Souris
Apport de la thérapie génique pour soigner le syndrome d’Usher de type 1C
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Deux nouvelles lignées de souris sont créées pour porter une mutation humaine responsable du syndrome d'Usher de type 1C, avec une surdité permanente et des troubles de l'équilibre annoncés comme phénotype attendu. 2 950 souris vont être utilisées, dans des procédures allant de l'intervention sous anesthésie sans réveil à un niveau de souffrance modéré, une partie opérée puis tuée avant tout réveil pour la formation à la chirurgie et pour vérifier au microscope la réussite de l'injection. Les autres reçoivent une injection unique dans l'oreille interne, dès l'âge d'un jour, ou sous la rétine à trente jours, puis passent des tests auditifs sous anesthésie, un test d'équilibre de trente et une minutes, deux tests d'orientation de quinze secondes, un test de nage de trente secondes et des enregistrements de la rétine après trois heures d'obscurité. Toutes sont tuées, celles qui n'ont pas le bon génotype comme les géniteurs remplacés avant quinze mois, et les autres entre six jours et onze mois après l'injection pour l'analyse de leurs vestibules, cochlées et rétines.
Objectifs
Le syndrome d’Usher de type 1 est la première cause de surdicécité héréditaire chez l’enfant. Il n’existe à ce jour aucun traitement pour prévenir et/ou corriger les déficits sensoriels responsables de ces atteintes auditives et visuelles. Depuis peu, la thérapie génique est l’une des pistes explorées pour soigner ces déficits. Notre objectif est d’évaluer l’effet d’une telle approche dans des modèles murins du syndrome d’Usher de type 1C (USH1C). Nous testerons deux stratégies de thérapie génique (via des vecteurs viraux ou via des liposomes) dans des souris génétiquement modifiées (à créer, mâles et femelles, nouveau-nés et adultes).
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables des pertes visuelles et auditives décrites dans le syndrome d’Usher de type 1C et de développer des stratégies thérapeutiques capables de prévenir et/ou retarder la maladie. A court terme : - L’utilisation d’une souris porteuse de la mutation humaine nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables de la maladie dans les cellules sensorielles de la rétine et de l’oreille interne. - Nous identifierons les méthodes les plus efficaces pour exprimer la protéine non mutée ou réparer la protéine mutée et déterminerons l’efficacité de ces deux stratégies pour corriger les troubles auditifs, vestibulaires et visuels chez nos souris déficientes. A long terme : Nous espérons avec ce travail développer des outils utilisables dans des essais pré-cliniques et cliniques afin de prévenir ou retarder la cécité et la surdité chez les patients atteints du syndrome d’Usher de type 1C. Ceci inclut : - la mise en évidence d’approches nouvelles pour le transfert de gène non viral, - la mise en évidence de l’efficacité in vivo de l’édition de gène pour la correction de mutations spécifiques.
Procédures
Evaluation d’un phénotype dommageable sur 2 nouvelles lignées de souris par pesées et onbservations. Chirurgie : Les animaux seront soumis à des injections sous anesthésie gazeuse et analgésie, elles seront uniques et ne dureront pas plus de 10 minutes. Tests auditifs : Les souris injectés au niveau de l’oreille interne seront soumises à des tests auditifs dès l’âge de 3 semaines. Ces tests pourront être répétés à 1, 2 et 3 mois. Les souris seront anesthésiées puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Des mesures seront enregistrées à l’aide d’électrodes sous la peau ou à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Tests d’équilibre : Les souris injectées au niveau de l’oreille interne seront également soumises à des tests comportementaux. Leurs déplacements seront analysés à l’aide d’un système vidéo (2 minutes). Leur capacité d’équilibre sera quantifiée par 2 tests (l’un durant 31 minutes, l’autre 2 minutes). Leur capacité d’orientation dans l’espace sera évaluée grâce à deux autre tests (15 secondes chacun). Un test de nage sera finalement réalisé (30 secondes) avant le retour en cage d’hébergement. Tests Visuels : Les souris injectées au niveau de la rétine seront soumises à des tests entre 2 et 11 mois post-injection. Elles seront placées à l’obscurité 3 heures avant leur anesthésie, puis exposées à de brefs flashes lumineux d’intensité croissante. Les réponses électriques générées seront enregistrées à l’aide d’électrodes placées sous les paupières. Des mesures seront également réalisés entre 0 et 60 minutes après désensibilisation à la lumière (exposition lumineuse intense de 3 minutes).
Impact sur les animaux
Les souris déficientes en protéine appelée Harmonine sont atteintes de surdités et présentent des troubles de l’équilibre. Les déficits visuels sont peu marqués et ne provoquent aucun changement comportemental. Les deux nouvelles lignées de souris que nous souhaitons créer pourraient présenter des phénotypes similaires. Aucune aggravation de phénotype n’est attendue pour ces lignées. Les injections dans l’oreille interne et dans la rétine seront réalisées sous anesthésie gazeuse et analgésie, en conditions optimales d’asepsie et avec un contrôle rigoureux des animaux en pré- et post-opératoire. Aucune dégradation de l’état des animaux n’est attendue, hormis un risque limité de cataracte. Bien au contraire, nous espérons que le remplacement ou la correction du gène muté contribuera à rétablir les fonctions d’équilibre voire l’audition des souris injectées. En découle la liste ci-dessous des interventions après raffinement, et de leurs éventuels effets indésirables supérieurs ou égal à une piqûre d’aiguille : 1) POUR la création de deux lignées de souris transgéniques déficientes en Harmonine, élevées dans un milieu fortement enrichi -> surdité permanente et troubles d’équilibre 2) POUR les injections intracochléaires ou sous-rétiniennes sous anesthésie gazeuse et analgésie, avec soins pré- et post-opératoires -> pas de nuisance attendue du fait des injections réalisées sous contrôle stricte pré et post-opératoire.
Devenir
Les animaux utilisés lors de cette procédure et destinés à la formation à certaines chirurgies seront mis à mort. La réussite de l’injection sera visible immédiatement après l’injection (après dissection post-mortem), il s’agira donc d’une procédure sans réveil. Certains animaux seront utilisés pour l’établissement de nouvelles lignées de souris. Les animaux ne possédant pas le génotype approprié seront mis à mort. Les géniteurs au génotype favorable seront mis à mort avant l’âge de 15 mois et remplacés. Certains animaux appartiennent à de nouvelles lignées. Ils seront caractérisés puis mis à mort afin d’analyser par microscopie les vestibules, cochlées et rétines. Des tests seront réalisés sur certains animaux afin d’évaluer l’efficacité du traitement. Ils seront ensuite mis à mort afin d’analyser les tissus injectés en microscopie.
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative in vitro ou in silico pour appréhender les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de la rétine ou de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus visuel ou mécanique par certains récepteurs ou cellules sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique à la rétine ou à certains neurones de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. De fait, nous aurons recours à la souris dans notre projet pour étudier les cascades physiopathologiques impliquées dans la cécité ou la surdité et pour tester l’efficacité thérapeutique de traitements préventifs ou curatifs.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons retraité les données issues de souris normales et mutantes avec un outil statistique. Nous avons déterminé qu'il nous faudrait un minimum de 5 individus par groupe. Afin d’éviter un éventuel « effet cage », les souris d’une même cage seront subdivisées pour recevoir au moins 2 traitements différents. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons.
Raffinement
Notre projet prévoit la création de deux nouvelles lignées de souris transgéniques. Dans la mesure où toute création d’une nouvelle lignée de souris implique de surveiller la survenue d’un phénotype dommageable, nous suivrons la « fiche d'évaluation de phénotype suite à une création de lignée » proposée par notre SBEA. Les animaux atteignant les points limites définis seront mis à mort immédiatement. Des enrichissements d’environnement supplémentaires seront fournis aux souris et adaptés aux besoins. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies. Les animaux opérés seront régulièrement inspectés pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans la grille d’évaluation fournie par notre SBEA.
Choix des espèces
Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’œil et de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Afin de nous rapprocher de la pathologie humaine, nous souhaitons nous focaliser sur une région du génome pour lequel un variant pathologique a été décrit. Il n’existe pas à ce jour de modèles murins impliquant précisément cette région, raison pour laquelle nous souhaitons créer deux nouveaux modèles de souris mutées pour cette région. Ces deux modèles vont nous permettre d’explorer les preuves de concept thérapeutique que nous pourrons transposer, du moins conceptuellement, chez l’homme. Les injections sous-rétiniennes se feront sur des animaux âgés de 30 jours, soit à un stade où l’espace sous-rétinien est bien formé. L’essentiel des injections intracochléaires se feront sur des souris âgées de 1 jour, soit à un stade immature où les cellules sensorielles ne sont pas encore trop affectées. Des stades plus tardifs seront également testés (7, 10, 14 et 21 jours post-nataux) de façon à déterminer la fenêtre de temps thérapeutique de nos injections intracochléaires. La mise à mort se fera entre 6 jours et 11 mois post-injection pour évaluer les effets à court, moyen et long termes d’une correction génique.
Étude de l’altération des réponses immunitaires innées lors de l’infection à Leptospira interrogans en phase de colonisation rénale chronique chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Infectées par injection d'une solution de leptospires, puis laissées porter la bactérie dans leurs reins pendant un à trois mois, 432 souris reçoivent ensuite dans l'urètre, sous trente minutes d'anesthésie, une seconde bactérie, Escherichia coli. Certaines reçoivent avant l'infection une injection destinée à supprimer un composant de leur système immunitaire. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, avec perte de poids, poil hérissé et mobilité réduite attendus, et toutes sont tuées pour le prélèvement de leurs reins et de leur vessie. Le porteur décrit la colonisation rénale comme légère et asymptomatique, et annonce découper chaque paire de reins en quatre morceaux pour "rationaliser au mieux chaque individu".
Objectifs
La leptospirose est une zoonose ré-émergente causée par des bactéries du genre Leptospira avec Leptospira interrogans (L. interrogans), la principale espèce pathogène. Les leptospires sont transmis par différents mammifères dont certains rongeurs comme les rats et les souris (principal réservoir connu) qui les hébergent de manière asymptomatique dans leurs reins et les excrètent via leurs urines dans l’environnement. Cette maladie affecte tous les mammifères incluant l’Homme chez qui elle se manifeste diversement, allant de symptômes pseudo-grippaux à des formes sévères, le plus souvent fatales. De mauvaises conditions sanitaires dans les pays en développement, les inondations liées au réchauffement climatique sont des facteurs favorisant la transmission de L. interrogans. Il n’existe à ce jour aucun vaccin universel capable de conférer une protection durable et croisée pour les 350 types de leptospires identifiés. Les antibiotiques ne sont efficaces que s’ils sont administrés précocement, sinon ils s’avèrent incapables d’éradiquer l’infection dès lors que les leptospires s’installent et persistent dans les reins de l’hôte. Trop souvent négligée, la leptospirose est une maladie généralement diagnostiquée tardivement et se caractérise par une infection rénale chronique cause de morbidité dans les élevages de rente et suspectée chez l’homme. Des études sérologiques récentes suggèrent que certaines maladies rénales chroniques pourraient être associées à une infection antérieure asymptomatique par les leptospires. L’objectif de notre projet est d’étudier, grâce au modèle murin infecté par la leptospirose, les conséquences de l’infection chronique rénale induite par les leptospires et de son impact sur le système immunitaire inné, encore mal compris. Afin de mener à bien notre projet, nous souhaitons étudier la réactivité de l’hôte infecté chroniquement par les leptospires à une co-infection par les Eschetrichia coli pathogène urinaires (UPEC). A l’aide de ces modèles, nos travaux devraient permettre de caractériser les conséquences, pour l’instant inconnues, de l’infection rénale chronique induite par l’infection aux leptospires et de son impact sur le système immunitaire inné lors d’une infection du système urinaire.
Bénéfices attendus
L’infection aux leptospires se caractérise dans un premier temps par une phase de dissémination sanguine, puis par une réapparition dans les reins de l’hôte où ils établissent une colonisation stable et pérenne. Malgré une légère fibrose rénale, aucune détérioration de la fonction rénale, ni perte de poids n’ont été observées. Cependant, nous ignorons si ce portage chronique altère ou non la réponse immunitaire innée de l’hôte. L’idée, ici est de proposer une étude complète sur le système immunitaire innée en contexte de leptospirose chronique, afin de caractériser et définir les acteurs de la réponse immunitaire innée face à une seconde infection (ici Escherichia coli). Ces éléments pourraient apporter des éléments probants montrant que la colonisation rénale chronique des leptospires détériore le système immunitaire inné, rendant l’hôte plus sensible lors d’une co-infection.
Procédures
Au maximum, les souris seront soumises à 1 injection de solution saline ou bactéries (durée 1 minutes/souris), puis 1 à 3 mois post-infection à une injection d’un cocktail d’anesthésiques afin de procéder à 1 administration dans l’urètre d’une solution saline ou de bactéries sur animal anesthésié (durée du geste 3 minutes/souris, durée totale de l’anesthésie 30 minutes/souris). De plus les animaux pourront recevoir 1 injection avant l’infection aux bactéries, afin de supprimer un composant du système immunitaire ; toutes les injections sont réalisées sur animaux vigiles sous contention (1 minute/souris) sauf l’intraveineuse dans la veine de l’œil qui sera réalisée sous anesthésie gazeuse (2 minutes/souris).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéales, réalisées par une piqure d’aiguille entraînent une douleur légère, et un inconfort de courte durée. Les agents infectieux administrés pourront provoquer des signes cliniques infectieux : perte de poids, poil hérissé, mobilité réduite.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique
Remplacement
L’étude des réponses immunitaires de l’hôte ne peut pas être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement biologique (interaction cellulaire, recrutements cellulaires, …). Cependant, nous investiguerons au maximum possible la mise en place d’étude in vitro complémentaire.
Réduction
Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) a été établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Dans notre analyse, nous avons souhaité introduire l’étude des deux sexes, c’est pourquoi chaque groupe expérimental sera constitué de 6 animaux, composé de 3 mâles et 3 femelles. Ce nombre a été défini d’après notre expérience, et avec l’aide d’un biostatisticien. Des tests statistiques appropriés seront appliqués pour déterminer la significativité des données. De plus, seules les expériences donnant des résultats intéressants seront répétées. L’étude de l’immunité innée en condition de co-infection (Leptospira interrogans et Escherichia coli) s’effectue sur deux compartiments différents, le rein et la vessie. Afin de réduire le nombre d’animaux inclus dans l’expérimentation les différents organes prélevés sur un même animal, pourront servir pour 4 types d’analyses. En effet, le rein, principale cible d’étude, est un organe pair. Chaque rein pourra être coupé en 2 permettant l’obtention de 4 morceaux distincts, cependant homogènes sur le plan histologique, pour 4 types d’analyses indépendantes. La vessie, elle, sera prélevée en totalité pour l’analyse de charge en Escherichia coli.
Raffinement
L’administration dans l’urétre sera pratiquée sous anesthésie générale de l’animal permettant une administration sans gêne ni douleur. La dose de leptospires utilisée dans notre projet, pour induire une colonisation rénale, ne provoque qu’une infection légère, asymptomatique. La surveillance des souris et des points limites sont définis et spécifiques de la maladie, ils permettent d’anticiper de façon fiable toute souffrance animale inutile. L’infection dans l’urétre sous anesthésie de la bactérie Escherichia coli n’entraîne pas de septicémie et les souris se rétablissent et éliminent complétement les bactéries en moins d’une semaine. Dans notre étude, l’infection sera de courte durée chez l’animal (24h). Cependant, dans les heures suivant l’infection les souris seront attentivement observées pour tout signe de souffrance animale (poil hirsute, attitude prostrée, signes faciaux de souffrance, mobilité altérée) et le cas échéant, mises à mort. Au terme de chaque expérience, les souris seront mises à mort selon les règles établies et leurs organes prélevés pour rationaliser au mieux chaque individu.
Choix des espèces
Dans la présente demande, l’étude de la leptospirose implique un hôte et les bactéries qui l’infectent. La complexité des mécanismes d’induction des réponses immunitaires et de l’interaction hôte-pathogène ne peut pas être appréhendée dans sa globalité in vitro. La souris, hôte naturel asymptomatique, est idéale pour pouvoir mieux comprendre la leptospirose. Par ailleurs, la souris est un mammifère avec une physiologie et un système immunitaire très proches de ceux de l’Homme. Ainsi, les résultats expérimentaux et la compréhension des mécanismes immunitaires mis en place lors de l’infection par les leptospires seront très probablement transférables à l’Homme. Ce projet sera réalisé avec des souris adultes (entre 6 et 12 semaines), défini comme matures en termes de système immunitaire.
Développement pré-clinique du traitement d’une maladie immunitaire génétique rare par thérapie génique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Neuf injections dans l'abdomen, treize sous la peau, six prélèvements sanguins à la veine mandibulaire et six séances d'imagerie sous anesthésie prolongée par animal : 1 176 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes. Les altérations génétiques de ces souris provoquent une immunodéficience sévère qui les expose aux infections, et l'injection de cellules humaines y déclenche une maladie du greffon contre l'hôte, décrite comme douloureuse au niveau cutané, digestif et pulmonaire. L'objet réel est de satisfaire une exigence réglementaire, l'agence du médicament demandant une étape animale avant le dépôt d'un essai clinique de thérapie génique. Le RNT ne nomme ni la maladie visée, ni le gène en cause, ni le vecteur testé, et s'en tient à une maladie auto-immune sévère touchant les garçons et à un gène "essentiel dans la régulation des cellules immunitaires".
Objectifs
Ce projet étudie une maladie auto immune sévère se manifestant chez les garçons, souvent fatale dans la petite enfance. Cette pathologie est la conséquence de mutations dans un gène essentiel dans la régulation des cellules immunitaires, entrainant une déficience des lymphocytes régulateurs. Les traitements actuels ne sont que partiellement efficaces, aussi nous proposons de développer une nouvelle alternative thérapeutique pour contrôler les manifestations autoimmunes chez ces patients. Celle-ci repose sur une thérapie génique des lymphocytes, grâce au transfert d'une copie saine du gène essentiel dans la régulation des cellules immunitaire pour restaurer le compartiment de lymphocytes régulateurs. Nous avons développé un vecteur viral permettant l’expression de ce gène thérapeutique et montré son efficacité dans des tests in vitro ainsi que dans le modèle murin de la pathologie. La dernière étape pour permettre le dépôt de l’essai clinique chez l’homme (requise par l’Agence Nationale de Sécurité du Medicament) est la validation de l’efficacité et de l’absence de toxicité des lymphocytes humains ainsi modifiées, chez la souris humanisée. Pour ce faire nous utiliserons l’un des modèles classiques pour évaluer la fonctionnalité des lymphocytes régulateurs humains, qui est le modèle de « maladie du greffon contre l’hôte ».
Bénéfices attendus
A terme, ces expériences permettront d'établir l'efficacité suppressive des lymphocytes modifiées avec le gène thérapeutique essentiel dans la régulation des cellules immunitaires à prévenir la maladie du greffon contre l’hôte dans un modèle pré- clinique de souris humanisées. Il s’agit d’un prérequis nécessaire au développement clinique de cette nouvelle stratégie thérapeutique pour les patients atteints de ette maladie auto-immune sévère.
Procédures
Injection intraveineuse : 1x, 1min par intervention Injection intrapéritonéale: 9X , 30s par intervention. Injection en sous-cutanée:13X, 10s par intervention. Prelevement sanguin en vigile: 6X, 30s à 2min. Imagerie intravitale : 6X, 10min par intervention
Impact sur les animaux
Les altérations génétiques des animaux utilisés dans le projet provoquent une immunodéficience sévère qui les rend vulnérables aux infections microbiennes. Le traitement appliqué aux souris peut provoquer une douleur transitoire durant les heures qui suivent l’injection intrapéritonéale. L’anesthésie gazeuse ou par injection intrapéritonéale peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. L’injection de cellules en intraveineuse et sous anesthésie peut provoquer un stress transitoire. Les prélèvements de sangs réalisés sur la veine mandibulaire peuvent provoquer une légère douleur et du stress. L’administration par injection sous-cutanée ou intrapéritonéale peut provoquer une douleur légère et un stress. L’imagerie intravitale peut provoquer chez les animaux un stress et une baisse de la température corporelle liée à l’anesthésie gazeuse prolongée nécessaire à sa mise en œuvre. La maladie du greffon contre l’hote peut provoquer une douleur modérée au niveau cutanée, digestif, pulmonaire. Les manifestations de douleurs peuvent se traduire par des troubles comportementaux, physiologiques et une perte de poids. Pour limiter cette souffrance les animaux seront surveillés quotidiennement à l'aide du score clinique et les souris seront mises a mort si le point limite est atteint.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin de cette procédure car nous avons besoin de prélever leurs organes afin de realiser plusieurs analyses moléculaires et histologiques. Les animaux non inclus dans la procédure seront mis à mort quand il dépasse l'âge prévu de la procédure.
Remplacement
Afin de caractériser le vecteur de thérapie génique et les cellules humaines corrigées à l’aide de celui-ci, nous avons réalisé plusieurs études in vitro afin d’optimiser la préparation du produit thérapeutique. La dernière étape requise pour le dépôt de l’essai clinique auprès des agences réglementaires est une étude chez l’animal afin de s’assurer de l’efficacité et l’absence de toxicité dans un modèle animal proche de l’homme.
Réduction
Nous avons développé un score d’évaluation clinique de la maladie dans ce modèle de souris, afin de réduire les variations entre animaux et leur nombre requis par les exigences statistiques. Sur la base de nos résultats préliminaires et les données de la littérature nous avons réalisé une étude statistique sur le nombre d'animaux requis pour mesurer une différence significative de score entre les groupes, afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour notre étude. Nous aurons recours à plusieurs tests statistiques destinés à réduire les lots du projet de manière optimale. Par ailleurs, nos élevages de souris seront synchronisés en amont de chaque expérience de manière à utiliser au maximum les animaux de chaque portée.
Raffinement
Afin de limiter la souffrance et l’angoisse des animaux, une surveillance rapprochée et l’utilisation d’antalgiques sont prévues. Les animaux seront hebergés sur portoir ventilé avec un accès à la nourriture et à la boisson ad libitum. Chaque cage bénéficie d’un enrichissement matérialisé par un tunnel translucide rouge destiné à diminuer le stress et stimuler leur activité, des carrés de cellulose afin de favoriser la nidification et un bâtonnet en bois pour répondre aux besoins naturels des rongeurs. Chaque procédure douloureuse sera précédée d’une anesthésie gazeuse ou une anesthésie par injection. Lors des prélèvements de sang, un anesthésique local sera appliqué à l’œil afin de diminuer la douleur qui suit la manipulation. Les animaux seront pesés trois fois par semaine en même temps que le suivi du score de la maladie afin de surveiller toute perte de poids ou comportement anormal. Des points limites ont été établis afin d’anticiper la mise a mort de l’animal si nécessaire. Une surveillance quotidienne sera réalisée par le personnel compétent de l’animalerie ainsi qu’une surveillance trois fois par semaine par les responsables du projet.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence pour étudier le devenir et le comportement de cellules du système immunitaires humaines. L’induction de maladie du greffon contre l’hôte est reconnu comme un modèle pertinent et robuste, avec une pathologie proche de celle survenant chez l’homme. Ce modèle est très utilisé pour tester l’efficacité de traitements de cellules régulatrices. Des souris agées de 8 à 12 semaines seront utilisées pour harmoniser les poids et les suivis entre les expériences. C’est le stade de développement classiquement rapporté dans la littérature pour ce modèle. Ce stade est justifié aussi dans le cadre du développement d’un modèle d’évaluation de traitement pour une pathologie auto-immune pédiatrique.
Effet d’un agoniste synthétique des récepteurs de l’acide rétinoïque dans l’insuffisance rénale chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles endocriniens
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Une perte de poids trop importante, une paralysie des membres postérieurs, un saignement de nez, la prostration ou une surinfection de la plaie déclenchent la mise à mort. 400 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes. Une partie subit une interruption de la circulation dans les deux reins pendant vingt-deux minutes, une autre une ischémie du rein gauche de vingt-cinq minutes doublée de l'ablation du rein droit, puis toutes reçoivent un gavage quotidien pendant cinq ou dix jours et des mesures répétées de la fonction rénale sous deux anesthésies séparées de deux heures. Le porteur écrit que l'induction d'une insuffisance rénale est "absolument indispensable" au projet, et n'utilise que des mâles parce que le rein des femelles résiste mieux, ce qui obligerait à recaler tout le protocole pour obtenir des lésions équivalentes.
Objectifs
Environ un patient sur trois admis dans une unité de soins intensifs va développer une insuffisance rénale aigüe définie par une diminution brutale de la fonction rénale. Il est désormais bien établi que même un épisode peu sévère d’ insuffisance rénale aigüe augmente le risque de décès, indépendamment de toute comorbidité . En outre, il est aussi démontré que l'insuffisance rénale aigüe, y compris chez les enfants, est un facteur de risque majeur pour le développement d'une insuffisance rénale chronique en l'espace de quelques semaines ou de quelques mois. Malheureusement, il n'existe actuellement aucun traitement médical pour traiter l'insuffisance rénale chronique. Le traitement de l’insuffisance rénale aigüe constitue donc un objectif majeur de santé publique. Nous espérons ici démontrer le rôle bénéfique d'un dérivé de la vitamine A dans la récupération rénale après l’ insuffisance rénale aigüe et la transition vers l'insuffisance rénale chronique. Le traitement proposé est déja utilisé en médecine humaine pour traiter certains cancers. Ce projet est une première étape qui pourrait déboucher sur un essai thérapeutique chez des patients sévères admis en unité de soins intensifs et souffrant d'insuffisance rénale aiguë. Pour tester l'effet potentiellement bénéfique de ce traitement sur la fonction rénale au cours de l'insuffisance rénale aigüe, notre projet a plusieurs objectifs : 1) Effet du traitement sur la fonction rénale dans des conditions normales chez la souris. 2) Effet du traitement sur la préservation de la fonction rénale dans les conditions d'insuffisance rénale aigüe et d'insuffisance rénale chronique (modèle préventif) 3) Effet du traitement sur la récupération de la fonction rénale dans les conditions d'insuffisance rénale aigüe et d'insuffisance rénale chronique (modèle curatif).
Bénéfices attendus
L'insuffisance rénale chronique est un problème majeur de santé publique, non seulement en raison du risque accru de dialyse et de transplantation, mais aussi parce que l' insuffisance rénale chronique est associée à une morbidité et une mortalité très élevées, même avant le stade de l'insuffisance rénale terminale. En effet, le déclin de la fonction rénale est associée à des augmentations majeures de la mortalité cardiovasculaire.L'insuffisance rénale aiguë constitue un véritable défi dans les unités de soins intensifs, car il s'agit d'une affection très courante, associée à une importante mortalité et pour laquelle il n'existe actuellement aucun traitement spécifique. Nous avons pu identifier une association, chez l’homme, entre l’expression du récepteur d'un dérivé de la vitamine A et la récupération de la fonction rénale. Ce projet vise tout d’abord à rechercher une relation de causalité et nous dira si la stimulation de ce récepteur, par un médicament déjà disponible dans la pharmacopée, peut améliorer la récupération rénale. Ce projet, en cas de résultats encourageants, pourraient déboucher sur un essai clinique chez l’homme, en particulier chez des patients sévères admis en unité de soins intensifs et souffrant d'insuffisance rénale aiguë. Il est donc d’une importance cruciale.
Procédures
(1) Une partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine les deux reins pendant 22 minutes. Elle s'accompagne d'injections pour l'analgésie et l'anesthésie. Ce protocole a une durée de 40 minutes. (2) Une autre partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine le rein gauche pendant 25 min (durée totale 30 min) et à exciser le rein droit (durée totale de 10 min). Cette chirurgie se fait en deux temps. Elle s'accompagne d'injections pour l'analgésie et l'anesthésie. (3) Toutes les souris du projet seront soumises à la mesure de leur fonction rénale par une nouvelle technique qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter par voie intra-veineuse le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure 5 minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire 2h plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que 2 minutes. La mesure sera répétée plusieurs fois sur chaque souris à des jours différents selon la procédure (4) Tous les animaux recevront un traitement ou un placebo par gavage à l’aide d’une canule adaptée à la morphologie des animaux. Cette étape est très rapide, environ 30 secondes par animal. Le gavage sera limité à une administration quotidienne pour une durée totale de 5 ou 10 jours (5) Prélèvement du sang sous anesthésie (30 secondes environ), sur un plateau thermostaté ; suivi de l'euthanasie par une méthode règlementaire en vue des différents prélèvements et analyses nécessaires.
Impact sur les animaux
La chirurgie et l'induction d'une insuffisance rénale aigue provoquent une douleur, une altération de l'état général et un stress de l'animal : (1) douleur provoquée par la procédure chirurgicale nécessaire pour la néphrectomie et la pose des clamps vasculaires (injections analgésie et anesthésie, ouverture des plans cutané et musculaire, sutures); (2) complications liées à l'anesthésie chimique pour la chirurgie et gazeuse pour la mesure de la fonction rénale (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire , stress thermique) (3)altération de l'état général : perte de poids, déshydratation ; (4) stress induit par les manipulations quotidiennes et en particulier lors du gavage par voie orale. (5) Douleurs modérées induites par les injections intraveineuses (Mesure de la fonction rénale). (6) Le gavage oral peut être source d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris. Le profil de sécurité du traitement utilisé dans ce projet est largement favorable et déjà utilisé en pratique clinique. Les effets secondaires décrits chez l’homme sont retrouvés pour des durées de traitements (de 10 à 800 jours) largement supérieures à celle utilisée dans ce protocole (10 jours maximum) Ces nuisances ne peuvent pas être complètement évitées car l'induction d'une insuffisance rénale est absolument indispensable pour le projet.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.
Remplacement
En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet thérapeutique du médicament utilisé dans ce projet est l'amélioration de la fonction rénale.
Réduction
Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter-individuelle du phénotype étudié dans nos deux modèles expérimentaux. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux pour ce projet est de 400 souris. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées : Les animaux sont acclimatés dans l'animalerie au moins une semaine avant le début de la procédure. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. La surveillance des animaux par du personnel qualifié est quotidienne. Le bien- être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. Pour assurer le bien-être des animaux pendant et après la chirurgie, les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur et d'une anesthésie appropriée. Les souris seront placées dans une couveuse pour faciliter la phase de réveil dans leurs cages initiales. Durant toute la procédure, de la nourriture humidifiée est mise à disposition des animaux directement dans la cage, en plus des croquettes habituelles. En dehors d'une courte période d'isolement limité à deux heures, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée quasiment quotidienne pendant toute la durée du protocole. Des points limites ont été définis, tels qu'une perte de poids trop importante, une paralysie des membres postérieurs, un saignement de nez, la prostration, l'hérissement du pelage, une surinfection liée à la chirurgie. Il existe aussi un risque de saignement causé par les injections. Il peut survenir aussi des complications liées à l'anesthésie (détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, stress thermique).
Choix des espèces
Concernant le stade de développement : Tous les animaux sont des souris mâles fournis par un éleveur agréé. Ils sont livrés à l'âge de 8 semaines. Une période d'acclimatation de 1 semaine est respectée avant le début des procédures. Les animaux sont donc soumis aux procédures à l'âge de 9 semaines. Des animaux jeunes sont utilisés pour éviter l'accumulation de tissu adipeux autour du pédicule vasculaire rénal, qui peut gêner l'interruption de la circulation. Concernant le choix de l’espèce : Les modèles expérimentaux du projet sont bien maîtrisés dans cette espèce par le personnel du laboratoire et sont bien documentés dans la littérature scientifique. Si les résultats de cette étude s’avèrent positifs, il sera intéressant de tester l’implication de cette voie de signalisation dans des modèles de souris génétiquement modifiées et de tester l'efficacité du traitement chez des femelles dans des modèles expérimentaux plus adaptés. En effet, le rein des femelles est plus résistant que le rein des mâles au modèle expérimental choisi et cela impliquerait de refaire toutes les mises au point pour avoir des lésions équivalentes.
Etude de nouveaux médicaments dans le traitement des infections par des bactéries résistantes aux antibiotiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées est génétiquement déficiente pour une réponse immunitaire, ce qui permet de mesurer l'action des molécules testées sur un organisme privé de cette défense. 8 455 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes, aucune ne pouvant être réutilisée après avoir reçu des bactéries ou des molécules. Jusqu'à 3 370 d'entre elles subissent une instillation dans chaque narine sous anesthésie générale, avec un risque d'arrêt cardiaque si le liquide atteint les poumons, ou un gavage pouvant blesser l'œsophage, 2 240 reçoivent jusqu'à trois injections en vingt-quatre heures et 1 040 un prélèvement de fèces quotidien pendant quatorze jours. Le porteur écrit que la souris présente une "remarquable similitude (99%)" avec le génome humain, et que le modèle insecte, sur lequel ces molécules ont déjà été testées, ne suffit pas pour une validation préclinique.
Objectifs
Les bactéries résistantes aux antibiotiques représentent l'une des plus grandes menaces de ce siècle. Il est impératif d’une part de protéger les antibiotiques actuels et d’autre part d’accélérer la découverte de nouveaux antibiotiques. Notre projet vise à caractériser de nouveaux antimicrobiens ciblant un nouveau mécanisme d’action, par une approche multidisciplinaire alliant recherche fondamentale et translationnelle. Notre laboratoire a identifié et caractérisé une protéine bactérienne comme une nouvelle cible thérapeutique dans la lutte contre les infections bactériennes. L’objectif du projet est de caractériser de nouveaux antimicrobiens en utilisant cette protéine comme cible moléculaire. Cette approche constitue une nouvelle voie thérapeutique puisque contrairement à la plupart des antibiotiques actuels, nous avons identifié des molécules capables de cibler des protéines importantes spécifiquement pour les bactéries pathogènes au cours d’une infection. Cette approche devrait permettre de préserver la grande majorité des bactéries non pathogènes présentes normalement au niveau de notre intestin, et ainsi de perturber le moins possible l’équilibre de notre microbiote. Un criblage ciblé de 5 millions de composés chimiques a permis la sélection de 105 inhibiteurs potentiels ciblant spécifiquement la fonction de notre protéine bactérienne ciblée. Des études préliminaires ont été menées pour déterminer l'efficacité et la toxicité de ces inhibiteurs sur des modèles in vitro, sur cellules eucaryotes et dans des modèles d’infection chez l’insecte et la souris. Toutes ces étapes ont permis d’identifier un candidat médicament prometteur. Ce candidat a été ensuite modifié chimiquement pour obtenir 5 molécules optimisées plus solubles et correspondant à des critères chimiques plus adaptés pour effectuer des tests physiologiques. Ces 5 molécules améliorées doivent désormais être testés in vivo chez la souris pour valider leur efficacité contre des bactéries pathogènes présentant un intérêt thérapeutique élevé. À la fin du projet, nous visons à obtenir au moins une molécule candidate préclinique avec un potentiel thérapeutique élevé. Ce projet répond donc à un besoin médical et sociétal et devrait permettre de trouver des alternatives aux antibiotiques actuels pour lutter contre les phénomènes d’antibiorésistance.
Bénéfices attendus
Nous proposons d'utiliser un modèle mammifère pour valider l'efficacité et la toxicité des candidats médicaments que nous avons préalablement identifiés. Sur la base de nos résultats préliminaires très prometteurs, notre objectif est de tester l'efficacité de ces inhibiteurs sur des bactéries pathogènes présentant un intérêt thérapeutique élevé et de valider l'innocuité des molécules vis-à-vis de l'hôte. Nous visons à obtenir des résultats robustes qui aboutiront à au moins une molécule candidate préclinique avec un potentiel thérapeutique élevé. Ce projet répond à un besoin médical et sociétal et devrait permettre de trouver des alternatives aux antibiotiques actuels pour lutter contre les phénomènes d'antibiorésistance.
Procédures
Interventions : Prélèvement de fécès : 1 fois par jour sur 14 jours, durée des prélèvements : 5 min (1040 souris). Instillation nasale dans chaque narine après anesthésie générale, durée de l'intervention 10 à 20 min (Nombre total de souris peut varier selon si cette méthode d’infection est conservée, nombre maximum : 3370 souris). Injection en vigile (3 injections maximum sur 24h), durée de l'intervention 1 à 5 min (nombre maximum : 2240 souris). Imagerie in vivo sous anesthésie générale, durée de l’intervention 20 à 30 min (274 souris). Gavage : contention de l’animal pendant 1 à 2 minutes (Nombre total de souris peut varier selon si cette méthode d’administration est conservée, nombre maximum : 3370 souris). Les méthodes d’anesthésies sont identiques pour chaque procédure et voie d’administration. Pour l’anesthésie par inhalation d’isoflurane, cela nécessite une contention de l’animal pendant 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les infections bactériennes sont sublétales et peuvent entrainer des effets indésirables sur les souris, tels que perte transitoire de poids, tremblements ou défaut de locomotion pendant tout le temps de la procédure. La toxicité des nouveaux candidats médicaments sera étudiée dans la procédure 1 du projet, il est possible qu’ils aient un impact sur la santé de la souris tels que perte transitoire de poids, tremblements ou défaut de locomotion pendant tout le temps de la procédure. Aucun effet n’est attendu sur la texture des selles (diarrhée…). Les voies d’administration des molécules seront par instillation intranasale, par gavage (per os), par injection intrapéritonéale et intraveineuse dans le sinus rétro-orbitaire. Les injections peuvent engendrer une douleur liée à la piqûre et un stress. Les animaux pourront subir un stress transitoire pour la contention pour les injections IP et le gavage bien que le geste ne dure que quelques secondes car maitrisé. Les injections à l'œil peuvent engendrer une douleur liée à la piqûre et un stress. Les instillations nasales peuvent éventuellement présenter un risque d’arrêt cardiaque si le liquide arrive dans les poumons. Le gavage peut entrainer un risque de traumatisme de l’œsophage ou une fausse route. Pour les prélèvements de fèces et les pesées, les animaux pourront subir un stress transitoire de quelques minutes dans le pot ou sur la balance. Pour la prise de température les animaux pourront subir un stress transitoire de quelques secondes pour la contention et la gêne due au thermomètre rectal.
Devenir
Les souris ayant reçu des bactéries ou des molécules ne peuvent pas être réutilisées et seront euthanasiées à la fin de chaque protocole pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Notre projet se base sur de nombreux résultats préliminaires qui ont permis de valider l'innocuité des molécules et leur efficacité sur des modèles in vitro et sur un modèle in vivo d'insectes. Toutes ces étapes préalables permettent de réduire le nombre de souris nécessaires pour valider l'efficacité et la toxicité des médicaments candidats les plus prometteurs. Ce projet vise à obtenir de nouveaux médicaments qui pourraient être utilisés pour des études précliniques. En raison de son application en thérapeutique humaine, les données doivent obligatoirement être validées dans un modèle mammifère d'infection.
Réduction
En plus de nos résultats préliminaires in vitro et in vivo chez l’insecte, une étude précédente a déjà permis de déterminer les bactéries d’intérêt et les paramètres optimums d’inoculation des bactéries chez l’animal. Ils ont permis d’identifier 1 candidat médicament. Des analogues de ce candidat médicament ont été synthétisés chimiquement ce qui a permis d’obtenir une famille de ce candidat médicament dont 5 dérivés ont été retenus pour être testés dans la présente DAP. Les conditions optimales déterminées à partir de l’étude précédente sont exploitées dans cette présente étude pour analyser l’effet antimicrobien des 5 nouveaux candidats pendant l’infection pour l’efficacité simple ou combinée des molécules contre 3 pathogènes d’intérêt médical. Le meilleur candidat sera testé pour sa spécificité. Le nombre d’animaux a été calculé grâce à une estimation de taille d’échantillon adaptée au plus juste pour permettre une évaluation de l’innocuité des molécules et leur efficacité. Le nombre total de souris nécessaires à cette étude est de 8455.
Raffinement
Le protocole expérimental préconise l’anesthésie des animaux pour limiter la douleur. D’autre part, l'état de santé des souris sera contrôlé quotidiennement pendant toute la durée de la procédure à l'aide d'une grille de score. Cela permettra de décider d’une euthanasie prématurée en cas de comportements anormaux des animaux suite à l’infection traduisant un mal être. Les marqueurs classiques de la santé animale seront surveillés, tels que le poids, le comportement général, la récupération et des signes de détresse (animal prostré, poil hirsute…). Les animaux seront hébergés dans les conditions standard d’habitat avec enrichissement comprenant des maisons en carton, des nids composés de lanières de papier ou des carrés de cotons, des bâtons de bois et des hamacs surtout pour les cages de mâles où il y a plus de compétitivité et un besoin d’isolement plus important. Les animaux seront regroupés à plusieurs par cage pour respecter le caractère social des souris.
Choix des espèces
La souris, avec sa remarquable similitude (99%) avec le génome humain, est une espèce de référence et un modèle largement utilisé dans le domaine de la Recherche et Développement pharmaceutique. Les souris développent naturellement des pathologies qui imitent les maladies humaines. Dans ce projet la seule utilisation du modèle insecte in vivo n’est pas suffisante pour la sélection de molécules et pour une validation préclinique de cibles. D’une part, tous les pathogènes ne peuvent pas être testés chez l’insecte, d’autre part, ce modèle est limité de par son immunité (uniquement innée), et enfin, pour toute validation de molécules d’intérêt biomédical, un modèle mammifère est nécessaire. L’utilisation du modèle souris est nécessaire pour notre projet et le plus opportun car les données préliminaires menant à ce projet ont été validées à l'aide de modèles murins. L’utilisation d’animaux déficients pour la réponse immunitaire de stress nitrique (iNOS synthase) permet d’étudier la spécificité des candidats médicaments vis-à-vis du système immunitaire de l’hôte. Cette étude est indispensable pour connaitre et, éventuellement, pouvoir limiter les effets non spécifiques des médicaments et permettre un traitement ciblé au site d’infection. Des souris âgées de 6-8 semaines sont utilisées pour le projet. L’âge des souris, après le sevrage, assurera la présence d’un microbiote et d’une immunité développée.
Etude de différentes molécules et stratégies de traitement sur des modèles d’insuffisance cardiaque chez le rongeur
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 3600
Soumis à une chirurgie cardiaque de vingt à cinquante minutes, ou à seize semaines de nourriture riche en graisse et d'eau sucrée, 3 600 souris et 3 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Après l'induction de l'insuffisance cardiaque viennent jusqu'à dix séances d'imagerie sous anesthésie, un prélèvement sanguin par semaine pendant seize semaines, des administrations quotidiennes pendant douze semaines, la pose de micropompes et une prise de pression sans réveil. Le porteur annonce des arrêts cardiaques possibles pendant les chirurgies, un risque de péritonite après les injections répétées dans l'abdomen et une irritation de l'œsophage après les administrations orales répétées. Le choix des espèces tient à leur commodité, la souris pour l'homogénéité des résultats et la fiabilité de la transgénèse, le rat parce que son épicarde se réactive et fournit une quantité de cellules jugée pertinente.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque (IC) reste à l’heure actuelle l’une des causes principales d’atteinte de la fonction cardiaque et représente une problématique de santé publique majeure. En effet, l’IC touche environ 64.3 millions de personnes dans le monde et sa prévalence est amenée à augmenter dans les années à venir. Malgré l’amélioration de la prise en charge clinique, la mortalité à 5 ans reste élevée (environ 50pourcents). L’IC se caractérise par la mise en place progressive d’un panel de phénomènes cellulaires et moléculaires altérant la fonction et la structure du cœur. L’IC peut trouver sa source d’une multitude de contextes pathologiques tels que l’infarctus du myocarde (obstruction de l’irrigation coronarienne, provoquant une ischémie du myocarde), l’hypertension artérielle ou de maladies métaboliques (obésité et diabète par exemple). L’ensemble de ces pathologies associées sont-elles aussi en progression dans la population, avec pour exemple la prévalence de l’obésité et du diabète de type II, qui atteindra plus d’1.5 milliard de personnes en 2025. Dans ce contexte, il est alors nécessaire d’accélérer la recherche autour de l’identification du potentiel thérapeutique de candidats médicaments. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets protecteurs de divers composés pharmacologiques et stratégies thérapeutiques associées sur la mise en place de modèles précliniques d’IC chez la souris et le rat, mimant les formes observées chez l’Homme dans un contexte d’infarctus du myocarde, d’hypertension artérielle et de maladies métaboliques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’impact de différentes stratégies thérapeutiques avec des candidats médicaments sur la mise en place de diverses formes d’insuffisance cardiaque et de leurs conséquences structuro-fonctionnelles sur le cœur. L’issue de ce projet sera donc l’identification précliniques de nouveaux actifs thérapeutiques.
Procédures
Les animaux pourront être soumis aux interventions suivantes : -chirurgie cardiaque sur animal anesthésié et analgésié (1xanimal, durée : 20 à 50minutes) OU alimentation riche en gras ou eau glucosée via eau de boisson sur animal vigil (au maximum : en continu pendant 16 semaines). Après l'induction des modèles par les techniques précédemment listées, tous les animaux peuvent être soumis aux explorations suivantes : -administration de traitement par différentes voies (orale, intrapéritonéale) sur animal vigil (au maximum : 1xjour pendant 12 semaines, durée : 1minute) OU administration de traitement par voie intraveineuse sur animal anesthésié (1xanimal, durée : 1minute) OU -microchirurgie pour installation de micropompes sous anesthésie et analgésie (1xanimal, durée : 5minutes) -imagerie du coeur sur animal anesthésié (au maximum : 10xanimal, durée 20minutes) -challenge métabolique qui nécessite une administration par voie orale, une injection intrapéritonéale puis des prélèvements sanguins de faible volume sur animal vigil (au maximum : 1xmois pendant 4 mois, durée : 2h) -prélèvements sanguins sur animal vigil (au maximum : 1xsemaine pendant 16 semaines, durée : 1minute) -test d'effort cardiaque par une injection en intraveineuse et un suivi par imagerie du coeur sur animal anesthésié (1xanimal, durée : 20minutes) -prise de pression sur animal analgésié et anesthésié (1x animal, durée : 10minutes, sans réveil).
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés peuvent présenter un phénotype dommageable : ces phénotypes peuvent être associés à un diabète de type II, une obésite, de la stéatose hépatique et de l'hypertension systémique conduisant à des problèmes cardiovasculaires. Les régimes alimentaires spéciaux pourront entraîner une prise de poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. Les chirurgies peuvent induire des difficultés post-opératoire comme des douleurs, une mauvaise cicatrisation mais aussi des arrêts cardiaques. Les anesthésies pourront engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire. Les injections pourront induire un stress et une douleur de courte durée aux animaux. Les injections répétées en intrapéritonéales peuvent induire un risque de péritonite. Les administrations répétées par voie per os peuvent induire une irritation de l'oesophage. Les injections intraveineuses pourront induire une irritation à la zone d'injection. Les challenges métaboliques induisent un stress et une douleur de courte durée en raison des administrations et des quelques prélèvements d’une goutte de sang ainsi que des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie durant quelques heures. Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie.
Devenir
Afin de compléter toutes les données scientifiques récoltées lors de ce projet, des analyses devront être réalisées sur les organes prélevés. C'est pourquoi tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.
Remplacement
Le but du projet est d'étudier différentes molécules et stratégies de traitement sur des modèles d’insuffisance cardiaque. Ce projet doit être réalisé à l'échelle de l'organisme, il est donc nécessaire d'utiliser des modèles expérimentaux proches de la pathologie ciblée. les modèles rats et souris présentés dans ce projet, permettent de reproduire des insuffisances cardiaques dans les différentes conditions retrouvées en santé humaine. C'est pourquoi les modèles rongeurs sont pertinents pour ce projet et ne peuvent pas être remplacés.
Réduction
7200 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les molécules qui seront inclues dans ce projet auront déjà été testées in silico (simulation par ordinateur) et in vitro (milieu artificiel : test en tube à essai ou plaque de culture) afin de tester leur efficacité, la concentration optimale et leur toxicité dans ces modèles. Ces tests en amont, permettent de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress en apportant des soins adaptés. Tout sera mis en oeuvre pour limiter au maximum les nuisances. Pour les injections, les volumes injectés seront réduits au minimum. Quand l'acte technique le nécessite, les animaux seront sous anesthésie. Les chirurgies sont réalisées par des spécialistes sous anesthésie et analgésie pour garantir le bien être des animaux. L'analgésie est poursuivie en post-opératoire et des croquettes humidifiées seront disposées au fond de la cage pendant 1 semaine. Les animaux sont manipulés par du personnel formé et compétent dans des pièces dédiées à chaque type d'intervention. La surveillance attentive quotidienne sera accompagnée de points limites définis.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus approprié ce projet. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. De plus, la souris est l'espèce pour laquelle la technologie de transgénèse est la plus fiable et la mieux établie ce permet d'avoir des modèles fiables. Le rat est utilisé dans le projet de l'insuffisance cardiaque, il a été montré dans des études antérieures que l'épicarde se réactive dans ce modèle fournissant une quantité de cellules pertinente. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. A partir de 7 semaines chez le rat et de 8 semaines chez la souris et jusqu'à 6 mois maximum. Ces âges permettent de pouvoir réaliser les chirurgies sur les animaux ou d'avoir le phénotype en place.
Evaluation du rôle d’un acide aminé dans le potentiel pro-carcinogène d’une souche bactérienne (E coli) isolé d’adénocarcinome colique humain, sur le développement tumoral, en modèle murin prédisposé
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
896 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement prédisposées à développer des tumeurs du tube digestif, elles reçoivent à six semaines un gavage de bactéries Escherichia coli productrices de colibactine, puis deux prélèvements sanguins, et vivent avec leurs tumeurs jusqu'à la mise à mort au 65e jour. Le porteur attend une baisse d'activité, une perte de poils, une posture voûtée, une anémie visible aux pattes blanches, un amaigrissement, des diarrhées, du sang dans les selles et un prolapsus. À court terme il s'agit de savoir si un acide aminé, la sérine, conditionne l'effet pro-cancérogène de ces bactéries, les régimes appauvris en sérine administrés en prévention à des personnes à risque restant renvoyés au long terme.
Objectifs
Ce projet a pour but de poursuivre les études sur les mécanismes d’action d’une bactérie capable de sécréter une toxine, nommée : « Escherichia coli producteurs de colibactine (CoPEC) », dans la carcinogénèse colorectale. En effet, l’infection par cette bactérie isolée de patients atteints de cancer colorectaux accélère le développement tumoral dans un modèle murin prédisposé à développer ce cancer. Les résultats préliminaires semblent démontrer le rôle essentiel d’un acide aminé (sérine) dans l’activité pro-carcinogène des souches CoPEC. Ainsi, nous proposons premièrement d’évaluer l’effet d’une alimentation déplétée en sérine sur l’effet pro-carcinogène de la souche CoPEC. Ensuite, nous souhaitons également vérifier la spécificité des besoins en sérine de cette souche, en étudiant une souche incapable d’utiliser la sérine. Pour cela, nous évaluerons l’effet de la toxine, la colonisation bactérienne, la perméabilité intestinale et le développement tumoral à un stade précoce et/ou tardif dans un modèle murin prédisposé à développer ce cancer.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats obtenus pourraient permettre de conclure sur l’implication de la sérine dans l’activité pro-carcinogène des CoPEC et de mieux comprendre les mécanismes de l’interaction bactéries/hôte/nutrition sur la carcinogénèse colique. A long terme, les résultats générés par ces recherches devraient permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en ciblant les personnes les plus colonisées par ces bactéries. Ce projet permettra de mettre au point des traitements curatifs afin d’empêcher la bactérie d’utiliser la sérine et ainsi diminuer le développement tumoral. Également, des alimentations déplétées en sérine pourront être administrées en prévention chez les personnes susceptibles de développer un cancer colorectal, ou en curatif chez les patients opérés afin de limiter la réimplantation des CoPEC.
Procédures
Une injection (gavage) sera réalisée à J0, soit lorsque la souris a 6 semaines. Des prélèvements sanguins seront réalisés à J9 et en pré-mortem sous anesthésie gazeuse. Les gestes techniques seront réalisés rapidement en quelques secondes.
Impact sur les animaux
L’expérimentateur contrôlera quotidiennement le comportement général de l’animal durant toute la durée de l’expérimentation (de la naissance à la mise à la mort, soit de J-36 (naissance) à J65 (mise à mort), J0 étant le jour de gavage). Une baisse d’activité, de locomotion, une perte de poil, une posture voutée, une anémie (pattes blanches) et un amaigrissement sont attendus. Au niveau digestif, l’expérimentateur pourra également observer des phases de diarrhée ou de constipation, un hyper toilettage anal ou à l’inverse un orifice souillé, du sang dans les selles et un prolapsus.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort après la reproduction ou à la fin de l'expérience. A la fin de l'expérience, les animaux sont sacrifiés afin de réaliser des prélèvements tissulaires. Lors des reproductions, seul les animaux d'intérêt sont conservés.
Remplacement
L’expérimentation animale est indispensable pour ce projet car il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer les effets de la colonisation bactérienne sur le développement tumoral. Il n’est pas possible d’étudier le rôle de la sérine sur les effets pro-carcinogènes des bactéries suite à une infection chronique sur des cellules en culture.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure ou cela ne compromet pas les objectifs du projet. En effet, des expérimentations antérieures réalisées au laboratoire ont mis en évidence une forte variabilité du modèle, de la colonisation bactérienne post gavage et de son maintien au cours du temps. Néanmoins, suite à une meilleure connaissance du modèle et à une formation interne du personnel à la technique de gavage, le nombre d’animaux par lot a été réduit au minimum. Le nombre de 8 souris par lot permettra donc d’analyser statistiquement les résultats de colonisation bactérienne, de perméabilité intestinale et le développement tumoral observées dans les différents lots. Toutefois, si l’analyse statistique suivant la première manipulation permet de réduire le nombre d’animaux, nous prendrons, bien entendu, ces résultats en compte pour définir l’effectif des manipulations suivantes.
Raffinement
Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien être des animaux, plusieurs mesures spécifiques seront prises. Tout d’abord un suivi renforcé des animaux. L’expérimentateur contrôlera quotidiennement la présence d’eau / de nourriture et observera le comportement général de l’animal (activité, locomotion, état du poil, prostration, vocalise, sang, anémie…etc). Cela permettra de repérer d’éventuelle anomalies comportementales et de traiter rapidement tous signes de douleurs par des antalgiques fort, utilisés dans le traitement des douleurs cancéreuses. Enfin, si les douleurs ne sont pas soulagées par les antalgiques, une mise à mort anticipées de l'animale sera réalisée. L'évaluation de la douleur sera réalisée grâce à un système de scooring et le suivi des animaux sera réalisé par une personne formée en interne et désignée compétente au suivi de ce modèle murin prédisposé à développer des tumeurs. Les animaux seront hébergés dans des cages de superficie adaptée, avec des cabanes pour se cachées et des enrichissements à ronger. Des croquettes seront également mis à disposition dans le fond de la cage et les tétines des biberons allongées si les douleurs empêchent l'animale de grimper sur la grille. Enfin certains animaux pourront être isolés si leur état général le nécessite.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler en modèle murin car la physiologie intestinale reste similaire à celle de l’homme. En effet, le modèle animal APC présente plusieurs avantages pour l’étude du développement tumoral : -La mutation du gène APC est retrouvée dans 80% des cancers colorectaux chez l’homme -Les souris développent spontanément des tumeurs au niveau du tube digestif -Il est représentatif des relations entre cellules tumorales et cellules de l’environnement tumoral -Il s’agit du modèle le plus proche de la physiologie humaine et le plus représentatif de l’interaction entre microbiote et tube digestif. Ainsi, ce modèle nous a déjà permis de conclure de manière satisfaisante sur les questions scientifiques dans un contexte de cancer colorectal. De plus nos animaleries sont adaptées à la prise en charge de ce type d’animaux. Le matériel utilisé est conforme aux règles du bien être animale (cages, enrichissements, température, cycle jour/nuit) et le personnel a suivi une formation adaptée à la gestion et à la prise en charge de ces animaux. L’étude sera réalisée chez les femelles adultes âgées de 6 semaines (20g au gavage). L’objectif est de réaliser l’expérience sur des animaux adultes et suffisamment jeunes puisque la durée totale de l’expérience est estimée à 65 jours post-gavage.
Etude des effets protecteurs de peptides mimétiques dans un modèle d’accident vasculaire cérébral (AVC) chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
64 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune subissant deux anesthésies successives pour poser puis retirer un monofilament dans une artère cérébrale, puis vingt heures de surveillance seule en cage. L'occlusion provoque un accident vasculaire cérébral, et le porteur liste un déficit locomoteur avec rotation, un risque modéré d'hémorragie, une hypothermie, des difficultés à s'alimenter et un fort risque de mortalité lié à la double anesthésie. Toutes sont tuées par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde, pour des marquages immunohistochimiques. Les deux peptides testés sont déjà en cours de validation clinique chez des patients hypertriglycéridémiques, et le porteur qualifie pourtant les tests chez la souris d'étape "indispensable" au développement préclinique.
Objectifs
L’objectif du projet est de tester les effets protecteurs de deux peptides mimétiques (D6PV et 5ASM) dans un modèle d’accident vasculaire cérébral (AVC) chez la souris. Par rapport aux protéines dont ils sont issus, les peptides mimétiques présentent l’avantage d’être facilement synthétisables et de contenir des modifications chimiques au niveau de leurs acides aminés qui les rendent non-immunogènes. Les peptides D6PV et 5ASM correspondent à des fragments d’apolipoprotéines humaines et présentent des propriétés hypolipémiantes, antidiabétiques, anti-inflammatoires, et vasculo-protectrices in vitro et in vivo. Leurs effets potentiellement protecteurs dans le cadre des complications vasculaires cérébrales n’est pas connu. Nous voulons montrer que ces deux peptides réduisent la taille et les complications hémorrhagiques d’un AVC in vivo. Leurs effets potentiellement protecteurs dans le cadre des complications vasculaires cérébrales n’est pas connu.
Bénéfices attendus
Les peptides que nous allons tester ici sont actuellement en cours de validation clinique pour traiter des patients hypertriglycéridémiques. Ces études ont aussi montré que ces peptides ont en outre des propriétés antiathérothrombotiques et vasculo-protectrices au niveau du muscle cardiaque suite à un infarctus provoqué chez la souris. Notre projet vise à établir que ces peptides seront également bénéfiques pour le traitement de l’AVC ischémique. Si, comme nous l’espérons, les résultats de l’étude que nous proposons sont positifs, ces deux peptides pourront être positionnés comme candidats médicaments pour prévenir la sévérité et les complications d’un AVC ischémique chez l’homme. Les tests in vivo que nous projetons de faire sont ainsi une étape indispensable au développement pré clinique de ces deux peptides.
Procédures
Un prélèvement sanguin par ponction caudale (100μL max, durée 1min). Insertion du monofilament et retrait sous anesthésie (2 x 10min). Perfusion intracardiaque au paraphormaldéhyde (4%) à la fin du projet.
Impact sur les animaux
Un prélèvement sanguin par ponction caudale (100μL max): risque d’hématome et stress chez l’animal. Double Anesthésie : fort risque de mortalité. Conservation du monofilament : Déficit locomoteur (rotation) Isolement des animaux : peut générer un stress chez l’animal. Chirurgie vasculaire : risque modéré d’hémorragie. Hypothermie. Difficulté à s’alimenter post AVC.
Devenir
La totalité des animaux du projet (n=64 ; 4 groupes de souris) sera gardée en vie pour la perfusion. A la fin du projet, les tissus de la totalité des animaux (n=64 ; 4groupes de souris) seront récupérés pour des marquages immunohistochimiques.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de modèle in-vitro qui reflète la complexité cellulaire du cerveau. Cependant dans un souci de remplacement, nous réaliserons toutes les expériences portant sur l’étude des mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels ces peptides protègent la barrière hémato-encéphalique sur des cellules endothéliales cérébro-vasculaires en culture (test in -vitro). L’utilisation de souris est cependant absolument nécessaire pour prendre en compte le contexte physiopathologique d’un AVC ischémique. Le modèle MCAO est en place au laboratoire
Réduction
Des études antérieures conduites au laboratoire ont déjà permis d'établir la durée de l’ischémie. Les expérimentateurs locaux ont de plus l’expertise des procédures chirurgicales. Nous avons également réalisé une analyse de puissance, nous indiquant que la taille minimale du groupe d'individus pour obtenir une puissance statistique d'au moins 0.8, avec un alpha de 0.05 est de 16 souris par groupe x 4 groupes soit 64 souris au total. Ces deux paramètres permettent la réduction au minimum du nombre d’animaux requis.
Raffinement
La phase d’induction de l’anesthésie est réalisée sous isoflurane, ainsi qu’une injection de buprénorphine La phase de maintien de l’anesthésie sera réalisée sous isoflurane. Lors de la ponction caudale une pression sera réalisée afin d’éviter le risque d’hématome. L’injection des peptides au moment de la reperfusion permet d’apporter un raffinement au protocole expérimental en diminuant le nombre des gestes interventionnels. Chaque animal sera observé en continu au cours de la procédure et pendant l’heure qui suit la chirurgie, en particulier son comportement, son activité et sa posture (s’il est prostré), son pelage (s’il est hérissé, s’il y a une perte de poils), sa respiration (si le rythme est rapide ou saccadé), et les mouvements qu’il effectue, pour détecter tout signe de souffrance. En cas de tels signes, nous augmenterons la dose d’analgésique buprénorphine. Si cela ne suffit pas et qu’une souris est en décubitus latéral avec une détresse respiratoire, elle sera euthanasiée par dislocation cervicale. Durant la phase de surveillance de 20 heures, chaque animal sera isolé dans une cage propre contenant les éléments d’enrichissement afin d’éviter toute blessure. Il bénéficiera d’une lampe chauffante pour maintenir sa température, ainsi qu’un accès facilité à la nourriture (directement dans la cage) et à l’eau (biberon avec bec allongé). L’environnement sera enrichi afin de limiter le stress et l’anxiété des animaux (abris en polycarbonate de couleur rouge leur offrant un abri obscur et permettant leur surveillance, croquettes d'alimentation préalablement hydratées afin de faciliter leur assimilation).
Choix des espèces
La souris représente une espèce validée dans ces modèles d’ischémie cérébrale, permettant de plus l’évaluation standardisée de l’étendue et de la sévérité de l’AVC. Il existe aussi une similarité du réseau vasculaire cérébral avec l’anatomie humaine (polygone de Willis). De plus, l’utilisation de souris du même âge, sur fond génétique C57BL/6 permet de limiter au minimum les variations inter-individuelles et de réduire la variabilité des résultats et donc le nombre d’animaux à utiliser. Les souris sont de plus idéales pour cette étude, car l’ensemble des procédures proposées (MCAO) a été établi dans ce modèle animal. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 8 et 12 semaines, un âge correspondant au stade adulte pour un poids de 25g en moyenne. La taille du monofilament est calibrée pour réaliser le MCAO sur des souris de cette taille.
Evaluation du potentiel immunogène et de la pharmacocinétique de différentes formulations d’encapsulation d’alpha-glucosidase pour le traitement de la maladie de Pompe.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Quatre injections dans le sinus rétro-orbitaire et cinq prélèvements sanguins à la queue par animal, à raison d'une séance par semaine pendant quatre semaines : 165 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque intervention se déroule sous anesthésie profonde, et le porteur indique qu'une réaction pseudo-allergique peut suivre l'injection de l'enzyme, un antihistaminique étant administré 48 heures avant en cas de réaction lors de la première expérience. Le projet compare des formulations d'encapsulation d'une enzyme utilisée contre la maladie de Pompe, dont la majorité des patients traités développent des anticorps qui la dégradent. Le porteur annonce une meilleure prise en charge de ces patients, quand l'étape réellement engagée ici mesure l'immunisation de souris et la distribution du produit dans leur rate et leur foie, prélevés après mise à mort.
Objectifs
L’alpha-glucosidase, une enzyme, est responsable de la dégradation du glycogène en glucose, en particulier au niveau des muscles. Dans le cas de la maladie de Pompe, un déficit de l’enzyme alpha-glucosidase (GAA), entraîne une accumulation de glycogène dans les lysosomes. L'accumulation de glycogène entraîne des conséquences graves dans de nombreux organes, en particulier les muscles et le système nerveux avec l’apparition d’une faiblesse musculaire et des troubles respiratoires. Le principal traitement de la maladie de Pompe se base sur l'administration en intra-veineux de l’alpha-glucosidase, permettant alors la dégradation du glycogène en glucose. Pour autant, ce traitement n’est pas sans complications étant donné que la majorité des patients traités développent des anticorps contre cette enzyme, ce qui entrainent sa dégradation et donc une diminution de l’efficacité de la thérapie. Il existe aujourd’hui des systèmes d’administration de médicaments basés sur l’encapsulation dans une paroi de phospholipides permettant la protection d’un médicament encapsulé contre le système immunitaire, l'amélioration de sa persistance chez l’Homme et la réduction des effets indésirables. Il serait intéressant de développer un tel système d’administration dans le cadre de la maladie de Pompe afin de réduire la résistance au traitement des patients. Ce projet vise donc à évaluer l’activation du système immunitaire par l’enzyme encapsulée ainsi que sa persistance chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Les patients qui nécessitent une thérapie basée sur l’injection de l’enzyme alpha-glucosidase dans le traitement de la maladie de Pompe, sont susceptibles de développer une réaction immunitaire face à ce traitement, ce qui le rend à terme moins efficace. Les bénéfices attendus de ce projet sont ; une diminution de l’activation du système immunitaire par le médicament encapsulé et une amélioration de la persistance et de la distribution du médicament chez l’Homme. In fine, ce projet permettra une meilleure prise en charge des patients atteints de la maladie de Pompe.
Procédures
Les animaux seront soumis au total à quatre injections par voie rétro-orbitale ainsi qu'à quatre prélèvements sanguins au niveau de la queue. Ces interventions seront réalisées une fois par semaine sur quatre semaines sur des animaux profondément anesthésiés. Le prélèvement à la queue suivi directement de l'injection en rétro-orbitale ne dépassera pas les 15 minutes. Un prélèvement de sang final sera également réalisé à la fin de la procédure sur animaux profondément anesthésiés. Le prélèvement final n'excédera pas les 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets prévus sur les animaux sont une immunisation des souris à l'enzyme alpha-glucosidase injectée et une diminution de cette immunisation ainsi qu'une meilleur absorption grâce à la nouvelle formulation de l'enzyme. Les effets indésirables attendus pour les deux procédures expérimentales sont : un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire, un saignement au niveau du point de prélèvement ou d’injection. Il peut également survenir un possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse pour le prélèvement à la queue (durée de 30 secondes avant endormissement). Une réaction pseudo-allergique peut également être attendue suite à l’injection de l’enzyme.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort, car le prélèvement sanguin est terminal et car les organes (rate et foie) doivent être récupérés afin d'analyser la distribution de la nouvelle formulation de l'enzyme.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’activation du système immunitaire par les différentes formulations d’encapsulation de l’enzyme alpha-glucosidase afin de diminuer la réponse immunitaire et d’améliorer l’efficacité du traitement. Ce processus fait intervenir de multiples types cellulaires et tissulaires (cellules immunitaires, cellules musculaires…) il n’est donc pas possible de remplacer le modèle animal par de l’in vitro du fait de la nécessité du métabolisme de la souris pour évaluer le processus complet.
Réduction
Le projet se fera par étapes. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 15 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison de moyennes des résultats obtenus pour chaque groupe d’animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 2 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée des procédures • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin de lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. • Par l’application d’une goutte de collyre sur l’œil après les injections retro-orbitale pour réduire la douleur au réveil • Par traitement des animaux avec un antihistaminique, 48h avant l’injection de l’enzyme en cas de réaction allergique lors de la première expérimentation • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
Puisque nous souhaitons observer les différences de réactions immunitaires en fonction de la formulation de l’enzyme alpha-glucosidase, le recours à l’animal est nécessaire, car l’activation du système immunitaire est un phénomène complexe qui implique plusieurs types cellulaires et tissulaires et faisant intervenir des intercommunications complexes entre les cellules circulantes, les cellules immunitaires, les cellules musculaires et les cellules résidantes des tissus environnants, qui ne peuvent pas être reproduites de façon complète in vitro. Les similarités connues entre le système immunitaire de la souris et de l’homme, et en particulier les cellules impliquées dans les procédés d’immunisation font de la souris un modèle de choix. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères présentant un système immunitaire mature et ne présentant pas encore de vieillissement.
Elevage de souris génétiquement modifiées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
633 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, un prélèvement de tissu au bout de la queue sous anesthésie générale au moment du sevrage, sept d'entre elles au maximum subissant un second prélèvement dans le pavillon de l'oreille quand le premier échoue. Ce génotypage sert à fournir des lots de souris transgéniques et sauvages à des projets sur la maladie d'Alzheimer, publics comme privés. Le champ de devenir est vide alors que la justification annonce que toutes les souris sont gardées vivantes, celles au bon génotype pour les études demandeuses et les surnuméraires pour des projets sans exigence de génotype. Le porteur écrit que cette lignée est "nécessaire" pour répondre aux "besoins" de ces études et qu'il n'existe pas d'autre méthode pour étudier in vivo le vieillissement pathologique.
Objectifs
L’objectif du projet est d’assurer la reproduction des souris, de les élever et définir leur génotype dans le cadre de la gestion de projets scientifiques sur la maladie d’Alzheimer pour constituer des groupes de souris transgéniques et sauvages issues des croisements programmés. La maladie d’Alzheimer est la démence la plus commune parmi les démences de la personne âgée où elle représente un peu plus de deux tiers des cas. L’âge est le principal facteur de risque de la maladie d’Alzheimer. En France, le nombre de personnes âgées de 65 ans ou plus et atteintes de la maladie d’Alzheimer serait compris entre 560 000 et 730 000 suivant les études. Aujourd’hui, aucun traitement n’est capable de prévenir efficacement la maladie qui est initiée plus de 20 ans avant les premiers symptômes. Ces projets collaboratifs peuvent porter sur l’étude de mécanismes physiopathologiques de la maladie, la recherche de biomarqueurs à visée diagnostique ou thérapeutique mais aussi pour étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques tout en intégrant le concept « one health ». Même si la recherche reste très active, aucun traitement n’est actuellement capable de modifier efficacement l’évolution de la maladie et la cause demeure toujours inconnue pour la forme non familiale la plus représentée dans la population. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives pour évaluer ou prévenir le vieillissement pathologique Alzheimer versus le vieillissement physiologique.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu dans ce projet est de pouvoir gérer le nombre d’animaux transgéniques versus sauvages en fixant le nombre d’accouplements le plus juste pour l’obtention du nombre de souris souhaitées avec un génotype clairement identifié dans les études scientifiques collaboratives publiques et/ou privées sur la maladie d'Alzheimer. Le contrôle sur la lignée transgénique permet de mieux prévenir le risque de dérive génétique et de s’assurer au sein de la plateforme expérimentale animale de la qualité de l’élevage et de l’hébergement.
Procédures
Pour 630 souris : 1 prélèvement tissulaire à l'extrémité de la queue sous anesthésie générale en moins de 5 secondes. En cas de perte de la boucle ou de résultats inexploitables suite à la biopsie de la queue (estimation 1% des effectifs, soit 7 souris maximum) : un deuxième prélèvement sous anesthésie générale sera effectué dans le pavillon de l'oreille. Pour 3 reproducteurs mâles : 1 prélèvement tissulaire dans le pavillon de l'oreille sous anesthésie générale. Le prélèvement se réalise en moins de 5 secondes.
Impact sur les animaux
Inconfort transitoire lié à la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse associé à une douleur légère et transitoire liée à la biopsie.
Devenir
Les individus avec le génotype requis seront gardés en vie pour une utilisation dans les projets scientifiques nécessitant l'utilisation des lignées concernées ou pour la reproduction. Les individus surnuméraires seront gardés en vie pour une utilisation dans des projets ne nécessitant pas de génotype particulier.
Remplacement
Cette lignée de souris transgéniques élevée dans l’animalerie est nécessaire pour répondre aux besoins des études collaboratives évaluées scientifiquement par des experts externes pour le public et internes pour le privé. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives pour étudier in vivo des mécanismes physiopathologiques, monitorer de nouveaux biomarqueurs à visée diagnostique ou thérapeutique ou juger l’effet de nouvelles stratégies thérapeutiques in vivo dans le cadre du vieillissement qu’il soit physiologique ou pathologique.
Réduction
La stratégie d'accouplement envisagée repose sur les études collaboratives privées ou publiques, donc cela évite des accouplements en continu (présence d'un mâle en continu dans la cage des femelles) et limite la production d'animaux surnuméraires. Cette stratégie participe fortement à la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Pour cette lignée, les deux transgènes sont transmis ensemble sans dissociation possible limitant ainsi les croisements multiples pour obtenir le bon phénotype. Les descendants sont dans 50 % des cas des souris hétérozygotes Alzheimer et l’autre moitié des souris de type sauvage. Toutes les souris sont utilisées dans les projets pour comparer les deux phénotypes. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet prend en compte qu’un mâle TG hétérozygote sera accouplé avec deux femelles de type sauvage. Le nombre moyen de petits est de sept par portée pour cette lignée. Sur une année, on peut compter dix-huit femelles accouplées sachant que trois mâles et six femelles seront achetés au début du projet. Les accouplements seront programmés tous les 4 mois pour avoir des souris des deux phénotypes dans les projets expérimentaux et renouveler les couples reproducteurs.
Raffinement
Sans autre alternative de prélèvements biologiques non invasifs pour le génotypage, le prélèvement de tissu pour déterminer le génotype des souris est réalisé systématiquement sous anesthésie gazeuse. Ce prélèvement sera réalisé à l’extrémité de la queue, à l’âge de 21 jusqu'à 30 jours au moment du sevrage, avant l’ossification complète de la queue ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Chez l’adulte, un prélèvement d’un morceau du pavillon de l’oreille en dehors de la zone cartilagineuse sera privilégié. La taille de la biopsie est réduite à son minimum de l’ordre d'un millimètre cube. Des points limites ont été définis pour réaliser ou pas la biopsie et sont détaillés dans les annexes. Les animaux sont hébergés en groupe social, en cage ventilée enrichie avec du matériel permettant de répondre à leurs besoins (nidification, se cacher, ronger) avec accès à l’eau et à l’alimentation ad libitum. Les souris incluses dans cette procédure (âge max 6 mois) n’expriment pas de phénotype dommageable.
Choix des espèces
Dans le cadre de la maladie d’Alzheimer, il existe différents modèles murins transgéniques. Le modèle choisi est largement utilisé dans la littérature et surtout présente une cinétique progressive des lésions comme chez l’homme contrairement à d’autres modèles murins plus agressifs. Pour ce modèle, il est donc aisé de faire des comparaisons avec les autres études déjà publiées. Les individus qui vont subir une biopsie de l'extrémité de la queue pour génotypage sont âgés de 21 à 30 jours. Cet âge correspond à l'âge du sevrage (séparation avec la mère) afin de ne pas compromettre le développement postnatal. Le développement de l'ossification de la queue n'est pas encore achevé à cet âge et limite ainsi la nuisance liée à ce geste. Le prélèvement d'un morceau du pavillon de l'oreille en dehors de la zone cartilagineuse sera privilégié pour les animaux de plus de 6 semaines et adultes. Ce cas de figure est rare (moins de 1% des animaux biopsiés dans l'animalerie) mais peut être réalisé à l’arrivée des premiers couples parents provenant du fournisseur agréé (pour vérification du génotype), en cas d’échec de la procédure de génotypage à partir de la biopsie de queue ou si au moins deux souris de la même cage perdent leur boucle d’oreille.
Impact des bactéries du phylum firmicutes sur l’immunité intestinale, la migration lymphocytaire et le rejet de greffe
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Gavées avec une suspension bactérienne, puis greffées d'un morceau de peau au cours d'une chirurgie de trente minutes, 72 des 92 souris reçoivent ensuite des injections abdominales tous les deux jours pendant une semaine, puis deux fois par semaine pendant deux à trois semaines. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Il s'agit de savoir si modifier le microbiote intestinal allonge la survie d'une greffe de peau sous immunosuppresseur, piste ouverte par le constat que le taux de rejet varie selon le lieu de vie des patients greffés. Le porteur indique que la chirurgie induit une douleur et que l'isolement qui la suit comme la répétition des gavages stressent les souris, et prévoit leur mise à mort si la douleur persiste au-delà de 48 heures, avant les prélèvements terminaux qui ferment le protocole.
Objectifs
La transplantation d’organes est le seul traitement de certaines pathologies, elle augmente de plusieurs années la durée de vie des patients. Cependant, le système immunitaire du patient reconnaît l'organe greffé comme étranger ce qui provoque un rejet de l'organe. Plusieurs traitements sont utilisés pour contrer le système immunitaire et donc le rejet. Les traitements historiques de prévention du rejet de greffe présentent de nombreux effets secondaires, ils réduisent l'espérance de vie des patients. Un des derniers traitements développés, le bélatacept, présente moins d'effets secondaires que les traitements historiques, mais il est moins efficace pour prévenir certains rejets spécifiques. Le risque de subir un rejet avec ce traitement semble relié à l'environnement des patients et leur microbiote. En effet, le pourcentage de rejet cellulaire aigu des patients traités par bélatacept varie fortement en fonction de leur lieu de vie mais n’est pas associé à d’autres paramètres d’ordre génétique. De plus nos résultats, issus d’échantillons de patients pré-transplantation, montrent une association entre un moindre risque de rejet cellulaire aigu et la translocation d’ADN de bactéries appartenant au genre Coproccocus, qui fait partie des espèces commensales du microbiote digestif. Le microbiote est l’ensemble des bactéries présentes naturellement sur et dans le corps humain. Il influence la fonction des organes et cellules, il peut provoquer la production de certaines molécules. Ce projet a pour objectif de modifier le microbiote des animaux puis d'évaluer l'effet de cette modification sur le rejet de greffe. Nos résultats précédents laissent envisager que la prépondérance de Coproccocus au sein du microbiote induirait une population de cellules immunitaires régulatrices. Ces cellules pourraient être à l’origine d’une moindre prévalence du rejet de greffe aigu. Dans un modèle de greffe de peau de souris, nous analyserons la durée de greffe et l'effet du microbiote sur les systèmes immunitaire et digestif.
Bénéfices attendus
Les données obtenues permettront de comprendre le lien entre le microbiote et le rejet aigu. Nos études précédentes, sur des échantillons de patients, ont montré que certaines bactéries pourraient avoir un effet bénéfique, réduisant le nombre de rejet. Ce projet nous permettrait de valider l'effet bénéfique des bactéries du genre Coprococcus et de comprendre par quel moyen ces bactéries agissent. Il est connu que le microbiote modifie le fonctionnement et le nombre des cellules immunitaires au niveau des intestins. Ainsi, nous modifierons le microbiote des animaux puis nous analyserons les modifications de l’immunité en présence ou non d’un traitement utilisé en prévention du rejet de greffe. Nous étudierons également la survie de greffe dans ce contexte. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les causes du rejet de greffe des patients greffés et traités par de nouvelles thérapies immunomodulatrices. Ces résultats permettront de mettre au point un test pour déterminer quels patients feront plus probablement un rejet de greffe avec ce nouveau traitement. Il sera ainsi possible de mieux cibler les patients pouvant recevoir ce traitement et de concevoir des thérapies pour modifier le microbiote des patients susceptibles de subir un rejet.
Procédures
92 souris seront gavées par une solution non-irritante, le gavage durant moins de 5 min. Par la suite, nous réaliserons une greffe de peau sur 72 souris (ayant été préalablement gavées), la chirurgie durera 30 min par animal. Ces animaux recevront un traitement dans l'abdomen ; tous les 2 jours pendant une semaine puis deux fois par semaine pendant 2 à 3 semaines. Les injections dureront moins d'une minute chacune.
Impact sur les animaux
La réalisation d'une greffe de peau est une procédure chirurgicale qui induit une douleur pour l'animal. La chirurgie et l'isolement à la suite de celle-ci peuvent également être source d'un stress. De même, la répétition des gavages est à prendre en compte dans les éléments de stress pour les animaux. L'ensemble de ces éléments a été considéré dans la méthodologie décrite dans les procédures. Le traitement par la molécule étudiée (CTLA4-Ig) n'est pas décrit comme ayant des effets délétères.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour procéder aux prélèvements terminaux. Il n’est pas envisageable de procéder à un réveil des animaux suite à ces prélèvements.
Remplacement
Nous avons jusqu'alors utilisé des échantillons issus des patients traités par la molécule étudiée (CTLA2-Ig). Nos précédentes études, portant sur la réponse au CTLA4-Ig, utilisaient des cellules humaines isolées de prélèvements ou des sérums issus de cohortes de patients. Toutefois, l'utilisation d'un modèle murin nous permettra de valider nos observations dans un contexte d'interaction entre la greffe, le microbiote intestinal et les cellules immunitaires. Une étude in vitro ne mime pas l’interaction de l’ensemble de ces acteurs, elle ne permettrait pas l’étude des mécanismes associant le traitement et le microbiote au rejet de greffe. Le modèle de greffe de peau permet une dose de CTLA4-Ig, sur le site de greffe et dans les ganglions drainant, proche de celle présente chez les patients transplantés.
Réduction
Nous nous sommes attachés à réduire le nombre d'animaux dans cette expérimentation. La validation de la méthode de colonisation intestinale par des bactéries du genre Coprococcus nécessitera 20 animaux, 10 par groupe. Le gavage sera réalisé jusqu’à 3 fois par animal avec des suspensions bactériennes différentes permettant de limiter la variabilité issue des lots de suspensions bactériennes. A l’issus des trois premières répétitions (12 animaux) nous évaluerons la nécessité de réaliser le reste de la procédure en fonction de la variabilité des résultats obtenus. Si ce nombre est suffisant pour déterminer les conditions d’une colonisation effective ou inductrice d’une modification immunitaire la procédure sera arrêtée, sinon nous réaliserons les 2 répétitions supplémentaires. L'étude de la durée de greffe avant rejet par des souris OMM-12 nécessitera 16 animaux, 8 par groupe, afin de déterminer des moyennes, écart-types et délais de rejet minimum attendus Cette étape a été intégrée à la procédure permettant de répondre à la question scientifique, réduisant ainsi le nombre d’animaux. L’obtention d’un nombre suffisant de données pour observer un allongement de la survie de la greffe nécessitera la greffe de 72 souris. Mais le nombre de répétition sera affinée à la suite de l’étude sur les 16 premiers animaux. Des mâles et des femelles en nombre équivalent seront inclus dans l’ensemble des procédures et à chaque répétition, afin d’évaluer la variabilité de réponse entre les sexes. Cette évaluation nécessite d’inclure un plus grand nombre d’animaux mais permettra de ne pas renouveler la procédure à l’avenir pour tester l’effet dépendant du sexe.
Raffinement
Les souris seront maintenues en groupe et dans des conditions d’hébergement habituelles tout au long de leur vie. L'alimentation des animaux sera adaptée (aliment humide au sol) suite aux procédures de chirurgie ou en cas de douleur limitant la mobilité. Au cours de l'expérimentation et en cas de douleur, un protocole d'analgésie sera défini. Toutefois, en cas de non-résolution de cette douleur dans les 48h, de rejet de greffe supérieure à 80% de la surface du greffon ou de perte de poids supérieur à 20%, l'animal sera mis à mort. Les greffes de peau seront réalisées sous anesthésie. La douleur post-chirurgicale sera anticipée et un protocole d’analgésie sera appliqué préventivement. La douleur sera évaluée et traitée si besoin tout au long des protocoles expérimentaux et du suivi post-opératoire des animaux.
Choix des espèces
L'utilisation d'un modèle murin les facteurs d'histocompatibilité du donneur et du receveur de greffe de peau. La greffe de peau est une technique parfaitement décrite dans ce modèle. L'utilisation de ce modèle permet dans le même temps une modification maîtrisée du microbiote intestinal, la greffe et l'utilisation d'un immunosuppresseur. Le modèle murin nous permet d'analyser l'interaction de ces trois composants (microbiote, greffe, traitement) avec l'immunité intestinale. Les animaux seront utilisés à un âge de 2-3 mois. Une étude de l'effet du CTLA4-Ig en fonction de l'âge ayant montré que l'âge des animaux influe sur leur réponse au CTLA4-Ig. Nos résultats devant être transférables dans un modèle de greffe murine, l'étude de colonisation pilote sera réalisée également sur des animaux de 2-3 mois.
Evaluation chez la souris du potentiel thérapeutique de deux molécules dans le cancer de la prostate
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
L'ablation des testicules, pratiquée sur la moitié des souris, ouvre un protocole qui comprend aussi des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant vingt-huit jours et des gavages tous les quatre jours. 1 836 souris immunodéficientes vont être utilisées, dont 816 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent des cellules tumorales humaines par voie intraveineuse ou directement dans un lobe de la prostate, puis passent chaque semaine trente minutes sous anesthésie gazeuse pour l'observation des tumeurs, pendant quatre mois au maximum. Seuls les mâles entrent en procédure, les femelles nées de ces élevages étant accouplées, proposées en don à l'institut, et tuées si personne ne les récupère.
Objectifs
Le cancer de la prostate est la troisième cause de mortalité par cancer chez l’homme. Dès lors que le cancer est invasif, la castration chimique (déprivation en hormones masculine) est mise en place pour ralentir efficacement le cancer, mais dans 100% des cas, la tumeur récidive, menant au décès du patient. Une population cellulaire a été identifiée chez la souris comme candidate dans cette récidive tumorale. Plus particulièrement, ces cellules sont amplifiées dans des souris génétiquement modifiées et résistent à la castration. Deux cibles de ces cellules semblent être des cibles thérapeutiques potentielles. Deux drogues les ciblant sont efficaces in vitro contre des cultures 3D de ces cellules (avec et sans hormones masculines) et leurs effets sont additifs La même chose a été observée sur une lignée humaine issue de métastasees de patient. L’objectif de ce travail est donc d’évaluer l’impact thérapeutique de ces deux composés chimiques sur l’inhibition ou la régression de métastases à partir d’une lignée cellulaire humaine.
Bénéfices attendus
Pour améliorer la survie des patients développant des cancers de la prostate résistant à la castration, il est nécessaire d’identifier les cellules responsables de la récidive tumorale et de les cibler de façon thérapeutique. Les études préliminaires in vitro nous ont permis d’identifier une nouvelle population cellulaire possédant les propriétés requises à l’initiation de la récidive et en faisant donc une population cellulaire candidate. Des expériences in vitro ont permis de trouver deux protéines cibles. Ce projet permettrait de définir in vivo, chez la souris, si leurs inhibiteurs, administrés seuls ou en combinaison, sont capables d’inhiber le développement métastatique tumoral et/ou faire régresser des métastases ou structures tumorales déjà établies dans un contexte naïf (présence d’hormones masculines) ou d’hormonothérapie (castration). Ces tests seront faits sur des métastases issues d’une lignée cellulaire humaine afin de voir si ces thérapies pourraient être étendues à l’homme par la suite.
Procédures
Les interventions subies par les animaux seront : - 1- Des injections par voie intra veineuse ou locale de cellules tumorales humaines (1 par souris (quelques secondes en intraveineuse ou quelques minutes en local)) . - 2- Des observations des tumeurs sous anesthésie gazeuse (toutes les semaines pendant maximum quatre mois pour toutes les souris durant 30 min). - 3- Des chirurgies (ablations de testicules) de 15 min sous anesthésie gazeuse et sous analgésique pour la moitié des souris. - 4- Des traitements en injections (de quelques secondes) intra péritonéal de drogues quotidiennement pendant 28 jours. - 5- Des traitements en gavage (de quelques secondes) tous les quatre jours pendant 28 jours. Chaque animal subira une combinaison de ces interventions 4 et 5 au cours des procédures.
Impact sur les animaux
Toutes les souris de la demande d’autorisation recevront par voie intraveineuse (douleur légère) ou intra-lobe prostatique des cellules tumorales humaines, mais, potentiellement, toutes ne développeront pas de structures tumorales/métastases. Le développement tumoral qui peut être observé chez ces souris peut être indésirable mais nous ne connaissons pas encore le développement métastatique attendu. L’ablation des testicules et l’injection des cellules en intra-lobe dorsal prostatique (procédures 2) sont des actes chirurgicaux réalisés sous anesthésie et analgésie mais ils peuvent occasionner une hypothermie, une déshydratation et l’asséchement des yeux. Suite à la chirurgie, les animaux peuvent souffrir modérément et la plaie chirurgicale peut présenter des signes d’inflammation ou d’infection. Les anesthésies lors des chirurgies et des séances d’imageries sont un stress. L’administration par gavage (procédures 2) comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections intra péritonéales répétées (procédures 2) peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les souris sont des souris immunodéficientes qui ont un risque infectieux plus élevé.
Devenir
Chaque animal sera mis à mort : - soit parce qu’il atteint avant la fin un score supérieur ou égal à 3 de la grille d’évaluation indiquant une souffrance nécessitant sa mise à mort. - soit parce qu’il a dû être exclue (pas de développement tumoral). En revanche il ne sera pas mis à mort tout de suite si sa présence peut éviter l’isolement d’un individu encore en procédure. - soit parce qu’il est un animal d’intérêt ou contrôle pour lequel il est nécessaire à la fin de la durée de la procédure de prélever différents organes et les tumeurs afin d’évaluer l’efficacité du traitement testé. Cet animal pourra appartenir soit à la branche des animaux témoins servant de référence, soit à une branche d’animaux traités. Parmi les animaux générés, seuls les mâles iront en procédure et les femelles (environ la moitié) seront soit utilisées pour les accouplements, soit proposées en don à l'institut. Si elles ne sont pas récupérées, elles seront mises à mort.
Remplacement
Nous avons mené l’étude par différentes approches dans un premier temps pour aborder ces questions, incluant, des études de prédiction par analyse bio-informatiques de données transcriptomiques, des cultures cellulaires 2D et 3D in vitro, selon le principe de Remplacement. Pour remplir nos objectifs, nous sommes contraints d’utiliser des modèles murins, car aucun système in vitro et aucun modèle d’organismes plus simples ne permet de reproduire les différents stades du développement tumoral prostatique (notamment les métastases) et de sa récidive postcastration.
Réduction
Selon le principe de Réduction, le nombre d'animaux utilisé est calculé de manière à obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Si un des modèles d'injection testés ne génère pas de métastases, les expériences se basant sur l’injection de ces cellules ne seront pas réalisées. En revanche, des animaux pourraient être écartés de l’étude, il est donc nécessaire de prévoir un effectif supérieur à celui calculé dans cette section. C’est pour cette raison que nous avons fixé un nombre final de 16 animaux par condition, tenant compte de tous ces paramètres.
Raffinement
Pour s’assurer du bien-être des souris durant la croissance des greffes tumorales, elles bénéficieront de coton, de maisonnettes, de tunnels et de bâtonnets de bois à ronger afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un nid. Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie et par la personne en charge du protocole afin de détecter tout signe de douleur. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et un analgésique sera administré en pré- et post-opératoire. A la suite de la chirurgie la souris sera réveillée au chaud et surveillée pendant les heures qui suivent et la bonne cicatrisation sera observée tous les jours durant la semaine qui suit l’opération par la personne en charge du protocole. Des points limites spécifiques à chaque étape ont été définis dans des grilles de score. Si, pour des raisons de protocole (mise à mort de certains congénères ayant atteint un point limite), une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, les modèles animaux créent le lien indispensable entre les tests in vitro et les études cliniques. Le modèle ici utilisé est préféré aux autres modèles de souris car c’est le meilleur modèle connu pour éviter toute réaction immunitaire et rejet de greffe de cellules tumorales tout particulièrement pour les cellules humaines.