Souris

Tester cinq souches probiotiques candidates conduit ici à sevrer précocement des souriceaux, puis à les infecter par un germe intestinal ou extra-intestinal. 1 054 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal est gavé sous contention vingt et une ou vingt-deux fois, isolé dans un pot en plastique pour recueillir ses excréments jusqu'à huit fois, saigné à la joue, et pour une partie d'entre eux piqué dans l'œil sous anesthésie. Le porteur annonce une perte de poids, un pelage hérissé, une posture voûtée et des diarrhées liées aux infections, et justifie l'usage des rongeurs par l'impossibilité de reproduire les communications entre organes sur des cultures cellulaires.

Objectifs

Le microbiote intestinal est une communauté dynamique, composée de microorganismes (bactéries, champignons, virus…) influencée par de multiples facteurs tout au long de la vie d’un individu. La transmission du microbiote par la mère est le facteur le plus important qui conditionne le schéma de colonisation microbienne chez le nouveau-né (primocolonisation). Aujourd'hui, il y a une tendance dans les populations humaines occidentalisées à avancer la fin de l’allaitement (sevrage) du nourrisson ce qui a un impact sur la primocolonisation et qui pourrait avoir un impact direct sur la santé du nouveau-né. Au cours du développement précoce du nouveau-né, des perturbations dans les interactions entre le microbiote et l'hôte pourraient nuire de manière irréversible et durable à la maturation du système immunitaire, prédisposant l'hôte à développer des maladies inflammatoires et une altération de la fonction de la barrière intestinale. Cette fonction correspond à la capacité de la muqueuse intestinale à confiner des éléments indésirables (typiquement des bactéries pathogènes) dans la lumière intestinale tout en conservant sa capacité d’absorption des nutriments. Dans ce contexte, des interventions ciblées au tout début de la vie pourraient constituer des stratégies faciles à mettre en œuvre et à contrôler pour compenser les perturbations du microbiote dues à ces sevrages plus précoces. Dans ce projet, nous nous proposons d´utiliser un modèle de souris de sevrage précoce et d’étudier la capacité d’une supplémentation avec différents probiotiques candidats (5 candidats en tout), c’est-à-dire des microorganismes ayant des effets santé bénéfique, à restaurer le microbiote intestinal. Pour évaluer si cette restauration est bien fonctionnelle, nous allons soumettre les souris ayant subi un sevrage précoce à une infection. Cette infection sera causée soit par un pathogène intestinal soit par un pathogène extra-intestinal (2 pathogènes différents).

Bénéfices attendus

Le bénéfice essentiel de ce projet est d’évaluer la capacité de 5 bactéries potentiellement probiotiques à améliorer la récupération du microbiote intestinal et les conséquences physiologiques liées au sevrage précoce. Il s’agit donc d’améliorations de connaissances fondamentales et des perspectives potentielles d’utilisation de bactéries probiotiques pour aider à la restauration d’un microbiote altéré par le sevrage précoce.

Procédures

Contentions et gavage sur animal vigile: 21 contentions et gavages pour 969 souris + 1 contention avec gavage pour 486 souris (les animaux subiront donc ce geste 21 ou 22 fois, selon les cas) ; chaque contention/gavage dure environ 15 secondes. Prélèvement de fèces : 1 fois pour 1063 animaux + 7 fois pour 486 souris (les animaux subiront donc ce type de prélèvement 1 fois ou 8 fois selon les cas) ; chaque prélèvement dure quelques minutes. injections : 1 fois pour 483 animaux vigiles et 1 fois pour les mêmes animaux anesthésiés. Contention et piqûre réalisées en 15-20 secondes environ Prélèvement de sang : sur animal vigile, 969 animaux concernés (concerne une seule fois chaque animal). Un prélèvement = une durée totale de 1 minute environ.

Impact sur les animaux

Les nuisances de ce protocole proviennent majoritairement des infections. Les principaux symptômes visibles attendus sont : une perte de poids et des signes cliniques tels que pelage hérissé, posture voûtée. L’une des infections pourrait en outre générer des altérations du transit intestinal, de type diarrhée légère. Le sevrage précoce peut engendrer chez les souriceaux un retard dans leur prise de poids. Par ailleurs, un stress temporaire lié à l’hébergement individuel des mères peut survenir en fin de gestation. Il y aura besoin de contention pour certaines manipulations qui peuvent générer un inconfort et un stress transitoires pour les animaux. Il y aura des administrations qui nécessiteront une anesthésie et une piqûre au niveau de l’œil. L’anesthésie nécessite une piqûre qui génère une brève douleur. La piqûre au niveau de l’œil étant réalisé sur animal anesthésié ne génère pas de nuisance particulière. Par ailleurs, nous isolerons les animaux dans des pots en plastique transparents afin de collecter des fèces individuellement. Cet isolement dure quelques minutes et peut générer un léger stress. Enfin, en fin d´essai, nous réaliserons un prélèvement de sang à la joue. Cette opération nécessite une contention et une piqûre, ce qui peut occasionner un stress et une douleur brève.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. La survie des animaux (souriceaux puis adultes) est incompatible avec les différents prélèvements et procédures effectués.

Remplacement

Les rongeurs sont couramment utilisés pour les études des interactions microbiote-hôte, car de telles expériences ne peuvent pas être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes.

Réduction

Les bactéries testées seront issues d’un programme préalable de criblage in vitro afin de ne conserver , pour les études sur les animaux, que des bactéries ayant montré un potentiel dans ces modèles. Par ailleurs, nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles.

Raffinement

Les animaux sont hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas les exposer à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux seront séparés pour être manipulés ne représentent qu’un temps très court (10 minutes maximum), pour la récupération de fèces dans des pots. Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la nidification, bâtons à ronger, maisonnettes en carton (sans encre) et des hamacs en plastique. Le matériel utilisé est adapté pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. Les manipulateurs maitrisant les gestes, le temps d’intervention et donc le stress seront réduits. Nous utiliserons des anesthésies adaptées en temps et aux besoins des essais. Lors des anesthésies, un gel oculaire sera appliqué pour prévenir le dessèchement des yeux des animaux. Des pads, avec une température stabilisée de 37°C, seront également placés sous les cages pour maintenir la température corporelle des animaux pendant l’anesthésie. Des tapis chauffants électriques seront aussi utilisés. Des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie et un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines, incluant les études sur le microbiote intestinal de par leurs similitudes fonctionnelles. La lignée retenue pour ce projet a été sélectionnée car elle a de fortes performances de fertilité et une bonne taille de portée (12 souriceaux en moyenne). Les souris seront utilisées du stade du nouveau-né au stade adulte.

Issues d'un élevage de lignées transgéniques dont une partie sera tuée en fin de période reproductive sans qu'aucun prélèvement ne soit réalisé, 4 930 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles développent une maladie neurodégénérative et des troubles cognitifs, avec un risque d'agressivité et de blessures entre congénères que le porteur signale. Chacune subit une biopsie avant sept jours de vie sur animal vigile, puis des injections répétées pendant sept mois, jusqu'à douze prises de sang et une batterie de tests cognitifs de cinq à vingt minutes. Le porteur affirme que le recours à la souris est "indispensable" et présente comme une mesure de remplacement le fait de n'avoir retenu que trois candidats vaccins sur huit après criblage in vitro.

Objectifs

L'implication de l'immunité dans les troubles neurodégénératifs est un domaine qui émerge fortement et qui est désormais considéré comme une voie très prometteuse pour le développement d'immunothérapies innovantes modifiant la progression de ces pathologies, en particulier dans la maladie d'Alzheimer (MA) et les autres Tauopathies. Il est clairement établi que l’inflammation locale au niveau du système nerveux central est une caractéristique associée à la neurodégénérescence, notamment dans la MA et d'autres tauopathies, et joue un rôle complexe dans la physiopathologie de la maladie. Outre cette inflammation locale, des preuves de plus en plus nombreuses mettent aujourd'hui en évidence un rôle des acteurs périphériques du système immunitaire dans la pathophysiologie de la MA et des tauopathies. Des résultats préliminaires suggèrent fortement une réactivité de ces cellules contre les protéines Tau pathogènes. Le projet a ainsi pour objectif de développer des stratégies thérapeutiques ciblant le système immunitaire réactif contre les protéines pathogènes, afin d’en contrôler son activité et limiter les mécanismes qui contribuent à l’émergence des processus neurodégénératifs. L’induction d’une tolérance immunitaire spécifique est alors recherchée pour agir de façon ciblée et ne pas perturber le fonctionnement normal du système immunitaire.

Bénéfices attendus

Les maladies neurodégénératives et plus spécifiquement la Maladie d’Alzheimer (MA) ont un impact considérable sur le secteur de la santé et le secteur médico-social, en raison du coût important de la prise en charge et de la prévalence élevée de cette maladie, qui touche environ 7 millions de personnes en Europe. Avec le vieillissement de la population, le nombre de personnes concernées par cette forme de démence va largement augmenter. La prise en charge de ces patients constitue aujourd’hui un coût de plus de 20 milliards d'euros par an pour la France. Aucune thérapie actuelle ne parvient à enrayer significativement cette pathologie, qui conduit à une destruction irréversible des neurones. Nous pensons qu’il y a un réel intérêt à développer cette nouvelle stratégie thérapeutique pour les maladies neurodégénératives. Cette approche se différencie des autres stratégies d’immunothérapie actuellement testées en clinique, qui visent à induire l’élimination active des dépôts protéiques. A noter toutefois, qu’un précédent essai a été suspendu en raison de cas de méningo-encéphalites chez certains patients. Notre approche cherche au contraire à induire une tolérance face à ces dépôts et limiter ainsi l’inflammation associée à la réactivité contre ces protéines pathogènes. Ces études devraient ouvrir la voie au développement de nouveaux essais cliniques thérapeutiques dans la MA et dans d’autres maladies neurodégénératives, dans le but de proposer une prise en charge plus efficace aux nombreux patients touchés par ces maladies.

Procédures

Les animaux modèles utilisés développent une maladie neurodégénérative avec l’émergence de déficits cognitifs au cours du temps, s’apparentant aux symptômes de la Maladie d’Alzheimer. Pour constituer les cohortes d’étude, les animaux devront être identifiés génétiquement à l’aide d’une biopsie effectuée de manière précoce sur animal vigile (geste d’environ 1 minute). Les traitements seront administrés par injection répétées au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale) ou sous-cutanée dès l’âge jeune adulte (3 mois) pour une période de 7 mois à raison d’une injection quotidienne pendant 5j et/ou toutes les 2 semaines, tous les mois ou tous les 3 mois, selon le protocole. Ces injections sont effectuées sur animal vigile par simple contention et ne dure que quelques secondes par animal (moins de 30 secondes). Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile toutes les 4 semaines sur la durée du traitement (environ 30 secondes à 1 minutes par prélèvement), à l’exception de la phase initiale où 2 prélèvements seront réalisés à 2 semaines d’intervalle. Les animaux seront prélevés entre 1 et 12 fois sur la durée du traitement (période de 12 mois). Les animaux seront finalement soumis à des tests cognitifs pour évaluer l’effet thérapeutique des thérapies proposées et évaluer leur impact sur les fonctions cognitives. Ces tests comportementaux durent entre 5 et 20 minutes chacun ; certains ne sont effectués qu’une seule fois, d’autres sont répétés tous les jours pendant 5 jours. Les souris seront habituées au lieu d’évaluation au préalable et auront un repos de 24h minimum entre chaque test. Enfin, les animaux seront euthanasiés selon différentes méthodes réglementaires à l’issue de la période de thérapie prévue, afin de réaliser des prélèvements pour des analyses complémentaires.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec l’émergence de déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge, source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). La biopsie effectuée chez les souriceaux vigiles de moins de 7 jours permettant l’identification génétique des animaux peut être génératrice de stress, d’inconfort et d’une douleur de courte durée. Les traitements mis en œuvre impliquent des injections au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale) ou de la base de la queue (sous-cutané) de manière répétée au cours du temps. Ces injections pourront induire un stress en raison de la contention nécessaire à la bonne réalisation de l’administration et une douleur de courte durée liée à l’introduction de l’aiguille (piqûre). De même, plusieurs prélèvements de sang seront nécessaires et potentiellement générateurs de stress et de douleur. Un risque de saignement prolongé existe mais reste peu probable. Les tests de comportement seront potentiellement générateurs de stress et ou d’angoisse en raison de la néophobie du modèle rongeur. Enfin, l’anesthésie précédent l’euthanasie des animaux pour les prélèvements implique une injection intrapéritonéale pouvant induire un stress en raison de la contention et une douleur de courte durée liée à la piqûre.

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires. Une première partie dans le cadre du maintien des lignées sera euthanasiés en fin de période reproductive sans réalisation de prélèvement. Une seconde partie euthanasiée afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact « biologique » des différents traitements, en utilisant les différents marqueurs de progression de la pathologie.

Remplacement

L’ensemble de ce projet vise à développer des stratégies thérapeutiques innovantes et jamais testées dans le cadre des maladies neurodégénératives. Il est donc indispensable d’avoir recours à un modèle expérimental in vivo chez la souris pour appréhender l’efficacité thérapeutique des traitements envisagés. Ces études ne peuvent être en aucun cas remplacer par des modèles in silico ou in vitro. Toutefois, ce modèle animal sera utilisé uniquement pour des vaccins ou des stratégies thérapeutiques ayant été validés in vitro et ayant démontré des effets. Ainsi, afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous pré-sélectionnerons et utiliserons un nombre limité de candidats vaccins. Sur les 8 candidats envisagés, seuls les 3 « meilleurs », sélectionnés sur la base des tests in vitro, seront retenus pour les études in vivo. Cette stratégie s’inscrit dans un principe de remplacement, en limitant les tests in vivo autant que faire se peut et de les remplacer si possible par des approches alternatives.

Réduction

Le projet impliquera un total de 4930 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Les souris utilisées pour une partie des analyses biologiques seront les mêmes animaux que ceux utilisés pour les tests comportementaux. Par ailleurs, une analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

L’ensemble des procédures réalisées au cours de ce projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.) quand cela est compatible avec les expériences. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi, etc.). De plus, la lignée utilisée est déjà bien caractérisée et connue de l’équipe, et les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : La souris est une espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. Il s’agit également d’une espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux dont notamment des pathologies neurodégénératives. Justification des stades de développement : Dans le cadre de l’entretien des modèles transgéniques à phénotype potentiellement dommageable, les animaux seront utilisés à partir de la maturité sexuelle (8 semaines). Dans le cadre de ce projet, les souris seront utilisées soit à l’âge de 2 à 3 mois, correspondant au stade précoce de la pathologie, soit à l’âge de 10 mois, stade où les troubles cognitifs sont observés.

Une souris qui perd plus de 20 % de son poids maximal, peine à se déplacer ou échoue aux tests de réflexes est retirée de l'étude et tuée. 128 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à neuf mois pour des analyses tissulaires et moléculaires. La moitié porte une mutation progéria qui les fait vieillir prématurément : perte de poids et de mobilité après six mois, courbure de la colonne vertébrale, mort entre quarante et cinquante-cinq semaines. Le porteur décrit un protocole sans chirurgie, les deux traitements passant par les croquettes et l'eau de boisson, et écrit choisir de tuer ces souris à neuf mois pour "éviter les nuisances liées à un vieillissement prématuré", nuisances que la lignée elle-même produit.

Objectifs

L'objectif principal de cette étude est d'utiliser la reprogrammation cellulaire comme stratégie pour retarder les effets du vieillissement, et notamment la perte des capacités régénératrices de l'organisme avec l’âge. En 2006 et 2007, il a pu être montré que les cellules adultes de souris et d'humains peuvent être reprogrammées en cellules souches pluripotentes. En 2016, il a été démontré que ce mécanisme de reprogrammation appliqué de façon transitoire améliore la santé et prolonge l’espérance de vie losqu’il est réalisé sur des souris progéria, qui vieillissent prématurément. Des expériences menées par notre équipe ont permis d’affiner cette stratégie in vivo. En effet, de 2018 à 2021, trois étudiants ont rédigé et publié leur thèse de doctorat, sur cette reprogrammation partielle in vivo. L’ensemble de ces travaux a notamment fait l’objet d’une publication en 2022. D’autres études plus récentes de l’équipe nous indiquent qu’une reprogrammation unique, trop tardive, ne permet pas d’augmenter la longévité et son effet sur les tissus est mitigé. Pour cette raison, nous faisons l’hypothèse, que l’accumulation de cellules sénescentes liée à l’âge, pourrait être un frein a l’effet de cette reprogrammation partielle, et proposons un projet combinant cette reprogrammation avec une sénolyse. L'objectif spécifique de notre projet sera donc de combiner ou non, chez les souris, un traitement visant à éliminer les cellules sénescentes avec la reprogrammation des cellules.

Bénéfices attendus

La reprogrammation cellulaire est un processus capable de ramener les cellules vers un état juvénile. Chez les souris, la reprogrammation a permis une amélioration de l’état de santé et de l’espérance de vie. La reprogrammation représente donc une stratégie innovante et prometteuse dans le développement de thérapies ciblant les maladies du vieillissement. Chez l’Homme comme chez la souris, a été constatée une accumulation de cellules dites sénescentes dans les différents tissus. Ces cellules sénescentes ont perdu leur capacité à proliférer et provoquent un état inflammatoire lié à l’âge dans les tissus. Des données du laboratoire montrent que la reprogrammation de souris agées présente une efficacité réduite. Notre hypothèse est que les cellules sénescentes réduisent l’impact positif de la reprogrammation. Nous envisageons donc de combiner la reprogrammation avec un traitement visant à supprimer les cellules sénescentes. Ce projet apportera de nouveaux éléments quant à l’utilisation combinée d’agents sénolytiques (qui suppriment les cellules sénescentes) et de la reprogrammation comme stratégie thérapeutique destinée à réduire l’impact des maladies liées à l’âge et améliorer l’espérance de vie en bonne santé.

Procédures

Lors de cette étude, l’état de santé des animaux sera étroitement surveillé. Le suivi du poids des animaux sera un critère important dans l’évaluation de leur état. Ainsi les animaux seront fréquemment pesés. Pour limiter au maximum les interventions, les deux traitements pharmacologiques prévus seront administrés par l’alimentation. La molécule destinée à supprimer les cellules sénescentes sera incorporée aux croquettes et la molécule permettant la reprogrammation sera dilluée dans l’eau. Il n'y aura aucun geste technique particulier lié à autre chose que de la surveillance des animaux (contention pour l'identification des animaux et la pesée). Les animaux seront transferé vers l'animalerie d'experimentation autours de 4 mois et les traitement seront inclu dans la nourriture et la boisson et euthénasié a 9mois sans autre gestes.

Impact sur les animaux

La moitié des souris de l’étude possèdent une mutation dite progéria. Ce caractère conduit à un vieillissement accéléré des animaux. Ces animaux connaissent les nuisances dûes aux grands âges de façon prématurée. De plus, ils meurent de façon précose à un âge situé entre 40 et 55 semaines. Après l’âge de 6 mois, une fragilité croissante liée à l’âge conduit à une diminution progressivement du poids et de la mobilité. Ces animaux ont également tendance à développer une lordose (coubure de la colonne vertébrale). Les démarches expérimentales ne comprennent pas de chirurgies susceptibles de causer de l'inconfort aux animaux. De plus, aucun effet indésirable n’est attendu sur les traitements passants par l’alimentation.

Devenir

Au terme de l’unique procèdure prévue, l’ensemble des individus sera euthénasié à l’âge de 9 mois afin de réaliser un large panel d’analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires.

Remplacement

Bien que la reprogrammation a permis une amélioration de l’état de santé et de l’espérance de vie chez la souris, des travaux menés par l’équipe tendent à démontrer elle se heurte à des niveaux de sénescence tissulaire élevés chez les souris agées. Le grand nombre de cellules sénescentes serait donc susceptible d’inhiber les effets positifs de la reprogrammation. Ce projet vise donc à rétablir l’effet thérapeutique de la reprogrammation en supprimant les cellules sénescentes au sein des différents organes et donc leur action de blocage présumée. De plus, cette étude a pour objectif d’analyser les changements cellulaires et moléculaires mis en place par les traitements au sein même des multiples organes et tissus. Un intérêt particulier sera donné au suivi des cellules sénescentes et l’impact de leur disparition sur les différentes niches de cellules souches adultes. Ainsi pour avancer, ce type d'analyse nécessite l'utilisation d'animaux puisqu'à l'heure actuelle, aucun modèle in vitro n'est capable de représenter la complexité de l’ensemble des mécanismes physiologiques lié à la sénescence et au vieillissement. Aussi, dans le cadre de ce projet, une étude sur l’organisme entier est nécessaire

Réduction

Les travaux de thèse réalisée en 2021 par l’équipe ont démontré pour la première fois qu’il existait une différence de la réponse à la reprogrammation in vivo entre les mâles et les femelles. Afin d’optimiser au mieux l’utilisation de tous les animaux produits, nous allons réaliser nos tests à la fois sur les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous utiliserons aussi en contrôles « jeunes », les individus non-progériques issus des mêmes croisements.Le nombre d'animaux par groupe est fixé à 8 par sexe pour les analyses tissulaires et moléculaires, nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs d’après nos analyses. Le nombre de groupes a été réfléchi de sorte à avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus, il s’élève à 4 (un groupe contrôles de 16 animaux non-traités, un groupe de 16 individus traités uniquement en sénolytiques, un groupe de 16 individus traités uniquement en reprogrammation, un groupe de 16 individus combinant les deux traitements. Cette configuration étant la même pour les animaux progéria ainsi que pour les non progéria, soit 128 animaux au total.

Raffinement

Nous utilisons un modèle de souris conduisant à un viellissement prématuré afin d'accélérer l'étude du des processus du vieillissement. Nous choisissons de sacrifier ces souris à l'âge de 9 mois pour éviter les nuisances liées à un vieillissement prématuré. Ces résultats seront ensuite comparés à ceux d'une étude précédente pour évaluer les différences et les similitudes. Pour administrer les traitements, nous les mélangeons à la nourriture des souris, ce qui limite les interventions directes sur les animaux. Nous surveillons régulièrement les souris pour détecter tout signe de douleur ou d'anomalie. Des indicateurs tels que l'isolement, la perte d'appétit ou des difficultés de déplacement peuvent indiquer des problèmes de santé. Si une souris perd plus de 20% de son poids maximal ou montre des signes de difficulté à se déplacer ou à manger, nous la retirons de l'étude pour éviter qu'elle ne souffre davantage. Nous réalisons également des tests de réflexes pour évaluer la santé des animaux. Si une souris échoue à ces tests, cela peut indiquer un problème de santé grave, et elle est alors retirée de l'étude. En résumé, nous prenons toutes les mesures nécessaires pour garantir le bien-être des souris tout en réalisant nos recherches sur le vieillissement.

Choix des espèces

La souris à vieillissement accéléré permet de suivre sur une courte durée les variations physiologiques au cours du vieillissement. Ces animaux présentent un état vieillissant au bout de 6 mois et décèdent autours de 9 à 10 mois environ. Afin d’étudier l’impact de la sénescence sur la reprogrammation, les expérimentations et analyses seront réalisées sur des animaux adultes. De plus, les périodes utilisées sont en accord avec les résultats précédemment obtenus au laboratoire lors d’études antérieures. Ainsi, les traitements seront réalisés sur des animaux dont les signes de vieillissement commencent à se manifester. Enfin, les analyses histologique et moléculaire de notre différent groupe seront réalisées à l’âge de 9 mois conformément à nos études précédentes afin d’être comparables.

Treize prélèvements de sang par microcoupure de la queue sur chaque animal, deux mises à jeun de seize puis six heures, un gavage et une injection intrapéritonéale. 1 688 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour récupérer les prélèvements, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. La lignée porte un phénotype dommageable, et les souris nourries au régime gras montent jusqu'à 45 grammes et deviennent moins actives, pour l'étude d'une protéine mitochondriale liée au diabète. Le porteur retient la souris parce que les gènes de l'obésité et du diabète sont conservés entre souris et humain, et parce que la proximité du centre d'explorations fonctionnelles facilite le travail.

Objectifs

Récemment, il a été établi que de petites structures présentes dans les cellules appelées mitochondries sont impliquées dans la mise en place et dans la progression du diabète. Nous avons identifié une molécule/protéine qui joue un rôle majeur dans le fonctionnement des mitochondries. Notre objectif est donc d'étudier comment cette molécule fonctionne et comment elle est affectée sous différents régimes alimentaires chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait définir une nouvelle cible thérapeutique dans l’obésité et les complications du diabète en ciblant ce gène cible ou son activité.

Procédures

- Injection intrapéritonéale, 10s, 1X par animal. - Mise à jeun, 16h, 1X par animal. - Mise à jeun, 6h, 1X par animal. - Gavage, 10s, 1X par animal. - Prélèvement de sang par microcoupure de la queue, 10s, 13X par animal.

Impact sur les animaux

•Elevage : La lignée murine utilisé dans ce projet est une lignée présentant un phénotype dommageable. •Régime riche en graisse : les animaux vont prendre du poids au fur et à mesure des semaines (jusqu’à 45 grammes) et devenir un peu moins actifs. •Injection intrapéritonéale : Causant une douleur légère due à la piqûre. •Microcoupure à la queue : Causera une douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. •Mise à jeun : Les animaux n’auront plus accès à la nourriture, ils pourront subir une gêne due à la sensation de faim. •Gavage : stress dû à la contention et à la sonde de gavage.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en oeuvre les trois grandes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.

Remplacement

Pour réaliser les tests nécessaires et les techniques que nous souhaitons mettre en œuvre dans ce projet, les modèles in vivo sont indispensables. Le choix de la cible de notre protéine d'intérêt a été déterminé partir d'observations sur des cohortes humaines et confirmé sur des cultures cellulaires. Cependant l'étude in vitro seule ne permet pas d'obtenir un modèle physiologique d'obésité. Les modèles animaux sont donc nécessaires pour définir la réponse globale d’un animal à une situation physiopathologique. Les procédures expérimentales que nous souhaitons mettre en place ne peuvent donc pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. En plus, les gènes impliqués dans l’obésité et le diabète jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme.

Réduction

Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mis à mort, afin d'approfondir les études. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations.

Raffinement

Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet et la douleur sera limitée à son maximum. Les souris seront sous surveillance journalière de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et une grille de score adaptée à la procédure est en place.

Choix des espèces

La souris est un des modèles les plus appropriés pour l'étude de l'obésité et du diabète de type 2. Les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes qui n'impliquent pas l'utilisation d'animaux vivants. Les souris sont faciles à manipuler et la proximité du centre d’explorations fonctionnelles nous permet d'utiliser ce modèle dans des conditions d'élevage optimales. Les animaux seront mis à l'accouplement à partir de l'âge de 56 jours, qui correspond à l'âge de la maturité sexuelle. Les souris utilisées dans les procédures expérimentales seront âgées de 8 à 10 semaines au début du processus. Cet âge correspond à la maturité sexuelle des souris, donc à une stabilisation hormonale. Les souris utilisées pour les procédures expérimentales sont de souris adultes.