes d'animaux utilisés sont en théorie de 2 maximum. En effet, la caméra planaire permet une vision fiable, rapide et reproductible de la distribution tissulaire. Elle peut représenter une étape préalable de validation rapide de candidats médicaments qui pourront être évalués dans un second temps par des méthodes quantitatives et robustes si pertinent. De plus, les biodistributions classiques entraînent la mise à mort des animaux à chaque temps d’intérêt. La mise en place de l’imagerie planaire par notre laboratoire permettra un suivi longitudinal des animaux et un nombre d’animaux utilisés bien moins important que classiquement.
Raffinement
Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux sont surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles sont mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux de 2 à 3 par cage maximum dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie éventuelle et de préhension des animaux.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similitude de sa biologie par rapport à l’Homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser la distribution de candidats médicaments variés. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 6 et 12 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est décrit comme mature.
Suivi calcique lors d’une crise d’épilepsie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 104
Dès qu'une convulsion tonique apparaît, ou si l'état épileptique dure plus de vingt minutes, l'animal est anesthésié ou tué. 104 souris et 104 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue parce que les deux chirurgies et les crises peuvent affecter durablement leur qualité de vie. Chacun subit deux opérations du crâne à une semaine d'intervalle, l'une pour injecter un vecteur viral, l'autre pour poser un implant, puis reçoit une substance convulsivante et porte un miniscope sur la tête pendant deux heures et demie. Le porteur indique que ces modèles de crises induites chimiquement sont "recommandés" pour tester l'efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché.
Objectifs
A l'heure actuelle, il existe des traitements médicamenteux qui permettent de traiter une partie des patients épileptiques. Néanmoins, environ 30 % des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux et sont dits "pharmaco-résistants". La recherche de nouvelles thérapies est donc nécessaire pour améliorer la qualité et l'espérance de vie des patients. L'objectif du projet consiste à mieux caractériser les modèles d'épilepsie chez le rongeur et évaluer de nouveaux candidats médicaments pour lutter contre les épilepsies généralisées ou partielles. L’augmentation de la concentration en calcium intracellulaire, fait partie des signaux précurseurs avant l’apparition de décharges électriques et de la crise d’épilepsie comportementale. Cette augmentation en calcium peut mener à des modifications transitoires ou permanentes sur la plasticité et la mort neuronale. La compréhension du rôle du calcium dans l’induction de l’épilepsie pourrait permettre de nouvelles avancées thérapeutiques pour traiter cette maladie. Les crises généralisées correspondent à des décharges électriques anormales au niveau cérébral (où les 2 hémisphères sont touchés), qui se traduisent par des convulsions tonico-cloniques. Les convulsions cloniques sont des secousses musculaires incontrôlées alors que les convulsions toniques correspondent à un raidissement et une contraction soudaine des muscles du corps et des membres inférieurs et supérieurs accompagnés d'un arrêt respiratoire, qui peut conduire à la mort dans certains cas. Les crises partielles sont liées à une décharge électrique anormale dans une région cérébrale spécifique. Les symptômes de la crise dépendent de la zone atteinte. Des fourmillements, picotements ou encore secousses musculaires incontrôlées au niveau d'un membre peuvent être observés chez l'Homme. Les épilepsies peuvent être non-convulsives, on parle alors de crises d'absence. Elles affectent principalement les enfants et correspondent à une perte de conscience (avec un regard dans le vide). Le projet consiste en la mise en place d’une technique de suivi calcique intracérébrale lors d’une crise d’épilepsie généralisée ou partielle, avec ou sans mesure de l’électroencéphalogramme chez le rongeur. Une fois la technique établie, ces modèles pourront être utilisés pour évaluer l'efficacité de substances pharmacologiques en développement.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux caractériser certains modèles d’épilepsie induits par une substance chimique par la mesure du calcium intracellulaire au niveau cérébral. L’évaluation de ce nouveau paramètre sur le flux calcique, en plus des décharges électriques et du comportement convulsif chez l’animal, sera utile pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et mieux comprendre leurs mécanismes d’action. Les modèles de crises généralisées et partielles induites par une substance chimique sont recommandés pour identifier et tester l’efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour améliorer les conditions ainsi que l’espérance de vie des patients épileptiques. A l'heure actuelle, les traitements antiépileptiques existants sont uniquement symptomatiques. Néanmoins, 10 à 30% des patients interrompent leur traitement initial en raison des effets secondaires indésirables ou de l'inefficacité des traitements (résistance aux traitements).
Procédures
Pour chaque procédure décrite, les animaux sont opérés deux fois avec un intervalle d’une semaine pour injecter le vecteur viral (45 minutes, 1 fois) puis réaliser la pause d'implant (90 à 150 minutes, 1 fois). Pour les études d’efficacité, les candidats médicaments sont administrés par un bolus rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat médicament. Pour chaque procédure, une substance réactive est administrée par bolus rapide, une fois, sur quelques secondes ainsi qu’une substance anti-épileptique, administrée de la même manière, en fonction des symptômes observés. Le comportement de l'animal sera évalué immédiatement après l’injection de la substance réactive (pendant 30 minutes à 2 h30). Pendant le test, un miniscope sera placé sur la tête de l’animal pour permettre le suivi calcique intracérébral. En fonction de la procédure, l’électroencéphalogramme sera évalué en activant l’implant télémétrique. Des prélèvements sanguins peuvent également être envisagés avant le test (a minima 24 heures avant le test) ou en fin d'étude pour compléter les données in vivo par des données biochimiques ou histologiques.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les animaux seront opérés deux fois à un intervalle d'une semaine. La phase d'anesthésie peut induire un léger stress et la phase chirurgicale peut entraîner des douleurs post-opératoires au niveau du crâne de l'animal. Des problèmes de cicatrisation peuvent également être observés, notamment si l'animal se gratte. Les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment du fait de la contention de ce dernier. Pendant le test, un miniscope de quelques grammes sera placé sur la tête de l'animal pour une durée maximale de 2h30. Les crises partielles peuvent conduire à l'apparition d'un état épileptique permanent (supérieur à 25 minutes), caractérisé par une hypersalivation, des mouvements de la tête et des pattes avant, un redressement de l’animal et une perte d’équilibre. Dans les tests modélisant des crises généralisées, des convulsions cloniques peuvent être observées. Ces crises correspondent à une perte d'équilibre de l'animal avec des mouvements incontrolés des membres antérieurs et postérieurs dont la durée n’excède pas quelques minutes.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure car les 2 interventions chirugicales ainsi que les crises épileptiques (convulsives ou non) peuvent affecter durablement leur qualité de vie.
Remplacement
Il existe des techniques alternatives in vitro permettant d'évaluer l'effet de traitements sur les variations de calcium intracellulaire lors de l'ajout d'une substance chimique sur des cultures primaires de neurones. Ces tests permettent de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux et les paramètres physiologiques (température corporelle par exemple).
Réduction
Le nombre d'animaux est ajusté afin de pouvoir mettre en place la technique de manière fiable et évaluer plusieurs paramètres en parallèle (intensité moyenne du suivi calcique, électroencéphalogramme et comportement). Le nombre d’animaux est également adapté pour évaluer l'effet d'un composé en réalisant une seule étude et en fonction des analyses statistiques réalisées dépendant de la nature des données: variables dichotomiques, données paramétriques ou non paramétriques.
Raffinement
Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Pour chaque phase chirurgicale, une analgésie est assurée par l’administration d'analgésiques injectés par voie systémique et l'utilisation d'un analgésique local. Un gel ophtalmique est également appliqué pendant la chirurgie pour éviter le dessèchement oculaire. La température corporelle est surveillée pendant toute la durée de l'anesthésie jusqu'au réveil de l'animal. Un suivi des animaux est assuré suite à la chirurgie avec des soins adaptés (prise pondérale, désinfection le cas échéant). Les animaux sont hébergés deux par deux, et systématiquement avec un enrichissement adapté (bois à ronger et frisure). Dès l’apparition de convulsions cloniques, une substance antiépileptique sera administrée. De la même manière, l’animal recevra une substance antiépileptique si un état épileptique persiste au-delà de 20 minutes. Les animaux seront anesthésiés et/ou euthanasiés, immédiatement après l'apparition d'une convulsion tonique ou la persistance d'un état épileptique.
Choix des espèces
Les modèles de crises convulsives induites par une substance chimique sont largement décrits dans la littérature chez le rongeur après sevrage jusqu'à l'âge adulte (souris et rat) car les crises chez l'humain sont également détectées chez des sujets jeunes et adultes. Les procédures décrites dans ce projet sont recommandées pour évaluer l'efficacité de nouveaux candidats médicaments dans le cadre de l'épilepsie.
Analyse de l’effet de candidats médicaments sur la physiopathologie de la dégénescence neurofibrillaire et les dépots amyloides dans des modèles murins de la maladie d’alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
12 788 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 11 088 subissent une biopsie de la queue, 4 808 une injection dans le sinus rétro-orbital, 12 588 reçoivent un composé pharmacologique par l'eau de boisson jusqu'à quatre mois d'affilée, et 6 336 passent des tests cognitifs nommés, actimétrie, labyrinthe en Y et labyrinthe de Barnes. Ces souris portent des modifications génétiques qui reproduisent les lésions de la maladie d'Alzheimer, que le porteur décrit pourtant comme dépourvues de "phénotype dommageable". Aucun calcul ne vient soutenir ces effectifs, le RNT indiquant seulement que le nombre a été "réduit au maximum" pour cinq familles de composés brevetés par l'équipe.
Objectifs
L’objectif général de notre projet consiste à comprendre le mode d’action, a découvrir la cible et à optimiser l'effet thérapeutique de 5 familles de composés pharmacologiques innovants, brevetées par notre équipe, dans la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer (MA). Cette maladie neurodégénérative liée à l’âge, est caractérisée par la présence de deux types de lésions neuropathologiques cérébrales particulières: les dépôts amyloïdes, constitués de peptides amyloïdes et les dégénérescences neurofibrillaires (DNF), qui résultent de l’agrégation de protéines microtubulaires Tau anormalement phosphorylées. Nos composés se différencient des molécules développées jusqu’à présent par un mécanisme d’action qui s'adresse à ces deux caractéristiques de la maladie. L’étude de l'action de nos composés sur les deux processus lésionnels, la neuroinflammation et les fonctions cognitives de la MA nécessite l’utilisation de modèles intégrés. Elle ne peut pas être abordée sur d’autres systèmes biologiques. Nos composés pharmacologiques ont fait l'objet de nombreuses études in vitro préalables aux analyses in vivo. Une première étape a permis d'éliminer les composés présentant de la toxicité cellulaire. Les composés sélectionnés ont ensuite été caractérisés en fonction de leurs capacités à inhiber l'expression et la phosphorylation de la protéine Tau sur ses sites pathologiques et à inhiber la voie amyloïdogénique dans des modèles cellulaires caractérisés. Le chef de file de chacune des 5 familles a été sélectionné. Leur effet thérapeutique doit maintenant être analysé par des approches intégratives dans des modèles expérimentaux reproduisant soit les altérations de la protéine Tau, soit les lésions amyloïdes. La cible thérapeutique sera également validée in vivo après identification dans nos modèles cellulaires. Ainsi, l'efficacité et la sélectivité de nos candidats médicaments sera renforcée. Les résultats obtenus grâce à nos modèles expérimentaux constituent une étape essentielle et préalable à la translation vers le patient sur le plan thérapeutique, mais également sur le plan diagnostic. Notre stratégie expérimentale a déjà fait ses preuves par le passé. Elle a permis le développement d’une start-up et la mise en place d’essais cliniques. Ainsi, notre projet permet de lever des interrogations fondamentales quant aux processus mis en jeu dans la MA, mais il répond également à des besoins cliniques en termes de thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet combine des approches expérimentales pré-cliniques indispensables à la validation des effets bénéfiques de composés innovants. Il permet de disséquer les mécanismes lésionnels et les fonctions cognitives, de comprendre le mode d’action de nos composés et d’optimiser leur structure chimique. L’originalité de ce projet repose sur une action originale de nos composés, à la croisée des voies induisant les altérations de la protéine Tau et les lésions amyloïdes. Les pathologies liées à la neurodégénérescence ne bénéficient, à l’heure actuelle, d’aucun traitement permettant de ralentir ou stopper la maladie. Elles touchent plusieurs dizaines de millions de personnes dans le monde. Nous bénéficions du soutient de la SATT et d’Inserm Transfert pour la valorisation et la protection de nos résultats. A plus long terme, nos données pourront implémenter les approches cliniques existantes et susciter des essais cliniques ultérieurs.
Procédures
11088 animaux subiront une biopsie de la queue pour le génotypage. 4808 animaux subiront une administration intraveineuse rapide et unique dans le sinus retro-orbital. 12588 feront l’objet d’une administration de composé pharmacologique. Les molécules seront préférentiellement administrées via l’eau de boisson (composés solubles dans l'eau), pendant 4 mois maximum. Alternativement, les composés pourront être administrés par voie orale ou par voie intra-péritonéale (administration journalière, 100 à 150 µL). Les animaux seront alors traités pendant 1 mois maximum. En dernier recours, si une administration par voie intra-veineuse devait être réalisée, une seule injection sera réalisée (100 µL max). Les fonctions cognitives seront étudiées sur 6336 animaux grâce à des tests comportementaux afin d’étudier les effets des composés sur les déficits cognitifs associés à la pathologie. La motricité globale des individus est analysée par un test d’actimétrie. La mémoire spatiale à court terme est évaluée par le test du labyrinthe en Y. La mémoire à long terme est évaluée par le test du labyrinthe de Barnes.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables consistent aux douleurs associées à la réalisation de la biopsie de la queue ou à la douleur au point d'injection lors des administrations. Il peut également y avoir un impact oculaire suite aux injections retro-orbitaires. Ces nuisances possibles seront prises en charge de manière adéquate.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort au point d’analyse final. Des études histochimiques, moléculaires et biochimiques seront réalisées sur les échantillons de cerveaux afin d’analyser les modulations des caractéristiques physiopathologiques spécifiques aux modèles.
Remplacement
Ce projet combine des approches expérimentales pré-cliniques, indispensables à la validation des effets bénéfiques de composés innovants. Les résultats obtenus grace à nos modèles expérimentaux consituent une étape essentielle et préalable à la translation vers le patient sur le plan thérapeutique, mais également sur le plan diagnostic. Notre équipe de recherche a recours à des systèmes biologiques alternatifs aux modèles animaux (techniques de biologie moléculaire et cellulaire) préalablement à l’étude de l’impact des composés sur les deux processus lesionnels, la neuroinflammation et les fonctions cognitives de la maladie d'Alzheimer qui ne peuvent être abordés sans l’utilisation de modèles intégrés.
Réduction
Notre plan d’expériences permettra de limiter le nombre d’individus au maximum. Une première procédure permettra définir deux concentrations, ainsi qu’un protocole d’administration et un schéma thérapeutique optimaux pour chaque des chefs de file de chacune des 5 familles de candidats médicaments. Les données récoltées seront exploitées et maximisées pour chaque individu afin de limiter ou d’éviter l’utilisation subséquante d’animaux supplémentaires. Pour chacun des groupes d’individus, le nombre a été réduit au maximum tout en permettantl’obtention de résultats robustes (différences statistiquement observables).
Raffinement
Les modèles expérimentaux sont maitrisés par notre équipe et répandu dans les laboratoires étudiants les mécanismes lésionnels et les fonctions cognitives dans la maladie d'Alzheimer. Les points d’analyses nécessitant une mise à mort ont été clairement définis grâce à la bibliographie. Les animaux seront hébergés en groupe. Des éléments d’enrichissement du milieu seront disposés dans chaque cage. Un suivi hebdomadaire des paramètres macroscopiques comportementaux (prostration, isolement, douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable) sera réalisé, en lien avec le personnel animalier. Toute modification de comportement sera prise en charge par des approches appropriées. Les signes de souffrance seront recherchés de manière active, en lien la personne en charge du suivi du bien-être animal (SBEA). Les animaux présentant un des points limites spécifiés dans chacune des procédures seront mis à mort dans une salle dédiée.
Choix des espèces
Dans notre étude, nous utilisons des souris de fond génétique C57BL/6J et génétiquement modifiées. Les modèles utilisés ne présentent pas de phénotype domageable. Ils reproduisent les altérations de la protéine Tau (modèle THY-Tau22) ou les lésions amyéloïdes (modèle APP/PS1) observées lors de la maladie d'Alzheimer et permettent d’étudier les mécanismes pathologiques et l’impact de nos candidats médicaments sur le processus lesionnels et les fonctions cognitives par des approches intégratives et complémentaires (transcriptomique, protéomique, étude du comportement, histochimie). Nos traitements, à visée curative, sont donc administrés à des animaux agès de 6 mois, période à partir de laquelle la pathologie est avérée. Dans les procédures qui nous permettront de valider notre cible thérapeutique, d’étudier son impact sur le developpement de la maladie et les concéquences de sa modulation, la surexpression ou l’inhibition de l’expression de cette cible sera réalisée grace à un protocole utilisé classiquement par les équipes de recherche, consistant à une injection unique d’un vecteur chez de jeunes animaux.
Évaluation de nouveaux traitements contre la maladie du greffon contre l’hôte
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Rats : 600
Greffés de cellules immunitaires humaines qui attaquent leurs propres tissus, 2 500 souris et 600 rats développent une maladie du greffon contre l'hôte, avec perte de poids, perte de poils, diarrhées, mobilité réduite et défaillance d'organes pouvant les tuer. S'y ajoutent des gavages, des injections rétro-orbitaires sous anesthésie, des prises de sang répétées et des mesures de température par sonde rectale. Le porteur ouvre le paragraphe des effets en parlant de nuisances "modérées", avant d'y ranger, quelques lignes plus loin, la mortalité par défaillance d'organes qu'il qualifie de sévère. Tous les animaux sont tués à l'issue, l'évaluation des candidats médicaments réclamant l'analyse des tissus et du système immunitaire en fin d'étude.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements sur des modèles de la maladie du greffon contre l’hôte. La maladie du greffon contre l’hôte (GvHD : Graft versus Host Disease) peut survenir après une greffe de moelle osseuse réalisée dans le cadre du traitement d’une leucémie. Les lymphocytes T contenus dans le greffon vont attaquer les cellules du patient greffé, conduisant à des lésions des tissus sains. La maladie du greffon contre l’hôte est une complication grave, parfois mortelle. Elle survient lorsque les cellules du donneur présentent une incompatibilité immunologique avec celles du receveur, et perçoivent ces dernières comme étrangères. Dans ce cas, les lymphocytes T du donneur, dits « alloréactifs », vont alors détruire les cellules et tissus sains de l’hôte. Ce phénomène survient chez environ 20 à 50 % des patients greffés, rapidement après l’intervention ou plus tardivement. Il peut être très difficile à traiter. Les informations qui seront générées par le biais de ces études seront utilisées pour préparer les phases précliniques et cliniques du développement pharmaceutique. Ces informations comprennent entre autres : • Dose minimale produisant un effet thérapeutique • Dose minimale pour lequel l’effet thérapeutique est le plus élevé. • Déterminant pharmacocinétique qui conduit à l’efficacité thérapeutique • Régime de doses pour les études toxicologiques exploratoires et règlementaires. • Régime de doses pour les essais cliniques chez le volontaire sain, puis chez le patient.
Bénéfices attendus
La maladie du greffon est contrôlée à l’aide de médicaments immunosuppresseurs qui atténuent le conflit immunitaire entre les cellules du donneur et celles du receveur. Ces traitements peuvent durer plusieurs mois, voire plusieurs années. Cependant beaucoup de patients sont réfractaires aux corticoïdes et de nouveaux traitements sont nécessaires puisque la maladie du greffon contre l’hôte est une cause de mortalité et de morbidité majeure. Les traitements biologiques récents sont très couteux et peuvent engendrer une immunogénicité et une perte d’efficacité due à la production d’anticorps neutralisants par le patient. Les études qui constituent ce projet s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes (y compris des thérapie cellulaires et fécalothérapie). A court terme, elles permettront de confirmer l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans les pathologies de la GvHD. A plus long terme, ces études constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux. • Pesées d'un animal vigile, pendant 30s jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Mesure de la température corporelle d'un animal vigile ou sous anesthésie générale via une sonde rectale pour rongeur pendant 30s. • Les prélèvements de sang via la veine caudale seront réalisés soit sur animal vigile, soit sur animaux anesthésié à l’isoflurane pendant 30 à 60s. Les prélèvements de sang terminaux par ponction cardiaque seront effectués sous anesthésie générale (Isoflurane ou kétamine/xylazine) pendant 30 à 60s. Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne en vigueur. Les volumes seront généralement de 20 à 50 µl chez la souris et de 20 à 200 µl chez le rat. Le volume total prélevé n’excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l’animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place pouvant aller jusqu’à une semaine. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques par voir orale (gavage à l’aide d’une sonde gastrique), intrapéritonéale, sous-cutanée ou via la veine caudale) pendant une durée de 15 à 30s : Sur animaux vigiles. • Administrations intraveineuses par voie retro orbitale : Sous anesthésie générale (Isoflurane ou kétamine/xylazine) pendant 15 à 30s.
Impact sur les animaux
Cette procédure induira chez l’animal un certain nombre de nuisances modérées : injection de cellules, , administration de traitement par gavage ou injection (ip, iv, sc) pendant plusieurs jours ainsi qu’une préhension accompagnant ces administrations. De plus, les animaux seront également soumis à une anesthésie, des administrations de composés (voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous cutanée) et des prélèvements sanguins sous anesthésie générale qui peuvent générer également des nuisances. Les effets indésirables attendus (suite à une xénogreffe) sont une perte de poids, une perte de poils, une piloérection, une réduction de la mobilité, des diarrhées, des douleurs qui selon la gravité justifierait une mise à mort immédiate (modéré). Une GvHD peut entrainer une mortalité selon le type de greffe, notamment lors de xenogreffe qui peut entrainer une défaillance des organes de l’hôte . ‘sévère
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort. L’évaluation de l’efficacité des composés à potentiel thérapeutique nécessite des analyses approfondies de différents tissus et du système immunitaire en fin d'étude.
Remplacement
Il existe des modèles de peau humaine isolée qui permettent de détecter avec une grande précision la possibilité pour un patient de développer une GvHD (compatibilité donneur/receveur). Cette méthode a aussi été utilisée avec des peaux de rats pour des études de transcriptomiques et recherche de biomarqueurs. Cependant, ce système dépourvu d’autres organes et de structures immunologiques clés (rate, système lymphatique, hépatique, rénale et circulatoire) ne peuvent pas à ce jour constituer un environnement fiable pour des études de pharmacologie in vivo. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.
Réduction
Les entités thérapeutiques auront préalablement été évaluées de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent par exemple de prédire le profil pharmacocinétique d’un composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. Chaque étude comprendra en moyenne 60 animaux (10 animaux par groupe : Ctrl-Naif, Vehicle et 4 groupes traités avec des composés). Chaque projet de développement nécessite en moyenne l’évaluation de 5 entités thérapeutique expérimentale. Nous estimons réaliser 2 projets par an dans le domaine de la GvHD. Le nombre d’animaux est donc 60 (animaux par étude) x 5 (composé par projet) x 2 (projet par an) x 5 ans. Ainsi, les tests sur animaux sont réduits au minimum nécessaire (3100 animaux estimés).
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux exigences règlementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront hébergés en groupe dans des cages contenant de l’enrichissement afin de satisfaire la manifestation de leur comportement naturelle (nidification, instinct grégaire, recherche de nourriture,..). Les procédures potentiellement douloureuses ou source d’inconfort ou de stress se feront sous anesthésie générale gazeuse. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique à minima journalière sur la durée des procédures. Les locaux d'hébergement et les systèmes d’hébergement suivront un programme d’hygiène et sanitaires (programme sanitaires) afin de prévenir tout biais. Les conditions d’ambiance seront contrôlées sur la durée des procédures. Un programme de soins adaptés sera mis en œuvre pour l’ensemble des animaux affectés à ce projet, par ou sous l'autorité du vétérinaire ou mis à mort selon les recommandations définis dans la consigne en vigueur. Un plan d'action incluant la communication sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire car Le stress lié à la manipulation peut être une nuisance pour l’animal, et aussi avoir un impact sur la réponse inflammatoire et immunitaire. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile.
Choix des espèces
La grande majorité des modèles et des techniques utilisés dans le cadre de la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez les espèces rats et souris qui sont communément utilisées en pharmacologie. De nombreuses données sur les modèles de GvHD chez le rongeur existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets. Adulte : Les données de la littérature indiquent clairement que les rats (4-5 semaines) et les souris adultes (7-8 semaines) représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine de la GvHD car ils doivent disposer d'une système immunitaire mature
Modèle de Maladie de Parkinson chez la Souris : approche thérapeutique par transfert de gène dans un modèle de souris inoculée par des fibrilles d’alpha-synucléine.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une trentaine de minutes de chirurgie crânienne, répétée trois mois plus tard pour près de la moitié d'entre elles, puis six séries de tests moteurs étalées sur un an. 195 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des fibrilles d'alpha-synucléine leur sont injectées dans le cerveau pour y provoquer une maladie de Parkinson, avec ralentissement des mouvements et perte d'équilibre attendus trois à six mois plus tard chez les souris non traitées. Le porteur nomme les tests, rotarod pour la coordination, épreuve de balance, mesure de force musculaire, et retient la souris parce que son petit cerveau favorise la diffusion des fibrilles, avec des animaux inoculés à 12 mois et suivis jusqu'à 24 mois pour reproduire l'âge tardif de la maladie humaine.
Objectifs
Notre objectif est d’évaluer l’effet thérapeutique d’un vecteur viral de type adénovirus (AAV) dans le cadre d’un projet de thérapie génique ciblant la maladie de Parkinson, en utilisant un modèle de souris âgées de plus de 12 mois atteintes de la maladie de Parkinson. Les vecteurs virus adéno-associé recombinants (rAAV) ont récemment montré des résultats encourageants pour le traitement de maladies génétiques. La thérapie génique par vecteurs AAV est en plein développement dans plusieurs maladies humaines, notamment dans certaines affections neurologiques. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative sévère caractérisée par la mort d’un certain type de neurones (dopaminergiques) et dont la fréquence augmente chez des personnes de plus de 60 ans. Cette affection provoque des difficultés motrices importantes voire invalidantes. Même s’il existe des traitements qui peuvent améliorer les symptômes, il n’existe pas à ce jour de traitement curatif de la pathologie. L’accumulation dans certains neurones d’agrégats de protéines composés d’alpha-synucléine est un mécanisme central de la maladie humaine qui conduit à la mort des neurones. Pour mettre au point une thérapie génique innovante, notre objectif est de créer un modèle d’étude de la maladie pertinent, pour cela nous utiliserons le modèle souris, dans lequel nous inoculerons des agrégats (fibrilles) d’alpha-synucléine dans le cerveau. Deux études ont déjà pré-établi la faisabilité de ce type de modélisation. Pour mimer la phase la plus sévère de la maladie, nous devrons recréer les conditions pathologiques chez des souris assez âgées. Nous inoculerons donc les fibrilles chez des souris âgées de 12 mois, pour mimer l’âge tardif de survenue chez l’homme. Nous étudierons les effets de transfert des gènes thérapeutiques introduits via des vecteurs viraux dans le cerveau de ces souris, pour contrecarrer les mécanismes de la maladie. La mise en évidence d’un effet bénéfique de la thérapie génique sur les paramètres pathologiques, cliniques, cellulaires et biochimiques, des souris-modèles ouvrirait une possibilité nouvelle de traitement chez l’homme. En résumé, l’objectif du projet est d’établir un modèle préclinique pour tester un nouveau vecteur de thérapie génique, constituant ainsi la première étape d’une démarche translationnelle en direction de la maladie humaine. Cette démarche nécessite l’établissement d’une preuve de concept thérapeutique dans l’espèce souris.
Bénéfices attendus
La thérapie génique par vecteurs AAV est en plein développement dans plusieurs maladies humaines, notamment dans certaines affections neurologiques. Elle s’appuie sur une dizaine d’années d’essais chez l’homme (plus de 2000 patients, atteints de diverses maladies, ont reçu des vecteurs AAV). Elle est considérée comme un des principaux espoirs de traitement curatif, à condition de prouver ses effets, dans un premier temps, dans des modèles animaux pertinents. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative sévère dont la fréquence augmente chez les personnes de plus de 60 ans. Elle n’a pas de traitement curatif et son évolution est invalidante. Cette maladie est caractérisée par la mort de neurones dopaminergiques entraînée par l’accumulation anormale d’agrégats de protéines riches en alpha-synucléine (une protéine présente normalement sous forme non agrégée dans les neurones). Pour tester un traitement innovant notre objectif est de créer un modèle d’étude pertinent de la maladie chez la souris, en inoculant des fibrilles d’alpha-synucléine dans le cerveau. La mise en évidence d’un effet bénéfique de la thérapie génique dans notre modèle ouvrirait une possibilité nouvelle de traitement applicable à l’homme.
Procédures
Chirurgie : Préparation de l’acte chirurgical et de l’anesthésie -Durée : 30 minutes -1 fois pour 90 souris -2 fois pour 90 souris à 3 mois d’intervalle Acte chirurgical : injection de fibrilles et/ou de vecteur thérapeutique et/ou d’une solution saline -Durée : 30 minutes -1 fois pour 90 souris -2 fois pour 90 souris à 3 mois d’intervalle Habituation à l’expérimentateur : 3 minutes par souris et par jour, durant 5 jours consécutifs Tous les 2 mois, 6 fois au total Tests comportementaux : Trois types de tests comportementaux seront réalisés tous les 2 mois après l’injection de fibrilles sur afin d’évaluer la balance, la coordination et la force musculaire de l’ensemble des animaux. Ces tests vont permettre d’étudier les effets du traitement par transfert de gène thérapeutique dans le cerveau des souris pour contrecarrer les mécanismes de la maladie de Parkinson. Test 1 : test de coordination Durée : 20 minutes/jour cad 4 passages d’environ 5 minutes max sur le rotarod avec 1 heure de repos entre chaque passage. Répétition : 3 jours consécutifs Test 2 : test de balance Durée : 20 minutes par jour Répétition : 4 jours consécutifs Test 3 : test de force musculaire Durée : 15 minutes Répétition : 3 jours consécutifs Ces trois types de tests seront réalisés au total 6 fois au maximum pour tous les animaux.
Impact sur les animaux
Les complications liées à aux chirurgies sont rares mais peuvent entrainer : - une altération grave du comportement, - des séquelles de traumatisme non-résolues par traitement, - un incident d’anesthésie avec séquelles (troubles respiratoires, fausse déglutition), - une hémorragie sévère en cours de chirurgie, - une perte de poids au cours de la semaine suivant l’intervention. L’injection de fibrilles d’alpha-synucléine entrainera un développement progressif de la maladie de Parkinson qui se traduira par des déficits moteurs (ralentissement des mouvements, perte d’équilibre). Ces symptômes devraient apparaitre environ 3 à 6 mois après l’injection de fibrilles dans le groupe des souris non traitées par vecteur thérapeutique. Une perte de poids peut en découler.
Devenir
A la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés. Le but est de prélever les organes post-mortem des animaux, et d'effectuer des analyses biomoléculaires et histologiques. Les cerveaux et les foies de ces animaux seront prélevés. Le but est de regarder l’effet des vecteurs thérapeutiques sur les marqueurs de la maladie de Parkinson.
Remplacement
Toutes les constructions génétiques (vecteurs viraux) utilisées seront caractérisées in vitro avant leur utilisation chez l’animal. Des études in vitro sur des cultures de cellules ont déjà été menées. Cependant, elles ne nous permettent pas d’évaluer l’efficacité des constructions génétiques pour corriger les manifestations cliniques de la maladie à l’échelle de l’organisme entier.
Réduction
La constitution des groupes est basée sur notre expérience et le type d’analyses réalisées nous permettant d’obtenir des données statistiquement significatives pour évaluer l’effet thérapeutique du traitement. Nous avons effectué une large recherche bibliographique afin de nous assurer de ne pas dupliquer des protocoles expérimentaux déjà réalisés. Cette recherche bibliographique nous a permis d'optimiser nos procédures et le nombre d'animaux à utiliser afin d'obtenir des résultats statistiques exploitables, robustes et valables. Les effectifs prévus ont été réduits au maximum. Ce nombre, validé par le un logiciel spécialisé, permettra de fournir un résultat fiable et statistiquement analysable pour chaque sous-groupe.
Raffinement
Pour l'administration des fibrilles et du vecteur thérapeutique, des protocoles anesthésiques et analgésiques adaptés seront mis en place selon la procédure. Nous surveillerons l’état de santé des souris tout au long de l’expérience, et de manière accrue en post-opératoire. Cela permettra une intervention immédiate et de appropriée si des signes de souffrance apparaissent et les points limites sont atteints. Tout au long de l’expérience un suivi précis des souris sera mis en place : pesées et observations hebdomadaires des animaux. L'application de critères de points limites permettra de veiller au bien-être des animaux. Afin de suivre l’apparition des signes cliniques de la maladie de Parkinson et d’évaluer l’effet du vecteur thérapeutique sur la maladie, un suivi précis des animaux sera mis en place à + 2 mois post-opératoire, âge à partir duquel les premiers signes cliniques de la maladie de Parkinson devraient apparaître : mise en place de tests de comportement tous les 2 mois afin de suivre une éventuelle modification du comportement de l’animal et le développement de déficits moteurs. Les souris seront habituées progressivement aux protocoles comportementaux et aux examinateurs. Cela permettra d’avoir un suivi régulier et proche des animaux. Enfin, nous assurerons le bien-être des animaux tout au long de l’expérimentation en limitant leur angoisse grâce au suivi des conditions d’hébergement, et d’utilisation de cages proposant un environnement riche.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme espèce d’étude préclinique a plusieurs justifications : - l’établissement d’un modèle original chez la souris de la maladie de Parkinson à un stade avancé permettra des études des mécanismes de la maladie et permettra également de tester des traitements ; - l’existence de modèles souris de maladie peu sévère basés sur l’inoculation de fibrilles établit la faisabilité de notre projet ; - la grande majorité des études de thérapie génique commence dans un modèle de souris pathologique, et selon les résultats peut se déployer secondairement chez le primate ; - la petite taille du cerveau de souris est propice à la diffusion étendue des fibrilles, ainsi qu’à la diffusion du vecteur thérapeutique à partir de son point d’injection ; - la maitrise par notre équipe des tests moteurs chez la souris permet une étude fine des défauts neurologiques. Nous avons déjà testé des vecteurs comparables dans des souris modèles d’autres maladies. Nous utiliserons des souris âgées de 12 mois au moment de l’injection des fibrilles accompagnée ou non d’une injection de vecteur thérapeutique. Cela permettra de mimer l’âge avancé de la maladie humaine. Le comportement de ces souris sera étudié entre l’âge de 14 et 24 mois.