Souris
Etude d’un nouveau modèle murin pour comprendre une maladie humaine liée aux mutations d’un canal ionique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
576 souris sont opérées pendant une demi-heure pour se faire implanter des électrodes, puis enregistrées six heures par semaine pendant un mois afin de détecter leurs crises d'épilepsie. 1 728 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation d'un canal ionique humain, elles peuvent présenter des déformations articulaires, une faiblesse musculaire, des difficultés respiratoires, des troubles du sommeil, une constipation sévère et une léthargie qui gêne leur alimentation. Le porteur annonce que 672 d'entre elles passeront des "tests standardisés" de développement moteur et cognitif pendant six mois, sans dire lesquels.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet d’une mutation d’un canal ionique (c’est-à-dire une protéine impliquée dans l’excitabilité des cellules) retrouvée chez l’Homme et qui engendre, chez les patients atteints, de graves altérations du développement du système nerveux. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs, nommés ci-après EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Les objectifs du projet sont les suivants : (1) Comprendre quels sont les mécanismes moléculaires à l’origine du syndrome CLIFAHDD (Congenital contractures of the LImbs and FAce, hypotonia, and Developmental Delay / Contractures congénitales des membres et du visage, hypotonie et retard de développement) ; (2) Déterminer le rôle du canal calcique responsable de ce syndrome dans le développement du cerveau et du cervelet. (3) Tester et vérifier l'efficacité du modèle murin comme représentation préclinique du syndrome CLIFAHDD, dans le but ultime d'évaluer des possibilités de traitement.
Procédures
Pour ce projet, nous évaluerons un total de 1728 animaux, qui seront utilisés comme suit: • 672 animaux seront évalués pour détecter, au travers de tests standardisés, des retards dans leur développement, ainsi que dans leurs capacités motrices et cognitives. Ces évaluations se dérouleront sur une période d'environ 6 mois. Pour les souris agées de moins de 21 jours, les tests sont limités à deux min par test et sont réalisés sur une plaque chauffante maintenue à 23°C. Ces tests seront réalisés dans l'EU1 • 576 animaux subiront une chirurgie d’environ 30 min afin de permettre l'enregistrement d'électroencéphalogrammes (EEG). L'EEG sera enregistré pendant environ 1 mois, avec une séance de 6 heures par semaine pour chaque animal. Ces expériences seront réalisées à l'EU1 • 480 animaux participeront à une étude longitudinale où des échographies du cerveau et du cervelet seront réalisées pour examiner les paramètres anatomiques et fonctionnels. Ces échographies seront effectuées lors de courtes séances d'acquisition, d'une durée de 15 minutes, sous anesthésie. Il est important de noter que certains des tests impliquent des procédures potentiellement stressantes pour les animaux, notamment un hébergement individuel temporaire. Néanmoins, toutes les mesures nécessaires seront prises pour assurer leur bien-être tout au long de l'étude. Cette étude longitudinale sera réalisée dans l'EU2.
Impact sur les animaux
Pour des animaux porteurs de la mutation, les symptômes présentés par les patients suggèrent qu'ils peuvent présenter des retards dans leur développement et leurs capacités cognitives, ainsi que des problèmes physiques tels que des déformations articulaires, des traits physiques inhabituels, une faiblesse musculaire, des difficultés respiratoires et de sommeil, des perturbations du rythme circadien, des crises d'épilepsie, des troubles de l'équilibre dus à une détérioration du cervelet et une constipation sévère et une importante léthargie peut également affecter leur capacité à se nourrir. Les études comportementales ainsi que les examens d'échographie sont non invasifs et indolores en eux-mêmes. Cependant, pour minimiser tout stress causé par la manipulation par les expérimentateurs, les séances d'évaluation seront précédées d'une période d'habituation à la manipulation d'au moins 5 jours. Le suivi des crises d'épilepsie à travers l'enregistrement électroencéphalographique (EEG) nécessitera une intervention chirurgicale (anesthésie, acte chirurgical, gestion de la douleur post-opératoire, risque d'infections). Toutes les précautions seront prises pour éviter toute douleur liée à la chirurgie. Après l'opération, les animaux seront hébergés individuellement pendant le temps nécessaire à la guérison ; ce temps n'excédera pas 7 jours.
Devenir
L’ensemble des animaux contribuant aux 3 procédures de ce projet seront euthanasiées. Les organes, tout particulièrement le cerveau, seront prélevés en post-mortem pour des analyses histologiques.
Remplacement
Le développement, déjà précédé d'une étape de validation in vitro, et la caractérisation d'un modèle murin sont essentiels pour étudier le syndrome CLIFAHDD. Ce modèle animal sera utilisé exclusivement pour des expériences in vivo et ex vivo (prélèvements d'organes) qui ne peuvent être effectuées sur des modèles in vitro ou via des simulations informatiques de la maladie. Pour l’instant, les conséquences fonctionnelles de la mutation du canal calcique responsable du syndrome CLIFAHDD sont examinées à travers des expériences d'électrophysiologie sur des lignées cellulaires, et des simulations informatiques seront développées pour modéliser ces conséquences sur l'excitabilité neuronale. Ces approches in vitro et in silico permettent de comprendre l'impact de la mutation au niveau cellulaire, mais elles ne peuvent pas rendre compte des effets sur l'ensemble de l'organe, en l'occurrence le cerveau, car les réseaux neuronaux établis pendant le développement cérébral ne peuvent pas être reproduits en culture ou par simulation informatique. Pour ce qui est de l’étude des caractéristiques phénotypiques telles que les problèmes de locomotion, les troubles du sommeil et les désynchronisations des rythmes circadiens, elles ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet, estimé à 1728, a été soigneusement déterminé pour nous permettre d'atteindre nos objectifs scientifiques de manière statistiquement significative. Nous avons élaboré une stratégie de croisement optimale pour maximiser l'efficacité de nos expériences. En utilisant des individus des deux sexes, nous cherchons à réduire le nombre total d'animaux nécessaires à produire. Dans la mesure du possible, nous réaliserons les expériences comportementales (in vivo) et les analyses anatomiques, tissulaires et cellulaires sur les mêmes animaux. Pour déterminer statistiquement la taille des groupes d'animaux à tester, nous nous sommes basés sur des recherches publiées ainsi que sur l'utilisation d'un logiciel spécialisé pour évaluer statistiquement le nombre d'animaux requis. Les tailles de chaque groupe d'animaux à générer pour ce projet ont été calculées en utilisant des tests paramétriques capables de détecter des différences significatives. Cela garantit que nos résultats seront robustes et fiables, tout en minimisant le nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien nos études.
Raffinement
Le suivi de l'état de santé des animaux sera rigoureusement respecté et effectué de manière régulière. Des critères spécifiques ont été définis pour détecter les signes de détresse (comme une perte de poids continue et excessive, une prostration, des poils ébouriffés, un arrêt de l'alimentation, etc.), et des mesures de raffinement seront mises en place pour assurer une prise en charge adaptée des animaux. Cela peut inclure l'utilisation d'analgésiques et, dans les cas les plus graves, la décision d'euthanasie. Pour minimiser le stress des animaux causé par la manipulation par les expérimentateurs, les sessions d'évaluation seront précédées d'une période d'habituation d'au moins 5 jours. En ce qui concerne les douleurs liées à la chirurgie (pour les mesures d'EEG par exemple seront réalisées sous anesthésie générales pour éviter toute souffrance associée à l'intervention. Après la chirurgie, les animaux seront hébergés individuellement pendant la période de cicatrisation, qui ne dépassera pas 7 jours.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le mieux adapté pour notre recherche. Il offre en effet le meilleur moyen pour tenter de reproduire la maladie étudiée de manière contrôlée. Nous pourrons aussi examiner en détail les effets sur le cervelet, une région du cerveau qui semble particulièrement atteintes chez les patients. Grâce à ces souris, nous pouvons gérer quand et où la mutation apparaît dans les organes. Pour notre étude, nous utiliserons des souris à différents âges, de la naissance à l'âge adulte. Cela nous aidera à comprendre les conséquences développementales de l'expression de la mutation, notamment en regardant des aspects comme la taille, le poids, les caractéristiques physiques inhabituelles, les problèmes de mobilité, l’apparition de crises d’épilepsies et les troubles de l’équilibre.
Prélèvement de tissu pour génotypage de souris transgéniques sans phénotype dommageable
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
50 000 souris transgéniques vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Entre le dixième et le quinzième jour de vie, chacune se voit amputer l'extrémité de la queue sur un millimètre et tatouer par injection intradermique, ou, à l'âge adulte, découper un morceau du pavillon de l'oreille. Le porteur indique qu'environ 15 000 souris au génotype inutile seront tuées, qu'un millier servira à l'entraînement aux gestes techniques, et que 35 000 seront gardées pour l'élevage ou versées aux projets qui les ont commandées, la mutilation de l'oreille par un congénère et l'automutilation de la queue figurant parmi les incidents prévus. Il écrit que le projet s'arrêtera dès qu'une méthode moins invasive sera disponible, et que le génotypage par follicule pileux est déjà à l'essai dans l'établissement.
Objectifs
L’établissement est une animalerie d’élevage de souris génétiquement modifiées nécessitant la détermination de la constitution génétique de chaque individu par une amplification précise de séquences d’ADN (génotypage par PCR), qui est généralement réalisée en même temps que leur identification. L’objectif de ce projet est d’utiliser un prélèvement (biopsie) de queue ou du pavillon d’oreille pour obtenir un morceau de tissu de souris transgéniques afin d’effectuer une analyse d’ADN et sélectionner les animaux avec les bonnes séquences d’ADN. La taille de la biopsie est réduite à son minimum et représente au maximum 1 mm. Ce projet ne concerne que les animaux n’ayant pas de caractère qui altère l’état général de l’animal (phénotype dommageable). La biopsie sera effectuée en même temps que l’identification des animaux par tatouage à l’aide d’encre appliquée en intradermique ou, très exceptionnellement, par la pose d’une bague numérotée à l’oreille (à l’âge adulte uniquement). Ce projet sera interrompu, sur décision de la SBEA de l’établissement ou une modification de la réglementation, si une méthode alternative moins invasive peut être proposée. Des essais sont actuellement réalisés dans l’établissement pour réaliser les génotypages à partir de prélèvements de follicules pileux mais cette technique nécessite une optimisation des conditions de purification et d’amplification de l’ADN.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la réalisation du génotypage, couplé à l’identification des souris transgéniques à phénotype non dommageable en élevage dans l’EU, dans l’attente de la mise au point d’une méthode non invasive. Il permet de gérer au mieux l’élevage de souris transgéniques pour sélectionner les souris avec le gène à sélectionner avant le sevrage. Ce projet pourra être réalisé sur 5 ans mais sera interrompu dès qu’une méthode alternative sera disponible, en particulier pour toutes les lignées qui pourraient être génotypées à partir d’un prélèvement de follicules pileux.
Procédures
Les animaux subiront un prélèvement de l’extrémité de la queue à l’âge de 10-15 jours. Si le prélèvement de tissu doit être réalisé à l’âge adulte, il sera réalisé sur le bord du pavillon de l’oreille dans une partie souple, non cartilagineuse de l’oreille. La durée du prélèvement sera de quelques secondes.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de tissu sera réalisé à l’extrémité de la queue ou sur le bord du pavillon de l’oreille, selon l’âge de la souris, et sera inférieure à 1mm afin de limiter les effets indésirables. Dans les deux cas, le prélèvement peut entrainer un léger saignement local qui peut être stoppé immédiatement par une légère pression de la zone incisée. La pose d’une bague numérotée aux oreilles pour identifier de façon définitive la souris peut entrainer une gêne ou un inconfort du au poids de la bague. En cas de bagarre entre congénères, la bague peut être arrachée ou l’oreille mutilée.
Devenir
Les animaux dont les séquences d’ADN ne sont pas celles attendues (génotype sans intérêt pour les porteurs de projet) seront mis à mort (environ 30% soit 15 000 souris); à l’exception de quelques souris qui pourront être utilisées pour réaliser du tutorat (environ 1000 souris). Les animaux d’intérêt (contenant le bon gène) seront conservés soit pour maintenir l’élevage des lignées de souris transgéniques, soit pour prélèvement de tissus, soit pour être utilisés dans les projets pour lesquels ils sont produits (35 000 souris).
Remplacement
L’utilisation de souris transgéniques permet l’étude d’un gène de façon ciblée ou d’une fonction spécifique de l’organisme. Des techniques génétiques permettent de modifier le génome de façon très précise. De plus, la modification du génome peut induire la perte ou l’activation de l’expression d’un gène, et ceci de façon ciblée dans le temps ou dans un organe, constitutivement ou après induction. Ces modèles animaux sont précieux pour réaliser des recherches scientifiques fondamentales ou précliniques et ne peuvent souvent pas être remplacés car les fonctions étudiées mettent en jeu des interactions inter-organes essentielles au bon fonctionnement de l’organisme, impliquant des réponses hormonales, immunitaires et nerveuses.
Réduction
Le nombre d’animaux pour le maintien d’un élevage de souris est maintenu au minimum pour éviter la dérive génétique (environ 10 à 15 souris maximum /lignée âgées de 6 mois au maximum pour garantir leur fertilité). L’élevage de lignées transgéniques est limité et restreint aux lignées utilisées pour la recherche. En cas d’arrêt ou d’interruption de projets, les lignées sont cryoconservées par congélation de sperme. Il est important de noter que le croisement de lignées transgéniques entraine la production d’animaux de génotype non utilisable dans les projets c’est-à-dire dont les séquences d’ADN ne correspondent pas à celles ciblées. Certains de ces animaux (mais ne représentant qu’un faible pourcentage) pourront être utilisés dans la cadre de la formation aux gestes techniques ou comme animaux « témoins » de projet.
Raffinement
Le prélèvement de tissu à l’extrémité de la queue ou au niveau de l’oreille sera réalisée précocement, à l’âge de 7-12 jours, avant l’ossification de la queue ou du cartilage de l’oreille, ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Chez l’adulte, le prélèvement d’un morceau du pavillon de l’oreille sera privilégié et sera effectué si possible sous anesthésie gazeuse afin de limiter les mouvements de l’animal et de réaliser le geste avec précision. La taille de la biopsie est réduite à son minimum et représente au maximum 1 mm. La biopsie de l’oreille sera réalisée au niveau du pavillon dans une zone souple non cartilagineuse sur le bord du pavillon de l’oreille pour limiter les nuisances. Cette zone est fibro-cartilagineuse et tapissée d’une fine couche de peau. L’incision sera réalisée dans une zone souple non cartilagineuse sur le bord du pavillon de l’oreille. En cas d’apparition d’une inflammation au niveau de la zone de biopsie ou d’automutilation de la queue, la plaie sera traitée selon la procédure décrite par la vétérinaire désignée jusqu’à cicatrisation. Tout animal présentant une blessure ou un signe d’automutilation (ce qui est souvent le cas des souris mâles qui peuvent être agressives avec leurs congénères) sera soigné selon la procédure fournie par la vétérinaire désignée. En cas d’apparition d’un signe de mal-être ou de souffrance comme un manque de toilettage, une prostration même sous stimulation de l’expérimentateur, l’animal pourra être mis à mort si son état général le justifie. Le tatouage à l’encre par injection intradermique n’entraine pas de nuisance. Des techniques alternatives de biopsie non invasives sont en cours d’évaluation et pourront être utilisées lorsque la validation des séquences d’ADN à amplifier par PCR est confirmée.
Choix des espèces
La transgenèse est généralement réalisée chez la souris et l’établissement est un plateau de conservation et d’élevage de différents modèles de souris transgéniques utilisées en recherche fondamentale et préclinique. Le prélèvement caudal sera réalisé à l’âge de 7-12 jours afin de limiter les nuisances. Le prélèvement effectué sur le pavillon l’oreille sera réalisé à 4 semaines pour éviter l’incision de la queue qui s’est ossifiée à cet âge.
Impact de l’exposition périnatale à la pollution atmosphérique sur les pathologies pulmonaires chroniques.
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système respiratoire
Des femelles gestantes reçoivent de la dioxine par instillation dans la trachée au treizième jour de gestation, puis passent une semaine enfermées jour et nuit dans un isolateur reproduisant l'air de Paris ou de Pékin. Leurs petits sont ensuite maintenus quatorze jours dans une atmosphère à 85 % d'oxygène, et d'autres souris sont exposées à la fumée de cigarette deux heures par jour, trois jours par semaine, pendant un à trois mois. 700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 644 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, alors que le porteur écrit qu'aucun effet létal n'est observé chez les souriceaux, qu'aucune détresse respiratoire n'a été identifiée chez les adultes, et que chaque procédure est conçue pour minimiser leur souffrance. Les bénéfices annoncés, des biomarqueurs "transposables à l'Homme" pour des maladies respiratoires du nouveau-né et de l'adulte, restent au conditionnel.
Objectifs
La pollution atmosphérique est reconnue comme étant la principale cause environnementale de maladies et de décès prématurés dans le monde selon l’Organisation Mondiale de la Santé. L'exposition périnatale à la pollution de l'air semble être un déterminant précoce dans les processus physiopathologiques des maladies respiratoires chroniques de l’enfant et de l’adulte. Cependant, aucune étude à ce jour n'a démontré de corrélation entre la progression de ces pathologies pulmonaires au cours de la vie et la détérioration de la qualité de l'air. L'un des principaux challenges dans l'étude des effets de la pollution atmosphérique sur la santé résulte de l'extrême complexité du mélange atmosphérique. La pollution atmosphérique est constituée d'un mélange complexe de plusieurs milliers de composants qui évoluent dans le temps et dans l'espace. Par conséquent, il nous faut étudier la dynamique globale d’une atmosphère polluée pour comprendre son impact sur les pathologies respiratoires de l’enfant et de l’adulte. Or, nous disposons d'un système unique en Europe permettant de soumettre des animaux à des atmosphères polluées complexes, système permettant d’aborder de manière pertinente et réaliste la problématique des effets de ces pollutions sur la santé. Nous nous intéressons particulièrement aux effets de la pollution atmosphérique sur une pathologie néonatale affectant le développement de l'alvéole pulmonaire pour laquelle aucun traitement n'est disponible à ce jour. Elle se caractérise par une expression très variable de la maladie (dans sa sévérité notamment), les déterminants de cette variabilité restant largement méconnus à l'heure actuelle, alors même que cette variabilité impacte grandement la qualité de la prise en charge thérapeutique des nouveau-nés atteints et leur devenir à l’âge adulte. Étudier le rôle du récepteur aux polluants chez les souriceaux génétiquement modifiés et exposés à la pollution atmosphérique in utero permettrait de mieux comprendre les mécanismes de ces maladies respiratoires néonatales et de l’adulte. De plus, la caractérisation de l'exposition des nouveau-nés atteints de cette pathologie pourrait permettre de mieux comprendre leur variabilité phénotypique, et ainsi améliorer leur prise en charge thérapeutique.
Bénéfices attendus
L’identification de marqueurs biochimiques, des gènes de susceptibilité et l’état de régulation de leur expression permettrait de cartographier ces pathologies, de stratifier leur sévérité, d’intégrer l’hétérogénéité des tableaux cliniques et de dégager de nouvelles pistes thérapeutiques. Ce projet pemettra de mettre en lumière des biomarqueurs prédictifs et diagnostiques transposables à l’Homme et de comprendre les mécanismes physiopathologiques de pathologies respiratoires du nouveau-né et de l'adulte pour dégager de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Liste des actes expérimentaux, leur durée et leur fréquence : Exposition à un polluant de référence (dioxine) : Description : instillation intra-trachéale sous isofluorane chez les femelles gestantes avec une dose faible de 1nmol/kg de dioxine Durée : moins de 2 min en moyenne par instillation et par animal. Fréquence : 1 seule fois à E13.5 Exposition à des atmosphères réalistes et complexes : Description : hébergement en isolateur des femelles gestantes (de E13.5 à E20.5) à une atmosphère de type Paris, Pékin ou filtrée Durée : 24 heures par jour. Fréquence : Continue sur une période de 7 jours Exposition à l'hyperoxie : Description : Souriceaux exposés à une atmosphère contenant 85% d'oxygène. Durée : 24 heures par jour. Fréquence : Continue sur une période de 14 jours (de P0 à P14). Exposition à la fumée de cigarette : Description : Exposition à la fumée de cigarette des souris adultes en utilisant la machine de type Teague® Durée : 1 mois pour le premier groupe et 3 mois pour le second groupe Fréquence : 2h par jour, 3 jours par semaine Surveillance clinique quotidienne : Description : Inspection visuelle des animaux pour détecter tout signe de détresse ou de souffrance (respiration, comportement, apparence physique). Durée : 15 minutes par groupe de cages. Fréquence : Une fois par jour. Pesée des souriceaux et des mères : Description : Pesée des souriceaux et des mères pour suivre la croissance et l'état de santé. Durée : 1 minute par animal. Fréquence : Deux fois par semaine. Sorties en normoxie pour les mères allaitantes : Description : Transfert des mères allaitantes en conditions normoxiques pour réduire le stress oxydatif. Durée : 3 heures par jour pendant 14 jours (de P0 à P14) Fréquence : Quotidienne. Prélèvements: Description : Le prélèvement du sang total, des urines totales se fera au moment de la mise à mort. Durée : 5 minutes par animal. Fréquence : Une seule fois,. Analyses post-mortem : Description : Euthanasie des animaux suivie de prélèvements d'organes (poumons, foie, cerveau, etc.) pour analyses histopathologiques et biochimiques. Durée : 30 minutes par animal. Fréquence : Une seule fois, à la fin de la période expérimentale. Ces actes expérimentaux sont essentiels pour la collecte de données précises et fiables tout en garantissant le bien-être des animaux. Chaque procédure est conçue pour minimiser le stress et la souffrance des animaux tout en permettant d'atteindre les objectifs de recherche.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes exposées 7 jours à la pollution atmosphérique peuvent présenter des signes de stress liés au changement de lieu d’hébergement et au bruit environnant. Les femelles gestantes seront hébergées par 2 afin de limiter leur stress. De plus, les études précédentes déjà réalisées au laboratoire n’ont pas révélées de différences significatives dans les naissances précoces des petits jusqu’à présent. Aucun effet léthal est observé chez les souriceaux exposés à 85% d'oxygène (modèle pré-clinique de pathologie respiratoire du nouveau-né). En revanche ces jeunes souris pourraient développer une gêne respiratoire ou une pathologie de la souris adulte. Les souris adultes ont une résistance limitée à l’oxygène concentré, ainsi les mères allaitantes peuvent présenter une gêne respiratoire. Cepandant, l’expertise de notre laboratoire a permis de développer des protocoles pour palier à ces conséquences. Enfin, aucune léthalité ou détresse respiratoire n’a été identifiée dans les modèles murins pré-clinique de pathologies chez l'adulte par enfumage aux temps choisis pour l’étude (90 et 150 jours après la naissance).
Devenir
A l’issue des procédures l’ensemble des animaux seront mis à mort conformément aux directives éthiques en vigueur et décrites dans cette saisine. Cette décision est justifiée par plusieurs raisons scientifiques et éthiques : - Les analyses post-mortem histopathologiques, biochimiques, cellulaires, moléculaires et morphométriques détaillées sont nécessaires en fin de chacune des différentes procédures afin de comprendre les mécanismes physiopathologiques. - Fiabilité des données : pour obtenir des données précises et comparables l’analyse post-mortem de l’ensemble des animaux de ce projet est nécessaire.
Remplacement
Notre étude qui porte sur l’impact de la pollution atmosphérique réaliste sur les trajectoires pulmonaires résultent d’une compléxité impossible à modéliser par la bio-informatique ou par des modèles non physiologiques (in vitro) pour l'étude des effets explorés à ce stade. L’utilisation des modèles animaux est donc nécessaire pour définir les signatures combinatoires complexes (biochimique, cellulaire, moléculaire et inflammatoire) des pathologies comme la dysplasie bronchopulmonaire et la bronchopneumopathie obstructive chronique en réponse à la pollution atmosphérique.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet est de 700 animaux soit 100 femelles gestantes et 600 souriceaux théoriques attendus pour un projet de 5 ans. Ce nombre a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données historiques du laboratoire et du nombre moyen le plus bas de naissances par portée. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations inter individus et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’une condition. L'effet d'une condition sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques paramétriques. Un calcul de l’effectif sera réalisé sur la base de notre étude préliminaire avant chaque étape afin d’ajuster le nombre d’animaux à inclure dans les procédures particulièrement au vu des naissances surnuméraires possibles (> 6 souriceaux par portée). Cette ajustement permettra de fixer la puissance statistique à 80%, standard admis, garantissant de détecter une différence de condition de l’ordre de 20% avec un risque de faux positif limité à 5%. En effet, précédemment au laboratoire nous avons harmonisé les procédures afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Par exemple, les signatures combinatoires de ce projet ont déjà été établies sur les animaux non transgéniques et pourrons être comparer avec les mêmes critères que les animaux transgéniques utilisés ici. Ce qui limite le nombre de contrôle interne nécessaire à ce projet. De la même manière, le choix des points temporels d’analyses a été conservé par rapport aux études précédentes du laboratoire. Ainsi, les résultats obtenus au laboratoire sur la pollution atmosphérique pourront être comparés. Ceci permet de diminuer drastiquement le nombre de conditions à tester dans ce projet et d’augmenter la puissance statistique. Enfin, à partir d’un seul animal nous pouvons établir l’ensemble des analyses combinatoires par individu en sachant que les protocoles d’analyses ont été optimisés en ce sens.
Raffinement
Avant d’être gestante, les femelles seront élévées avec soin par les mêmes zootechniciens et expérimentateurs pour une meilleure habituation. De même, nous avons fait le choix de garder une animalerie unique depuis leur élevage jusqu’à leur entrée dans le projet et leur mise bas pour permettre de limiter au maximum leur manipulation inutile, leur stress et optimiser leur bien être. Les femelles gestantes seront hébergées par 2 dans des cages ventillées pour favoriser leur entraide et diminuer leur anxiété au moment de la mise bas. Les souriceaux une fois sevrés seront élevés dans les cages ventillées par 5 maximun afin d’assurer leur bien être et leur vie sociale. Un enrichissement de l’habitat sous forme de maisonnettes, de briquettes de bois et de morceaux de cotons permettra de réduire le stress des animaux et de favoriser leur bien-être. L’ensemble des zootechniciens et expérimentateurs du projet a une expertise particulière quant aux différents protocoles et procédures de ce projet ce qui assurera une manipulation douce en adéquation avec le statut des femelles gestantes et de leurs souriceaux. L’instillation oro-pharyngée, l’exposition à une atmosphère complexe, l’hébergement en hyperoxie ou l’enfumage sont des techniques maitrisées au sein de notre équipe expérimentée. Les animaux seront observés quotidiennement pendant toute la durée du protocole, y compris les week-ends et jours fériés par les zootechniciens et expérimentateurs formés et habitués à ce type de projet. Ainsi, la mise en place de points limites précis (décrit en détails pour chaque procédure plus bas) permettra d’intervenir rapidement et efficacement pour éviter toute souffrance de l’animal. En cas de douleur observée sur l’animal ne répondant pas aux stratégies de soin mises en place, une mise à mort de l’animal sera pratiquée et une autopsie sera réalisée afin d’en comprendre les causalités.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples que seul ce modèle peut permettre : 1) le modèle murin est un modèle de choix lorsque l’on veut étudier des trajectoires physiopathologiques du fait de leur rythme rapide de reproduction, leur longévité et leur robustesse. 2) L’expertise pointue de notre équipe depuis de longues années sur les modèles pré-cliniques murins opère à plusieurs niveau : physiologique, chirurgicale, biochimique, cellulaire et moléculaire. 3) Les signatures combinatoires étudiées ont été particulièrement travaillées en amont de ce projet pour une transposabilité optimisée de l’espèce murine à l’espèce humaine. Les biomarqueurs identifiés dans ce projet pourront faire l’objet d’une recherche dans un protocole clinique chez l’Homme. 4) La génétique de la souris compte parmi les meilleures connaissances de la communauté scientifique et nous permet une diversité et une finesse d’outils analytiques sur lequel nous prendrons appui (exemple : les atlas transcriptomiques, les données physiologiques, les normes biochimiques…) 5) Seule la souris nous permet d’identifier précisement l’impact de la pollution sur les mécanismes physiopathologiques de ces maladies respiratoires. En effet, la construction d’un modèle génétiquement modifié est le seul qui nous permettra de suivre l’expression du récepteur aux polluants dans les cellules progénitrices du poumon. Il est le seul qui nous permettra de comprendre le rôle de la voie de signalisation aux polluants dans l’alvéologénèse afin de déterminer les trajectoires de ces pathologies pulmonaires en fonction de la présence ou de l’absence de réponse aux polluants.
Génotypage et identification de rongeurs génétiquement altérés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 2800
Triés selon leur génotype, les rongeurs qui ne correspondent pas au projet visé sont tués dès le sevrage quand aucune autre utilisation n'est trouvée. 40 000 souris et 2 800 rats vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Entre le cinquième et le douzième jour de vie, chaque animal est immobilisé pour un tatouage par perforation des phalanges ou des coussinets et pour l'amputation de l'extrémité de la queue, geste de cinq secondes qui peut entraîner un saignement, une infection, ou le rejet du nouveau-né par sa mère. Le porteur annonce que 500 rats non transgéniques seront proposés à l'adoption, sur les 42 800 rongeurs concernés.
Objectifs
La recherche fondamentale, dans de nombreux domaines, nécessite encore l’utilisation d’animaux pour des sujets d’étude requérant l’observation d’interactions entres les organes et systèmes vivants. L'objectif de cette demande est d’identifier et de déterminer l'ensemble des caractères génétiques d’animaux génétiquement modifiés ou altérés. Ces animaux sont élevés à des fins scientifiques, suite à des demandes d’établissements externes pour réaliser leurs études. Ce projet décrit l’identification et le génotypage de souris et rats transgénique dans le but de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation et les reconnaitre individuellement - sélectionner les animaux reproducteurs et les identifier individuellement - sélectionner les animaux pour la formation, le maintien des compétences, les prélèvements ou de tissus pour des études hors du vivant.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt. L’identification par tatouage permet : - d’identifier individuellement les animaux, - d’identifier les animaux de manière permanente, - d’éviter le recours à une méthode d'identification plus invasive. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables,- de minimiser les risques de contaminations entre échantillons, - d’éviter le recours à l’anesthésie.
Procédures
La procédure de génotypage décrite dans cette DAP est composée de deux actes techniques invasifs : - Le tatouage par perforation des phalanges et/ou des coussinets : réalisé une fois, durée d'une minute maximum - La biopsie de queue qui consiste en l’amputation de l’extrémité de la queue : réalisée une fois, durée de 5 secondes. Ces deux gestes provoquent une légère douleur. L’animal est maintenu en contention pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure.
Impact sur les animaux
La procédure de génotypage décrite dans cette DAP est composée de deux actes techniques invasifs : - le tatouage au niveau des phalanges et/ou des coussinets - la biopsie de queue, qui consiste en un prélèvement de l’extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une légère douleur. L’animal est maintenu en contention sécuritaire pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure ce qui est une source de stress. Dans certains cas, très rares, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir : - Saignement - Rejet du nouveau-né par la mère - Infection au niveau de la queue
Devenir
Le devenir des animaux diffère ensuite selon les résultats du génotypage : a/ ils sont sélectionnés pour un projet, pour la formation ou pour le maintien des compétences (inclus dans d'autres DAP), b/ ils sont conservés pour l’entretien des colonies, c/ ils sont mis à mort pour prélèvements de tissus post mortem, d/ ils sont mis à mort dès sevrage si leurs caractéristiques ne répondent pas aux besoin du projet et si aucune autre utilisation n’est possible.
Remplacement
La recherche fondamentale, dans de nombreux domaines, nécessite encore l’utilisation d’animaux pour des sujets d’étude requérant l’observation d’interactions complexes et fines entres les organes et systèmes vivants. A ce jour, les prélèvements salivaires et pileux pour génotypage ne sont pas suffisamment fiables sur les équipements robotisés. Il n’existe donc pas d’autres méthodes aussi performantes que les tatouages et la biopsie de queue. Un doute sur les résultats conduirait à la nécessité de recommencer à nouveau les gestes (prélèvement et tatouage). Il est donc indispensable de recourir à une méthode de génotypage fiable. Une erreur de génotypage se traduirait par la mise en accouplement d’animaux n’ayant pas les caractéristiques attendues. Cela impliquerait : - une augmentation du nombre d’animaux produits inutilement contraire à la réduction, ; - des résultats erronés et non exploitables (si l’erreur n’est pas détectée précocement).
Réduction
Le responsable de l’établissement établi les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de ne produire que les animaux nécessaires et éviter des surnuméraires non utilisés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’établissement. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.
Raffinement
Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté et formé. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel adapté permettant de limiter les infections, d’effectuer un geste rapide et précis tout en respectant les conditions d'aspesie. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les animaux sont remis en présence de leur mère dans des cages collectives enrichies : maison rouge, nid... et observés quotidiennement. De plus, des mesures précoces sont mises en place au sein de l'animalerie pour tous les rongeurs pour s'assurer du bien-être des animaux tout au long de leur vie. Dans le cas de rats non transgéniques, ils seront proposés à l’adoption (particulier ou association spécialisée).
Choix des espèces
Le choix de la souris et du rat comme modèle d’expérimentation se justifie par son utilisation très fréquente dans le milieu scientifique, notamment dans la recherche fondamentale. Il se justifie également par la connaissance approfondie de son génome,ses similitudes avec le génome humain et le grand nombre de pathologies humaines qu'il est possible de modéliser. Pour toutes les lignées, les rongeurs sont identifiés et génotypés entre 5 et 12 jours. A cet âge : - les animaux sont aisément manipulables ; - le cartilage est souple ; - les groupes sociaux constitués sont stables.
Etude des désordres biochimiques vasculaires lors d’une Hypertension Pulmonaire induite par les maladies Métaboliques dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
3 570 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune passant jusqu'à cinq jours consécutifs en tube de contention pour la mesure de sa tension artérielle. L'équipe leur injecte du tamoxifène cinq jours d'affilée, puis les met sous régime gras pendant six semaines à quatre mois, avec jusqu'à quatre jeûnes de quinze heures et des tests de réponse au glucose. Certaines subissent un infarctus provoqué par chirurgie, d'autres un cathétérisme du ventricule droit sous anesthésie en acte final. Le porteur signale que le tamoxifène peut provoquer une inflammation chronique du péritoine, que l'hypertension pulmonaire induite peut aller jusqu'à l'arrêt cardio-respiratoire, et qu'au-delà des poumons, cible du projet, le mésentère et le rein seront prélevés pour une étude annexe.
Objectifs
L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie rare et très grave qui entraine une insuffisance cardiaque droite nécessitant à terme une transplantation cœur-poumon. Cette pathologie est caractérisée en particulier par une multiplication des cellules formant la paroi des vaisseaux (cellules endothéliales et cellules musculaires lisses vasculaires) ce qui diminue leur lumière et participe à l’hypertension pulmonaire. Les mécanismes impliqués dans ce remodelage artériel ne sont pas élucidés. Des études récentes montrent une forte corrélation entre le déclenchement, la gravité de l'HTAP et les troubles métaboliques. Nous nous proposons de décrypter ces mécanismes par l'étude chronologique de l'installation de l'HTAP en utilisant un modèle murin de syndrome métabolique par l'utilisation d'un régime alimentaire gras.
Bénéfices attendus
Nous espérons apporter par cette étude une compréhension fine des mécanismes physiologiques et cellulaires, non seulement du développement de l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) non familiale, mais en plus des effets locaux lié à l'obésité et au syndrome métabolique sur les vaisseaux sanguins pulmonaires. Et cela tant au niveau physiologique que cellulaire et moléculaire. En outre nous pensons aussi développer sur le plan de la biologie fondamentale, les connaissances sur le fonctionnement et les voies de signalisation des cellules progénitrices (cellules qui ont la capacité de se transformer en différents types de cellules spécialisées). Les nouvelles voies paracrines trouvées pourront à terme être des cibles pharmacologiques pour stopper le développement de l'HTAP afin d'augmenter le pronostic des patients et leur qualité de vie.
Procédures
Certaines souris recevront 1 injection par jour de tamoxifene pendant 5 jours puis 2 semaines après seront mises sous régime normal ou riche en graisse pour 0.5 à 4 mois. Une partie de ces souris seront mises à jeun 15h pour des tests de réponse au glucose et à l’insuline 4 fois maximum et toujours à au moins une semaine d’intervalle. Après le jeûne, elles seront prélevées en vigiles d'une faible quantité de sang sur 2h. Des prises de tension artérielles systémiques (10 min/souris) seront effectuées sur ces souris vigiles (les souris sont dans un tube de contention et la pression est mesurée à la queue à l'aide d'un bracelet similaire à ceux utilisés chez l'Homme), 5 jours consécutifs 1 à 2 fois durant la procédure avec 1 mois d’intervalle. Ces souris subiront une échocardiographie sous anesthésie légère pendant environ 15 min puis 3 jours plus tard une prise de pression dans le ventricule droit sous anesthésie en procédure finale. Certaines souris subiront un infarctus induit par chirurgie d'une durée de 20minutes sous anesthésie et analgésie (pré et post opératoire) puis une échocardiographie après deux semaines sous anesthésie légère. Certaines recevront une injection supplémentaire 3 jours avant l’euthanasie (animal vigil) puis un dernier prélèvement de sang sous anesthésie juste avant l'euthanasie.
Impact sur les animaux
L'injection intrapéritonéale de tamoxifene peut provoquer une inflammation xanthogranulomateuse péritonéale chronique et des dépôts, du côté du diaphragme ou du péritoine, aigus ou chroniques. L'hypertension pulmonaire induite par le régime gras pourrait être sévère induisant dans de rare cas un arrêt cadio-respiratoire. Un stress (peur ou détresse) des animaux est possible lors de l’acclimatation à la prise de pression systémique vigile. L’anesthésie peut induire des effets tels que l’hypothermie, des difficultés respiratoires ou dans les cas les plus critiques un arrêt cardio-respiratoire. La chirurgie peut conduire à des risques anesthésiques (détresse respiratoire, hypothermie, arrêt cardio-respiratoire) mais aussi être source d'hémorragie ou de douleurs post-opératoires ou encore à un risque infectieux.Les procédures d’injection peuvent potentiellement conduire à des infections. L'obésité peut conduire à des difficultés de déplacement, un changement cutané et du pelage mais également à une hypertension ou un diabète. L'insuffisance cardiaque engendre des difficultés de déplacement et d'alimentation les 1ers jours et des arrêts cardiaques. La mise à jeun des animaux peut induire une sensation de faim.
Devenir
La totalité des animaux seront euthanasiés à la fin des actes pour réalisation des prélèvements et analyses.
Remplacement
L'objectif du projet est de mettre en évidence les effets d'un régime gras et de l'obésité sur le développement et l'installation d'une hypertension pulmonaire. Nous étudions les effets du métabolisme systémique sur le remodelage des vaisseaux du poumon. Pour cela, il est nécessaire de conserver l’ensemble des phénomènes intervenants dans la régulation des vaisseaux pulmonaires : inflammatoires (interactions cellules immunes et cellules vasculaires), vasculaires (interactions des cellules vasculaires entre elles), cardiaques (retentissement éventuel d’altérations de la fonction cardiaque gauche), respiratoires (hypoxie locale) et éventuellement nerveux. Cela ne peut être réalisé que par une étude sur organisme entier, nous avons donc choisi un modèle de souris, pour leurs susceptibilités au syndromes métaboliques et du fait de l’existence des lignée transgéniques d’intérêt. Si nous caractérisons les voies biochimiques, leurs mécanismes seront prioritairement étudiés ou sur lignée ou sur cellules différenciées dérivées de cellules souches pluripotentes induites.
Réduction
Au total, 3570 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Bien que ce projet ait pour objet la circulation pulmonaire, la tension artérielle systémique sera mesurée dans tous les groupes et a tous les temps et d'autres organes seront prélevés, comme le mésentère et le rein, pour une étude ancillaire sur le remodelage vasculaire systémique.
Raffinement
Les animaux seront stabulés avec leurs congénères (2 à 6/cage), par fratrie pour les mâles, avec du matériel d'enrichissement : lanières de papier, morceau de bois, maison en carton. Ils seront observés quotidiennement par du personnel compétent et informé des paramètres à contrôler et de façon hebdomadaire par les membres de l’équipe de recherche. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). La profondeur de l'anesthésie sera vérifiée en testant l'absence de réflexe de retrait de la patte (après pincement). La douleur sera soulagée par l’administration d’analgésique systémique en péri-opératoire et à 12, 24, 36 et 48 h en post-opératoire et pourra être renouvelée en cas de souffrance de l’animal. Les infections éventuelles seront traitées localement par application de crème antibiotique. Après chirurgie cardiaque, La 1ère semaine, les animaux seront nourris avec de la bouillie et l'apport d'eau sera facilité. Des points limites suffisament prédictif ont été définis et seront quotidiennement évalués.
Choix des espèces
Les souris (Mus Musculus) sont un modèle classique à la fois pour l'étude des désordres métaboliques et pour l'étude du développement de l'hypertension artérielle pulmonaire. De plus la lignée nécessaire pour la deuxième procédure n'existe pas dans d'autres espèces animales, à notre connaissance. Les souris seront mises au régime spécial à l’âge de 8-12 semaines, soit le début de l’âge adulte, l'étude ne portant ni sur le développement, ni sur la senescence.
Etude de l’effet de faibles doses chroniques par contamination interne de type gamma (Césium) et d’un régime riche en lipides sur la microvascularisation cérébrale et cardiaque chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles boivent pendant des mois une eau contaminée au césium, reçoivent pour certaines un régime riche en lipides, subissent jusqu'à sept échocardiographies de trente minutes sous anesthésie, des jeûnes de douze heures en cage individuelle, et jusqu'à vingt minutes en tube de contention pour la mesure de leur radioactivité. L'objet est de chercher un seuil de dose à partir duquel apparaissent des atteintes des petits vaisseaux du cœur et du cerveau, en simulant l'exposition de personnes vivant sur un territoire contaminé après un accident nucléaire. Le porteur écrit que ni le césium ni le régime gras n'entraînent "de douleur ni d'effet secondaire pour les animaux", alors que les 104 souris sont toutes déclarées en souffrance modérée.
Objectifs
L’objectif de notre étude est d’identifier la réponse de la microvascularisation cardiaque et cérébrale à une contamination interne chronique à des doses faibles à modérées de RI, associée ou non à un facteur de risque tel qu’un régime riche en graisse. Pour cela, l’évaluation de potentielles conséquences sur les troubles moléculaires, physiopathologiques, phénotypiques et fonctionnels cardiaque et cérébral sera réalisée. L’objectif de ce projet sera d’évaluer cette hypothèse par un modèle expérimental d’exposition interne unique aux rayonnements gamma corps entier. Les effets des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma à long terme sur les vaisseaux du cœur et du cerveau seront évalués afin d’apporter des réponses très attendues quant aux questions des effets biologiques pouvant induire des pathologies non-cancéreuses comme les pathologies cardiovasculaires pour permettre d’alimenter le système de radioprotection. En mimant une exposition à des doses faibles à modérées, ce projet sera complémentaire aux études épidémiologiques et permettra d’apporter des réponses notamment dans les gammes de doses où les études épidémiologiques manquent de puissance statistique
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances sur les effets à long terme d’une exposition de doses faibles à modérées sur la microvascularisation (cardiaque et cérébrale), et permettra l’apport de nouvelles connaissances sur l’effet de faibles doses sur la microvascularisation cérébrale très peu étudié auparavant sur un modèle pré-clinique.
Procédures
Les animaux seront exposés en chronique à des faibles doses internes de rayonnements ionisants (Césium à une concentration de 500 KBq/L déjà utilisés dans des projets passés). Certains lots recevront un régime alimentaire riche en lipides pendant toute la durée de l’étude. Pour les échocardiographies (10 animaux par lot soit 40 animaux), elles sont non invasives et effectuées sous anesthésie (au maximum 7 échographies par animal, durée maximale par échographie de 30 minutes). Pour les tests métaboliques (10 animaux par lot soit 40 animaux) : - 1 administration orale ou 1 administration intrapéritonéale selon le test, - 7 ou 8 prélèvements d’une goutte de sang à la queue (suffisant pour la mesure avec l’aide d’un glucomètre) sur animal vigile. Ce type de prélèvement dure 3 à 4 secondes. - ou 1 prélèvement de 75 microlitres de sang sous anesthésie Ces tests nécessitent une mise à jeun au préalable (avec eau à disposition) en hébergement individuel pendant maximum 12 heures. Pour les mesures de zooradiamétrie (10 animaux par lot soit 26 animaux), la mesure se fait sur animal vigile maintenu en tube à contention (temps maximum en tube à contention 20 min). L’ensemble des prélèvements sera réalisé en terminal.
Impact sur les animaux
L’exposition à de faibles concentrations de Césium dans l’eau de boissons (débit de dose 6µGy/h), de même que le régime gras (modérément riche en lipides) n’entrainent pas de douleur ni d’effet secondaire pour les animaux. Seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque ont été observées à long terme. L’ajout d’un régime riche en graisse n’impacte pas le bien-être des animaux. Cela peut pour les temps longs les faire prendre du poids. Il peut exister un inconfort au point d’injection lors des tests de tolérance au glucose et à l’insuline et un stress lié à la contention des animaux lors de prélèvements de sang en vigile ou lors des mesures de zooradiamétrie.
Devenir
A la fin de la procédure, toutes les souris seront euthanasiées pour prélever des organes (cœur et poumons) qui permettront une analyse histologique complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.
Remplacement
Les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique, il est de plus très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules.
Réduction
Au total, 104 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre de 26 animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude et avec notre expérience concernant ce type d'analyses et ces modèles murins pour être au minimum. Il n’y aura pas 20% de mortalité mais la puissance statistique sera supérieure à celle attendue avec 20 souris. Si nous n’observons pas de mortalité tous les animaux seront pris en compte pour nos résultats.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs (4 à 5 souris par cage) et l’isolement est évité. Le milieu est enrichi avec des lanières de papier, morceau de bois et maison en carton. En cas de bagarres, les animaux pourront être isolés. Les souris seront suivies quotidiennement. Elles seront pesées régulièrement une fois par mois. Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues aux bagarres entrainera l’euthanasie anticipée. Les infections ou blessures éventuelles seront traitées localement par application de Vétédine, crème antibiotique ou par administration d’antibiotique. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée par les zootechniciens et hebdomadaire par le porteur de projet. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20% de perte de poids constituent un point limite.
Choix des espèces
Ce projet vise à déterminer un seuil dose pour lequel on observe le développement de pathologies microvasculaire (raréfaction au niveau cardiaque ou cérébrale) et également des troubles du rythme cardiaque chez des souris irradiées en corps entier avec des rayonnements gamma à faible dose et ce afin de mimer des effets secondaires à long terme de l’exposition des personnes en territoire contaminé post accident nucléaire. Les souris seront âgées de 2 mois (8 semaines) au moment de l’irradiation car à cet âge leur système nerveux sympathique cardiaque est mature.
Modèle murin de gliomes/glioblastome par greffe orthotopique chez la souris immunodéficiente ou immunocompétente : mise au point et études d’efficacité
- Recherche appliquée
- Cancers
Les premiers essais de chirurgie se feront sur des souris récupérées à la sortie d'autres projets, pour que les expérimentateurs maîtrisent le geste avant de l'appliquer aux animaux dédiés. 1 320 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une stéréotaxie de 45 minutes pour recevoir des cellules de gliome directement dans le cerveau, puis jusqu'à six séances d'imagerie sous anesthésie, six prélèvements sanguins sur animal vigile, des injections répétées de composés à tester, et une ponction intracardiaque terminale suivie d'une dislocation cervicale. Le porteur fixe le point limite à 20 % de perte de poids et une durée maximale de 100 jours, et annonce que 320 souris serviront à mettre au point huit modèles tumoraux avant même le début des tests d'efficacité.
Objectifs
Les différents types de gliomes sont des cancers au pronostique sombre qui touchent préférentiellement les enfants et adolescents (cancer pédiatrique). Le gliome a pour origine les cellules gliales du cerveau et est représenté par 3 types majeurs : l'astrocytome, l'épendynome et l’oligodendrogliome. Le glioblastome est une des formes agressives du gliome malin dérivant du sous- type astrocytome à un stade 4. Le gliome est un cancer localisé dans le cerveau ce qui confère une difficulté supplémentaire de part cette localisation pour l’accès des traitements à la zone malade. La thérapie du gliome/glioblastome repose sur une ablation chirurgicale aussi étendue que possible, une radiothérapie et, pour certaines tumeurs, une chimiothérapie. L'exérèse de la zone tumorale est rarement curative et nécessite de poursuivre la thérapie. Ainsi, il est important de développer de nouveaux traitements pour ce cancer afin d’améliorer la survie et la qualité de vie des patients. Dans le cadre de la recherche de nouveaux médicaments, après avoir été sélectionnés grâce à des tests in vitro, les composés de recherche sont évalués in vivo chez des souris porteuses de tumeurs humaines greffées sous la peau pour y déterminer leur activité et leur efficacité anti-tumorale vis-à-vis de la cible. Pour autant, la localisation des gliomes ajoute une complexité thérapeutique qui est de passer la barrière hématoencéphalique. En complément, un modèle orthotopique de greffe de cellule (différentes lignées de type gliomes ou glioblastomes) dans le cerveau sera induit par stéréotaxie de manière à complexifier le modèle d’étude et recréer une tumeur dans son site primaire. Cette localisation spécifique constitue une barrière physique aux traitements et permet aussi l’ajout du microenvironnement tumoral spécifique de ce type de tumeur. Ce projet sera réalisé avec différentes lignées tumorales rendues bioluminescentes (exprimant la luciférase) de manière à obtenir des modèles d’études pertinents et dont la croissance est compatible avec le suivi des traitements. L’activité anti-tumorale de traitements candidats sera ensuite évaluée sur ces différents modèles à l’aide d’un suivi par un système d’imagerie in vivo permettant de visualiser la bioluminescence appelé IVIS. La mise en place d’un ou plusieurs modèles orthotopiques de gliomes va permettre d’évaluer de manière plus pertinente des candidats médicaments pour ce type de tumeurs dont la localisation est un frein au progrès thérapeutique.
Bénéfices attendus
Actuellement, les études pharmacologiques pour les pathologies du gliome et du glioblastomes sont réalisées sur de modèles de xénogreffes de cellules tumorales humaines sous la peau de souris (greffe ectopique ou hétérotopique). Mais ces modèles ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à ces pathologies qui sont localisées dans le cerveau. Notamment il existe une différence au niveau du microenvironnement tumoral mais également au niveau de la sélection des médicaments car sur des modèles sous cutanés il n’est pas possible de sélectionner la capacité des médicaments à passer la barrière hématoencéphalique et aller interagir avec la cible au site de la pathologie. En complément de ses modèles de routine néanmoins utile, la greffe de cellules tumorales de type gliomes/glioblastomes dans le cerveau de souris permet d’enrichir le microenvironnement tumoral, d’ajouter la barrière physique qu’est la barrière hématoencéphalique et est donc considérée plus pertinente pour l’évaluation de nouveaux traitements anti-tumoraux. Il est bien décrit que le modèle orthoptique montre une bonne réponse aux traitements actuellement administrés aux patients que sont la chimiothérapie et la radiothérapie. L'objectif est de compléter les modèles existants qui seront gardés pour les premières phases de tests des produits (efficacités ou activité) et permettront de ne sélectionner que les produits prometteurs à tester sur ce modèle orthotopique. Le modèle orthotopique est essentiel pour évaluer l'activité et l'efficacité des produits candidats dans un contexte de passage de barrière hématoencéphalique. Ainsi les bénéfices de ce projet seraient de mettre au point un modèle plus prédictif de la pathologie humaine et ainsi de mieux prédire l’efficacité de candidats médicaments chez l’homme.
Procédures
Intervention chirurgicale (stéréotaxie) sous anesthésie générale gazeuse et locale avec analgésie (45 min de la préparation de l’animal et fin de chirurgie) – 1 fois Imagerie IVIS sous anesthésie gazeuse (20min) – 1 fois par semaine jusqu’à 6 fois au cours de l’étude Prélèvement sanguin vigile (microsampling) jusqu’à 6 fois durant 2 min de contention et 30s de prélèvement Injection d’analgésie, anesthésique et de produit à tester en IP (intrapéritonéale), SC (sous-cutanée), PO (orale), IV (intravéneuse) vigile pouvant aller jusqu’à plusieurs jours consécutifs, durant 30s, 2 min pour IV Prélèvement sanguin terminal par ponction intracardiaque sous anesthésie gazeuse, puis dislocation cervicale – 1 fois Prélèvement final (perfusion du cœur) sous anesthésie générale injectable (Ketamine Xylazine), analgésie – 1 fois
Impact sur les animaux
Une potentielle source de stress ou douleur légère à modérée peut provenir lors : − Douleur modérée : de la phase chirurgicale (stéréotaxie)nécessaire à l’administration des cellules (d’une durée d’environ 30 minutes) et du suivi post-opératoire. - Douleur modérée : de la phase de pousse de la tumeur. Un suivi quotidien permettra de mettre en évidence l’éventuelle douleur et les points limites comme la perte de poids qui sera limitée à 20% maximum du poids de l’animal (100 jours maximum). − stress et douleur légère : de l’administration de composés testés réalisée par voie sous cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse ou per os. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress. − stress et douleur légère : des prélèvements de sang au niveau de la veine marginale de la patte. La contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress. − des signes cliniques observables associés à l’injection des composés (troubles du comportement, altération de l’état général). - de l’anesthésie gazeuse pour l’évaluation de la taille de la tumeur par de l’imagerie (IVIS) d’une durée de 20 min hebdomadaire maximum. - des injections d’analgésiques lors du sacrifice de fin d’étude réalisées en SC, IP. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress.
Devenir
Lorsqu’un point limite est atteint, l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et d’autres organes (si d’intérêt pour analyse). Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…) ou pour des analyses de biomarqueurs dans le cadre des études d’efficacités.
Remplacement
Ce projet a pour but de mettre au point un modèle de greffe orthotopique chez la souris de cellules tumorales de cellules de la glie. L’implantation des cellules dans le cerveau permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du cerveau permettant ainsi une récapitulation des nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. De plus, cette localisation ajoute une complexité au développement du médicament qui se doit d’avoir des propriétés physico-chimiques spécifiques pour atteindre la tumeur et franchir la barrière hématoencéphalique tout en interagissant avec la cible. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro les interactions d’une tumeur avec le micro-environnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives. En amont de l'activité vivo un screen vitro sur BBB (Blood Brain Barrier dit barrière hématoencéphalique en français) test de passage de la barrière hématoencéphalique sera réalisé. Des campagnes d'environ 10 composés seront réalisés et les produits capables de passer la barrière seront sélectionner pour être testés vivo sur des modèles orthotopique pour vérifier leur activité sur les cellules tumorales et la cible. Cela permettra de diminuer le nombre de produits à tester in vivo.
Réduction
• Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour estimer la variabilité de la pousse de la tumeur pour chaque lignée cellulaire étudiée dans le cadre de ce projet. Cette étape permettra d'établir le nombre d'animaux nécessaires par groupe pour les études futures d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie en évaluant la robustesse des designs de ces études à sera utilisé pour évaluer l’efficacité des candidats médicaments. • Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons. • Dans les phases d’entrainements, les premiers essais se feront sur des souris non utilisées sorties d’autres études (issues d’autres projets) afin de maitriser le/les site et les volumes d’injections avant de valider le geste sur des souris dédiées au projet. De plus la mise au point des techniques et sélection de la plus pertinente se fera par un seul expérimentateur expérimenté à la chirurgie et à la stérotaxie afin de réduire le nombre d’animaux. Ensuite le second expérimentateur sera formé par le premier sur des animaux issus des 320 cités pour mise en place des 8 modèles (en plus des souris non utilisées sorties d'études). • De plus, afin d’inclure toutes les souris greffées nous utiliserons l’imagerie pour randomiser tous les animaux au fur et à mesure du développement de la tumeur sur la base d'un volume tumoral similaire permettant ainsi de maximiser le taux d'inclusion. • Lors des études d’efficacité de candidats traitements, il sera possible d’effectuer des analyses de pharmacocinétique c’est-à-dire d’évaluer, en fonction du temps, le devenir d’un médicament dans l’organisme (via des prélèvements sanguins de faibles volumes et répétés au maximum sur 6 points) évitant la réalisation d’une seconde étude dédiée.
Raffinement
•La procédure de greffe orthotopique est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire, avec à un maintien de la température corporelle dès l’anesthésie jusqu’au réveil total de la souris. •Les souris seront placées en hébergement seule après la chirurgie jusqu’au lendemain matin suivant la chirurgie (max 18h) afin de suivre individuellement leur récupération post chirurgie vis-à-vis du processus de nidification. •L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger (bâtonnet de bois), se réfugier (tube ou dôme) ou nidifier (cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. •Les animaux font l’objet d’une observation clinique en post chirurgie et tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique (comme la perte de poids et le dos vouté), le vétérinaire est alerté et les recommandations de la SBEA et les points limites seront appliqués. • Les animaux peuvent être hébergés dans des cages connectées. Ce mode d’hébergement permet de mettre en évidence le changement de comportement à la suite du développement de la tumeur cérébrale. Pour certains modèles de glioblastomes les signes cliniques connu en plus de la perte de poids sont une démarche modifiée, la rotation ou l'inclinaison de la tête et des étapes de ralentissement des mouvements. Changements capturables par les cages connectés dont l’analyse des résultats permettra une meilleur documentation des modèles et des réponses aux médicaments. • Le suivi de la croissance tumorale par l’imagerie sous anesthésie gazeuse est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur qui permet de suivre un même animal tout au long de l’étude sans procéder à l’examen macroscopique de la tumeur en systématique. Les tumeurs sont mesurées par l’IVIS 1 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais aussi pour limiter la souffrance et appliquer les points limites Des prélèvements par microsampling peuvent être mis en œuvre afin d’obtenir des informations complémentaires comme le profil d’exposition plasmatique.
Choix des espèces
En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe orthotopique de cellules tumorales dans le cerveau chez la souris est couramment utilisée dans les études précliniques d’oncologie. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souches utilisées seront des souris immunodéprimées présentant un phénotype dommageable pour permettre la prise de greffe de cellules humaines d’intérêt. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.
Etude de la physiologie cellulaire de l’hippocampe chez le modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes finissent sur la table d'opération, dans une chirurgie terminale de moins de vingt minutes à l'issue de laquelle elles sont tuées pour prélever le cerveau. 2 944 souris vont être utilisées, 1 206 opérées sous anesthésie sans jamais se réveiller, 1 738 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit d'abord une injection de vecteur viral dans le cerveau, qui peut provoquer une douleur pendant 24 à 48 heures et une perte de poids, pour étudier la physiologie des neurones de l'hippocampe et son rôle dans la mémoire sociale. Le porteur affirme par ailleurs que trois semaines d'environnement enrichi transforment les connexions entre ces neurones et souligne "les effets néfastes de l'appauvrissement environnemental", constat qu'il tire d'animaux élevés en cage puis tués.
Objectifs
Bien que la capacité de former et de rappeler des souvenirs soit essentielle à la survie, elle est également cruciale pour établir des relations avec autrui et définir notre sens de soi. L'hippocampe est depuis longtemps reconnu comme une structure fondamentale pour l'apprentissage et la formation de la mémoire. De nombreuses études de lésions chez des patients humains ont révélé que l'hippocampe est nécessaire à la formation de souvenirs épisodiques à long terme. Le projet se concentre sur une région du cerveau : l'hippocampe, qui est essentielle pour la mémoire sociale et est un site de génération de l'activité cruciale pour la cognition. De plus, cette région présente une vulnérabilité unique et marquée dans de nombreuses maladies psychiatriques et neurodégénératives. Des preuves indiquent que lors du déclenchement d'une psychose, l'hippocampe est l'un des premiers à présenter une diminution de la fonction, car l'incapacité à reconnaître correctement sa famille et ses connaissances est fréquemment un symptôme précoce et un fort prédicteur du pronostic du patient. Contrairement à d'autres régions du cerveau qui ont fait l'objet de recherches depuis de nombreuses décennies, la neurophysiologie des neurones pyramidaux de l’hippocampe est largement méconnue. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre les cellules hippocampiques, avec des implications considérables pour plusieurs maladies neurodégénératives et troubles psychiatriques.
Bénéfices attendus
Les objectifs de ce projet sont de mieux comprendre comment l'environnement et l'expérience influent sur la formation de la mémoire. Nous cherchons à découvrir comment les mécanismes moléculaires contrôlent l'activité des cellules nerveuses dans une partie peu étudiée du cerveau appelée l'hippocampe. Nos recherches ont montré que trois semaines d'enrichissement environnemental chez des souris adultes ont un impact significatif sur les caractéristiques et la plasticité des connexions entre ces neurones. En considérant que cet environnement enrichi représente une simulation plus réaliste de la vie pour une souris, nos résultats soulignent les effets néfastes de l'appauvrissement environnemental, tant dans des contextes sains que pathologiques. Ainsi, notre étude contribuera à mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents à l'apparition de la psychose et, nous l'espérons, ouvrira des perspectives pour inverser ces altérations. Les troubles neurologiques ont un coût social élevé, estimé à 798 milliards d'euros en 2010, et touchent environ un Européen sur trois, directement ou indirectement, chaque année. Les perturbations de la cognition sociale sont des symptômes centraux de maladies comme la schizophrénie, et les altérations dans ce domaine sont souvent parmi les premiers signes de ces troubles, étant fortement liées à un mauvais fonctionnement global. Par conséquent, il est essentiel de mieux comprendre les circuits cérébraux impliqués dans la cognition sociale pour les troubles neuropsychiatriques. Des recherches post- mortem ont révélé que l'hippocampe est particulièrement vulnérable et souvent affectée précocement au début de diverses maladies. Ce projet vise à approfondir notre compréhension des mécanismes moléculaires qui régulent l'activité des neurones en réponse à l'expérience. L'hippocampe joue un rôle crucial dans plusieurs fonctions, notamment l'émotion et la mémoire, et nous nous concentrons spécifiquement sur la région qui est importante pour la mémoire sociale. Cette région est affectée de manière unique dans des pathologies telles que la schizophrénie, la démence et la maladie d'Alzheimer. Malgré l'intérêt croissant pour l’hippocampe, les conséquences de ses altérations lors d'expériences ou dans des contextes pathologiques ne sont pas encore entièrement comprises.
Procédures
Une partie des animaux subissent une injection cérébrale de vecteur viral sous analgésie et anesthésie générale permettant d’exprimer des marqueurs fluorescents. Cette procédure dure moins de 30 minutes et elle est réalisée une seule fois. Tous les animaux seront impliqués dans une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie à l’issue de laquelle ils seront euthanasiés en vue des prélèvements pour analyses. Cette procédure dure moins de 20 minutes.
Impact sur les animaux
La chirurgie injection cérébrale peut entraîner une perte de poids transitoire (inférieure à 20 pour cent de leur poids initial) et provoquer une douleur pendant 24/48 heures. L’anesthésie au cours de l’acte terminal pourrait également provoquer des nuisances très courtes et temporaires, notamment l'hypothermie, l'hypertension, et des risques cardiorespiratoires. Néanmoins, ces interventions sont indispensables à notre projet, car seules ces procédures permettent d'exprimer les protéines requises pour la manipulation de la transmission synaptique chez les animaux adultes.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, soit afin de prélever le cerveau pour analyse des caractéristiques fonctionnelles du tissu cérébral soit afin de prélever le cerveau pour analyse histologique.
Remplacement
Le cerveau est un organe d'une extrême complexité, composé de milliards de neurones de centaines de types différents, chacun établissant des milliers de connexions avec d'autres neurones. Ces éléments sont regroupés en structures fortement interconnectées, que ce soit entre elles ou avec d'autres organes. En raison de cette complexité, il n'existe actuellement aucune alternative non animale pour étudier les propriétés physiologiques et cellulaires de l'hippocampe, en particulier dans le contexte des modifications induites par l'expérience. De plus, étant donné que l'on sait si peu de choses sur l'hippocampe et sur son rôle dans la formation de la mémoire, les modèles computationnels sont totalement insuffisants.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé en tenant compte de l'expertise de l'équipe en chirurgie, électrophysiologie et histologie, des résultats précédemment obtenus au laboratoire, ainsi que des données de la littérature. Nous avons mis au point une méthode de préparation de tissu à partir d'un seul cerveau, ce qui permet d'obtenir entre 16 et 20 tranches utilisables pour la physiologie. Cette méthode permet à plusieurs expérimentateurs de partager une seule préparation, réduisant ainsi l'utilisation globale d'animaux. Compte tenu de l'expertise de l'équipe et des taux de succès obtenus au laboratoire au cours des 12 dernières années, le nombre de souris transgéniques a été réduit. La taille des effectifs a été établie par un calcul de puissance et des tests statistiques seront réalisés afin d’avoir une interprétation fiable des résultats. Au total, nous estimons que pour réaliser ce projet, 2944 souris sont nécessaires pour obtenir des résultats scientifiques significatifs.
Raffinement
Pour l'hébergement, toutes les directives sont respectées. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Les souris seront observées quotidiennement. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Pendant la chirurgie, l’animal reçoit une injection d’un analgésique général pour prévenir la douleur, puis est placé sous anesthésie générale gazeuse et disposé sur un tapis chauffant, puis reçoit une injection d’un anesthésique local avant la première incision. Pendant l’opération, les yeux sont protégés par un gel ophtalmique. Les yeux sont également protégés de la forte lumière chirurgicale. Pour les procédures avec réveil, l’animal reçoit après chirurgie une injection de solution saline en sous-cutané afin de prévenir la déshydratation et est placé dans une cage posée sur un tapis chauffant jusqu’au réveil. Après récupération, il réintègre sa cage d’origine, son comportement est surveillé et la suture est sous observation quotidienne pour évaluer sa bonne cicatrisation. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec la structure locale de bien-être animale et les conseils vétérinaires. Après chirurgie, l'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de détecter tout signe de douleur ou stress et de traiter les animaux si besoin avec des antalgiques.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle animal pour ce projet en raison de la similitude de son système nerveux central avec celui des humains et de la disponibilité de lignées génétiquement modifiées. De plus, la souris est le modèle animal le plus couramment utilisé dans ce domaine de recherche, ce qui permet des comparaisons avec d'autres études et l'utilisation des résultats d'autres recherches pour réduire le nombre d'animaux nécessaires. Le réseau hippocampique continue de se développer et subit des changements dans la transmission synaptique et la plasticité jusqu'au jour postnatal 35. Pour cette raison, nous effectuerons toutes les injections cérébrales ainsi que les expériences de physiologie et d'histologie chez des souris âgées d'au moins 6 semaines.
Vectorisation d’acides ribonucléiques circulaires à visée thérapeutique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
370 souris, en grande majorité des femelles de 5 semaines, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour prélever des échantillons. Sous anesthésie générale, elles subissent une chirurgie de 20 minutes dont la nature n'est pas précisée, trois injections dans le derme et une lymphographie, et le porteur indique que les chirurgies et le développement d'un lymphœdème entraîneront des "douleurs modérées". L'équipe teste une nouvelle génération de vecteurs à ARN circulaire, censés prolonger la production de facteurs de croissance lymphatique, contre le lymphœdème qui peut suivre la chirurgie du cancer du sein. Elle a choisi la souris pour rester comparable à ses études précédentes, une autre espèce faisant selon elle "perdre tout le bénéfice des données précédemment obtenues".
Objectifs
Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué́ dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphœdème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphœdème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude récente menée au laboratoire , notre équipe a montré que l’utilisation de lentivecteurs à acides ribonucléiques permettant la production de facteurs lymphangiogéniques permettait d’améliorer la résolution du lymphoedème sur une durée courte. Dans cette étude, nous nous appuierons sur les résultats déjà obtenus par notre équipe et testerons l’efficacité d’une nouvelle génération de vecteurs à acides ribonucléiques développés au laboratoire. Ces nouveaux vecteurs produiront les mêmes facteurs lymphangiogéniques mais basés sur une nouvelle technologie qui permet de produire des lentivecteurs contenant des acides ribonucléiques thérapeutiques circulaires. La particularité des acides ribonucléiques circulaires est d’être beaucoup plus stable que les acides ribonucléiques linéaires utilisés dans nos études précédantes et devraient ainsi permettre une expression prolongée des molécules thérapeutiques. Le bénéfice attendu sera une meilleure efficacité et un effet renforcé par rapport aux résultats obtenus précédemment.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’évaluer l’utilisation de lentivecteurs à acides ribonucléiques circulaires pour la première fois in-vivo et de faire la preuve du concept de leur utilisation. Les données obtenues au cours de ce projet et comparées à celles obtenues dans nos études précédantes visent à démontrer que cette nouvelle génération de vecteurs possède un avantage thérapeutique en permettant une expression prolongée du vecteur et des molécules thérapeutiques produites.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie sous anestésie générale d'une durée d'envion 20 minutes, 3 injections intradermiques lors d'une même anesthésie générale soit une durée d'envion 5 minutes, Une observation du systéme lymphatique par lymphographie sous anesthésie générale pendant environ 20 minutes.
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le développement de lymphœdème vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiée à l'issue de chaque procédure afin de collecter les échantillons nécessaires à l'étude.
Remplacement
Les données relatives à l’expression du vecteur ont été évaluées in-vitro (culture de cellules) mais ne sont pas suffisantes pour évaluer le niveau d’expression et la durée d’expression dans un contexte intégré in-vivo (implication de la réponse immunitaire en particulier). Par ailleurs, Le développement du lymphœdème fait intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche intégrée permettant de comprendre les interactions complexes entre le vecteur et l’hôte (souris). Par ailleurs l’approche in-vivo seule permet d’évaluer le bénéfice thérapeutique des molécules exprimées dans le cadre du lymphoedème et la restauration de la fonction endothéliale lymphatique. Le lymphœdème fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires (cellule endothéliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux…) ; il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permette de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre de l’étude et du traitement du lymphœdème après cancer du sein. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris afin de pouvoir obtenir des résultats comparables et à mettre en perspective par rapport à ceux obtenus dans nos études précédentes dans lequel le même modèle de souris a été utilisé. L’utilisation d’une autre espèce ferait perdre tout le bénéfice des données précédemment obtenues et ne permettrait pas d’évaluer le bénéfice attendu produit par les nouveaux vecteurs à ARN circulaires Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.
Effet du composé X, administré seul ou en combinaison avec la sémaglutide, sur la masse et la force musculaire ainsi que la performance à la course chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
Corriger la fonte musculaire que provoque le sémaglutide, médicament anti-obésité déjà commercialisé, pour permettre de le prescrire plus longtemps : 58 souris mâles rendues obèses par douze semaines de régime gras vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit treize injections intrapéritonéales et quarante-deux injections sous-cutanées, subit trois prélèvements sanguins précédés d'un jeûne de quatre heures, deux tests de force des pattes avant et une session de tapis roulant de trente à quarante-cinq minutes. Le porteur note que l'obésité induite réduit déjà leur capacité de mouvement. Il justifie le passage par l'animal en invoquant une "étape règlementaire incontournable" pour constituer le dossier des premiers essais chez l'humain.
Objectifs
Le sémaglutide est utilisé comme médicament antidiabétique et anti-obésité. Son efficacité s'avère excellente, et son emploi relativement sûr. Cependant, outre la perte de masse grasse qu'ils induisent, les traitements chroniques à la sémaglutide sont également associés à une importante fonte musculaire, qui est considérée comme un effet indésirable. Le composé X a été initialement développé comme un médicament visant le muscle dans le cadre de pathologies induisant une atrophie musculaire. Le présent projet vise à élargir les indications thérapeutiques potentielles du composé X et de tester notamment sa capacité a compenser les effets délétères de la sémaglutide sur la masse musculaire lors d'un traitement chronique chez la souris obèse.
Bénéfices attendus
La Sémaglutide est aujourd'hui autorisée et utilisée en tant que médicament anti-obésité et anti-diabétique. Néanmoins ce composé à pour inconvénient d'induire une perte de masse et de force musculaire lors de traitements prolongés, réduisant la possibilité de son utilisation sur des périodes prolongées. Le développement du composé X permettrait, en co-administration, de bloquer totalement ou partiellement cet effet délétère de la sémaglutide, autorisant son utilisation sur des périodes plus prolongées et ainsi, une meilleure prise en charge thérapeutique des troubles métaboliques chez l'humain.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (10 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de composés par voie intrapéritonéale (13 administration; durée : 1 minute); 3) Administrations de composés par voie sous-cutanée (42 administrations; durée : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (5 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 5) Prélèvements sanguins (3 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Test de la force des pattes avant (2 tests, durée du test : 10 min); 7) Test d'exercice sur tapis roulant (1 session, Durée de la session : 30 à 45 min); 8) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux et sous-cutanés, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Les tests de la force des pattes avant et tests sur tapis roulant pourront également être source de stress et de fatigue pour les animaux. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 10 animaux, contre 12 pour les groupes expérimentaux constitués de souris obèses, compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie intrapéritonéale et sous-cutané seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (2-3 souris / cage) et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.
Choix des espèces
Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (45% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Ce modèle est sensible aux effets anti-obésité de la sémaglutide et présente également les effets secondaires de fonte musculaire observée chez l'humain. Les animaux seront utilisés au stade adulte, âgés de 18 semaines à la réception (28 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 12 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur afin d'induire le phénotype obèse.
Développement d’un vaccin administré par voie respiratoire contre les infections respiratoires chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour mettre au point un vaccin contre la grippe administré par le nez plutôt que par injection, 522 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe leur administre du liquide dans le nez ou dans le pharynx sous anesthésie générale, deux à trois fois à dix jours d'intervalle, puis infecte une partie d'entre elles par plusieurs souches du virus grippal. Le porteur indique que ces administrations peuvent provoquer une gêne respiratoire temporaire et que l'infection peut faire perdre jusqu'à 15 % du poids. Une grille de score fixe le seuil au-delà duquel les souris sont tuées par anticipation, et toutes les autres le sont en fin de procédure pour prélever poumons et ganglions.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de développer un vaccin contre la grippe administré par voie respiratoire car cette voie induit une forte réponse immunitaire dans les poumons. La plupart des vaccins contre la grippe sont administrés par injection intramusculaire et vont induire une protection contre un nombre limité de souches du virus, car celles-ci évoluent d’une année sur l’autre. D’une part, ce projet analysera la capacité du vaccin à activer le système immunitaire et à induire une mémoire immunologique dans le nez et les poumons des souris vaccinées. D’autre part, ce projet étudiera la capacité du vaccin à protéger ces souris contre une ultérieure infection par plusieurs souches du virus de la grippe. La mise en place d’une mémoire immunologique lors d’une vaccination est un processus complexe qui nécessite l’utilisation d’un modèle souris pour son étude. La souris est un animal qui permet de modéliser de nombreux mécanismes physiopathologiques rencontrés dans l’infection humaine respiratoire par le virus de la grippe.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour vocation d’établir un vaccin contre la grippe qui sera administré par voie respiratoire (sans injection) pour induire une mémoire immunitaire au niveau des poumons et qui protégera contre différentes souches du virus de la grippe. Cette stratégie de vaccination pourrait également être utilisée pour la conception de nouveaux vaccins contre d’autres pathogènes respiratoires.
Procédures
Administration dans le nez sous anesthésie générale (2-3 min), 2 fois à 10 jours d’intervalle ou 3 fois pour les souris infectées. 1 prélèvement du sang sur souris vigile (1 min). Administration dans le pharynx sous anesthésie générale (5 min), 2 fois à 10 jours d’intervalle et 1 fois administration dans le nez sous anesthésie générale (2-3 min) pour les souris infectées. 1 prélèvement du sang sur souris vigile (1 min).
Impact sur les animaux
L’administration de liquide dans le nez ou dans le pharynx sous anesthésie générale peut provoquer une gêne respiratoire temporaire. Les anesthésiques seront administrés par injection intrapéritonéale, ce qui est légèrement douloureux pour l'animal au moment de l'injection. Le prélèvement de sang provoque une douleur locale modérée au site de prélèvement. À la suite d'une infection par le virus de la grippe, l'animal peut perdre jusqu'à 15 % du poids qu'il avait avant l’infection.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure car nous avons besoin d’analyser la réponse immunitaire dans plusieurs organes tels que les poumons et les ganglions par des techniques qui précisent le prélèvement de l’organe.
Remplacement
La mise en place d’une réponse immunitaire lors d’une vaccination est un processus complexe qui implique plusieurs acteurs et qui ne peut pas être recréée in vitro. Nous utilisons donc un modèle de souris qui permet l’utilisation de nombreux outils disponibles pour l’exploration immunologique du modèle. De plus, l’infection par voie respiratoire du modèle souris fait intervenir de nombreux mécanismes physiopathologiques rencontrés dans l’infection humaine que nous ne pouvons pas reproduire par le biais de techniques in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet a été calculé sur la base des données existantes dans la littérature et de l'utilisation d'un logiciel statistique permettant d'estimer le nombre de souris par groupe.
Raffinement
L’administration des produits par voie respiratoire sera effectuée sous anesthésie générale (mélange d’anesthésique et d’un antidouleur). Un gel ophtalmique sur chaque œil sera appliqué pour éviter le dessèchement de ceux-ci pendant les anesthésies. Les souris seront placées sur tapis chauffante jusqu’au réveil pour limiter l’hypothermie lors des anesthésies. Le raffinement sera assuré par un suivi clinique des animaux (observation et pesée) deux fois par semaine après administration du vaccin, puis un suivi clinique quotidien après infection pendant la période critique. Ce protocole inclut des points limites qui seront évalues à l’aide d’une grille de score. Si le score limite est atteint, les animaux seront mis à mort de façon anticipée.
Choix des espèces
Le modèle souris, largement utilisé en laboratoire, est utilisé pour sa praticité et la bonne connaissance de son système immunitaire. Nous avons les outils necessaires pour l’analyse des réponses immunitaires du modèle. Animaux adultes livrés à 6-7 semaines d’âge, âge constituant un bon compromis entre une maturité suffisante du système immunitaire. Ils seront utilisés à 7-8 semaines (début de procédures).
Étudier le rôle des astrocytes cérébraux dans la régulation du métabolisme énergétique chez le modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Toutes opérées sous anesthésie pour recevoir des vecteurs viraux dans le cerveau et y implanter une fibre optique, 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit jusqu'à deux injections intrapéritonéales par jour pendant cinq jours, un régime riche en gras et en sucre pendant un à deux mois, un jeûne de cinq heures, puis sept prélèvements sanguins en deux heures. Le porteur reconnaît que la chirurgie peut provoquer des douleurs après l'opération malgré l'analgésie, et que le port de la fibre optique gêne les déplacements. L'objet reste la compréhension du rôle des astrocytes de l'hypothalamus dans le métabolisme énergétique, le porteur espérant seulement que manipuler ces cellules permettrait un jour de contrôler certaines maladies métaboliques.
Objectifs
Le maintien de l'équilibre énergétique est essentiel pour la santé. Le dysfonctionnement de ce processus conduit à une variété de maladies métaboliques pour le cerveau et le corps. Particulièrement, l'hypothalamus dans le cerveau représente un centre de signalisation pour la régulation du métabolisme énergétique du corps. Comprendre les mécanismes sous-jacents à la signalisation cellulaire dans l'hypothalamus dans le contexte du métabolisme énergétique, est la base pour contrôler les maladies métaboliques. L'objectif de ce projet est d'utiliser des modèles de souris pour comprendre le rôle des astrocytes hypothalamiques dans le contrôle du métabolisme énergétique du corps, via l'angle des interactions entre astrocytes et neurones.
Bénéfices attendus
Comprendre la participation des astrocytes dans le métabolisme énergétique fera progresser nos connaissances sur la façon dont le cerveau régule l'énergie du corps. De plus, ce projet découvrira également de nouvelles voies moléculaires qui pourraient être poentiellement ciblées pour améliorer les syndromes métaboliques. En particulier, nous espérons qu’en manipulant directement ces cellules, nous pourrions contrôler certaines maladies métaboliques.
Procédures
1) L'injection intrapéritonéale d'un médicament chimique sur une partie des animaux vigiles (10 secondes, au maximum 2 fois par jour pendant cinq jours); 2) Procédure chirurgicale effectuée sous anesthésie générale/locale et analgésie pré et post-opératoire sur tous les animaux (30 min chaque); 3) Expériences in vivo sur une partie des animaux: les souris qui se déplacent librement portent une fibre optique légère pendant 15-20 min pour chaque enregistrement. 4) Alimentation riche en sucre et gras: pour étudier l'adaptation métabolique, les souris reçoivent un régime riche en gras et sucre pendant 1 à 2 mois sur une partie des animaux. 5) mise à jeun: une partie des souris qui subissent des tests de métabolisme sont à jeun pendant 5 heures. 6) Tests métaboliques impliquant une administration (1 gavage ou 1 injection unique) puis 7 prélèvements de faible volume sur une durée de 2h pour une partie des animaux. 7) Euthanasie d'une partie des souris pour prélèvement sous anesthésie et analgésie, durée 20 minutes.
Impact sur les animaux
1) L’administration d’une hormone pour induire le modèle génétiquement modifié peut entrainer des irritations, un stress et une douleur de courte durée au site d'injection. 2) Une intervention chirurgicale sera effectuée pour délivrer des gènes portés par des vecteurs viraux et implanter un système de fibre optique. Cette chirurgie pourra entrainer des douleurs en post-opératoire malgré la prise en charge analgésique. 3) le port d'une fibre optique peut légèrement influencer la liberté de mouvement des souris; 4) Au cours des tests métaboliques, les animaux seront mis à jeun pendant cinq heures, ils pourront donc ressentir une sensation de faim durant une courte période. Une solution de glucose sera administrée par injection intrapéritonéale ou oralement : un stress lors de la contention et une légère douleur peut être ressentie au point d'injection ou lors de l'introduction de la canule de gavage dans la cavité buccale. 5) Des prélèvements sanguins de faible volume seront effectués pour mesurer la glycémie, une légère douleur peut être ressentie lors du prélèvement de sang. 6) Lors des procédures mentionnées, il existe un risque d'infection au niveau des sites d'injection (par exemple, par la voie sous-cutanée ou intrapéritonéale) et de prélèvement, des risques liés à l'anesthésie, à la chirurgie et à un régime alimentaire riche en graisse.
Devenir
Les souris seront euthanasiées. En effet, les tissus prélevés pour les analyses biochimiques et immunohistochimiques (analyse de la pathologie, de l'inflammation, changements dans chaque type de cellule) et pour les études moléculaires et génomiques nécessitent l’euthanasie de l’animal.
Remplacement
Dans le présent projet, le remplacement des modèles animaux par des approches in vitro ne permet pas l’étude de l'effet des astrocytes sur le métabolisme du corps. En outre, il est connu que les astrocytes in vitro ont des caractéristiques biologiques différentes de leurs états in vivo, ce qui rend indispensable l'utilisation de modèles animaux pour comprendre l'interaction complexe avec les neurones dans l'environnement natif.
Réduction
L'estimation du nombre d’animaux et les tests statistiques utilisés sont basés sur les études standards dans le domaine du métabolisme. Nous avons minimisé le nombre d'animaux, à un niveau qui permet d'être sûr de répondre aux questions scientifiques proposées de ce projet, et prend également en compte les échecs occasionnels lors des procédures expérimentales. La quantification statistique de nos données a besoin d'au moins 20 animaux par groupe et par condition. De plus, il faut prendre en compte le risque chirurgical en ajoutant 5 souris par lot, ce qui conduit à un nombre total de 300. C’est le nombre permettant d'atteindre des résultats scientifiquement solides statistiquement.
Raffinement
Tout au long du projet, les animaux seront hébergés avec un cycle jour/nuit adapté et avec la boisson et la nourriture ad libitum. Ils feront l’objet d’un contrôle quotidien par une personne professionnelle, en complément de celle des expérimentateurs. L’anxiété des animaux sera réduite par un maintien en groupe social et par une manipulation régulière de la part de l'expérimentateur. Par ailleurs, les souris seront placées dans des cages avec des enrichissements environnementaux, y compris rouleaux en carton, coton, bûchettes en bois, etc, afin de leur permettre de manifester leurs comportements naturels. Les signes d'anomalie seront renseignés comme l'aspect des souris, un comportement irrégulier, des blessures, ou perte de poids. En outre, une analgésie sera mise en place afin de réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Si les souris montrent une souffrance ou une douleur mise en évidence par une modification comportementale ou physique, une analgésie supplémentaire sera administrée. Les souris ayant atteint un point limite seront euthanasiées. Ces contrôles permettent d'identifier des animaux malades ou blessés et de prendre les mesures appropriées. L'ensemble du suivi se fait en coordination avec la SBEA (Structure chargée du Bien Etre des Animaux) et le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Il s’agit ici d’études physiologiques et de comportement métabolique qui ne peuvent être reproduites par des systèmes, autres que celui de l’animal vivant. Les effets alimentaires et la régulation métabolique peuvent être étudiés avec pertinence chez la souris en comparaison avec l’homme. La souris permet aussi de manipuler certains gènes permettant d’accéder à la partie plus mécanistique des processus dans un environnement physiologique comparable à l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 2 mois) afin que les réseaux neuronaux et astrocytes soient bien établis et que les expériences ne soient pas perturbées par une plasticité neuronale ou le développement des astrocytes.