Souris

Les souris mâles de ce projet sont génétiquement modifiées pour développer un cancer du testicule dans 75 % des cas. 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le seul acte que le porteur décrit est le prélèvement de deux phalanges au maximum à sept jours, pour l'identification et le génotypage, et il annonce comme nuisances la tumeur elle-même, une gêne au déplacement quand elle se développe au niveau du scrotum, une baisse d'activité. Les animaux surnuméraires et ceux dont le génotype ne sert pas au projet sont tués, les autres le sont en fin de procédure pour le prélèvement d'organes.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’analyser la survenue et/ou la progression des cancers germino-testiculaires et la sensibilité aux traitements par chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Le cancer du testicule (CT) est le plus fréquemment diagnostiqué chez l'homme jeune (15-35 ans). Son incidence n'a cessé d'augmenter dans les pays industrialisés depuis plusieurs décennies. L'étiologie des CT est peu connue. L'identification d'acteurs impliqués dans la prédisposition et la survenue de ces cancers permettra une meilleure compréhension des mécanismes impliqués. Ceci est d'autant plus important que 10% des malades décèdent des suites de leur cancer. L'étude de la physiologie des cellules germinales est fondamentale, puisqu'elles sont à l'origine de la majorité (95%) des CT. Des études récentes ont démontré les rôles des signalisations des xénobiotiques dans la régulation de la physiologie testiculaire et notamment celle des cellules germinales. L’objectif de ce projet est d’analyser l’implication de ces signalisations cellulaires dans la survenue et/ou la progression des cancers germino-testiculaires.

Procédures

Sur ces animaux, il y aura 1 prélèvement à 7 jours de deux phalanges maximum par souris pour la numérotation et le génotypage.

Impact sur les animaux

Seulement les animaux obtenus des croisements avec la lignée exprimant la recombinase Cre développeront des tumeurs. Les nuissances et effets indésirables attendus seront d'une part développement de la tumeur, ce qui au niveau du scrotum pourrait entrainer une gêne pour le déplacement de la souis, aussi nous abserverons les troubles au niveau de son activité (hypoactivité).

Devenir

Les animaux surnumérères et de génotypes sans intérêt pour le projet seront mis à morts. De même à la fin de la procédure, les animaux d'intérêt seront mis à morts pour les prélèvements d'organes.

Remplacement

Le remplacement par des approches alternatives n'est pas possible car aucune approche ne permettrait d'analyser les mécanismes de l'étiologie la tumorigenèse testiculaire avec une origine potentiellement au cours de la vie empbryonnaire et un développement de la patholgie et période postnatale.

Réduction

Nous réduirons au maximum le nombre de souris utilisées et présentant des attente délétère grâce à l'utilisation du système de ciblage tissulaire de l'altération génétique dans le tissus d'intérêt. Le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence l'effet des altérations génétiques dans la survenue des tumeurs germinales du testicule. Avec une incidence attendue selon la litérrature de 75%; nous utiliserons 20 animaux par groupe et par âge afin d’obtenir des résultats valides pour définir les différences entre les différents génotypes.

Raffinement

Le raffinement reposera sur la surveillance quotidienne des animaux effectuée par du personnel qualifié (expérimentateurs et personnel animalier). De plus, les animaux seront maintenus en groupes sociaux (5 au maximum) dans des cages de tailles conformes à la législation en fonction du nombre de souris, avec un enrichissement (tunnel en carton et maisons à souris) des cages. De plus, nous avons défini un arbre décisionnel (annexe) avec des critères adaptés d'arrêt de l'expérimentation en cas de souffrance de l'animal. Si un animal devait présenter des signes de douleur, l’animal sera isolé et un analgésique sera administré à des intervalles qui seront définis avec le vétérinaire référent.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris mâles modifiés génétiquement et qui développent dans 75% des cas un cancer germino- testiculaire. il s'agit d'un des rares modèles permettant de développer ce type de pathologie avec un incidence suffisante pour réaliser des études moléculaires et physiologiques donnant des résultats fiables.

Aucun analgésique ne sera administré, le porteur estimant qu'ils interféreraient tous avec le modèle, et les souris qui atteignent les points limites sont tuées par surdosage d'anesthésiques. 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs intestins. Elles reçoivent pendant sept jours du dextran sulfate de sodium dans leur eau de boisson, ce qui déclenche une inflammation intestinale, une douleur viscérale et une perte de poids, puis passent une minute trente dans un tube de mesure de composition corporelle la veille de leur mise à mort. L'enjeu déclaré est de vérifier si des antagonistes du récepteur minéralocorticoïde, déjà commercialisés pour d'autres indications, pourraient être repositionnés contre les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.

Objectifs

5.5.1 décrire les objectifs du projet (repris automatiquement du champs 3.3.2.1) Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin affectent près de 300 000 personnes en France. Il existe des thérapies, mais de nombreux patients ne répondent pas à ces thérapies ou y deviennent résistants. Le projet a pour objectif d’évaluer l’inhibition du récepteur minéralocorticoïde sur la réponse inflammatoire dans un modèle de colite aiguë induite par un agent chimique. L’inhibition du récepteur minéralocorticoïde exerce des effets anti-inflammatoires dans des contextes extra-intestinaux. Ces effets anti-inflammatoires sont médiés par une de ces cibles : la neutrophil gelatinase-associated lipocalin, et impliquent les cellules myéloïdes.

Bénéfices attendus

Même si des progrès thérapeutiques notables ont été réalisés dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, de nombreux patients ne répondent pas ou plus aux traitements proposés. De plus, les antagonistes du récepteur minéralocorticoïde ne sont pas contre-indiqués chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. En cas de validation de notre hypothèse de travail, nous pourrions repositionner les antagonistes du récepteur minéralocorticoïde déjà disponibles sur le marché dans un nouveau champ thérapeutique. De plus, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents sur l’implication du récepteur minéralocorticoïde dans le développement de l’inflammation intestinale.

Procédures

Les animaux seront soumis à du dextran sulfate sodium (1%) dans leur eau de boisson durant 7 jours afin d'induire une inflammation intestinale relative aux maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. La composition corporelle des animaux sera mesurée le jour précédant la mise à mort des animaux. Cette mesure peut occasionner un inconfort chez les animaux lors de l’introduction de la souris vigile dans un tube de mesure, mais n’entraine pas de douleur, la souris reste 1min30 dans l'appareil.

Impact sur les animaux

Le modèle de colite aiguë induite par le dextran sulfate sodium peut entrainer une douleur viscérale chez la Souris, ainsi qu’une perte de poids. La composition corporelle des animaux sera mesurée, le jour précédent la mise à mort des animaux. Cette mesure peut occasionner un inconfort chez les animaux lors de l’introduction de la souris vigile dans le tube de mesure, mais n’entraine pas de douleur.

Devenir

À l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer leurs intestins pour analyser différents paramètres et marqueurs biologiques.

Remplacement

Avant d’être testés in vivo, nous utilisons des modèles in vitro d’inflammation intestinale comme des lignées de cellules épithéliales intestinales ou de macrophages en réponse à des molécules pro-inflammatoires. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas de rendre compte de la complexité physiologique de la réponse inflammatoire in vivo. Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales.

Réduction

Ce projet s’efforce de réduire le nombre de souris au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante et en collectant le maximum d’observations au cours d’une même expérience (données nutritionnelles, composition corporelle, poids des animaux, inflammation et fonction de barrière intestinale). Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué selon la spécificité des procédures utilisées, en fonction de l’expérience acquise lors de nos précédentes études et des données de la littérature. Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, plusieurs approches combinées ont été prévues : la dose de Dextran Sodium Sulfate utilisée est évaluée à chaque lot de dextran sulfate sodium comme recommandé dans le protocole initial et nous avons fait le choix d’utiliser une dose faible de dextran sulfate sodium (1%) pour limiter au maximum la mortalité, permettant ainsi d’optimiser le bien-être des animaux et de réduire le nombre d’animaux. L’utilisation d’espèces d’animaux utilisés à des fins scientifiques, caractérisés par une faible variation génétique, permet de limiter la variabilité de la réponse biologique et par conséquent le nombre d’animaux. L’effectif de chaque groupe a été déterminé par une approche statistique en prenant comme critère principal le score histologique. Nous avons fait le choix de tester l’inhibition génétique du récepteur minéralocorticoïde uniquement sur les animaux colitiques et par conséquent de limiter les groupes contrôles au strict minimum. Les données obtenues chez des animaux contrôles seront réutilisées autant que possible. Par exemple, des échantillons de côlon seront préservés dans le laboratoire et indiqués dans une base de données communes à notre Unité et pourront ainsi être réutilisées au cours d’un autre protocole.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages standards (4 souris/cage), avec enrichissement. Les animaux seront maintenus dans un environnement contrôlé et stabilisé. Une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera réalisée avant le début des procédures. Les conditions de soins et les méthodes utilisées viseront à réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Une grille d’évaluation des points limites pour le bien-être animal sera utilisée. Un animal présentant un état de mal être ou de souffrance sera exclu de l'étude et mis à mort en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule SBEA. Pour limiter la douleur des animaux avec colite induite par le dextran sulfate sodium, l’usage est de ne pas utiliser d’analgésique en raison en de leur interaction potentielle avec le processus inflammatoire. Il existe un panel d’analgésiques utilisés dans l’inflammation intestinale, qui présentent tous un risque d’interférence avec notre modèle. Nous ne pourrons donc pas utiliser ces analgésiques dans nos procédures. En cas d'atteinte des points limites, les souris seront mises à mort par surdosage d'anesthésiants .

Choix des espèces

La Souris est le mammifère non-primate le plus proche (phylogénétiquement) de l’Homme. La Souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser la colite expérimentale et les modèles génétiques d’invalidation du récepteur minéralocorticoïde ne sont disponibles que chez la Souris. Cette souche n’est pas résistante à l’induction par le dextran sulfate sodium et permet ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés. Nous utiliserons des souris d’environ 6 semaines. La réponse à la colite diffère en fonction de l'âge des animaux et le stade de développement choisi correspond à une phase de réponse optimale avec un risque de mortalité réduit.

Toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus, 768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 240 d'entre elles reçoivent de trois jours à quatre semaines un régime enrichi en graisses destiné à les faire grossir, 160 subissent deux prélèvements sanguins à la mâchoire, d'autres passent vingt-quatre heures à jeun avant un test de réalimentation. La mesure des paramètres métaboliques impose d'isoler des souris pendant quatre semaines, un enfermement que le porteur range parmi les sources d'inconfort. Sur le remplacement, il affirme avoir déjà obtenu la preuve de concept in vitro et écrit avoir "maintenant besoin de la souris", la régulation de l'énergie mobilisant selon lui plusieurs organes à la fois.

Objectifs

L'homéostasie énergétique se définit comme l'équilibre entre les entrées et les dépenses énergétiques. Les dépenses résultent principalement du métabolisme basal et de l’activité physique, tandis que les apports trouvent leur origine dans l’alimentation. Quand cet équilibre est rompu, le terrain est favorable à l’installation de maladies métaboliques telles que l’anorexie ou l’obésité. Récemment, nous avons mis en évidence le rôle neuronal d'une protéine dans la régulation de la balance énergétique. Nous avons récemment observé, chez la souris, qu'en invalidant cette protéine dans les cellules microgliales (cellules immunitaires du cerveau impliquées dans la neuroinflammation) les animaux soumis à un régime riche en graisse présentent une prise alimentaire et une prise de poids réduites. Or, ce régime alimentaire est bien connu pour induire une inflammation de bas grade qui contribue à l'obésité, établissant ainsi un lien entre notre protéine d'intérêt dans les cellules microgliales et l'obésité induite par un régime gras. Cependant ces observations ont été réalisées aprés plusieurs semaines de régime gras. Dans ce projet, nous voulons déterminer les mécanismes moléculaires précoces de la neuroinflammation induite par un régime gras conduisant à l'obésité.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de diabète de type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établies. Plus important encore, la propagation de l'épidémie est encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation, caractéristiques de notre société moderne, expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète à part entière est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les mécanismes responsables de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Cette étude servira à identifier les mécanismes moléculaires qui font le lien entre la suralimentation et la mise en place de l'obésité et, par conséquent, le développement du DT2. L'identification de ces mécanismes permettra de savoir si notre protéine d'intérêt constitue une cible thérapeutique pour prévenir le développement de l'obésité. En effet, les médicaments réduisant l'obésité sont particulièrement intéressants pour l'industrie pharmaceutique, notamment en combinaison avec des médicaments qui agissent pour restaurer la fonction des cellules sécretrices d'insuline. Ainsi, notre approche jettera les bases de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients atteints de DT2.

Procédures

Des prélèvement sanguins seront réalisés sur 160 animaux vigiles. Ces animaux subiront un prélèvement temporo-mandibulaire (1min) à l'age de 9 semaines et un autre à l'âge de 15 semaines avant euthanasie. Au cours du test de tolérance au glucose, des gouttes de sang seront prélevées (6x10 secondes). 240 souris seront soumises à un régime enrichi en gras pendant 3 jours, 1 semaine ou 4 semaines, qui entrainera une prise de poids.

Impact sur les animaux

Le test de réalimentation après un jeûne prolongé nécéssite une mise à jeun des souris pendant 24H. Une diète riche en gras pour créer une environement obésogène sera mise en place chez les souris, ce qui peut créer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisées dans les cages. La tolérance au glucose nécessite l'injection d'un bolus de glucose qui peut entrainer un inconfort chez la souris. La détermination des paramètres métaboliques par calorimétrie indirecte nécessitent d'isoler les souris pendant 4 semaines.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus seront prélevés pour des études histologiques ou moléculaires

Remplacement

Toutes nos données in vitro convergent vers une fonction de notre gène d'intétêt dans la neuroinflammation induite par l'obésité. Nous avons apporté la preuve de concept in vitro que notre approche expérimentale fonctionne. Pour tester nos hypothèses, nous avons maintenant besoin de la souris. En effet, la régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes de régulation ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.

Réduction

Nous utiliserons un total de 768 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris. L'invalidation du gène n'est pas fiable à 100%, pour cette raison, le nombre d'animaux a été déterminé en prennant en compte cette difficulté. Afin d’analyser les paramètres évalués (poids des souris, nourriture consommée) nous déterminerons les tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Le stress lié aux procédures nécessitant L'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Un tube sera disposé dans la cage pour déplacer les animaux en limitant le stress dû à la préhension. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort ou de douleur après avis vétérinaire. Des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Pour étudier le métabolisme, la souris est le modèle animal de référence. L’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifées dans lesquelles le gène pour notre protéine d'intérêt est invalidé. Les animaux seront injectés avec du tamoxifène à l'age de 5 semaines, stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées. Les animaux seront nourris avec de la nourriture riche en gras dès l'âge de 9 semaines afin de favoriser une prise de poids optimale

Trois à cinq injections d'antigène, des séries de cinq jours d'instillations nasales, des gavages répétés puis jusqu'à quatre prélèvements sanguins à la mâchoire : 750 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par ponction cardiaque terminale. L'objet est la production d'anticorps polyclonaux destinés à des activités de recherche ou de diagnostic, un consommable de laboratoire fabriqué dans le corps de ces souris. Le porteur indique que l'inoculation peut provoquer une hyperthermie, une forte inflammation locale, une ulcération ou une nécrose au point d'injection. Il qualifie pourtant ces mêmes gestes de douleur "légère de courte durée".

Objectifs

Produire sur des souris de très bons anticorps polyclonaux spécifiques avec une haute affinité dirigée contre des protéines d'intérêt, pour des activités de recherche ou de diagnostic pour lesquels ils n’existent pas des alternatives accessibles. Éventuellement : Utiliser les cellules B pour préparer des hybridomes et/ou extraire les séquences des portions variables des chaines légères et lourdes des anticorps.

Bénéfices attendus

De nombreuses analyses de diagnostic ou de recherche nécessitent de détecter, de visualiser ou de quantifier une protéine dans un échantillon biologique. La plupart d'entre elles reposent sur l'utilisation d'anticorps qui reconnaissent spécifiquement la protéine d'intérêt. Ces anticorps sont produits en immunisant un animal contre la protéine.

Procédures

- 3 à 5 iInjections sous-cutanées, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale ou espacées de 14 à 21 jours sur animaux vigiles : quelques secondes - 3 à 5 series de 5 jours d’iInstillations intranasales (20ul) sur animaux anesthésiés espacées de 14 à 21 jours : 6 à 10 min - Gavage avec sonde gastrique sur vigiles : jusqu’à 3 séries de 5 jours consécutives espacées de 21 jours: quelques secondes - Prélèvement sanguin (retro mandibulaire) sur souris vigiles (100ul, J-7, J24, J45 ou 48 et éventuellement J66 et J87: quelques secondes - Prélèvement sanguin (cœur) sur souris anesthésiés (acte terminal) animaux : quelques minutes

Impact sur les animaux

Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 48h premières heures, puis régulièrement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour un prélèvement sanguin terminal afin de répondre à l’objectif scientifique.

Remplacement

La production d'anticorps polyclonaux de forte affinité dirigés contre un antigène résulte de la stimulation de différentes populations leucocytaires qui ne peut être reproduite de façon satisfaisante et efficace in vitro. L’initiation de la réponse immunitaire dans les souris naïves est unique pour chaque antigène et possible grâce à l’expression d’une grande diversité d’anticorps par les cellules B in vivo. Cette diversité est assurée par la recombinaison de différents segments de gènes qui ensemble composent les anticorps (germline répertoire). Au début d’une immunisation, certaines de ces anticorps (cellules B) vont se lier à l’antigène avec une affinité souvent très faible, mais suffisante pour initier une réaction immunitaire. Lors de cette réactions les cellules B reconnaissant de l’antigène vont se multiplier et commencer à secréter des anticorps. Au fur et à mesure de l’immunisation et des boosts, les cellules B accumulent des mutations aléatoires dans les gènes codant pour les anticorps, permettant ainsi d’augmenter (ou diminuer) de manière significative l’affinité des anticorps produits. Ce processus nécessite des interactions des plusieurs types cellulaires dans des tissues immunitaires et ne peuvent pas être reproduits in vitro ni prédit de manières satisfaisant par des méthodes in silico.

Réduction

Dans la très grande majorité des cas, un lot de 5 animaux sera suffisant pour obtenir la quantité d'anticorps nécessaire pour les travaux scientifiques. Dans certains cas (échec de l'immunisation ou besoin de très grandes quantités d'anticorps), il peut être nécessaire de répéter l’immunisation 2 ou 3 fois. Nous estimons que le nombre de demandes de production d'anticorps polyclonaux portera sur un total d'environ 30 antigènes et donc 150 animaux par an.

Raffinement

Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 48h premières heures, puis régulièrement. Le protocole d'immunisation sera interrompu si des signes généraux sont observés. Les soins adéquats seront apportés à l'animal (anti-inflammatoires, antibiotiques, soins locaux…). L’animal sera mis à mort si aggravation des signes cliniques malgré le traitement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention, une préparation aseptique et une anesthésie locale et une réhydratation sous-cutanée. Le prélèvement terminal (grand volume) sera réalisé sous anesthésie générale.

Choix des espèces

L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. De plus, l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées permettra d’évaluer plus précisément les mécanismes moléculaires et cellulaires de la pathologie humaine. L’ensemble des animaux expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte » : entre 6 et 12 semaines au début de l’expérience, âge à partir duquel le système immunitaire est mature et ne subit plus de changements majeurs.

Injectées de cellules leucémiques puis maintenues en boîte de contention pour recevoir jusqu'à trois injections de lymphocytes modifiés, 120 souris immunodéficientes subissent aussi trois prises de sang dans la joue et une ponction de moelle osseuse dans le fémur. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue. Les souris témoins, laissées sans traitement, développent la leucémie jusqu'à la restriction des mouvements des pattes arrière, la perte d'appétit et la perte de poids. Le porteur écrit avoir déjà démontré en culture que ces cellules tuent les cellules tumorales, et juge pourtant l'étape chez la souris "indispensable et incontournable" avant tout usage clinique.

Objectifs

L’objectif de cette étude est d’étudier différents modes d’administration de cellules qui ont été génétiquement modifiée dans le but de reconnaître puis d'éliminer des cellules cancéreuses (lymphocyte T modifié, CAR-T) afin d’étudier la réponse immunitaire dirigée contre la leucémie dans un modèle murin. La thérapie par cellules CAR-T consiste en la greffe autologue de lymphocytes T préalablement modifiés par thérapie génique pour leur faire exprimer un récepteur dirigé contre une protéine tumorale et permettre son élimination. Cependant, la réponse dirigée contre la tumeur provoque le relarguage massif de certaines molécules pouvant donner lieu à des complications plus grave jusqu’à la mort du patient. De plus, suite à leur activation, les cellules administrées meurent, ce qui nous emmene à une autre problématique : la persistance de ces cellules CAR-T in vivo. Enfin à cause de la pression thérapeutique, les cellules tumorales peuvent perdre l'expression de la cible du CAR-T conduisant aux rechutes des patients traités. Ainsi, le développement de nouveaux modèles d’administration est donc un enjeu majeur pour inhiber ces réponses et permettre le succès thérapeutique sur le long terme. Dans ce projet, nous allons utiliser de 2 types de cellules CAR-T en comparant la méthode d’administration standard telle qu'elle est utilisée à ce jour en clinique à une injection de manière séquentielle (fractionnée). Ainsi, la même dose sera administrée soit en une seule injection soit en deux injections. L’objectif principal sera d’évaluer la tolérance de la dose fractionnée ainsi que l'effet antileucémique comparativement à la dose unique. Secondairement, nous évaluerons la persistance des cellules CAR-T in vivo.

Bénéfices attendus

Cette approche devrait nous permettre d’évaluer dans un modèle murin l’intérêt d’une telle stratégie d’injection chez l’homme afin d’améliorer la sécurité du traitement et d’optimiser l’injection des cellules CAR-T afin d’en améliorer l’efficacité thérapeutique.

Procédures

Injection en intra-veineuse sur souris vigile maintenue en boite de contention, 1 injection de cellules à J0 puis 1 ou 2 autres (J10 et J17 selon les groupes de souris), moins de 10 secondes par injection. Des prélevements sanguins seront réalisés en submandibulaire sur souris anesthésiée avec un volume n’excédant pas 75 µl tous les 10 jours et un maximum de 3 prélèvements au total par souris, durée de prélèvement moins de 5 secondes. 1 prélèvement de moelle osseuse sur souris anesthésiée, moins de 10 secondes par prélèvement. Suivi par utilistion d'un bioimageur du développement des tumeurs sur souris anesthésiée. Prélèvements de sang et de moelle sur souris après le mise à mort.

Impact sur les animaux

Les souris contrôles vont développer la leucémie et l'avancée de la maladie va conduire à une restriction des mouvements des souris notamment des pattes arrières, une perte d'appétit et de poids. Une réaction de greffon contre l'hote plusieurs semaines après l'injection des CAR-T peut également se produire chez les souris, faisant partie des points limites de la procédure expérimentale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de la procédure expérimentale.

Remplacement

Nous avons déjà étudier le phénotype et la fonctionnalité des CAR-T cells in vitro en démontrant leur capacité à tuer les cellules tumorales. Cette validation in vitro nous a permis de démontrer la qualité et l'efficacité des cellules CAR-T à court terme. Pour nous rapprocher des conditions physiologiques chez le patient, une étude de l'efficacité des CAR-T à long terme dans un modèle in vivo reste cependant indispensable et incontournable avant leur utilisation en thérapeutique clinique.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum grâce à l’expérience acquise d’autres protocoles expérimentaux dans lesquels la réponse antitumorale des CAR-T cells chez des souris greffées de cellules leucémiques a été évaluée. Le nombre minimum de souris utilisées prend en compte les variabilités des mesures par bioluminescence du signal tumoral chez les souris (pouvant varier selon l’âge, le sexe, le délai de prise de greffe tumorale) et des réponses immunologiques observées durant ces protocoles. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, statut SPF, où les conditions d’hébergement sont contrôlées quotidiennement : température (23°C), hygrométrie (50%), cycle jour/nuit (12/12), change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de cellulose et des fibres de coton. Des points limites ont été mis en place et dans l'éventualité où un ou plusieurs animaux atteindraient le point limite, ils seront mis à mort. Pour les animaux présentant des difficultés de locomotion, la nourriture et l’eau seront apportés directement dans la cage sous forme de gel. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Toutes les interventions sur les souris seront réalisées sous hotte à flux laminaire pour éviter tout risque d'infection. Afin de répondre au principe de raffinement les prélèvements de sang seront effectués en sub-mandibulaire sous anesthésie générale. Les volumes de sang prélevés aux différentes étapes seront limités à 2 gouttes. Une analgésie par injection en sous-cutané (au niveau du genou) d'un analgésique sera mis en place 5 minutes avant le prélèvement de la moelle osseuse pour renforcer l’analgésie locale. Un maximum de 2 prélèvements par souris sera autorisé (1 prélèvement par fémur). En cas de douleur des souris (évaluation physique et comportementale) un anti douleur adapté sera injecté en sous-cutané, toutes les 6 à 12 heures durant 24 à 48 heures.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivi des réponses immunitaires. L’utilisation d’animaux immunodéprimés nous permet de n’observer que les effets des cellules CAR-T sur la leucémie. Les mécanismes immunologiques observé dépendront donc des cellules injectées et non des cellules murines. Les animaux seront âgés entre 8 et 12 semaines (adultes) au début des protocoles, car il faut que le système immunitaire soit totalement mature. Le poids des souris varient entre 20 et 30g.

1 515 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à vingt échographies abdominales sous anesthésie de quinze minutes et dix prélèvements de sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des vecteurs viraux sont injectés avant la naissance ou sur des souriceaux de deux, cinq et quinze jours, pour déclencher un cancer du foie de l'enfant, d'autres animaux recevant une greffe de fragment tumoral au cours d'une chirurgie abdominale. Le porteur signale que l'usage d'animaux à des âges aussi précoces peut conduire la mère à les abandonner, voire à les manger. Toutes sont tuées à l'issue, pour une maladie qui touche vingt enfants par an en France et dont quatre sur cinq guérissent avec les traitements actuels.

Objectifs

L’hépatoblastome (HB) est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. La survie globale à 5 ans actuellement est de 80 pour cent. Le traitement associe de la chimiothérapie à base de Cisplatine à une résection chirurgicale de la tumeur. Mais 20 pour cent des enfants traités vont développer une résistance au Cisplatine au cours de la chimiothérapie néoadjuvante ou au cours de la récidive de la maladie. Il existe actuellement peu d’alternatives thérapeutiques, avec des données insuffisantes sur les alternatives proposées. Il est donc crucial de pouvoir tester de nouvelles associations de traitement ou de nouveaux traitements. Les modèles pré-cliniques d’hépatoblastome qui existent aujourd’hui sont réalisés sur des souris nude, souris immunodéprimées, chez qui un fragment d’HB humain, ou des suspensions cellulaires issues de culture cellulaires d’HB sont implantés en sous cutané ou en situation orthotopique, c’est-à-dire directement dans le foie. Cependant le système immunitaire a un rôle primordial dans la réponse anti-tumorale. Il est donc très important de développer des modèles syngéniques d’hépatoblastomes chez la souris immunocompétente afin de pouvoir, une fois le modèle établi, étudier l’effet de nouveaux traitements et également étudier la réponse immunitaire impliquée dans la réponse anti-tumorale. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Notre équipe s’intéresse à deux grands types de tumeurs malignes du foie : les carcinomes hépatocellulaires (CHC) principalement développés chez l’adulte et les hépatoblastomes (HB) qui se développent chez l’enfant de moins de 5 ans. L’HB est une maladie rare mais c’est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. L'incidence est de 1 à 1,5 /1000000 d'enfant de moins de 15 ans, et cette incidence est en cours d'augmentation. Il touche 20 enfants par an en France. Dans le cas des HB, bien que la majorité des patients répondent aux traitements conventionnels, environ 20 pour cent sont réfractaires et décèdent. Les modèles de xénogreffes de lignées tumorales ou de greffes orthotopiques de tumeurs dérivées de pièces opératoires de patients représentent les modèles précliniques les plus pertinents actuellement pour étudier la réponse thérapeutique. Mais ces modèles sont développés chez des souris immunodéficientes et ne permettent pas d’étudier le rôle du système immunitaire. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, et notamment les mécanismes immunitaires, et de tester de nouvelles approches thérapeutiques pouvant être bénéfiques aux patients réfractaires aux traitements habituels.

Procédures

Les animaux pourront être soumis, selon les cas, à l’un des gestes suivants : 1) une chirurgie abdominale ou lombaire pour injection dans le foie ou la rate (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (réalisé dans l'établissement utilisateur 1 (EU1), 2) injection percutanée (animal vigile, 1 fois maximum, 15sec) (EU1), ou 3) une chirurgie abdominale pour greffe d’un fragment tumoral dans le foie (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (EU1). L’ensemble des animaux seront amenés à avoir : des prélèvements de sang de faible volume (animal anesthésié, 10 fois maximum avec une intervalle d’une semaine minimum entre chaque, 1min) ; un suivi par échographie abdominale (animal anesthésié, 20 fois maximum, 15 min) (EU1) ; pour certains un transport dans un autre établissement afin d’effectuer une imagerie non invasive par IRM (animal anesthésié, 2 fois, 30 min) (réalisé dans l'établissement utilisateur 2 (EU2)). En fin de période de maintien les animaux seront anesthésiés, un dernier prélèvement sanguin (1 min) sera réalisé et ils seront immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances prévues sont principalement celles engendrées par les procédures chirurgicales réalisées, qui peuvent engendrer une douleur au niveau de l’incision au réveil de l’animal et avoir une incidence sur l‘état général de santé de l‘animal (perte d‘appétit, baisse de l‘activité, infection de la cicatrice, détresse de l’animal dans les cas les plus grave), ainsi qu’entrainer une légère gêne dans la locomotion. Un risque anesthésique est également à prendre compte (détresse respiratoire, réveil intempestif). L’utilisation d’animaux à des âges précoces peut engendrer un abandon de la part de la mère, voir du cannibalisme dans le cas des nouveau-nés. Un stress de l’animal peut aussi être constaté lors des contentions, ainsi qu’un inconfort lors des injections. Le développement des tumeurs hépatiques est généralement asymptomatique et n’entraîne donc pas de nuisances en soit, car les animaux seront euthanasiés avant que les tumeurs entrainent une dégradation de l’état général des animaux. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance du fait du stress lié à la néophobie des rongeurs. Un risque anesthésique est également à prendre compte car l'IRM est effectuée sous anesthésie générale (détresse respiratoire, risque d'hypothermie, réveil intempestif).

Devenir

Le prélèvement des tissus d’intérêt étant nécessaire pour la réalisation de nos analyses, l’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin des procédures grâce à une méthode réglementaire, et dans le respect des bonnes pratiques.

Remplacement

Les modèles in vitro ne miment que partiellement la pathologie humaine car ils ne permettent pas de modéliser certains paramètres biologiques pouvant influencer le développement tumoral ou la réponse thérapeutique, tels que les interactions des cellules tumorales avec leur environnement ou encore l'hétérogénéité intra-tumorale. Il est donc essentiel de disposer de modèles in vivo reproduisant le plus fidèlement possible les caractéristiques de la pathologie humaine. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour mieux comprendre l'histoire naturelle de la maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Les effectifs ont été réduits au maximum et les groupes seront composés de 8 à 12 animaux. Cet effectif a été déterminé grâce à un calcul de puissance, afin d’utiliser le moins d’animaux possibles tout en permettant d’obtenir des résultats suffisamment robustes, et les expériences pourront être réitérées jusqu’à 3 fois si nécessaire. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Afin de limiter au maximum les éventuelles variations entre les expériences, les paramètres d’hébergement et de soin des animaux seront contrôlés. Le suivi tumoral hépatique sera réalisé grâce à une méthode non invasive, l’imagerie par échographie et par IRM, ce qui diminue également le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d'animaux utilisés sur la totalité du projet s'élève à 1515.

Raffinement

Les paramètres d'hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Les cages seront enrichies avec du coton de nidification, des maisonettes en plastique ainsi que des batônnets à ronger. Les femelles gestantes seront regroupées à 2 par cages afin d’éviter leur isolement, et ne seront séparées qu’après avoir mis bas afin d’éviter la surpopulation au sein d’une même cage. Les animaux issus d’établissement fournisseur observeront une durée d’acclimatation de 7 jours minimum avant toute utilisation. Un change sera réalisé par le personnel de l’animalerie une fois par semaine (sauf indication contraire) et une surveillance quotidienne rigoureuse des animaux sera réalisée tout au long de leur vie. Des pesées seront également réalisées à intervalles réguliers et une grille de suivi est utilisée. Les procédures seront raffinées afin de limiter au maximum la douleur et l’inconfort des animaux (personnel formé et compétent, anesthésie et analgésie adéquate suite aux procédures chirurgicales puis surveillance rapprochée des animaux avec étiquetage spécifique des cages concernées), et des points limites précis seront établis. Si un animal présente des signes de douleur ou de détresse, il sera immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire afin d’éviter toute souffrance animale. La Structure chargée du Bien-Etre Animal et/ou le vétérinaire pourront être sollicités pour conseil si besoin. Les transposrts des animaux entre l'EU1 et l'EU2 est assuré par un transporteur agréé, dans des boîtes de transport appropriées, ventilées, sécurisées et suffisament spacieuses. Un apport en nourriture et en eau gélifiée sera fourni durant le transport. Le temps de transport est de moins de 20 minutes entre les 2 EU.

Choix des espèces

La souris est un modèle expérimental de choix pour l'étude des pathologies humaines car c'est un petit mammifère qui se reproduit rapidement, est facile à manipuler, et dont nous avons une bonne connaissance du comportement et de la génétique. De plus, le génome de la souris est identique à plus de 95 pour cent à celui du génome humain, ce qui suggère une bonne homologie des mécanismes observés. On peut également facilement apprécier les modifications physiques et/ou comportementales traduisant une souffrance et/ou douleur, ce qui conduirait à l’euthanasie de l’animal. De nombreux outils moléculaires sont également disponibles chez ce modèle animal. La première procédure sera réalisée sur des femelles gestantes âgées de 2 à 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte et également à l’âge optimal permettant le bon déroulement de la gestation d’une part, et une bonne récupération de l’acte chirurgical d’autre part. Les vecteurs viraux seront injectés à différents âges (prénatal, 2, 5 et 15 jours de vie post natal), présentant un foie encore immature et en prolifération, afin de développer un hépatoblastome.

Les femelles de cette lignée transgénique peuvent mourir subitement à quinze mois sans signe annonciateur, seule nuisance du modèle que le porteur reconnaisse. 1 345 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Après une biopsie de la queue au sevrage, elles passent trois tests comportementaux à trois, six, douze et dix-huit mois, dont un test de mémoire en piscine étalé sur cinq jours, et une partie est transportée une à deux heures vers deux autres établissements pour des imageries cérébrales sous anesthésie. Le porteur détaille la répartition des mises à mort : 456 pour prélever le cerveau et l'intestin, 592 après les imageries, 297 couples reproducteurs ou animaux surnuméraires tués après avoir été inclus dans des études hors champ, le tout pour un futur complément alimentaire à base de polyphénols.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est la démence la plus commune parmi les démences de la personne âgée où elle représente un peu plus de deux tiers des cas. L’âge est le principal facteur de risque de la maladie d’Alzheimer. En France, le nombre de personnes âgées de 65 ans ou plus et atteintes de la maladie d’Alzheimer serait compris entre 560 000 et 730 000 suivant les études. Même si la recherche reste très active pour cette maladie, aucun traitement n’est actuellement capable de modifier efficacement l’évolution de la maladie et la cause demeure toujours inconnue pour la forme la plus représentée dans la population. Des travaux récents soulignent le rôle du microbiote intestinal dans la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. La recherche de molécules capables de modifier le microbiote intestinal tout en prévenant d’autres altérations du système nerveux central observées chez le patient devient aujourd’hui une priorité pour de futurs traitements. Plusieurs études soulignent le rôle modulateur de certains polyphénols sur le microbiote intestinal pour avoir un écosystème bactérien bénéfique sur la santé humaine. Toutefois, l’interaction entre les polyphénols et ce microbiote est complexe et des recherches approfondies sont nécessaires pour valider cette cible périphérique dans la maladie d’Alzheimer. L'objectif de notre projet est d'étudier l'effet de plusieurs polyphénols sur l'évolution des troubles cognitifs dans un modèle de la maladie d'Alzheimer chez la souris. Trois établissements utilisateurs seront impliqués dans ce projet.

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet conduira, à plus long terme, à la production d’un complément alimentaire visant à mieux vivre chez les personnes âgées.

Procédures

Dans l’établissement utilisateur EU1, les souris sont identifiées en posant une boucle d'oreille numérotée et les caractéristiques génétiques nécessaires à l'étude sont connues en réalisant une biopsie de la queue au sevrage. Les souris (1048) seront soumises à des tests du comportement pour évaluer les troubles cognitifs et moteurs liés au vieillissement physiologique et pathologique (Alzheimer) : au total 3 tests réalisés à 3, 6, 12 et 18 mois. Les tests de mémoire à court terme sont au nombre de 2, ils se feront respectivement 7 jours et 3 jours avant le début du test de mémoire à long terme. Chaque test de mémoire à court terme dure moins de 20 minutes. Le test de mémoire à long terme demande 4 jours d'apprentissage avec 4 essais par jour de 60 secondes espacés d'une heure. Le 5ème jour, la souris passe une seule fois le test sur 60 secondes. Durant tout le projet, les fèces seront recueillies 1 fois par mois. Les souris seront placées 5 min dans une nouvelle cage le temps du recueil de 3 crottes spontanées et retourneront dans leur cage d’origine. Dans un autre établissement utilisateur (EU2 à 1 heure de l’EU1), des souris (296) suivront deux imageries cérébrales pour évaluer le flux sanguin (30 min), l'inflammation et le métabolisme (60 min) qui nécessite la mise à jeun des animaux quelques heures avant l’imagerie. Dans un autre établissement utilisateur (EU3 à 2 heures de l’EU1), d'autres souris (296) suivront une imagerie par résonance magnétique (30 min) après administration orale de glucose. Dans les deux EUs une anesthésie gazeuse, régulée sera réalisée sur tapis chauffant thermorégulé durant l'examen.

Impact sur les animaux

Inconfort transitoire lié à la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse, associé à une douleur légère et transitoire liée à la pose de la boucle d’oreille et la biopsie. Tests comportementaux : stress léger et transitoire pour les tests de mémoire à court terme minimisé par l’habituation ; stress modéré et transitoire et sensation de froid légère et transitoire lors du test de mémoire à long terme avec des essais espacés d’une heure pour laisser le temps à la souris de se réchauffer. Concernant les protocoles d’imagerie dans l’EU2 nécessitant la mise à jeun des animaux quelques heures avant l’imagerie, il est possible d’avoir les effets suivants sur 5 min maximum : Inconfort/douleur au niveau du site d’injection des agents de contraste ; Inconfort au niveau du site d’apposition de la sonde d’image ultrasonore ; Stress lié à la contention (imagerie) ; Stress lié à la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse. L’imagerie au sein de l’EU3 est une technique non invasive. Cependant durant l’examen, un changement du rythme cardiaque et/ou respiratoire, mesurés grâce à un capteur placé entre l’animal et le lit, peut subvenir, du fait de la variabilité inter-animaux, de la sensibilité aux anesthésiques. Cette nuisance entraînera l’arrêt de l’expérimentation. L’administration orale de glucose avant l’imagerie peut induire un stress et une souffrance et des blessures physiques si l’animal bouge mais cela est très rare car la canule utilisée sera en matière souple avec un bout arrondi et le geste sera exercé par une personne qualifiée. Aucune autre nuisance n’est connue sur ce modèle murin transgénique mise à part la mort subite à 15 mois chez les femelles sans signe annonciateur.

Devenir

Tous les animaux inclus dans la demande d’autorisation de projet seront mis à mort avec la répartition suivante dans chaque établissement utilisateur : - EU1, 456 seront mises à mort pour le prélèvement du cerveau et de l’intestin en vue de réaliser des analyses biochimiques et de biologie moléculaire et d’étudier l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Les couples reproducteurs de plus de 6 mois et souris surnuméraires (297 au total)) seront mises à mort après inclusion dans des études hors champ. - 296 souris seront envoyées vers chaque établissement utilisateur EU2 et EU3 qui disposent de systèmes d'imagerie cérébrale indispensables à l'étude. Ces souris (592) seront mises à mort après les imageries pour des analyses biochimiques et de biologie moléculaire post-mortem.

Remplacement

Des études préliminaires in vitro ont déjà été réalisées pour étudier l’efficacité des polyphénols à une dose non toxique pour différentes cellules du cerveau permettant ainsi de définir les doses ciblées dans cette demande de projet. Ici, il est important de prouver les effets bénéfiques de ces polyphénols sur le vieillissement physiologique et pathologique Alzheimer mais aussi de s’assurer qu’elles n’ont pas d’impact délétère sur les fonctions physiologiques de l’organisme. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives pour juger de l’effet d’une nouvelle molécule à visée thérapeutique in vivo dans le cadre du vieillissement qu’il soit physiologique ou pathologique.

Réduction

Deux collaborations nationales sont envisagées dans ce projet et dans les deux cas il s’agit d’étudier les effets bénéfiques de polyphénols. Le fait de regrouper ces études sur la même demande de projet permet une réduction du nombre de souris. Par ailleurs, plusieurs paramètres sont mesurés chez une même souris, permettant ainsi de réduire encore le nombre de souris. Une souris permettra en final de générer des données aussi bien au niveau périphérique avec l’analyse du microbiote intestinal mais aussi au niveau cérébral. Enfin, le projet se déroulera par étapes. Si les résultats bénéfiques dans les étapes antérieures restent très faibles voire absents, des lots d’animaux ne seront pas inclus dans la suite du projet. Ainsi le nombre d’animaux indiqué est un nombre maximum. Pour estimer le nombre d’animaux par lot de souris, nous avons utilisé un calcul qui tient compte de la variabilité des réponses du vivant ; le nombre d'animaux par lot permettra d'obtenir des résultats robustes sur le plan statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en animalerie exempt de tout organisme pathogène spécifique et opportunistes (couples reproducteurs) ou tout organisme pathogène spécifique en respectant l’Arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d’aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques et leurs contrôles. Une période d’acclimatation de 10 jours minimum sera respectée avant l’introduction des souris dans une procédure. Pour diminuer les stress lors de la prise de l’animal pour les tests comportementaux, les animaux seront manipulés par préhension durant les 2 semaines qui précèdent les tests à raison d’une fois par jour. Pour le test comportemental en piscine, il est prévu de maintenir les souris dans ses mains en coupe posées sur une serviette (utile pour éponger l’eau) avant de les remettre dans leurs cages qui seront placées sur un tapis chauffant pour réchauffer les souris entre chaque essai. Dans les EU2 et EU3, les animaux seront hébergés en zone SPF en maintenant les interactions sociales des groupes de souris dans les sous-lots suivis dans l’EU1 avec une période d’acclimatation de 10 jours, température de 20-24°C, avec un enrichissement du milieu changé régulièrement (jouet en plastique : tunnel, igloo, maison). Pour diminuer les stress liés aux sorties des cages et aux contentions, les animaux seront régulièrement manipulés par le personnel en charge de l’étude. Le transport des animaux sera assuré vers les établissements utilisateurs collaborateurs par une société agréée pour le transport de rongeurs. Les cages seront réceptionnées par l’EU1 avant la date de transport pour permettre aux zootechniciens(nes) de prendre le temps de préparer les cages en incluant l’enrichissement, les gels hydriques en bonne quantité et l’alimentation nécessaire. Les anesthésies avec exsanguination seront réalisées sur tapis chauffant à température régulée. Toutes les anesthésies et analgésies prévues respecteront les résumés caractéristiques des médicaments utilisés (posologie). Pour les imageries dans les EU 2 et 3, du gel ophtalmique sera appliqué afin de compenser la sècheresse oculaire. Dans les 3 EUs, il est prévu une fois par semaine, une pesée des animaux avec l’utilisation d’une grille de scores et la mise en place de points limites gradés et d’actions en réponse à l’atteinte des points limites.

Choix des espèces

Dans le cadre de la maladie d’Alzheimer, il existe différents modèles murins génétiquement modifiés. Le modèle choisi est largement utilisé dans la littérature et surtout présente une cinétique progressive des lésions comme chez l’homme contrairement à d’autres modèles murins plus agressifs. Pour ce modèle, il est donc aisé de faire des comparaisons avec les autres études déjà publiées. Les souris seront incluses dès l’âge de 3 mois, âge pour lequel aucun stigmate Alzheimer n’est détectable donc très intéressant pour définir les données basales avant tout traitement. Des lots de souris seront utilisés jusqu’à l’âge de 12 mois où la perte de mémoire est quantifiable ainsi que les caractéristiques biologiques de la maladie. D’autres lots seront suivis jusqu’à l’âge de 18 mois où la perte neuronale pourra être quantifiée ainsi que les autres paramètres déjà quantifiés à 12 mois pour voir leur évolution.