Souris
Etude chez la souris de l’action protectrice d’un probiotique instillé en prophylaxie et en curatif sur les infections pulmonaires à Pseudomonas aeruginosa.
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Anesthésiées deux à trois fois pour recevoir dans la narine un probiotique puis une suspension de Pseudomonas aeruginosa, 845 souris développent une infection pulmonaire aiguë. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec pertes de poids, chute de température et immobilité progressive sur sept jours au maximum. Le porteur qualifie de faible l'intensité de chaque geste pris isolément, préhension, anesthésie, injection d'analgésique, tout en reconnaissant que l'évolution de l'infection va jusqu'à une intensité sévère. Toutes les souris infectées sont tuées, précisément parce qu'elles ont subi cette infection pulmonaire aiguë.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose, de bronchopneumopathie chronique obstructive et chez les patients en réanimation. Cette bactérie devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi, il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, exercent des effets positifs sur la santé. Nous avons pu valider une preuve de concept, suite aux résultats prometteurs d’une bactérie à potentiel probiotique actuellement en développement au laboratoire, et ayant une action protectrice vis-à-vis de l’infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa. L'objectif du projet est de tester l'efficacité du probiotique à des souris ayant une infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentielles bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines étant à l’origine d’infections pulmonaires notamment dans la mucoviscidose ou la bronchopneumopathie chronique obstructive.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés deux à trois fois et recevront durant 1 minute du sérum physiologique ou un probiotique dans la narine puis la seconde fois une suspension bactérienne sur une durée de 1 minute. Si une troisième instillation est prévue, les souris recevront du sérum physiologique ou un probiotique durant 1 minute dans la narine.
Impact sur les animaux
Selon les procédures, les suivis quotidiens pourront durer de 3 à 7 jours. Ce projet peut induire un stress chez les animaux notamment lors de la préhension de l’animal, pour les suivis, les pesées et la prise de température (2 à 3 fois par jour maximum) : intensité faible, durée environ 1 min. Les animaux auront au maximum 3 anesthésies : Intensité faible, durée environ 2 min. Des pertes de poids et de température, une mobilité réduite voire, une inactivité après le début de l’infection pulmonaire peuvent être observées, elles sont d’intensité progressive avec l’évolution de l’infection pouvant aller jusqu’à une intensité sévère sur une durée de 7 jours maximum. Les analgésies par injection des animaux sont d’intensité faible et d’une durée d’environ 30 secondes.
Devenir
A l'issu du projet tous les animaux ayant été infectés, seront mis à mort. Et certains auront des prélèvements de tissus. Tous les animaux doivent être mis à mort, car ils ont subi une infection pulmonaire aigue.
Remplacement
Nous souhaitons observer dans cette demande un pourcentage de survie d’animaux à une infection pulmonaire causée par Pseudomonas aeruginosa mais également observer les effets aux niveaux tissulaires (poumons et autres) de l’instillation du probiotique sur l’infection à Pseudomonas aeruginosa. Les modèles cellulaires et/ou autres modèles in vitro ne permettent pas à ce jour de conclure sur la survie d’un animal ou des dommages tissulaires à une infection pulmonaire. Pour cette raison, nous faisons le choix de conserver le modèle animal. De plus, nous souhaitons étudier la sécurité du potentiel probiotique ce qui doit impérativement se faire sur un modèle animal.
Réduction
Lors des études de survies, l’analyse de la survie sera réalisée par des tests statistiques, le nombre de souris nécessaire par groupe est de 10 souris. Afin de réduire le nombre d’animaux, le nombre de souris dans notre groupe recevant uniquement notre probiotique est réduit au minimum car nous n’attendons aucune mortalité. Lors des procédures d’études de l’inhibition de Pseudomonas aeruginosa au niveau pulmonaire, le nombre de souris nécessaire afin de garantir une puissance statistique est de 6 souris minimum dans chaque groupe. Pour nos procédures de test du probiotique de manière curative 10 souris minimum sont nécessaires dans chaque groupe. Par ailleurs, dans nos procédures, nous nous limitons à une seule souche clinique de notre probiotique alors que plusieurs espèces sont décrites.
Raffinement
Avant toutes instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés, une analgésie est mise en place en accord avec notre table se suivi de soin. De plus, un gel appétent contenant de l'analgésiant est déposé dans les cages 24h/24. Ce gel permet une analgésie continue pour les animaux tout au long de la journée. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement (2 à 3 fois par jour) à l’aide d’une table de suivi de soins mise en place afin de réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies, car leur sensibilité à Pseudomonas aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante à 24h. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats.
Caractérisation de nouveaux modèles murins pour l’étude de la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue, dont 1 248 opérées sous anesthésie sans jamais reprendre conscience, 1 934 souris vont être utilisées pour caractériser quatre nouveaux modèles génétiques de la maladie de Huntington. Les 686 autres relèvent d'un niveau de souffrance léger. Certaines lignées sont maintenues jusqu'à onze mois pour que des symptômes neurologiques et moteurs apparaissent, symptômes que le porteur dit jamais handicapants, avant une série de tests comportementaux d'une semaine au maximum puis une chirurgie terminale. Ces tests, présentés comme très fins et seuls capables de révéler les symptômes en question, ne sont nommés nulle part dans le résumé.
Objectifs
La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Afin de pouvoir répondre à des questions fondamentales sur les mécanismes de cette maladie, quatre nouveaux modèles murins génétiquement modifiés ont été développés. Cependant, avant de pouvoir les utiliser en recherche, une description complète de leur comportement est indispensable. De plus, il faut également analyser si les modifications génétiques ne perturbent pas le développement des animaux afin de valider la fiabilité de ces nouveaux modèles. Cette étape est primordiale pour s'assurer que de futurs projets de recherche dans lesquels ces modèles seront utilisés ne seront pas biaisés.
Bénéfices attendus
Les différents modèles murins déjà existants pour étudier la maladie de Huntington ne permettent pas d’étudier et de visualiser directement et à l'état normal les protéines défaillantes et responsables de la maladie. Pour cela, il faut utiliser des intermédiaires cellulaires permettant de tracer et marquer les protéines. Cependant, l'ajout de ces intermédiaires peut engendrer des modifications cellulaires indésirables et fausser certains des résultats. Ainsi, ces nouveaux modèles murins vont être de précieux outils pour atteindre les objectifs des projets qui visent à mieux comprendre les mécanismes de mise en place de la maladie de Huntington et à aboutir à des innovations thérapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie et/ou d’empêcher l’apparition des symptômes. Ainsi, la caractérisation du développement, du comportement et des fonctions physiologiques de ces souris est essentielle.
Procédures
Parmi les animaux de ce projet, certains développent un phénotype dommageable avec l'âge. Tous les animaux effectueront une seule série de tests comportementaux pendant une durée maximale d'une semaine, puis une chirurgie terminale sera réalisée.
Impact sur les animaux
Certains des nouveaux modèles présentés ici peuvent développer avec l’âge des symptômes légers de la maladie de Huntington. Ces symptômes neurologiques et moteurs associés au modèle ne sont observés que lors de tests comportementaux très fins conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte de poids excessive ni une perte d'autonomie. Il est possible d’identifier 3 nuisances légères potentielles : 1) un stress léger pendant leur transport d'une animalerie vers l'autre. 2) un stress léger lors de la manipulation par l'expérimentateur pendant la mise en place des croisements et pendant la réalisation des tests comportementaux. 3) un stress léger d'une femelle ayant mis bas lorsque les animaux seront prélevés.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin des procédures. Leurs tissus cérébraux ainsi que d'autres organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés et conservés afin de réaliser des expériences ultérieurement.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs des projets de recherche et reproduire la complexité d’un organisme vivant. De plus, les nouveaux modèles murins de la maladie de Huntington qui ont été développés vont permettre d'étudier le rôle de plusieurs protéines impliquées dans le développement de la maladie en conditions physiologiques et/ou pathologiques sans devoir utiliser des intermédiaires pouvant biaiser les résultats. Le modèle murin est indispensable pour comprendre le rôle de la protéine huntingtine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier.
Réduction
Le nombre total d’animaux pour ce projet a été calculés en considérant que les expérimentations doivent être validées avec au minimum deux groupes de souris afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables. Dans une démarche de réduction, les souris utilisées vont permettrent de faire plusieurs études et de répondre à différentes questions fondamentales. De plus, à la fin de chaque étude, les tissus cérébraux ainsi que d’autres organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés. Ceci permettra d’obtenir du matériel biologique précieux sans devoir générer des animaux supplémentaires.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez ces animaux. Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées et équipées d’une litière stérile ainsi que de la paille permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. De plus, différents matériaux pour divertir les rongeurs seront ajoutés dans la cage avec une rotation chaque semaine pour que les animaux aient chaque semaine un nouveau divertissement. Ces cages seront changées toutes les semaines. L’accès à l’eau et à la nourriture sera illimité. Les biberons d'eau et les croquettes seront également changés toutes les semaines. Le transport des animaux d’une animalerie à l’autre sera effectué en cages occultées avec au moins un matériau de divertissement et des croquettes mouillées à disposition. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. L’état de santé des animaux sera surveillé toutes les semaines ou tous les jours si besoin jusqu'à la fin de leur vie. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude de la maladie de Huntington. Certaines souris seront utilisées au stade de jeunes adultes, c'est-à-dire entre 8 et 12 semaines, d’autres devront atteindre l’âge de 11 mois afin qu'elles développent les symptômes légers de la maladie de Huntington et permettre que l’étude soit pertinente. Concernant les études développementales, les animaux seront utilisés à différents stades de développement cérébrale car cette période est fondamentale pour la mise en place des tissus cérébraux. En outre, de plus en plus d'études montrent que des dyfonctionnements cérébraux s’installent très tôt, bien avant l'apparition des symptômes de la maladie de Huntington.
Le rôle du système inhibiteur du système vestibluospinal dans le contrôle de la posture chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour cartographier les réseaux de neurones inhibiteurs entre la moelle épinière et le cerveau, 224 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. 64 subissent une chirurgie d'injection dans la moelle épinière, 60 en subissent deux, moelle épinière puis tronc cérébral, et 100 reçoivent une injection dans le tronc cérébral puis l'implantation d'une fibre optique. Ces dernières passent trois épreuves comportementales, un couloir, un plateau basculé à 45 degrés dix fois par jour pendant deux semaines et un tapis roulant, pendant que la lumière active ou inhibe leurs neurones. Les suites annoncées sont le saignement, la douleur postopératoire, l'infection des sutures, le déséquilibre et la perte de poids, quand le bénéfice tient en une phrase, des connaissances utiles à la compréhension du système postural.
Objectifs
Les interactions entre la moelle épinière et le cerveau sont responsables de nombreux comportements, plus particulièrement les comportements moteurs. Cependant les mécanismes d’interaction entre ces deux systèmes (moelle et cerveau) ne sont pas comlètement élucidés. La connaissance de l’anatomie et du fonctionnement de ces interactions reste essentielle à la compréhension des mécanismes locomoteurs. En effet, les réflexes permettant la position debout et la stabilité pendant les déplacements ainsi que les positions statiques sont contrôlés par ces interactions. Si le réseau de neurones excitateurs a bien été étudié et caractérisé, ce n’est pas le cas pour les interactions entre ce réseau dit « excitateur » et celui dit « inhibiteur ». Le but de cette étude est donc de comprendre comment sont anatomiquement organisés les réseaux de neurones inhibiteurs de la moelle épinière et du cerveau et de caractériser également leur fonctionnement. Dans ce but nous travaillerons sur le modèle murin, et plus particulièrement sur des souris génétiquement modifiées dont les neurones cibles ont été rendus facilement répèrables par des outils de génie génétique ce qui permettra leur ciblage pour les étudier. La souris possède un système locomoteur quadripède assez proche de l’homme, de par les structures cérébrales qu’il implique. Pour ce faire, nous allons utiliser des approches de marquage des projections neuronales entre la moelle épinière et le cerveau, ainsi que des approches fonctionnelles permettant d’activer ou d’inhiber les neurones cibles en utilisant la lumière.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra une meilleure compréhension du système postural impliqué dans le maintien corporel d’un être vivant. L’étude anatomique et fonctionnelle de ce système d’adaptation apportera des connaissances utiles piur la compréhension de son fonctionnement en situation pysiologique et pathologique.
Procédures
-64 animaux seront soumis à 1 chirurgie d’injection dans la moelle épinière, d’une durée de 30 à 45 min sous anesthésie générale. -60 animaux seront soumis à 2 chirurgies : 1 injection dans la moelle épinière d’une durée de 30 à 45 min, puis 3 à 4 semaines après, 1 injection dans le tronc cérébral, chirurgie d’une durée de 1h. -100 animaux seront soumis à 2 procédures de chirurgies et 3 tests comportementaux : 1 injection au niveau du tronc cérébral (30min). 3 semaines après, 60 animaux seront soumis à une implantation de fibre optique au même niveau que le lieu d’injection précédemment mentionné (30min). Les 60 autres animaux seront implantés dans la moëlle épinière (1h) La stimulation optogénétique : durée et fréquence 30 sec toutes les minutes pendant 10 minutes Les animaux utilisés en comportement recevront 3 comportements différents : couloir (3 jours, 5x1min par jour), bascule (2 semaines, 10 basculements de 45° par jour), tapis roulant (6 jours, 4x 3 min).
Impact sur les animaux
Il s’agit de risques généraux suite à la chirurgie tel que le saignement, la douleur post-chirurgicale, l'infection au niveau de la suture, la réduction de la mobilité à court terme, le déséquilibre, la perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation pour l'étude histologique
Remplacement
En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives. A notre connaissance, seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent aux questions scientifiques posées par notre étude. Le recours donc au modèle animal « souris » est indispensable pour la réalisation de cette étude qui nécessite une évaluation comportementale et un ciblage de neurones spécifiques. Aucun modèle in vitro ne peut reproduire de telles conditions. Cependant, nous avons réalisé des études pilotes chez le xénope pour mettre au point les protocoles et s’assurer de leur fonctionnement avant de les adapter à la souris.
Réduction
Avant la mise en place de ce projet, nous avons réalisé des expériences pilotes pour la mise au point des injections spinales cervicales afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux du projet. La réduction du nombre d’animaux a été prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique. Le nombre maximal, en prenant en compte les variations expérimentatles, ne dépasse pas ainsi 15 animaux par groupe pour l’étude fonctionnelle et 8 par groupe pour l’étude anatomique. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles, ce qui permet d’inclure tous les animaux des portées.
Raffinement
Tous les protocoles sont réalisés par des experts dans le domaine et sont ainsi optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. Les animaux sont hébergés en cage collective avec enrichissement du milieu (tunnel, maisonnette, cellulose pour le nid). L’utilisation d’anesthésique et d’analgésiques est prévue pour soulager les douleurs post-chirurgicales. De plus, de la nourriture enrichie est fournie pendant au moins 3 jours suivant la chirurgie. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après la chirurgie jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place d’une réhydratation, un réchauffement, des traitements vétérinaires si besoin.Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter la souffrance des animaux, pour cela, les animaux seront suivis régulièrement pour détecter d’éventuels signes cliniques (perte de poids, apparence physique, comportements provoqués/non provoqués). En plus des points limites spécifiques sont déterminés suite à la chirurgie (poids, mobilité, respiration) et ce pendant 3 jours après la chirurgie. Les sutures seront particulièrement surveillées pendant la première semaine et seront reprises en cas d’ouverture.
Choix des espèces
Cette étude nécessite d’agir sur des neurones dont les modifications génétiques ne sont maitrisées n’existant que chez la souris, d’où le choix de cette espèce. Nous utiliserons des animaux adultes âgés de minimum 8 semaines et n’excédant pas 6 mois pour des raisons de conservation de mobilité optimale car nous nous interressons à l’organisation des réseaux locomoteurs matures et fonctionnels.
Effets d’une thérapie ciblée dans des modèles murins de tumeurs à cellules squameuses
- Recherche appliquée
- Cancers
Trois injections intraveineuses par semaine pendant trois mois, une injection de chimiothérapie par semaine sur la même période, des tumeurs mesurées deux à trois fois par semaine : 780 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Des cellules cancéreuses humaines leur sont greffées sous la peau, des plaies peuvent s'ouvrir sur les tumeurs et s'infecter, et la chimiothérapie provoque chez certaines un affaiblissement important avec forte perte de poids. Le projet teste un anticorps seul ou associé à une chimiothérapie contre des cancers de l'épiderme, un essai clinique avec cet anticorps étant déjà à l'étude. Le porteur retient la souris immunodéficiente précisément pour que son système immunitaire, amputé d'une partie de ses cellules, n'élimine pas les cellules humaines greffées.
Objectifs
Les cancers de l’épiderme (à la surface de la peau) sont des cancers qui touchent principalement les cellules squameuses (cellules qui se détachent au fur et à mesure que de nouvelles se forment) au niveau de la tête, du cou et des poumons entre autres. Le taux d’incidence de ce type de cancer a augmenté de 200% sur les 30 dernières années avec 1,8 millions de cas diagnostiqués chaque année malgré les campagnes de prévention. Sans traitement mis en place, les tumeurs peuvent se développer dans des couches plus profondes et engendrer des métastases dans d’autres parties du corps. Actuellement le traitement de choix contre ce genre de tumeurs est principalement différents types de chirurgie d’ablation des tumeurs lorsqu’elles sont détectées de manière précoce et possibles puis en combinaisons ou non avec de la radiothérapie, de l’immunothérapie et/ou de la chimiothérapie. Néanmoins, une proportion importante de patients ne répondent pas ou rechutent suite à ces traitements. Il convient donc de développer de nouvelles alternatives thérapeutiques offrant une nouvelle option aux patients atteints de stade avancé de la maladie. L'objectif principal de ce projet est d’étudier l’effet d’un anticorps (ciblé contre une protéine) seul ou en association avec une chimiothérapie sur le développement de certaines formes de cancers de l'épiderme dans des modèles cellulaires humains greffés chez la souris.
Bénéfices attendus
L'hypothèse de ce travail est que la protéine ciblée par notre anticorps joue un rôle dans le développement des cancers de l’épiderme. Ceci est basé sur l'expression de cette protéine ciblée dans les tumeurs de patients atteints de cette maladie. Dans le cadre de cette étude, l’effet anti-tumoral de notre anticorps seul ou en combinaison avec une chimiothérapie sera évalué dans des modèles de souris. Un projet d’essai clinique portant sur le traitement de ces cancers avec cet anticorps est actuellement à l’étude. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement de cet anticorps sur ce type de cancer et de son fonctionnement en association avec des chimiothérapie (si l’anticorps est capable d’améliorer l’effet des chimiothérapies). Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.
Procédures
Toutes les souris prévues dans le protocole subiront différentes manipulations 2 à 3 fois chaque semaine pour des prises de poids, les mesures des tailles des tumeurs pendant 3 mois. Mais aussi des injections intraveineuses d'anticorps = traitement (3 injections par semaine pendant 3 mois) et/ou des injections dans l’abdomen de chimiothérapie (1 injection par semaine pendant 3 mois). Mais aussi une seule injection sous-cutanée de cellules cancéreuses en début de protocole. 3 prises de sang réalisées par du personnel qualifié représente un stress de 1 à 2minutes et les volumes de sang prélevés sont inférieurs aux volumes maximums recommandés avec une semaine de récupération entre chaque prise de sang.
Impact sur les animaux
Dans les trois procédures il est possible d’observer l’apparition de plais sur les tumeurs à la surface de la peau qui peuvent dans de rares cas provoqués des infections. Dans les traitements avec chimiothérapie, un affaiblissement important de l’organisme associé à une forte perte de poids peut être observée chez certains individus. Toutes les souris prévues dans le protocole subiront différentes manipulations chaque semaine pouvant engendrer un stress pour des prises de poids et le suivi de la croissance tumorale. Le stress liés aux injections intraveineuses d'anticorps dure moins d’une minute ainsi que moins de 20 secondes pour les autres injections et la douleur est restreinte aux quelques secondes de la piqûre. 3 prises de sang seront réalisées seulement dans la dernière procédure et nécessitant une contention et donc un stress de 1 à 2 minutes ainsi qu’une douleur restreinte au moment de la piqure. Dans de rare cas ces prises de sangs peuvent entrainer des saignement anormales (volume plus important ou de l’oreille ou du nez). Ces nuisances sont diminuées par la mise en place de précautions spécifiques à chaque geste.
Devenir
Tous les animaux porteurs de tumeurs seront donc mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet.Les animaux non porteurs ne pourront pas être réutilisés et devront également être mis à mort en cas de développement de tumeurs de manière tardive.
Remplacement
Les cancers de l’épiderme nous intéressent pour la diversité des cellules qui les composent ainsi que toutes les interactions entre elles = microenvironnement tumoral. Ces éléments sont nécessaires à la compréhension des mécanismes d’action de notre thérapie ciblée. Les modèles retrouvés dans la littérature montrent que cette diversité n’est pas retrouvée dans les cultures cellulaires (qui contiennent en général un nombre très limité de types cellulaire différents) mais uniquement dans les greffes de cellules cancéreuses chez la souris où l’on retrouve un microenvironnement tumoral complet avec tous les types cellulaires comme les cellules cancéreuses, les cellules immunitaire, les cellules des tissus touchés par ce type de cancer.
Réduction
Tout d'abord nous testons 6 lignées cellulaires cancéreuses de cancer de l’épiderme (3 groupes de 2 qui forment des tumeurs à des endroits différents) pour voir si une fois injectées chez la souris elles forment des tumeurs. Nous nous basons sur des données de la littérature scientifique pour décider du nombre de cellules injectées. Nous utilisons 5 souris par lignée cellulaire injectée à 2 endroits différents pour tester la prise tumorale de 10 tumeurs tout en utilisant moins de souris. Dans le cas où aucune tumeur ne se forment, 5 nouvelles souris par lignée cellulaire pourront être utilisées pour tester une nouvelle condition de prise tumorale. Les lignées cellulaires n’ayant montré aucune croissance tumorale ne seront pas utilisées pour les prochaines procédures, ce qui limitera donc le nombre de conditions testées. Une nouvelle procédure permet cette fois-ci de tester l’efficacité de notre anticorps en combinaison ou non avec une chimiothérapie sur la croissance tumorale. Pour cela et selon des tests statistiques nous aurons besoin de 15 souris par groupe de traitement. Nous testerons 4 groupes de traitement différents. Si les des 2 groupes de traitement contenant notre anticorps ne montrent aucune efficacité antitumorale dans cette procédure sur une lignée cellulaire, celle-ci ne sera pas testée dans la dernière procédure conduisant à une nouvelle réduction du nombre d’animaux. Enfin une dernière procédure permettra de répéter le schéma de traitement précédent en mettant fin au protocole de manière plus précoce (arrêt de la procédure à partir d’un volume tumorale 3 fois inférieur à la procédure 2) dans le cas d’efficacité antitumorale de notre anticorps afin de nous permettre d’étudier les mécanismes d’action de cette thérapie dans les temps précoces du traitement.
Raffinement
A leur arrivées les animaux ont une période d’habituation à leur nouvel environnement d’hébergement et aux expérimentateurs qui vont suivrent le protocole. Les souris seront élevées et hébergées par groupes, avec un milieu enrichi pour favoriser la nidation (maison en carton, coton). Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux (pesées, mesure de la croissance tumorale etc.) plusieurs fois par semaine permettra la recherche de tout signe de souffrance. Toutes les souris immunodéficientes (manque d’une partie de leurs cellules immunitaires) sont hébergées en cage ventilée et manipulées sous hotte qui leur permettent de rester dans des zones stériles limitant les risques d’infections de ces souris plus fragiles que les autres. Des points limites adaptés sont mis en place au-delà desquels, si aucun moyen de correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort. Toutes les injections et les mesures de croissance tumorale sont réalisées par du personnels qualifiés afin de réduire au maximum le temps de manipulation et le stress des animaux. Une prise de sang réalisée par du personnel qualifié représente un stress de 1 à 2minutes et les volumes de sang prélevés sont inférieurs aux volumes maximums recommandés avec une semaine de récupération entre chaque prise de sang.
Choix des espèces
La souris immunodéficiente (manque d’une partie des cellules immunitaires) est le modèle le plus approprié pour injecter des cellules cancéreuses humaines et éviter que le système immunitaire de la souris ne s’en prennent à ces cellules et les élimine. Par ailleurs les schémas d'administration des anticorps et chimiothérapies sont bien standardisés chez la souris (voie, doses, et fréquence des injections) contrairement à d'autres modèles animaux. De plus la protéine étudiée dans ce projet n'est pas exprimée dans toutes les espèces. On retrouve une forte ressemblance entre la forme humaine et murine, justifiant encore l'usage des souris. En dernier lieu, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils destinés à l'analyse des tumeurs qui n'existent pas tous pour d'autres espèces que l'homme et la souris. Les expérimentations seront effectuées sur des souris adultes.
Evaluation de la pathogénicité des anticorps anti HMGCR et anti SRP dans un modèle murin de myopathies nécrosantes auto-immunes
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
55 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant sept jours des injections quotidiennes d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de patients atteints de myopathie nécrosante, subissent trois microprélèvements de sang et deux tests de force par traction, avant le prélèvement de leurs muscles gastrocnémiens. L'objet du projet est de vérifier si les anticorps de quatre nouveaux malades déclenchent bien la maladie chez la souris, pour disposer d'un modèle où tester des médicaments. Le porteur écrit que l'atteinte musculaire n'a pas de répercussion visible en termes de souffrance ou de perte de poids, tout en prévoyant une gêne de la mobilité du train arrière et un traitement antidouleur quotidien pour tous les lots.
Objectifs
Au sein des myopathies inflammatoires, les myopathies nécrosantes auto-immunes (MNAI) sont définies histologiquement par la présence d'une importante nécrose des fibres musculaires sans infiltrat inflammatoire. La nature auto-immune des myopathies nécrosantes a été suggérée par leur association fréquente à la présence d'autoanticorps (aAc) anti-Signal Recognition Particle (SRP) ou, plus récemment, d'aAc anti-3-hydroxy-3-méthylglutaryl- Coenzyme A réductase (HMGCR) et la corrélation de leur titre avec le myolyse. Notre laboratoire a établi un modèle murin de MNAI par injection à des souris C57BL/6J d'IgG purifiées issues de patients porteurs d’aAc anti- HMGCR ou anit-SRP. Ce transfert induit une myopathie clinique avec diminution de la force musculaire associée à un dépôt d’IgG et de C5b-9 (ensemble de protéines formant un pore dans la membrane) à la surface des fibres musculaires, démontrant le caractère directement pathogène des aAc et suggérant un rôle cytotoxique exclusif du complément. Ce modèle nous a permis récemment de tester de nouvelles thérapies avec succès. Cependant, les aAcs de certains malades n'induisent pas de myopathies chez la souris pour des raisons inexpliquées. Les IgG anti-HMGCR et anti-SRP sont purifiées à partir de plasmaphérèse de patient qui sont extrêment rares à obtenir. En relation avec différents hôpitaux en France, nous avons réussi à obtenir des plasmaphérèses de 4 nouveaux malades. L'objectif général de notre programme est d'évaluer la pathogénicité des anticorps de ces nouveaux patients dans le but de les utiliser en cas de résultat positif dans des protocoles d'évluation de l'efficacité de nouveaux médicaments. L’étude des animaux se fera par (i) une observation clinique (suivi du poids), (ii) une mesure de la force musculaire chez l’animal anesthésié et (iii) par une analyse sanguine et des tissus musculaires.
Bénéfices attendus
Lors de précédents protocoles expérimentaux avec ce modèle animal , nous avons pu démontré l'efficacité de molécules thérapeutiques dans (i) l'apparition et (ii) le traitement de la myopathie. Cela s'est traduit par respectivement (i) une absence d'atteinte histologique et de diminution de la force musculaire et (ii) par une réduction significative de l'atteinte histologique et une restauration de la force musculaire. Les plasmaphères de pateints sont rares et épuisables. La possibilité de disposer de nouvelles sources d'anticorps de malades permettra de tester de nouvelles molécules thérapeutiques qui ne peuvent pas être testées dans les modèles in vitro que nous développons parallèlement.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à 3 microprélèvements de sang, d'une durée de moins de 5 secondes chacun. Les souris seront injectées quotidiennement en IP durant 7 jours soit 7 injections d'une durée de moins de 10 secondes chacun. 2 grip test seront réalisés pour chacune des souris à 8 jours d'intervalle, durée moins de 10 secondes. Les gastrocnémiens de tous les animaux seront prélevés sur les souris euthanasiées en fin de protocole.
Impact sur les animaux
L'injection d'anticorps de malades atteints de MNAI chez la souris entraine l'apparition d'une myopathie se traduisant par une diminution de la force musculaire. L’expérience acquise lors de précédents protocoles expérimentaux autorisés avec ce modèle animal a montré que l'atteinte musculaire n'avait pas de répercution visible chez l'animal en terme de souffrance ou de perte de poids. Lors des injections IP les souris pouront ressentir un peu de stress du à la contention et l'injection en elle même, mais qui sera de très courte durée. Pour les souris de l'étude qui développeront une myopathie consécutive à l'action pathogéne des anticorps testés une gêne dans la mobilité du train arrière pourra être observée.
Devenir
Le prélèvement des gastrocnémiens pour analyse histologique ne permettra pas de maintenir les animaux en vie.
Remplacement
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable pour l'évaluation de la pathogénicité des anticorps de malades dans une perspective d’approche à visée thérapeutique. Il n’existe actuellement pas de modèles in vitro pour une telle étude combinée de la réponse humorale et de la physiologie du muscle. Ce projet ne peut donc être réalisée que chez l'animal.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été réduit à son minimum grâce l'expérience acquise lors d'autre protocoles expériementauxautorisés utilisant ce modèle murin de myopathie par transfert d'aAcs chez la souris. L'analyse rétrospective des résultats obtenus a permis de faire un calcul statistique excat des effectifs nécessaires. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum en tenant compte également de la variabilité des mesures de la force musculaire, ainsi que de la variabilité des réponses notamment immunologique obervées lors de ces protocoles.
Raffinement
L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées : température, hygrométrie, cycle jour/nuit, change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de celllose et des fibres de coton. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Une échelle de gravité des symptômes observés a été établie et permet de déterminer un point limite dans l’ensemble des expériences. Elle permettra également d’évaluer la douleur des animaux et de mettre en place une procédure visant à la limiter. En effet, les animaux seront observés quotidiennement et l'apparition de signes cliniques, poils hirsutes, perte de poids visible (sans pesée) ou prostration ou lorsque le score 1 de l’échelle de gravité des symptômes seront atteints entraineront la mise en place de des dispositions pour réduire la douleur (conférer paragraphe suivant). Un traitement préventif quotidien (par voie orale) de la douleur sera mis en place pour les animaux de tous les lots. En cas de douleur, un traitement en sous cutané (s.c) sera administré. Le protocole sera arrêté lorsque le score 2 ou le point limite qui a été défini seront atteints. Un analgésique sera administré 30 minutes avant la mesure de la force musculaire in situ (injection en s.c).
Choix des espèces
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Il permet également de n'utiliser que de faibles quantités d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de malades qui sont difficiles à obtenir. Animaux âgés de 8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature.
Maintien d’un élevage de tiques Ixodes ricinus
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Lapins : 8
Réutilisés jusqu'à trois fois, 8 lapins sont utilisés pour nourrir des tiques déposées sur leurs oreilles sous anesthésie, cinquante nymphes ou dix couples d'adultes par oreille, avec une collerette maintenue pendant le gorgement. 200 souris reçoivent chacune cinquante à cent larves et restent isolées jusqu'à sept jours avec un enrichissement appauvri, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les souris sont tuées après la collecte des tiques, faute d'être réutilisables ou adoptables selon le porteur, alors que quatre lapins sont réutilisés et quatre adoptés. Sur le remplacement, il décrit des systèmes de gorgement artificiel jugés prometteurs mais pas encore prêts, avec 57 % de femelles pondeuses, et annonce une veille documentaire régulière.
Objectifs
Le but de ce projet est de maintenir une lignée de tique, afin de disposer de lignées de laboratoire au fond génétique commun. Ces tiques constituront un matériel pour : - Analyser la transmission de différents microorganismes aux animaux. En effet, bien que l'inoculation des microorganismes soit possible à la seringue, celle-ci reproduit de façon très imparfaite la transmission des agents infectieux par les tiques et ne permet pas de l’étudier. - Elles permettront également d’analyser les déterminants susceptibles de provoquer une attractivité plus importante des tiques chez certains individus.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de maintenir pour fournir des tiques possédant un fond génétique commun afin de réaliser plusieurs expériences dont les principaux axes sont les suivants : - Étude des déterminants favorisant l’attractivité des tiques. Chez les moustiques, une attractivité différentielle entre individu a été mise en évidence. En effet, certains individus sont plus « attracteurs » que d’autres définissant ce que l’on peut appeler une « peau à moustiques ». Les déterminants chimiques de cette attractivité sont en partie connus et seraient liés au microbiote cutané. Empiriquement, une attractivité différentielle entre individus est observée pour les tiques. Les déterminants de cette dernière demeurent inconnus. Un des buts de l’élevage est d’étudier les déterminants de cette activité in vitro en utilisant les tiques de l’élevage. - Mesure de la compétence vectorielle et analyse de la transmission des microorganismes. Les tiques hébergent différents microorganismes susceptibles d’être transmis à l’homme. Disposer de tiques de laboratoires dont le fond génétique est commun et maitrisé permet de savoir si ces microorganismes sont d’abord effectivement transmis lors du repas sanguin, c’est-à-dire si cette espèce est un vecteur compétent. Une fois la compétence vectorielle affirmée, nous nous intéresserons aux modalités de cette transmission (localisation des microorganismes lors des phases de diapause des tiques ou lors du repas sanguin), ainsi qu’aux déterminants permettant cette transmission. Pour cela les tiques seront nourri sur animaux porteur du microorganisme d’intérêt. Ces projets feront l’objet d’autorisations spécifiques séparées de la présente saisine.
Procédures
- Lapin : dépôt des tiques (50 nymphes ou 10 couples d’adultes/oreille) confection du manchon en tissu et fixation à l’aide d’un sparadrap médical. Gestes réalisés sous anesthésie générale (protocole décrit dans la procédure - Souris : dépôt des tiques (50 à 100 larves/individu) sur animal vigile. La durée de gorgement est de maximum 10 jours pour les lapins et de maximum 7 jours pour les souris.
Impact sur les animaux
Concernant les lapins les effets indésirables sont concomitants au repas sanguin, des réactions inflammatoires locales à la piqure de tiques peuvent s’observer jusqu’à 4 semaines après le repas sanguin : - inconfort lié au port de la collerette - irritation du cou à cause du port de la collerette et irritation de la base des oreilles - au site de piqure, les tiques peuvent provoquer une réaction inflammatoire locale susceptible de démanger le lapin. - Les procédures peuvent induire de la fièvre. Concernant les souris, les effets indésirables sont concomitants au repas sanguin et correspondent à des réactions locales inflammatoire à la piqure des tiques. A noter que lors du repas sanguin (5-7 jours) les souris seront isolées avec un enrichissement apauvri. Un tunel transparent et un barreau à rongé seront néanmoins à leur disposition.
Devenir
Concernant les lapins, il n'ont pas été en contact avec des tiques porteuses de microorganismes, les lapins peuvent petre adoptés. De plus, ils ont été en contact avec l'homme pendant leur vie. Il font d'excellent candidats à l'adoption. Concernant les souris, elle ne peuvent être réutilisée et son difficilement adoptable, elles seront donc mise à mort.
Remplacement
Les systèmes de gorgement artificiel pour tiques, bien qu'étudiés, ne sont pas encore commercialisés et présentent des limites qui empêchent le remplacement des hôtes animaux pour l'élevage de tiques. Des travaux, montrent que le nourrissage artificiel nécessite une grande expertise, avec des résultats variables avec seulement 57% des femelles qui ont pondu. Des recherches similaires confirment ces résultats sans pour autant détailler l'efficacité sur les générations successives ou le taux de développement des tiques. Les comparaisons entre les tiques nourries artificiellement et celles sur des hôtes animaux révèlent des taux de réussite inférieurs pour la reproduction et le nourrissage dans le cas d'un nourrissage artificiel. Une étude apporte une contribution significative en explorant tout le cycle d'Ixodes ricinus mais soulève des questions sur l'approche statistique utilisée et l'impact des antibiotiques sur le microbiote des tiques, un aspect crucial pour la conservation de lignées en laboratoire. En conclusion, bien que prometteurs pour certaines recherches, les systèmes de nourrissage artificiel ne sont pas encore prêts pour remplacer l'élevage sur animaux en laboratoire. Une veille scientifique sur le site de l’ECVAM concernant ce point sera régulièrement réalisée et présentée en SBEA.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux utilisés pour le maintien de l’élevage de tiques est minimisé au mieux. L’expérience des années précédentes sur l’élevage de tiques ainsi que l’expérience de nos collègues de Neuchatel nous permet d’estimer à 100 souris/an et 4 lapins par an pendant la durée de ce protocole. Afin de minimiser l'utilisation des lapins, ils seront utilisés 3 fois.
Raffinement
Durant la procédure, les souris sont isolées pour un maximum de 7 jours, avec des contrôles réguliers pour évaluer leur état et collecter les tiques gorgées, tout en maintenant un contact olfactif avec leurs congénères. Elles disposent d'un tunnel, d'un barreau à ronger et de coton. L'absence de douleur au point d'injection élimine le besoin d'analgésiques. Après le sevrage et avant la procédure, les souris s'acclimatent à une manipulation douce, visant à réduire le stress via des interactions et des caresses. Les souris sont euthanasiées après la collecte des tiques, sans dépasser 7 jours. Les lapins, quant à eux, suivent un entraînement bi-quotidien de 20 minutes incluant la contention, l'habituation à des manipulations et à la collerette, et l'introduction de récompenses pour encourager les comportements désirés. En outre, ils bénéficient de minimum une heure d'activité quotidienne dans un enclos de 1m² pour leur bien-être physique. Pour le dépôt des tiques, une sédation est administrée aux lapins. Cette approche assure le bien-être animal tout en facilitant les procédures expérimentales.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les hôtes naturels des larves et les nymphes de tiques. Les lièvres ou les lapins sont piqués par des tiques (toutes les stases, y compris les femelles) dans la nature. Le lapin de laboratoire constitue donc une bonne alternative pour le repas sanguin des stases nymphales et adultes et les souris permettent le gorgement à la fois des nymphes et des larves. A noter que nous allons privilégier les lapins pour les stases nymphales car ces derniers sont réutilisés et adopté au terme des procédures. Cela limite donc le nombre de souris. Age pas d’impact. Nous pourrons utiliser les animaux disponibles à l’animalerie
Colite : Evaluation de l’efficacité de composés chimiques ou biologiques sur l’inflammation du colon induite par administration d’agents chimiques ou de bactéries, par injection d’anticorps, ou par transfert de cellules chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 2000
8 000 souris et 2 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une colite leur est provoquée par du dextran sulfate de sodium dans l'eau de boisson, par instillation intrarectale d'acide trinitrobenzènesulfonique après douze à seize heures de jeûne, par oxazolone, par bactéries ou par transfert de cellules immunitaires chez des souris immunodéficientes, avec diarrhée potentiellement hémorragique et pertes de poids marquées attendues. Certains protocoles courent jusqu'à vingt-deux semaines, avec pesée quotidienne dès l'apparition des signes cliniques. Le porteur explique l'effectif de 10 000 animaux par le nombre élevé d'études prévues pour tester un grand nombre de composés, sans autre justification chiffrée.
Objectifs
La colite inflammatoire se traduit par une diarrhée chronique consécutive à l’inflammation des parois de l’intestin. Elle peut être provoquée par des bactéries, des parasites, la prise de médicaments, le traitement par radiothérapie, la rectocolite hémorragique ou la maladie de Crohn. La rectocolite hémorragique est caractérisée par une inflammation de la muqueuse et sous-muqueuse du rectum et du colon. La maladie de Crohn entraîne plus de complications, car l’inflammation peut toucher le tube digestif entier, de la bouche jusqu’à l’anus, et créer une obstruction partielle de l’intestin. La colite post-radiothérapie s’observe surtout après irradiation dans la zone abdominale et pelvienne dans le cas de traitement anti-cancéreux. Les parasites et bactéries provoquent des colites spontanément résolutives, mais certains d’entre eux peuvent produire des lésions qui ressemblent à une maladie inflammatoire primitive. Ce projet a pour but de tester in vivo des composés chimiques ou biologiques dont le potentiel anti-inflammatoire aura été déterminé au préalable dans des tests in vitro. Pour cela, il est nécessaire de disposer d’un modèle rongeur où il est possible de créer un état inflammatoire du colon tel qu’on peut l’observer chez l’homme. Actuellement, l’arsenal thérapeutique disponible, notamment les anti-inflammatoires, ne permet pas de soigner correctement ces pathologies lourdes, et de multiples interventions chirurgicales sont nécessaires pour retirer au fur et à mesure les portions lésées de l’intestin. Malgré leur efficacité, les anti-TNF doivent être utilisés avec précaution dans ces pathologies car ils augmentent la survenue de maladies infectieuses. Il existe clairement un besoin thérapeutique pour soigner les colites inflammatoires. Pour réaliser ce projet, un travail important est réalisé au préalable in vitro sur des cellules humaines, ceci dans le but de sélectionner les meilleures molécules à progresser. Cependant, étant donnée la complexité des mécanismes impliqués dans les pathologies inflammatoires du colon, il est difficile de prédire le potentiel thérapeutique d’une molécule uniquement sur la base de résultats in vitro. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit les différents aspects de ces maladies, afin de pouvoir évaluer in vivo les meilleurs composés identifiés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur plusieurs maladies inflammatoires digestives : maladie de Crohn, rectocolite hémorragique, colite ulcéreuse... A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies pour laquelle les options sont pour le moment limitées et imparfaites.
Procédures
Une colite pourra être induite par l’administration de Dextran sulfate sodium dans l’eau de boisson des animaux pendant 7 jours, combiné ou non à des anticorps (2 injections/sem, 5min par injection). Ces études dureront au maximum 4 semaines. Il est aussi possible d’administrer le DSS dans l’eau de boisson 3x5 j, avec 5 j sans DSS entre les cycles. Ces études dureront au maximum 8 semaines. Le Trinitrobenzenesulfonic acid pourra aussi être administré 1-2xpar voie intra-rectale (anesthésie générale, 1h), après 12-16h à jeun. Ces études dureront 2 semaines au maximum. L’oxazolone pourra être administrée 1x par voie sous cutanée ou topique, puis par voie intrarectale 1x. Des bactéries Citrobacter Rodentium (administration durant 5min) pourront être administrées. Ces études dureront au maximum 3 semaines. Chez des souris immuno-déficientes, le modèle aigu de colite (8 jours) est induit par administration d’un anticorps (injection unique, 5 minutes). En utilisant les mêmes souris immuno-déficientes, un modèle chronique de colite est inductible par injection de cellules immunitaires humaines ou murines (5min). Les études dureront au maximum 16 semaines. Des modèles de souris développant spontanément une colite peuvent aussi être utilisés. Ces études dureront au maximum 22 semaines. Les animaux seront pesés 2x/sem avant induction, puis une fois par jour à partir de l’induction ou de l’apparition des signes cliniques dans les modèles spontanés (5 minutes). Des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par voie: intranasale et intratrachéale ou intrarectale (animal vigile, 5min, ou anesthésie, 1h), intramusculaire et intradermique (anesthésie, avec analgésie, 1h), orale sur animaux vigiles (1 minute), sous cutanée et intrapéritonéale (anesthésié, 1 heure, ou vigile, 1 minute), ou par minipompe osmotique posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (anesthésié 1 heure). Des prélèvements de sang ou d’urine ou de fécès pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 1 heure si anesthésie). Des biopsies de peau pourront éventuellement être réalisées, sous anesthésie générale avec analgésie (1h30). Des endoscopies digestives pourront être réalisées, avec 12h à jeun, sous anesthésie générale (1h max). Les animaux pourront être mis à jeun avant et pendant l’administration puis la digestion de Dextran Isothiocyanate de fluorescéine (FITC) afin de mesurer la perméabilité digestive (à jeun total 12h).
Impact sur les animaux
Dans ces modèles de maladies inflammatoires digestives, de la diarrhée, potentiellement hémorragique, est attendue. Des pertes de poids marquées sont attendues. Les animaux pourront recevoir des traitements par toutes voies et avec toutes les fréquences d’administrations possibles, dans le respect des recommandations vétérinaires. Des prélèvements de sang pourront être effectués dans le respect des recommandations de voies et de volume. Pour induire la colite, les animaux pourront recevoir du TNBS ou de l’oxazolone par voie intrarectale, une à deux fois, après mise à jeun 12 à 16H. Des endoscopies pourraient être réalisées, sous anesthésie générale, avec mise à jeun de 12h. Dans le cas où du Dextran FITC serait administré, les animaux seront mis à jeun 12h maximum.
Devenir
Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération de la peau et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.
Réduction
Le nombre minimum suffisant permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt est systématiquement utilisé. En pratique, ces nombres ont été déterminés sur la base de la littérature sur le sujet et d’expériences préalables dans nos laboratoires. Dans tous ces modèles sauf l’oxazolone, il a été démontré que 8 à 11 animaux sont nécessaires en fonction des paramètres d’intérêt, afin d’observer des différences sur ces paramètres, sauf dans les modèles spontanés sur souris transgéniques dans lesquels 10 à 12 animaux seront nécessaires. Pour l’oxazolone, il faudra entre 10 et 20 animaux par groupe selon les paramètres à mesurer post mortem. Le nombre élevé d’animaux prévu est lié au nombre d’études élevé prévu pour tester un grand nombre de composés et de schémas d’administration et au nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, le maximum d’analyses compatibles sera effectué sur les mêmes tissus afin d’éviter de multiplier les animaux nécessaires. Afin d’éviter de multiplier les groupes contrôles, dans la mesure du possible si plusieurs composés doivent être testés ils le seront au cours de la même étude.
Raffinement
La diarrhée et le sang dans les selles seront suivis quotidiennement à partir de l’induction. Dans les modèles spontanés, ils seront suivis deux fois par semaine jusqu’à apparition des signes cliniques puis une fois par jour. Le poids des animaux sera suivi deux fois par semaine jusqu’à l’induction puis une fois par jour. Dans les modèles spontanés, le poids sera suivi deux fois par semaine avant apparition de signes cliniques / pertes de poids puis une fois par jour dès l’induction. Les actes douloureux seront réalisés avec analgésie. Les actes moins stressants (autres administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction des maladies et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.
Choix des espèces
-L’administration du DSS ou du TNBS peut être réalisée sur des souris ou des rats, et est très bien documentée dans la littérature. -Pour créer un modèle de colite d’origine auto-immune, il faut utiliser des souris immuno-déficientes qui ne possèdent pas de lymphocytes T et B matures. -Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées à minima sur une espèce rongeur (rat ou souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie et la dose toxique dans la même espèce. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), étant donné que les modèles d’inflammation digestive d’intérêt sont bien décrits dans la littérature sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines.
Rôle d’un facteur de transcription dans la réponse à l’exercice physique et à un régime hyperglucidique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Contraintes de courir sur un tapis roulant sous stimulations électriques, jusqu'à cinquante par séance, 90 souris subissent aussi un test de tolérance au glucose avec injection dans l'abdomen et scarification de la queue. 42 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 48 d'un niveau léger, et toutes sont tuées pour prélever six organes chacune. Le gène étudié n'est jamais nommé dans le résumé, désigné seulement comme un facteur de transcription induit par l'exercice et par le glucose. Le porteur qualifie la stimulation électrique de désagréable sans être douloureuse, et affirme que l'eau sucrée n'induit aucun stress, la stéatose hépatique qu'elle provoque étant selon lui asymptomatique.
Objectifs
La sédentarité est un facteur de risque pour de nombreuses pathologies, et l’activité physique s’impose de plus en plus comme un moyen de prévenir et/ou de contribuer à guérir des pathologies telles que les maladies métaboliques (diabète, stéatose hépatique non alcoolique ou ‘‘maladie du soda’’), et les cancers. Le muscle squelettique capte l'essentiel du glucose sanguin après un repas, c'est donc un organe clé dans le contrôle de l’homéostasie glucidique. Cette captation de glucose dépend du type de muscle (glycolytique ou oxydatif), elle est augmentée par l’exercice physique alors qu’elle est altérée dans le cas de maladies métaboliques comme diabète et l’obésité. Le projet de recherche a pour but de déterminer le rôle d’un gène induit par l’exercice physique et le glucose dans la performance physique, le métabolisme musculaire et l’homéostasie métabolique de l’organisme.
Bénéfices attendus
Ce projet est pleinement justifié d'un point de vue scientifique et respecte la règle des 3R. Il a pour but d'étudier le rôle d'un gène dont l'expression varie au cours de la journée, dont l'expression est augmentée par l'exercice physique et par le glucose, et qui joue un rôle dans le métabolisme glucidique et lipidique et dans la physiologie du muscle squelettique. Ce projet devrait permettre d’évaluer le rôle de ce gène musculaire dans la performance physique en fonction du temps de la journée, et d’identifier les gènes régulés par l’augmentation de l’expression de ce gène, soit lors de l’exercice physique, soit lors d'un régime sucré dans différents muscles glycolytiques et/ou oxydatifs. La physiologie musculaire jouant un rôle important dans l'homéostasie métabolique systémique, ce projet permettra également de déterminer le rôle de ce gène musculaire dans la régulation de la glycémie., Sur la base des résultats obtenus, nous pourrons étendre le projet à l’étude des voies de régulation et des processus métaboliques les plus affectés par la délétion de ce gène dans le muscle squelettique.
Procédures
Pour le test de performance physique, les souris reçoivent des stimulations électriques de l'intensité la plus faible. Pour le test de tolérance au glucose, durée 2h, chaque souris subit une injection intrapéritonéale de glucose au début du test et une seule scarification à la queue pour prélever une goutte de sang.
Impact sur les animaux
Il y a peu d’effets indésirables concernant le test de performance physique car il sera effectué pendant la phase active nocturne des souris. L'intensité de la stimulation électrique utilisée pour contraindre les souris à courir est la plus faible. Elle est désagréable mais n'induit pas de douleur. En ce qui concerne le challenge nutritionnel, l’ajout de glucose-fructose dans l’eau de boisson conduit à une prise de poids modérée ainsi qu’à une stéatose hépatique une résistance à l’insuline asymptomatiques et n'induit donc aucun stress ni aucune douleur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes
Remplacement
Nous avons utilisé un modèle cellulaire de myotubes (cellules C2C12) pour montrer que l’expression du facteur de transcription d'intérêt est induite rapidement et fortement par le glucose. De plus nous collaborons avec d'autres équipes afin d’analyser les fibres musculaires isolées et d’établir un modèle mathématique multi-échelles d’organisation et de fonctionnement des muscles.
Réduction
Nous prélevons 4 muscles (EDL, gastrocnemius, soleus, tibialis antérieur) ainsi que d’autres organes impliqués dans l’homéostasie métabolique (foie, tissu adipeux) chez chaque souris et à partir de ces différents organes nous allons réaliser une analyse transcriptomique, et une analyse des fibres musculaires. Comme nous prélevons 6 tissus/organes à partir de chaque souris, nous réduisons le nombre d'animaux par 6. Une collection d’échantillons d’ARN sera constituée et réutilisable dans le cadre du prolongement de ce projet ou pour d’autres projets. Les données brutes de transcriptomique seront déposées dans un entrepôt de données publiques (ENA, EBI). Les effectifs sont élaborés à partir d'expériences antérieures d'une autre équipe de recherche avec laquelle nous collaborons. Nous utiliserons ensuite des tests non paramétriques pour analyser les résultats.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnement enrichi varié (dôme, briquette en bois, frizzoti pour nidification) , en groupes sociaux et en accord avec la réglementation en vigueur. Le suivi sanitaire effectué chaque jour ouvré par les animaliers permet de déceler tout signe de souffrance ou d’angoisse. En amont de chaque procédure, des dispositions (habituation) sont prises pour minimiser tout stress aux animaux. Pour limiter le stress lié à l'exercice physique sur tapis roulant, une habituation de 10 minutes au tapis roulant sera réalisée 3 fois par semaine la semaine précédant le début du protocole. La 1ère session d'habituation consiste en une habituation à l'environnement (les souris se déplacent librement sur la ligne du tapis roulant, mise en route du tapis à très faible vitesse (les souris se déplacent en marchant). Les souris incapables de courir ne seront pas incluses dans la procédure. Nous réaliserons les séances d'entrainement et d'habituation en pendant la phase d’activité nocturne des souris. . Points limites : Lors du test de performance physique, si la souris ne court pas spontanément, mais uniquement sous la contrainte de stimulations répétées,nous arrêterons ces stimulations lorsque le nombre de 50 sera atteint. Toutefois, si la souris refuse de courir malgré la stimulation, l'expérience sera immédiatement stoppée et la souris sera considérée comme étant dans le groupe contrôleL’ajout de glucose-fructose n’induit pas de stress car les souris ont une appétence naturelle pour le sucré. Aucune souffrance n’est attendue par cette procédure qui induit une stéatose hépatique connue pour être asymptomatique chez l’homme et l’animal. Avant le test de tolérance au glucose, les souris seront régulièrement manipulées pour éviter le stress au moment du test. La mesure de la glycémie aux temps 0, 15, 30 ,60 et 120 min, se fait par dépôt d’une 1 goutte de sang sur une électrode et analyse avec un glucomètre (Abbott). La goutte de sang est obtenue par scarification de l’extrémité de la queue. Pendant la durée du test, la cicatrisation est incomplète, il n’est donc pas nécessaire de répéter le geste à chaque mesure de glycémie. Point limite : si la souris perd du poids (>10%), si elle a un comportement anormal (prostrée), elle sera euthanasiée.
Choix des espèces
1- La souris est le seul modèle chez lequel des mutants du gène d'intérêt peuvent être générés. 2- Elle est très utilisée dans les études fondamentales sur le métabolisme et permet de faire des analyses physiologiques. Le gène étudié est conservé chez l’humain. Les échantillons permettent d’obtenir assez de matériel pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Des travaux antérieurs de notre équipe et les données in vivo de la littérature sont obtenus sur des souris et les modèles génétiques des mutants de ce gène, ce qui permet de faire des comparaisons indispensables et de ne pas répéter certaines expériences. 3-Nous utilisons la souris C57Bl6J car la régulation du métabolisme est similaire chez la souris et l'humain et la souche C57Bl6J est prédisposée au maladies métaboliques. les souris seront âgées de 2-4 mois au début du challenge exercice physique car c'est à cet âge que les résultats montrant une diminution de l'endurance ont été générés. les souris seront âgées de 6 à 10 semaines au début du challenge hyperglucidique car c'est à cet âge que nous avons montré que la délétion de ce facteur de transcription hépatique aggravait la stéatose hépatique.
Etude des pathologies liées à l’âge associées à une dérégulation de SHP2-EU1/2
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
Mises à jeun six heures, injectées à l'insuline, gavées cinq jours sur sept pendant vingt-huit jours, piquées huit fois à la queue pour mesurer leur glycémie, 1 664 souris enchaînent les épreuves d'un protocole sur le syndrome de Noonan. S'y ajoutent une irradiation, une greffe de moelle osseuse sous anesthésie, 48 heures isolées en cage de calorimétrie, un test de force par traction de la queue et des tests d'équilibre et de démarche. 1 184 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 480 d'un niveau léger, et le porteur prévoit que certaines lignées créées développent des tumeurs, sources de douleur et de perte de poids. Sur ce qu'il advient d'elles, le résumé tient en une ligne, toutes sont tuées, sans un mot sur ce qui est prélevé ni pourquoi.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre la physiopathologie du syndrome de Noonan (SN), une maladie génétique relativement fréquente principalement causée par des mutations sur le gène codant la proteine tyrosine phosphatase SHP2, qui causent une trop forte activation de cette protéine. Les patients présentent de multiples atteintes développementales (malformations du cœur, du crâne, du squelette, retard de croissance), mais aussi des troubles communément retrouvés chez l’individu âgé dans la population générale : syndrome métabolique, ostéoporose, cancers du sang, inflammation systémique, faiblesse musculaire. A l’appui de ces observations cliniques, de premières données in vitro révèlent un phénomène de vieillissement accéléré (appelé sénescence) dans des cellules exprimant des formes mutées de SHP2. De même, un modèle de la maladie développé chez la souris, en mutant le gène codant SHP2 pour introduire la mutation responsable de la maladie chez l’Homme, présente ce même vieillissement dans ses tissus dès son plus jeune âge. Ces données suggèrent que l’hyperactivation de SHP2 associée au SN pourrait provoquer un phénotype de vieillissement précoce dont nous souhaitons élucider les mécanismes, et qu’en miroir, l’inhibition de SHP2 pourrait freiner le développement de maladies liées à l’âge. Les objectifs du projet sont donc - de caractériser un modèle murin du SN du point de vue des pathologies liées à l’âge et de la longévité. - d’identifier les mécanismes responsables de ce phénotype, en explorant le rôle de la sénescence, des cellules du système immunitaires et de certaines hormones, dont on sait déjà qu’elles présentent des anomalies dans le SN. - d’évaluer si l’inhibition de SHP2 permet d’améliorer les pathologies liées à l’âge.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux comprendre la physiopathologie du SN afin de proposer des stratégies thérapeutiques et un suivi adapté aux patients. Au-delà des maladies rares, ce projet pourrait permettre d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans le développement des pathologies liées à l’âge.
Procédures
-La mise à jeun des animaux pendant 6h pour normaliser la glycémie. -L’injection d’insuline et la contention associée sont réalisées une fois, durée max 15s. -Le gavage et la contention associée (durée
Impact sur les animaux
-Effets indésirables liées à l’établissement de nouvelles lignées : Certaines lignées générées dans le cadre de ce projet pourraient développer des tumeurs ce qui peut être source de douleur et de perte de poids mais pourra être anticipé par le suivi de l’expression précoce d’un marqueur fluorescent dans les cellules cancéreuses. -La mise à jeun des animaux représente un stress. -L’injection d’insuline et la contention associée sont source d’inconfort et de douleur légère au point d’injection. -Le gavage et la contention associée (durée
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés
Remplacement
Le syndrome de Noonan (SN) est une maladie génétique pour laquelle les patients portent dans toutes leurs cellules une mutation dite « gain-de-fonction » sur le gène codant pour SHP2, c’est-à-dire qui rend la protéine plus active. Les souris modèles de cette maladie développent les principaux symptômes de la maladie et représentent en ce sens le meilleur modèle d’étude de cette pathologie. Ce projet vise à mieux comprendre la physiopathologie du SN au regard du développement de pathologies liées à l’âge, ce qui nécessite un modèle intégré permettant une étude à l'échelle de l'organisme entier prenant en compte notamment des échanges hormonaux, du dialogue inter-organe et la contribution de cellules sanguines. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche. Les procédures expérimentales présentées à l’appui de ce projet ne peuvent donc pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Toutefois, des tests in vitro sur cellules en culture ont été préalablement réalisés pour limiter au maximum l'expérimentation sur l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes questions scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant à la fois sur les données bibliographiques et sur des études préliminaires déjà réalisées par le porteur du projet au cours des précédents projets. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène, des groupes de 8 animaux seront nécessaires afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Pour les suivis tout au long de la vie des animaux, 20% d’animaux supplémentaires seront prévus pour pallier des pertes d’animaux en cours de protocole. Dans un souci de réduction, le projet a été designé afin de réaliser plusieurs expériences sur les mêmes groupes dès lors qu’elles ne sont pas susceptibles d’interférer les unes avec les autres. Les tissus et organes prélevés seront collectés afin de pouvoir réaliser différents types d’analyses.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (igloo, frisure, papier) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause de bagarres ou pour certaines expériences). Les cages sont passées en revue quotidiennement et les animaux sont observés en détail au moins 2 fois par semaine pour repérer les blessures éventuelles, un comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal, maigreur, problème de dentition), et pesés 1 fois par semaine. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale et un analgésique sera utilisé en parallèle de ces procédures pour minimiser toute douleur.Les points limites sont: émaciation ou perte de poids > 20% en moins d’une semaine, hypothermie, cumul de signes de souffrance (prostration, poil hirsute, dos rond, perte d'activité, ou tout autre signe clinique jugé par le technicien expérimenté comme indiquant un état de souffrance auquel nous ne serions pas en mesure de remédier dans les 24h) atteignant un scoring >9. Ceux-ci permettront d’écarter précocement les animaux du protocole ou de les mettre à mort immédiatement en fonction de l’intensité des comportements observés et donc du niveau de souffrance.Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience.
Choix des espèces
Les modèles murins utilisés dans ce projet représentent les seuls modèles de mammifères génétiquement modifiés pour reproduire la maladie humaine SN. De plus, les souris représentent un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques, endocriniennes et cardiaques. Pour la caractérisation d’un éventuel phénotype dommageable des lignées, les animaux seront suivis dès la période de croissance (3-8 semaines). Le reste des expériences, s’agissant de suivre des pathologies liées à l’âge, sera réalisé sur des animaux adultes de 3 à 24 mois.
Rôle de la mitophagie dans les cellules myéloïdes sur le développement de l’athérosclérose liée à l’âge.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Génétiquement modifiées pour développer de l'athérosclérose, privées du récepteur aux LDL ou de l'apolipoprotéine E, 376 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 300 d'entre elles reçoivent pendant trois mois un régime enrichi en cholestérol, avec des prises de sang sous anesthésie gazeuse, et une partie est maintenue en vie jusqu'à 28 mois pour croiser vieillissement et maladie. Toutes sont tuées, le porteur listant le sang, le cœur, l'aorte, le liquide péritonéal, la moelle osseuse, le foie, la rate, les reins, le tissu adipeux, les quadriceps et les artères fémorales parmi les prélèvements attendus. Il décrit l'athérosclérose et la stéatose hépatique induites comme asymptomatiques et sans altération de la qualité de vie, tout en déclarant une souffrance modérée pour l'ensemble du projet.
Objectifs
L’athérosclérose est un facteur de risque majeur des maladies cardiovasculaires, première cause de mortalité en France. Elle se caractérise par une accumulation de graisses (lipides) au niveau des artères. En s’oxydant, ces lipides sont reconnus comme des signaux de danger par les macrophages de la paroi artérielle. Progressivement, ces macrophages vont se charger en lipides oxydés. Ceci, en entraine leur mort, contribue à la formation progressive de la plaque d’athérome et mène à l’obstruction des artères. L’âge est un facteur de risque majeur de l’athérosclérose. Pourtant, les mécanismes sont peu compris et peu étudiés. L’athérosclérose est associée à une inflammation de bas grade et au recrutement de cellules immunitaires qui jouent un rôle central dans le développement de la plaque. Les altérations de la fonction des cellules immunitaires et l’inflammation chronique constituent une piste de choix pour expliquer l’athérosclérose liée à l’âge. Les travaux de notre équipe suggèrent que l'activation des cellules myéloïdes est liée à des changements dans l’élimination des mitochondries endommagées (mitophagie). Le vieillissement est associé à un ralentissement de la mitophagie qui contribue à une altération des fonctions mitochondriales. De manière intéressante, in vitro, nous avons observé un phénotype similaire dans des monocytes et macrophages de sujets âgés. L’objectif de ce projet est d’étudier les altérations de la fonction mitochondriale et de la mitophagie dans les cellules myéloïdes dans des modèles de souris génétiquement modifiées sensibles à l’athérosclérose d’âges différents. Ces paramètres seront évalués chez des souris nourries avec un régime standard ou favorisant l’athérogénèse. Le niveau de mitophagie et la fonction mitochondriale seront modulés par des approches pharmacologiques via l’utilisation de modulateurs pharmacologiques de la mitophagie.
Bénéfices attendus
Ce projet va nous permettre de décrypter le rôle des altérations de la mitophagie et de la fonction mitochondriale dans l’athérosclérose liée à l’âge. La première stratégie mise en place permettra de caractériser en détail l’impact de l’âge et du sexe sur l’athérogénèse dans le cadre d’un régime standard ou d’un régime athérogénique. Cette caractérisation reposera sur une analyse détaillée des tissus. Ceci nous permettra de décrire avec précision les modifications de la mitophagie et de la fonction mitochondriale dans les cellules myéloïdes au cours du vieillissement et de mettre ces résultats en parallèle du degré de développement de l’athérosclérose et des critères de gravité associés. Cette étude nous permettra également d’évaluer la pertinence d’une stratégie de restauration pharmacologique de la mitophagie ou de la fonction mitochondriale pour lutter contre l’athérosclérose. Les 2 volets de cette étude permettront de déterminer si les altérations de la mitophagie et/ou de la fonction mitochondriale dans les cellules myéloïdes contribuent à l’athérosclérose liée à l’âge. Ce travail de recherche pré-clinique nous permettra également d’évaluer la pertinence du ciblage pharmacologique de cette voie. Ainsi, ce travail contribuera à améliorer la connaissance de la physiopathologie de l’athérosclérose liée à l’âge en lien avec la fonction des cellules myéloïdes et d’évaluer l’efficacité de deux nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
300 souris seront placées sous régime athérogénique enrichi en cholestérol pendant 3 mois. Les prises de sang seront réalisées sous anesthésie gazeuse de même que l’euthanasie des animaux qui seront toutes réalisées par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Le régime athérogénique enrichi en cholestérol va induire une athérosclérose et une stéatose hépatique chez les souris. Ces évènements sont asymptomatiques et ne se traduisent pas par une altération de la qualité de vie des animaux pour un régime d’une durée de trois mois. Des animaux âgés seront utilisés dans le cadre de ce projet. Il s’agit d’un processus physiologique. Dans les conditions standards d’hébergement, les animaux ne présentent aucun signe de souffrances visibles jusqu’à un âge 30 mois. Au-delà de cet âge, des cas d’altérations de l’appareil locomoteur peuvent être observés. Par ailleurs, il est également classique d’observer une perte de poids. Ce phénomène est également physiologique et non lié aux investigations mises en place.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie gazeuse pour prélever le sang, le cœur, l’aorte, le liquide péritonéal, les fémurs (prélèvement de moelle osseuse), le foie, la rate, les reins, le tissu adipeux, les quadriceps et les artères fémorales. L’objectif de tous ces prélèvements est de réduire la nécessité de reproduire ces l’expérience.
Remplacement
L’athérosclérose est une pathologie complexe faisant intervenir des interactions entre plusieurs organes et entre le métabolisme des lipides et des lipoprotéines, l’inflammation et le système immunitaire (cellules myéloïdes en particulier). Ce type de pathologie ne se développe que chez les mammifères et ne peut pas être mimée in vitro. Seule l’utilisation de modèles animaux présentant une physiopathologie de l’athérosclérose proche de celle observée chez l’Homme peut permettre une meilleure compréhension de cette pathologie. Les souris déficientes pour le gène codant pour le récepteur aux LDL (lipoprotéine de basse densité) ou l’apolipoprotéine E (apolipoprotéine présente au niveau des lipoprotéines LDL qui permet leur captation tissulaire) sont deux modèles bien décrits pour l’étude de l’athérosclérose. En effet, les souris de souche sauvage ne développent que de rares lésions athéromateuses avec un régime athérogénique. C’est pourquoi ces 2 modèles, qui conduisent à une augmentation des niveaux plasmatiques de lipoprotéines LDL sous régime athérogénique, sont classiquement utilisés. Il est par ailleurs très bien établi que la physiopathologie de l’athérosclérose dans ces modèles mime parfaitement la situation humaine sur une durée beaucoup plus courte. Par ailleurs, la souris est un modèle parfaitement adapté pour étudier les conséquences du vieillissement sur cette pathologie à l’échelle d’un organisme entier. Cette approche permet ainsi d’étudier les conséquences sur plusieurs organes en parallèle.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables en ce qui concerne la formation de lésions athéromateuses, nos études requièrent 10 animaux par groupe. Cet effectif a été établi en tenant compte de la variabilité inter-individuelle. Par ailleurs, cet effectif par groupe est en cohérence avec les nombreuses publications scientifiques basées sur l’utilisation de ces mêmes modèles animaux. La pertinence d’un tel effectif est également basée sur l’expérience acquise par notre laboratoire durant de nombreuses années avec ces modèles animaux. Afin de prendre en compte la différence de susceptibilité à l’athérosclérose liée au sexe, les expériences seront réalisées chez des souris mâles et femelles. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous n’utiliserons qu’un modèle de souris sensible au développement de l’athérosclérose pour la première partie de l’étude visant à décrire l’impact de l’âge et du sexe sur le développement de l’athérosclérose. Ces résultats seront confirmés sur le second modèle de souris sensibles à l’athérosclérose avec un nombre de groupe limité.
Raffinement
Les régimes alimentaires ne sont pas générateurs de souffrance. Néanmoins, le suivi de animaux permettra d’identifier des signes de souffrances qui pourraient survenir de manière indépendante, notamment en raison de l’âge des animaux dans certain groupe expérimentaux. Si les points limites définis sont atteints, les animaux seront immédiatement mis à mort. Le milieu d’hébergement sera enrichi avec des nids. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 à 10 animaux pour maintenir les interactions sociales.
Choix des espèces
L’utilisation de modèles murins pour étudier l’athérosclérose est nécessaire car l’athérosclérose est un processus physiopathologique complexe ne pouvant pas être modélisé in vitro et les souris génétiquement modifiées sont le modèle de référence dans ce domaine. Les similarités génétiques, développementales, physiologiques et biochimiques entre la souris et l’homme, nous permettent d’extrapoler les conclusions à l’Homme, en particulier dans le domaine de l’athérosclérose où la souris demeure le modèle pré-clinique de référence dans lequel sont testées la majorité des stratégies thérapeutiques émergentes. Ce projet vise à caractériser l’impact du vieillissement sur l’athérogénèse en lien avec un déficit de la mitophagie et/ou de la fonction mitochondriale. Ainsi, des animaux âgés de 3 à 4 mois, de 14 à 16 mois, de 22 à 24 mois et de 28 mois seront utilisés.
L’inflammasome en tant que cible thérapeutique des processus inflammatoires périphériques et cérébraux dans la maladie d’Alzheimer dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des ultrasons délivrés une minute par jour, jusqu'à cinq jours de suite, pour ouvrir la barrière qui protège le cerveau, après la pose d'un cathéter et l'injection de microbulles de gaz : 176 souris porteuses d'une modification génétique reproduisant la maladie d'Alzheimer subissent ce protocole, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi, à l'état vigile, une injection quotidienne pendant deux jours d'une protéine bactérienne qui déclenche fièvre, poil hérissé et prostration pendant trois à six heures, puis un inhibiteur censé bloquer l'inflammation cérébrale. Toutes sont tuées et leur cerveau prélevé pour analyse. Le porteur annonce des tests comportementaux étalés sur quatorze jours, dix minutes par test sur animal vigile, sans préciser lesquels.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA), constituent un problème de santé et sociétal majeur dans le monde, les causes et les nombreux facteurs contribuant à la MA sont encore mal compris, et les essais cliniques n’ont jusqu'à présent pas réussi à stopper la progression de la MA. Une meilleure compréhension des mécanismes de la MA est nécessaire pour explorer de nouvelles approches thérapeutiques. La contribution de l'inflammation périphérique et cérébrale aussi appelée « neuroinflammation », à la pathologie de la MA est établie mais reste encore mal comprise. L’inflammation peut être ciblée via l’un de ses composants critiques : l’inflammasome, et plus particulièrement par une protéine impliquée dans cette neuroinflammation. Ce projet vise: - à déterminer la contribution de l'inflammation systémique, induit par des stimuli pro-inflammatoires, à la pathologie de la MA - à établir si la protéine peut être ciblée à la fois de manière périphérique et centrale - à utiliser une approche innovante pour améliorer la délivrance cérébrale d'un inhibiteur sélectif de cette protéine en utilisant les ultrasons (US) pour ouvrir la barrière hémato-encéphalique(BHE).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont : • De valider une cible thérapeutique innovante associée à une technologie permettant d’améliorer l’efficacité potentielle de cette thérapie ; • D’apporter de nouvelles connaissances dans le domaine des neurosciences et plus particulièrement du rôle de l’inflammation et de la neuroinflammation dans la MA.
Procédures
Un groupe d'animaux recevra: une injection intra-péritonéale (IP) par jour d'une protéine bactérienne pendant 2 jours d'une durée de 20 secondes par injection. (Animal vigile) et recevra une autre injection intra-péritonéale (IP) d'une molécule inibitrice de la protéine concernée, 1 seule fois, d'une durée de 20 secondes par injection (Animal vigile). Les animaux ayant reçu les injections IP auront une séquence d'ultrasons d'une durée d'une minute: pose de cathéter en IV (1 min) puis injection de microbulles de gaz (1min) et séquence ultrasonore. (sous anesthésie gazeuse). Il auront 1 fois une injection en IP (vigile) pour une anesthésie chimique d'une durée de 20 secondes. Un autre groupe d'animaux recevra également une injection intra-péritonéale (IP) par jour d'une protéine bactérienne pendant 2 jours d'une durée de 20 secondes par injection. (Animal vigile) et recevra une autre injection intra-péritonéale (IP) d'une molécule inibitrice de la protéine concernée de J3 à J7 d'une durée de 20 secondes par injection (Animal vigile). Ces animaux recevront une fois par jour pendant 5 jours une séquence d'ultrasons d'une durée d'une minute: pose de cathéter en IV (1 min) puis injection de microbulles de gaz (1min) et séquence ultrasonore. (sous anesthésie gazeuse). Habituation de la pièce de comportement: 30 min avant les tests. Les souris auront différents tests comportementaux pendant 14 jours pour une durée de 10 min par test (animal vigile). Tous les animaux auront 1 fois une injection en IP (vigile) pour une anesthésie chimique d'une durée de 20 secondes.
Impact sur les animaux
Administration intrapéritonéale et intra veineuse: Les injections peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection et la manipulation/contention des souris peut engendrer un certain stress. La protéine bactérienne n’induit pas d’effets indésirables sévères chez les animaux, mais peut induire un état fiévreux : poil hérissé, prostration liée la fièvre (l’inflammation périphérique) induite par la protéine bactérienne pendant les 3-6h suivant l’administration. Ces symptômes disparaissent d’eux-mêmes dans les 6h suivant l’injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue du projet et leur cerveau sera prélevé pour des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Seules des études chez l’animal vivant peuvent reproduire la complexité de l’ensemble des processus physiopathologiques dans leur intégralité. De plus, il est important de noter que la méthode d’imagerie TEP (tomographie émission de positions) utilisée est intégralement transférable à la clinique et que l’étude chez l’animal nous informera de l’amplitude des différences entre groupes qui lors d’études similaires précédentes se sont révélées similaires de celles observées chez l’homme.
Réduction
L’utilisation de la méthode d’imagerie in vivo permet de réduire le nombre d’animaux utilisé (-25%) par le biais du suivi longitudinal. Le nombre total d’animaux est néanmoins dicté par les groupes expérimentaux requis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée. Ces groupes seront composés de 50% de mâles et 50% de femelles. Bien que des différences mineures de pathologie de la MA aient été notées entre mâles et femelles dans le modèle transgénique, celles-ci ne devraient pas affecter significativement les paramètres mesurés dans cette étude. Nous prévoyons ainsi d’inclure un effectif de 10 animaux/groupe (afin d’assurer un minimum de 8 animaux à exploiter, par exemple en cas d’échec de l’injection du traceur ou de mort au cours de l’imagerie), nombre qui a été suffisant lors d’études précédentes dans ce modèle. Par souci de réduction, nous n’inclurons qu’un seul groupe non transgénique comme contrôle absolu pour tous les autres groupes, puisque d’un point de vue scientifique et translationnel des animaux/patients sains ne recevraient pas de traitement. D’après notre expérience, ce groupe est néanmoins nécessaire car il y une légère augmentation de la neuroinflammation avec l’âge (notamment mesurée par un radiotraceur fluoré) chez ces souris. Dans ce projet, nous utiliserons des tests statistiques appropriées pour analyser les différents paramètres mesurés au cours de ce projet: en imagerie, le comportement, des études in-vitro.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les animaux seront observés une à deux fois par jour. Une récompense alimentaire sera donnée aux animaux après les injections pour diminuer leur stress. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par les procédures. Pendant le protocole, si nous constatons des conflits dans les cages, nous procéderons à une séparation des individus. En cas de blessures, nous appliquerons un nettoyant et un désinfectant sur la plaie jusqu’à la cicatrisation complète. Pendant le projet, le point d’injection, les expressions faciales, la posture de l’animal, la réactivité de l’animal à des stimuli externes (bruit…) seront monitorés chaque jour. Une perte de poids de plus de 15%, une réactivité anormale à des stimuli externes (bruits), une posture et des expressions associées à une souffrance de l’animal impliqueront sa mise à mort. Le jour de l'imagerie l’induction et le maintien se fera sous anesthésie gazeuse. Une protection oculaire sera appliquée. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations d’imagerie sur tapis chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés. Dès son réveil, l’animal sera remis dans sa cage d’hébergement.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix car la pathologie de la maladie d'Alzheimer (MA) est bien reproduite dans ce modèle d'animal transgénique et les processus inflammatoires lié à cette maladie dans ce modèle sont très similaire à ceux observé chez l'humain. La taille du cerveau de la souris est compatible avec la résolution spatiale de la caméra microTEP. Nous utiliserons des souris adultes car la MA ne concerne que les populations adultes/âgées.
Etude du rôle du long ARN non-codant LincPint sur la fonction endothéliale lymphatique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
Après cinq jours d'injections quotidiennes dans le ventre, des souris reçoivent des cellules tumorales, subissent une chirurgie qui provoque un lymphœdème ou l'application d'une molécule inflammatoire, puis, pour certaines, une lymphographie par injection entre les coussinets d'une patte. 280 souris femelles de 5 semaines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour récolter leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe étudie, chez des souris génétiquement modifiées qui ne l'expriment plus dans leurs vaisseaux lymphatiques, le rôle d'un ARN, LincPint, retrouvé en excès chez des patientes atteintes de lymphœdème après un cancer du sein. Le résumé ne nomme ni la substance injectée cinq jours de suite ni la molécule inflammatoire, et liste les signes surveillés, dos voûté, yeux mi-clos, poil hérissé, perte de poids, sans dire ce qui arrive à une souris qui les présente.
Objectifs
Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence qu’un Long Acide Ribo Nucléique (ARN) non traduit en protéine, LincPint, était fortement surexprimé dans vaisseaux lymphatiques au niveau les lésions. De plus, des données de la littérature ont montré que cette molécule jouait une rôle prédominant dans la croissance tumorale. Ce projet aura pour but de déterminer quel est le rôle de LincPint dans la fonction lymphatique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre certains aspects de la physiopathologie du système vasculaire lymphatique non étudiés à ce jour. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre quels sont les mécanismes de régulation génique qui contrôlent l’apparition et le développement du lymphoedème.
Procédures
Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 procédures au total. D'abord, une injection intraperitonéale par jour pendant 5 jours consécutifs est réalisée. Ensuite, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.
Remplacement
Les effets des long Acides Ribo Nucléiques (ARN) font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de ces molécules dans la fonction endothéliale lymphatique. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide d'un logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif et donc de ne pas utiliser plus d'animaux que necessaire.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Cette surveillance permet d'appliquer des points limites précis. Les paramètres contrôlés sont le dos vouté/courbé, yeux plissés/mis-clos, poil herissé et absence de toiletage, diminution des mouvements d'activité, ainsi que la perte de poids. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car il n'existe que dans cette espèce des individus génétiquement modifiés afin d'avoir les caractéristiques nécessaires à notre étude. Cette modification génétique a conduit à l'invalidation de notre molécule d'intérêt dans les vaisseaux lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.