Souris

4 608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des cellules tumorales injectées dans le poumon après incision de la peau, sous anesthésie générale, les autres portent des tumeurs sous-cutanées, et toutes passent par une irradiation localisée de cinq minutes, réalisée sur animal vigile maintenu en contention un quart d'heure. Le porteur décrit l'irradiation comme indolore et annonce une perte de poids inférieure à 5 % liée au passage des rayons sur l'intestin ou l'œsophage. Le bénéfice avancé, réduire les doses de radiothérapie chez des patients, est renvoyé à un transfert clinique lointain, quand les tumeurs greffées et les mini-chirurgies pulmonaires, elles, sont immédiates.

Objectifs

Le cancer du poumon est l'un des cancers les plus répandus. La radiothérapie est un outil puissant qui fait partie de l’arsenal de traitements anticancéreux. De nombreuses études précliniques et cliniques montrent que l’efficacité antitumorale de la radiothérapie dépend du système immunitaire et du microenvironnement tumoral de l’hôte. Nous voulons évaluer un nouveau traitement.Nous pensons que la combinaison radiothérapie + traitement spécifique peut s’avérer être très efficace. Par ailleurs, de nombreuses données précliniques et cliniques suggèrent que la combinaison de radiothérapie + traitement classique est prometteuse. Toutefois, les données cliniques en faveur sont encore parcellaires et de nombreux modèles murins restent résistants à ce traitement. Nous évaluerons donc la triple combinaison radiothérapie + traitement classique+ traitement spécifique pour voir si l’ajout ce traitement spécifique peut sensibiliser les tumeurs au traitement radiothérapie + traitement classique. Il a été observé que la radiothérapie pouvait induire des effets antitumoraux « abscopaux », c’est-à-dire en dehors du champ d’irradiation. Ainsi, l’irradiation d’une tumeur primaire peut entraîner un effet antitumoral sur une tumeur secondaire ou une métastase placée hors du champ d’irradiation. Cet effet « abscopal » est augmenté par les modulateurs de l'immunité. Nous testerons la triple combinaison thérapeutique dans un contexte de tumeurs multisites (plusieurs tumeurs portées par le même hôte) pour évaluer si le traitement spécifique peut augmenter l’effet abscopal.

Bénéfices attendus

50% des patients traités pour un cancer reçoivent une radiothérapie au cours de leur traitement. Le but de la radiobiologie est de permettre l’amélioration de l’efficacité des radiations ionisantes sur les tumeurs (en diminuant la radiorésistance), et de minimiser les effets secondaires sur les tissus sains traversés par les rayons. L’amélioration de la réponse tumorale à l’irradiation pourrait permettre de réduire les doses d’irradiation et ainsi les effets secondaires sans affecter l’efficacité du traitement anti tumoral. Les progrès en immunologie ont révolutionné le pronostic de maladies métastatiques autrefois incurables et de nombreuses études montrent des combinaisons prometteuses entre radiothérapie et immunothérapie chez l’humain. L’effet à distance induit par l’irradiation qui provient du système immunitaire est également un thème de recherche actif en radiothérapie. A court terme, notre étude permettra l’apport de connaissances scientifiques supplémentaires pour mieux appréhender les interactions radiothérapie/immunité mais elle constituera surtout un socle de données précliniques permettant d’envisager à plus long le transfert en clinique de cette combinaison lors d’essais cliniques et donc potentiellement permettra la mise au jour d’un nouveau traitement.

Procédures

Les souris pourront avoir des injections (1 à 4) sous anesthésie locale, durée 1 minute maximum. Injection de cellules tumorales dans le poumon après incision de la peau, sous anesthésie générale, n=1, durée 1 minute. Irradiation localisée sur souris vigiles, durée 5 minutes.

Impact sur les animaux

Le type d’irradiation utilisée dans notre étude est une irradiation localisée. Elle a lieu sans anesthésie pour les tumeurs sous-cutanées. Les souris sont placées dans un système de contention pendant une quinzaine de minutes ce qui peut générer du stress et de l’anxiété légers et transitoires. Elle a lieu sous anesthésie gazeuse pour l’irradiation du thorax dans le cas des tumeurs pulmonaires. L’irradiation en elle-même est indolore et, comme elle est localisée et à dose raisonnable, elle n’induit pas une perte de poids conséquente (perte de poids de moins de 5% due à l’irradiation d’une partie des intestins ou de l’œsophage qui sont proches de la tumeur). L’administration traitements peut engendrer un stress transitoire léger. Les tumeurs peuvent gêner la souris modérement. L Pour les prélèvements de sang, les souris seront d’abord anesthésiées ce qui peut générer un stress léger et transitoire. La principale nuisance réside dans l’implantation en orthotopique des cellules cancéreuses pulmonaires qui se fait au cours d’une mini-chirurgie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les prélèvements de sang et tumeurs pour analyses ultérieures, ou pour respecter les points limites dans le cadre des études d'efficacité.

Remplacement

Le recours à des modèles animaux nous permettra d’étudier les effets d’une nouvelle combinaison thérapeutique dans un contexte qui inclut le micro environnement tumoral et le système immunitaire. Ceci permet donc l’interaction des cellules tumorales avec leur environnement naturel. Ces interactions jouant un grand rôle dans les effets de la radiothérapie, il apparaît donc indispensable d’avoir une évaluation sur un modèle animal pour déterminer exactement les effets de ces immunomodulateurs avant d’envisager un passage en thérapie humaine. Aucun modèle in vitro ne permet actuellement d’obtenir la complexité présente dans un animal vivant (immunité, vascularisation, organo-dépendance,…).

Réduction

Uune analyse statistique à priori a été effectuée afin de calculer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives de croissance tumorale. L’analyse de la croissance tumorale se fera avec une analyse de la variance pour tester la significativité des différences obtenues pour les différents groupes, suivie d’un test de comparaisons multiples pour tester la significativité du traitement triple combinaison par rapport aux doubles combinaisons. La dernière procédure ne sera menée que si les résultats des procédures précédentes sont prometteurs.

Raffinement

Au cours de notre projet, les nuisances aux animaux sont de la douleur et du stress. Pour les injections, un anesthésique local sera utilisé. La mise en contention pour l’irradiation sera réalisée par une personne entraînée qui effectue déjà geste depuis des années au sein du laboratoire pour réduire le temps de la contention et le stress induit. La chirurgie pour l’implantation du tumeur dans le poumon se fera sous anesthésie gazeuse, également par une personne très entraînée et un analgésique sera administré avant et après le geste opératoire pour limiter au maximum la douleur induite. Les prélèvements de sang se feront sous anesthésie générale. Les animaux seront observés quotidiennement (vérification de l’état général) et pesés 3 fois par semaine (pour surveiller la survenue d’une éventuelle perte de poids, même si elle est non attendue dans ce projet. Un complément alimentaire énergétique sera donné en cas de perte de poids. De l’enrichissement est introduit dans les cages tout au long de l’expérience. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les souris C57BL/6 ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les animaux auront 8 semaines. Souris après sevrage.

Trois jours après le réveil, l'animal qui n'a pas repris de poids, dont le poil est hérissé, qui ne se toilette plus ou reste prostré est tué. 1 200 souris et 300 rats vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie abdominale de quinze minutes sous anesthésie, puis jusqu'à quatre tests de mémoire pendant cinq semaines, dont un conditionnement de peur reposant sur un stimulus aversif, et un à trois prélèvements de sang. Il s'agit de tester des molécules du laboratoire contre le déclin cognitif que 10 à 13 % des patients de plus de 65 ans présentent trois mois après une opération, et aucun animal n'est gardé vivant, une réutilisation risquant de fausser les tests de mémoire suivants.

Objectifs

Chez la personne âgée, une des complications liée à un acte chirurgical se traduit par un déclin cognitif qui peut se prolonger au delà de 6 mois (mémoire, compréhension, sociabilité, problèmes d'attention...). Ces séquelles neurologiques postopératoires peuvent, 3 mois après l'opération, concerner 10 à 13% des patients âgés (+ de 65 ans). Elles sont liées au geste chirurgical en soi et non pas au type d'anesthésie qui peut être générale ou locale. Un des mécanismes probables à l'origine de ces troubles cognitifs est une propagation au système nerveux central de l'inflammation périphérique provoquée par la chirurgie. Le projet a pour but de reproduire les conditions d'une chirurgie chez l'animal et d'ensuite d'étudier les conséquences cognitives à l'aide de plusieurs tests comportementaux. Une des activités de notre centre de recherche est de développer de nouvelles molécules ayant pour cible le système nerveux central. Ainsi au cours de ce projet l'objectif sera de tester les effets de nos nouvelles molécules sur les performances cognitives d'un modèle animal de déclin cognitif postopératoire.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de fournir des données précliniques sur l’efficacité potentielle de nouvelles molécules pour réduire les troubles cognitifs postopératoires. A long terme, ce projet pourrait donc conduire à un bénéfice en clinique notamment chez les personnes âgées qui est une population présentant le plus de risques de développer des troubles cognitifs après une intervention chirurgicale.

Procédures

Les souris ou les rats vont subir sous anesthésie un geste chirurgical d'une durée maximale de 15 minutes et ensuite passer pendant 5 semaines une série de maximum quatre tests de mémoire. Ces tests de mémoires basés sur des phases apprentissage et d'oubli spontanné pourront durer entre 1 à 5 jours chacun. Un à trois prélèvements sanguins pourront être réalisés dans les 5 semaines qui suivent la chirurgie. Des molécules à tester pourront être administrées par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intramusculaire.

Impact sur les animaux

Parmi les effets indésirables attendus sur les rongeurs, même s'il y a administration d'analgésiques nous ne pouvons exclure à minima une gêne voire une douleur résultant du geste chirurgical au niveau de la paroi abdominale. Dans une moindre mesure on aura le stress de la courte contention liée à l'administration des composés à tester par voie orale, voie intrapéritonéale, voie intramusculaire ou voie sous-cutanée qui pourront également causer une courte et légère douleur dans le cas d’une injection. De plus, le passage dans les différents tests comportementaux peut être source de stress voire source de douleur passagère dans le cadre du test de conditionnement de peur au cours duquel les animaux reçoivent un stimulus aversif.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. En effet l'objectif du projet étant de travailler sur les mécanismes de mémorisation, toutes réutilisations des animaux dans d'autres études comportementales pourraient être biaisées par les tests précédemment réalisés.

Remplacement

Ce projet ayant pour but de tester l'action pharmacologique de nouveaux composés sur la mémoire suite à un geste chirurgical il est nécessaire de passer par des modèles animaux. En effet, l'évaluation d'un comportement aussi complexe que la mémoire mettant en jeu de multiples zones du cerveau ne peut être réalisée que sur un animal vigile. Il n'existe pas à ce jour de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. De plus, les nouvelle molécules à tester peuvant aussi bien avoir une action périphérique qu'une action au niveau du système nerveux central devront être testées sur un animal entier.

Réduction

En raison de la variabilité liée aux études comportementales, un effectif de 12 animaux est nécessaire pour la robustesse des tests statistiques. Les tests de plusieurs molécules ou plusieurs doses d'une même molécule pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant qu'un seul groupe recevant une molécule de référence. 5 groupes d'animaux seront nécessaires par expérimentation : 1 groupe non opéré et 4 groupes d'animaux opérés pouvant recevoir un véhicule, un traitement de référence, et 2 nouvelles molécules à tester ou une seule molécule à tester mais à 2 doses différentes. Nous prévoyons 4 expérimentations par an avec des souris soit un total de 240 souris par ans, 1200 sur 5 ans et 1 expérimentation par an avec des rats soit un total de 300 rats sur 5 ans.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie centrale (température et hygrométrie contrôlées) dans des cages adaptées à l'espèce avec la présence d'enrichissement de milieu et avec accès libre à l'eau et à la nourriture. Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), une fiche de contrôle du bien-être animal comprenant 30 critères est renseignée chaque semaine. Si nous constatons une déviation concernant au moins 3 critères sans qu'aucune action puisse corriger ces déviations alors la mise à mort de l'animal sera envisagée. Les membres de la structure bien-être animal effectuent une observation mensuelle de tous les animaux. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse avec administration d'analgésiques en local (lidocaïne) et en systémique (buprénorphine). Dans le suivi postopératoire est prévue une administration de buprénorphine de manière systématique toutes les 10 à 12 heures, cependant si 3 jours après le réveil, l'animal présente des signes de mal-être (non reprise de poids, poil hérissé, absence de toilettage, prostration, absence de fèces....) alors il sera euthanasié. Si nous constatons une réouverture de la plaie dans les 3 jours qui suivent la fin de la chirurgie, des soins et des sutures pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont largement caractérisés d'un point de vue comportemental. Ce sont deux espèces très classiquement utilisées et décrites dans la littérature concernant les tests d'évaluation de la mémoire, les protocoles sont très bien établis. Le rat et la souris ont un système nerveux central suffisamment évolué pour envisager une extrapolation à l'homme de certains résultats. En effet, de nombreux parallèles existent entre les caractéristiques de la mémoire étudiées chez le rat ou la souris et les caractéristiques de la mémoire chez l'humain. De plus, leur taille permet d'effectuer un geste chirurgical dans des conditions satisfaisantes. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte chez la souris comme chez le rat. En effet dans la littérature, les tests de mémoire sont classiquement décrits sur des animaux adultes avec un développement cérébral complet et des capacités cognitives et d'attention fonctionnelles. Les troubles cognitifs postopératoires concernant essentiellement des personnes âgées, les effets de nos nouveaux composés pourront être évalués sur des animaux plus âgés (maximum 18 mois).

576 souris subiront une chirurgie de trente minutes pour l'implantation d'électrodes, puis six heures d'enregistrement électroencéphalographique par semaine pendant un mois, avec un hébergement individuel de sept jours après l'opération. 1 728 souris au total vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement du cerveau. Porteuses d'une mutation qui reproduit un syndrome humain rare, elles peuvent présenter déformations articulaires, faiblesse musculaire, difficultés respiratoires, crises d'épilepsie, troubles de l'équilibre et constipation sévère. 672 d'entre elles passeront des "tests standardisés" de développement moteur et cognitif étalés sur six mois, sans que le résumé indique lesquels.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet d’une mutation d’un canal ionique (c’est-à-dire une protéine impliquée dans l’excitabilité des cellules) retrouvée chez l’Homme et qui engendre, chez les patients atteints, de graves altérations du développement du système nerveux. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs, nommés ci-après EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Les objectifs du projet sont les suivants : (1) Comprendre quels sont les mécanismes moléculaires à l’origine du syndrome CLIFAHDD (Congenital contractures of the LImbs and FAce, hypotonia, and Developmental Delay / Contractures congénitales des membres et du visage, hypotonie et retard de développement) ; (2) Déterminer le rôle du canal sodique responsable de ce syndrome dans le développement du cerveau et du cervelet. (3) Tester et vérifier l'efficacité du modèle murin comme représentation préclinique du syndrome CLIFAHDD, dans le but ultime d'évaluer des possibilités de traitement.

Procédures

Pour ce projet, nous évaluerons un total de 1728 animaux, qui seront utilisés comme suit: • 672 animaux seront évalués pour détecter, au travers de tests standardisés, des retards dans leur développement, ainsi que dans leurs capacités motrices et cognitives. Ces évaluations se dérouleront sur une période d'environ 6 mois. Pour les souris agées de moins de 21 jours, les tests sont limités à deux min par test et sont réalisés sur une plaque chauffante maintenue à 23°C. Ces tests seront réalisés dans l'EU1 • 576 animaux subiront une chirurgie d’environ 30 min afin de permettre l'enregistrement d'électroencéphalogrammes (EEG). L'EEG sera enregistré pendant environ 1 mois, avec une séance de 6 heures par semaine pour chaque animal. Ces expériences seront réalisées à l'EU1 • 480 animaux participeront à une étude longitudinale où des échographies du cerveau et du cervelet seront réalisées pour examiner les paramètres anatomiques et fonctionnels. Ces échographies seront effectuées lors de courtes séances d'acquisition, d'une durée de 15 minutes, sous anesthésie. Il est important de noter que certains des tests impliquent des procédures potentiellement stressantes pour les animaux, notamment un hébergement individuel temporaire. Néanmoins, toutes les mesures nécessaires seront prises pour assurer leur bien-être tout au long de l'étude. Cette étude longitudinale sera réalisée dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Pour des animaux porteurs de la mutation, les symptômes présentés par les patients suggèrent qu'ils peuvent présenter des retards dans leur développement et leurs capacités cognitives, ainsi que des problèmes physiques tels que des déformations articulaires, des traits physiques inhabituels, une faiblesse musculaire, des difficultés respiratoires et de sommeil, des perturbations du rythme circadien, des crises d'épilepsie, des troubles de l'équilibre dus à une détérioration du cervelet et une constipation sévère et une importante léthargie peut également affecter leur capacité à se nourrir. Les études comportementales ainsi que les examens d'échographie sont non invasifs et indolores en eux-mêmes. Cependant, pour minimiser tout stress causé par la manipulation par les expérimentateurs, les séances d'évaluation seront précédées d'une période d'habituation à la manipulation d'au moins 5 jours. Le suivi des crises d'épilepsie à travers l'enregistrement électroencéphalographique (EEG) nécessitera une intervention chirurgicale (anesthésie, acte chirurgical, gestion de la douleur post-opératoire, risque d'infections). Toutes les précautions seront prises pour éviter toute douleur liée à la chirurgie. Après l'opération, les animaux seront hébergés individuellement pendant le temps nécessaire à la guérison ; ce temps n'excédera pas 7 jours.

Devenir

L’ensemble des animaux contribuant aux 3 procédures de ce projet seront euthanasiées. Les organes, tout particulièrement le cerveau, seront prélevés en post-mortem pour des analyses histologiques.

Remplacement

Le développement, déjà précédé d'une étape de validation in vitro, et la caractérisation d'un modèle murin sont essentiels pour étudier le syndrome CLIFAHDD. Ce modèle animal sera utilisé exclusivement pour des expériences in vivo et ex vivo (prélèvements d'organes) qui ne peuvent être effectuées sur des modèles in vitro ou via des simulations informatiques de la maladie. Pour l’instant, les conséquences fonctionnelles de la mutation du canal sodique responsable du syndrome CLIFAHDD sont examinées à travers des expériences d'électrophysiologie sur des lignées cellulaires, et des simulations informatiques seront développées pour modéliser ces conséquences sur l'excitabilité neuronale. Ces approches in vitro et in silico permettent de comprendre l'impact de la mutation au niveau cellulaire, mais elles ne peuvent pas rendre compte des effets sur l'ensemble de l'organe, en l'occurrence le cerveau, car les réseaux neuronaux établis pendant le développement cérébral ne peuvent pas être reproduits en culture ou par simulation informatique. Pour ce qui est de l’étude des caractéristiques phénotypiques telles que les problèmes de locomotion, les troubles du sommeil et les désynchronisations des rythmes circadiens, elles ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet, estimé à 1728, a été soigneusement déterminé pour nous permettre d'atteindre nos objectifs scientifiques de manière statistiquement significative. Nous avons élaboré une stratégie de croisement optimale pour maximiser l'efficacité de nos expériences. En utilisant des individus des deux sexes, nous cherchons à réduire le nombre total d'animaux nécessaires à produire. Dans la mesure du possible, nous réaliserons les expériences comportementales (in vivo) et les analyses anatomiques, tissulaires et cellulaires sur les mêmes animaux. Pour déterminer statistiquement la taille des groupes d'animaux à tester, nous nous sommes basés sur des recherches publiées ainsi que sur l'utilisation d'un logiciel spécialisé pour évaluer statistiquement le nombre d'animaux requis. Les tailles de chaque groupe d'animaux à générer pour ce projet ont été calculées en utilisant des tests paramétriques capables de détecter des différences significatives. Cela garantit que nos résultats seront robustes et fiables, tout en minimisant le nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien nos études.

Raffinement

Le suivi de l'état de santé des animaux sera rigoureusement respecté et effectué de manière régulière. Des critères spécifiques ont été définis pour détecter les signes de détresse (comme une perte de poids continue et excessive, une prostration, des poils ébouriffés, un arrêt de l'alimentation, etc.), et des mesures de raffinement seront mises en place pour assurer une prise en charge adaptée des animaux. Cela peut inclure l'utilisation d'analgésiques et, dans les cas les plus graves, la décision d'euthanasie. Pour minimiser le stress des animaux causé par la manipulation par les expérimentateurs, les sessions d'évaluation seront précédées d'une période d'habituation d'au moins 5 jours. En ce qui concerne les douleurs liées à la chirurgie (pour les mesures d'EEG par exemple seront réalisées sous anesthésie générales pour éviter toute souffrance associée à l'intervention. Après la chirurgie, les animaux seront hébergés individuellement pendant la période de cicatrisation, qui ne dépassera pas 7 jours

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le mieux adapté pour notre recherche. Il offre en effet le meilleur moyen pour tenter de reproduire la maladie étudiée de manière contrôlée. Nous pourrons aussi examiner en détail les effets sur le cervelet, une région du cerveau qui semble particulièrement atteintes chez les patients. Grâce à ces souris, nous pouvons gérer quand et où la mutation apparaît dans les organes. Pour notre étude, nous utiliserons des souris à différents âges, de la naissance à l'âge adulte. Cela nous aidera à comprendre les conséquences développementales de l'expression de la mutation, notamment en regardant des aspects comme la taille, le poids, les caractéristiques physiques inhabituelles, les problèmes de mobilité, l’apparition de crises d’épilepsies et les troubles de l’équilibre.

10 800 souris vont recevoir une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des molécules radioactives fournies par des clients, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées, soit à la fin de l'étude, soit dès qu'un point limite est atteint. Le protocole prévoit jusqu'à sept pesées par semaine, trois tontes, jusqu'à quatre administrations du composé et jusqu'à quatre prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire, le dernier étant terminal. L'effectif n'est pas fixé par le laboratoire mais par le client selon sa molécule, et le porteur précise que 10 800 représente le maximum réalisable en fonction des demandes reçues.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la 2ème cause de décès dans le monde. Les modèles animaux sont encore aujourd’hui indispensables en cancérologie notamment pour comprendre la physiopathologie de ces maladies, trouver des thérapies innovantes et évaluer leur efficacité. L’utilisation de radiopharmaceutiques (molécules ciblant les cellules cancéreuses et entrainant ainsi leur destruction par l’émission de rayonnements ionisants) est une nouvelle approche thérapeutique prometteuse. Notre projet vise donc à quantifier l’efficacité thérapeutique de molécules fournies par nos clients couplées à différents radioéléments pour le traitement de différents modèles tumoraux greffés chez la souris en sous-cutanée et ainsi d’évaluer le retard de croissance tumorale ou sa régression. Ces molécules doivent viser spécifiquement les cellules tumorales pour permettre au médicament d’y accéder et in fine de les détruire.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de tester différentes molécules thérapeutiques couplées à des radioéléments et de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques ciblées et spécifiques de certaines cellules tumorales afin de les transférer en clinique en fonction de leur efficacité.

Procédures

Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 s) ; Tonte du flanc en vue de la greffe ou de la mesure du volume tumoral (1 à 3 fois, 10 s) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (1 injections, 15 s) ; Administration de composés thérapeutiques en SC , IP ou en gavage (maximum 1 fois /jour et 4 fois, 15 s) Sur animal anesthésié : Tonte de l’omoplate en vue de la greffe (1-3 fois, 10 s) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (omoplate) (1 injection, 1 min) ; Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire (3 fois maximum, 30 s) ; Prélèvement de sang terminal par voie rétro-orbitaire (1 fois, 1 min) ou en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min) ; Administration de composés thérapeutique en IV (maximum 1 fois/ jour ; maximum 4 fois, 15 s) ;

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère liés à l’administration des cellules tumorales en sous cutanées ; stress et douleur légère liés à l’administration des molécules radiothérapeutiques en sous cutanée, gavage oral ou intraveineuse ; stress lié à l’anesthésie à l’isoflurane ; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ou les mesures de tumeurs au pied à coulisse.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux de chaque procédure lorsque l’une des conditions ci après est remplie : Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animale ; Fin de l’étude

Remplacement

Evaluer l’efficacité de molécules couplées à des radioéléments nécessitent d’être en présence d’un système biologique complexe. En effet, il est nécessaire dans le cadre de notre projet de vérifier que le candidat cible les cellules tumorales et de suivre son évolution dans d’autres tissus où il n’est pas souhaitable qu’il soit en trop grande quantité. Il n’est pas possible aujourd’hui de faire ce suivi in vitro, l’animal semble donc être un modèle pertinent pour ce type de traitement.

Réduction

Toutes les molécules évaluées dans cette étude ont été au préalable testées dans des modèles in vitro. De nombreuses molécules ont donc été mises de ce côté à cette étape. La pousse tumorale a été caractérisée dans des études vivo préalables. Le nombre d'animaux utilisé par groupe est donc déterminé par le client par des méthodes classiques statistiques en fonction des résultats préalables qu'il a obtenu avec sa molécule d'intérêt et du modèle tumoral sélectionné (homogénéité de la croissance des tumeurs SC). Ce nombre est réduit au minimum utilisable afin d'obtenir des données statistiquement relevantes. Enfin ce nombre est un maximum que nous pouvons réaliser en fonction des demandes de nos clients.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux sont surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles sont mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux de 6 par cage maximum dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie éventuelle et de préhension des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies anti-cancéreuses. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 6 et 12 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est décrit comme mature.

130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Un implant dentaire leur est posé, puis, quatre semaines plus tard, un fil de soie est noué autour pour déclencher l'inflammation, fil vérifié chaque semaine sous anesthésie gazeuse et remplacé s'il s'est relâché. Le porteur qualifie la pose de la ligature et l'application quotidienne du gel de non douloureuses, tout en prévoyant une évaluation quotidienne de la douleur par score de grimaces. Il indique travailler avec une équipe qui développe un modèle artificiel de gencive et d'os, ces expériences servant précisément à le valider, ce qui reviendrait à réduire plus tard le recours aux souris.

Objectifs

Les implants dentaires sont des racines artificielles qui permettent de remplacer une dent. Dans plus d’un tiers des cas, 2 ans après leur pose, une maladie inflammatoire localisée autour de l’implant survient et peut entrainer sa perte : la péri-implantite. Cette maladie est causée par un déséquilibre des bactéries orales avec la présence en excès de bactéries néfastes qui vont jouer un rôle dans l’inflammation. Ce projet a plusieurs objectifs : 1. fournir des données sur l’os et la gencive autour des implants qui serviront de références pour la réalisation d’un modèle artificiel de gencive et d’os en condition saine 2. fournir des données sur l’os et la gencive autour des implants qui serviront de références pour la réalisation d’un modèle artificiel de gencive et d’os lors de la péri-implantite 3. tester l’efficacité d’un nouveau traitement dans la péri-implantite : les dérivés de probiotiques. Les dérivés des probiotiques sont définis comme une préparation de micro-organismes inanimés et/ou de leurs composants exerçant un bénéfice pour la santé de l'hôte. Ils sont utilisés pour rééquilibrer les bactéries, réduire l’inflammation et pourraient améliorer la maladie de la péri-implantite. Ces 3 objectifs correspondent aux 3 procédures expérimentales du projet : la procédure 1 avec la mise en place d'un implant dentaire, la procédure 2 avec la mise en place d’un implant dentaire qui sera entouré dans un second temps par un fil de soie (ce qui induit la péri-implantite), et la procédure 3 qui correspond à l'application thérapeutique d'un gel contenant des probiotiques dans la péri-implantite.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Les données obtenues sur la gencive et l’os autour des implants chez la souris serviront de référence pour la réalisation d’un modèle artificiel de gencive et d’os en condition saine et de péri-implantite. La validation du modèle artificiel pourrait permettre de réduire l’utilisation des modèles animaux dans les études des implants dentaires dans le futur. En effet, en fonction de sa validation, il pourrait être utilisé en première intention, en remplacement des animaux. Les traitements utilisés à l’heure actuelle pour la péri-implantite ont des effets imprédictibles et variables d’un patient à l’autre. Les dérivés de probiotiques pourraient constituer un nouveau traitement prometteur dans cette maladie où un déséquilibre des bactéries a été retrouvé.

Procédures

Pour la procédure expérimentale 1, de 25 à 45 souris bénéficieront de la mise en place d’un implant dentaire (le protocole de mise en place de l'implant dure environ 3 minutes). Pour la procédure expérimentale 2, de 30 à 45 souris bénéficieront de la mise en place d’un implant dentaire, puis 4 semaines après de l’induction de la péri-implantite par mise en place d’une ligature péri-implantaire (le protocole de mise en place d'une ligature péri-implantaire autour de l'implant dentaire dure environ 5 minutes). Pour le procédure expérimentale 3, de 20 à 40 animaux bénéficieront de la chirurgie de la mise en place d’un implant dentaire, puis 4 semaines après de l’induction de la péri-implantite par mise en place d’une ligature péri-implantaire et de l’application quotidienne de gel au niveau de l’implant dentaire (l'application de gel autour de l'implant dentaire dure moins d'une minute).

Impact sur les animaux

La mise en place des implants dentaires a déjà été effectuée par d'autres équipes chez la souris : il n'y a pas de perte de poids ou de comportements anormaux entrainés par la chirurgie. Des antidouleurs sont administrés aux souris avant la chirurgie de façon systématique et après la chirurgie en fonction de l'évaluation de leurs douleurs (score de grimaces). L'évaluation de la douleur se fera quotidiennement au minimum et de façon renforcée si un signe de douleur est détecté. Pour induire l'inflammation autour de l'implant dentaire, dans les procédures expérimentales 2 et 3, un mois après la pose des implants, sous anesthésie générale, un fil sera placé autour de l'implant au-dessus de la gencive. La mise en place de cette ligature est non douloureuse. Chaque semaine, sous anesthésie gazeuse courte, on viendra vérifier que la ligature est en place ; si on observe un relâchement ou une perte de celle-ci, il en sera repositionné une autre. Une partie de la procédure expérimentale 3 consiste en l'application quotidienne d'un gel au niveau de l'implant dentaire. Cet acte sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse courte : il s'agit d'une application indolore.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort pour la réalisation de coupes histologiques, de mesure de la hauteur osseuse.

Remplacement

Actuellement, il n'existe pas de modèle n'utilisant pas d'animaux qui permet d'étudier le comportement de la gencive et de l'os après la mise en place d'un implant dentaire. Notre projet s'inscrit dans un projet collaboratif avec une équipe qui tente de développer un modèle de substitution n’ayant pas recours aux animaux. Ainsi nos expérimentations vont servir à valider ce nouveau modèle qui permettrait de diminuer l'utilisation d'animaux dans le futur. Nous ne pouvons pas remplacer les souris par des invertébrés car nous étudions en partie le comportement de l'os.

Réduction

Afin de réduire le plus possible le nombre d'animaux utilisés, nous allons effectuer des études préliminaires sur un petit nombre d'animaux. Ces études préliminaires nous permettent d'observer et de quantifier la réaction de la gencive et de l'os à l'inflammation dans les modèles que nous allons utiliser. A l'aide d'outils statistiques, nous pourrons ensuite calculer le nombre minimal d'animaux à utiliser par la suite dans les expérimentations pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les animaux, à la suite de leur arrivée dans l'animalerie, auront une période d'acclimatation d'une semaine afin qu'ils se familiarisent avec leur nouvel environnement. Ils seront hébergés par groupes de 5 dans des cages de taille adaptée. Des enrichissements de type de frisottis seront présents dans toutes les cages de souris. L'eau et l'alimentation seront proposées à volonté et en permanence aux souris. Après la chirurgie, une visite, au minimum quotidienne, sera effectuée pour observer les souris et évaluer la présence de signes douloureux : si un signe est repéré, des anti-douleurs seront donnés aux animaux et la fréquence de surveillance renforcée pour vérifier leur disparition. Si les animaux montrent une souffrance qui n'est pas soulagée par les traitements, ou un comportement reflétant un mal être ne pouvant pas être résolu, les animaux seront sacrifiés dès l'arrivée de ces signes (sans attendre la fin de l'expérimentation) : le bien-être animal étant un prérequis indispensable à nos procédures.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux fréquemment utilisés pour étudier les implants dentaires. L'utilisation de cette espèce a l’avantage de permettre la réalisation des protocoles sur des temps plus courts (entre 1 et 3 mois) que sur d'autres espèces (par exemple, les durées chez le lapin sont de 10 mois). Par ailleurs, les souris ont une maturité osseuse plus précoce que les autres mammifères (à 3 mois) : les protocoles peuvent donc avoir lieu sur des animaux plus jeunes. Utiliser des souris, nous permettra également d'avoir éventuellement recours à des modèles de souris génétiquement modifiés dans des études futures. Ceci pourrait nous permettre d’étudier certains mécanismes de l'immunité et de l'inflammation.

Vingt souris seront utilisées uniquement pour que les expérimentateurs s'entraînent à l'injection intracardiaque à travers le thorax, geste que 260 autres subiront pour de bon. Au total 1 528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. 1 248 d'entre elles reçoivent des cellules cancéreuses sous la peau des deux flancs, 960 un gavage quotidien pendant deux à quatre mois, et l'ensemble est pesé et mesuré deux fois par semaine jusqu'à ce que la tumeur atteigne la taille fixée d'avance. Le porteur retient la souris parce qu'elle existe en lignées immunodéficientes, donc capables d'accepter des cellules tumorales humaines sans les rejeter.

Objectifs

Environ 3% des cancers du poumon non à petites cellules présentent des mutations du récepteur MET conduisant à son activation et favorisant la croissance tumorale. Le but de notre projet est de comprendre les mécanismes moléculaires conduisant au développement de tumeur induite par des formes mutées du récepteur MET afin de pouvoir proposer des stratégies thérapeutiques basées sur ces mécanismes. Afin de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, nous nous sommes fixé deux objectifs. Le premier objectif est de déterminer si d’autres mutations de MET sont capables d‘induire des tumeurs similaires à celles obtenues avec la mutation spécifique que nous étudions. Pour cela, des cellules bronchiques humaines non tumorale ont été modifiées pour exprimer les formes activées de notre récepteur, ainsi qu’un panel d’autres mutations affectant ce dernier. Le second objectif est d’identifier les voies de signalisation requises pour l’induction des tumeurs par les formes activées de MET. Pour cela, l’expression d’acteurs de la signalisation de MET sera inhibée en plus de la mutation du récepteur MET. Nous avons identifié 5 acteurs de voies de signalisation à étudier et nous prévoyons d’étudier l’implication de cinq acteurs supplémentaires soit 10 cibles en tout. Dans un second temps, de façon à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant le récepteur MET muté, nous utiliserons dans notre modèle trois inhibiteurs de tyrosine kinase (TKI) utilisés en clinique (représentant le traitement de référence) et ciblant le récepteur MET. Nous utiliserons également des traitements ciblant les voies de signalisation en aval du récepteur MET. Ces inhibiteurs seront choisis parmi les molécules déjà en essai clinique et ciblant des voies de signalisation. Dans le cadre de ce projet et selon l’avancée de nos résultats sur les modèles cellulaires, nous prévoyons de tester 3 autres inhibiteurs supplémentaires, soit 6 inhibiteurs au total. Ces traitements seront également combinés (TKI/ Inhibiteur des voies de signalisation) afin d’évaluer leur potentiel thérapeutique dans notre modèle.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d’une part d’identifier les mécanismes moléculaires permettant aux formes activées de MET répertoriées dans le cancer du poumon d’induire la tumorigenèse. Sur cette base, nous pourrons évaluer l’efficacité de nouveaux traitements ciblant notamment des acteurs de voies de signalisation en aval en traitement simple ou en co-traitement avec les TKI (traitement de référence). Les bénéfices pourraient donc être importants pour les patients atteints d’un cancer du poumon présentant des mutations de MET par la proposition de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Après l’arrivée et l’acclimatation pendant 7 jours des animaux en zone d’hébergement, l’ensemble des 1528 animaux seront identifiés par bague à l’oreille (durée : 30 secondes) puis manipulés régulièrement par l’expérimentateur avant le début des procédures afin de réduire leur stress et de les habituer à la manipulation humaine. Le projet se déroulera ensuite en 4 parties. Plusieurs étapes sont communes à l’ensemble des parties. L’ensemble des animaux (1528) recevront une anesthésie par injection (Injection : 30 secondes ; durée anesthésie : 30min). Pour les parties 1 et 3, suite à l’anesthésie, 1248 animaux recevront une injection de cellules cancéreuses au niveau des 2 flancs (durée : 2 minutes). L’ensemble des souris seront pesées 2 fois par semaine (1 minute) et la croissance des tumeurs sera mesurée 2 fois par semaine (2 minutes). De plus, et seulement dans la partie 3, 960 animaux recevront par gavage une fois par jour un traitement ou un placebo (durée 1 min) au plus tôt une semaine après l’injection des cellules et jusqu’à la fin de l’expérience (durée totale : de 2 à 4 mois). Pour les parties 2 et 4, après l’anesthésie, 260 animaux seront tondus au niveau du thorax et recevront une injection intracardiaque trans-thoracique sous anesthésie générale de cellules cancéreuses ou non. Cette injection se fera sous anesthésie (durée de l’anesthésie : 30 minutes). Pour apprentissage, 20 animaux supplémentaires subiront ce geste. Une analyse par imagerie sera réalisée une fois par semaine afin de suivre le développement des cellules tumorales. Pour cela les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse et maintenus sous anesthésie à l’aide d’un masque (durée anesthésie : 5 à 60 min). Ils recevront ensuite l’injection d’une molécule permettant la réalisation de l’imagerie (durée : 30 secondes). De plus, et seulement dans la partie 4, 160 animaux recevront par gavage une fois par jour un traitement ou un placebo (durée 1 min) dès le lendemain de l’injection des cellules et jusqu’à la fin de l’expérience (durée totale : de 2 à 4 mois). Enfin, l’ensemble des 1528 animaux seront mis à mort lorsqu’une taille de tumeur qui aura été prédéfinie sera atteinte ou dès l’apparition du moindre signe de souffrance. Pour cela, les 1528 souris seront anesthésiées par voie gazeuse avant d’être mises à mort. La durée maximale pour chaque partie sera de 4 mois.

Impact sur les animaux

Les procédures que nous prévoyons de réaliser pourraient être à l’origine d’un stress lié à la manipulation. L’injection des cellules et/ou de la molécule pour la lecture de la bioluminescence pourrait entraîner un stress ou une douleur chez les animaux. Pour limiter le stress des animaux, ces derniers seront anesthésiés lors de ces étapes de la procédure. Aux sites où les cellules seront injectées, le développement des tumeurs ne devrait pas entraver la liberté de mouvement des souris, cependant si cette liberté était altérée, une mise à mort des animaux sera réalisée. Le suivi régulier des animaux permettra de pallier toute souffrance ou détresse ressenties par ces derniers.

Devenir

En fin de procédures, les animaux seront tous mis à mort car il est nécessaire de pouvoir étudier les organes et les tumeurs afin d’analyser le potentiel tumoral, métastatique mais également l’efficacité des traitements utilisés.

Remplacement

Avant d’initier la partie utilisant des modèles animaux de notre projet, de nombreuses études ont été réalisées sur des cellules de manière à pouvoir notamment étudier la prolifération cellulaire, la résistance à l’apoptose, la migration et la croissance sans ancrage. Seuls les mutants présentant au moins une de ces capacités sont évalués dans les modèles animaux remplaçant ainsi l’animal dans le processus de sélection des lignées d’intérêt. Cependant, la croissance tumorale implique de nombreux processus biologiques, comme la vascularisation tumorale, l’implication du microenvironnement tumoral, l’invasion des tissus voisins qui nécessitent pour leur évaluation un système biologique complexe rendant pour l’instant nécessaire l’utilisation d’animaux.

Réduction

Comme précisé précédemment, de nombreuses réponses biologiques sur des cellules ont été évaluées au préalable à l’étude sur l’animal incluant la prolifération cellulaire, la résistance à l’apoptose, la migration et la croissance sans ancrage. Seuls les mutants présentant au moins une de ces capacités sont évalués dans les modèles animaux. De plus, l’utilisation de l’imagerie pour évaluer la dissémination métastatique permet un suivi longitudinal de la dissémination évitant donc l’utilisation de plusieurs cohortes d’animaux à différents temps Pour l’évaluation de l’efficacité des traitements, les molécules sont d’abord utilisées sur les modèles cellulaires. Seules les molécules capables d’inhiber au moins une réponse seront utilisées sur le modèle animal. Les groupe d’animaux par condition ont été déterminés en fonction de nos expériences précédentes pour donner une puissance statistique suffisante en tenant compte de la variabilité entre les animaux.

Raffinement

Afin de limiter au maximum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage dans un environnement enrichi (maison, carré de coton, copeaux de cartons...) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés 7 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés avant la mise en place de l’expérimentation afin de procéder à une habituation. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés avant les procédures pouvant induire un stress ou une angoisse chez l’animal ainsi qu’avant la mise à mort. Une fois l’injection intracardiaque de cellules tumorales réalisée, les animaux seront suivis quotidiennement de manière à pouvoir détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou d’angoisse. Des points limites ont été définis préalablement à l’expérience et seront suivis à l’aide d’une fiche d’évaluation des signes cliniques. En cas d’atteinte des points limites, les animaux seront mis à mort selon la méthode définie. La mise à mort sera réalisée à distance des autres animaux.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix pour l’étude de la croissance tumorale expérimentale. Ce modèle permet notamment de disposer d’animaux immunodéficients compatibles avec l’injection de cellules tumorales humaines ainsi que d’utiliser des outils de modifications génétiques permettant le fonctionnement de notre modèle. Les injections de cellules tumorales seront réalisées comme classiquement décrit dans la littérature sur des animaux âgés de 6 à 8 semaines à la fois mâles et femelles.