Souris
Analyse des interactions entre cellules cancéreuses et les neurones dans un modèle d’épilepsie tumorale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Des femelles gestantes subissent une chirurgie de quarante-cinq minutes pour que leurs embryons, à 14,5 jours de développement, reçoivent une injection puis une électroporation destinées à faire naître une tumeur cérébrale. 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 128 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 16 un niveau modéré. Les souriceaux sont tués à cinq ou vingt jours de vie pour analyser les propriétés électriques de leurs tumeurs et comprendre comment les connexions entre neurones et cellules cancéreuses provoquent l'épilepsie. Le porteur affirme qu'aucun symptôme n'est attendu, les signes cliniques apparaissant après la date prévue de prélèvement, et ne justifie pas l'effectif, se bornant à indiquer que "les effectifs seront déterminés" avec des tests statistiques adaptés.
Objectifs
Le cerveau est composé de differents types de cellules et la mise en place de connexions entre elles au cours du développement embryonaire est indispensable à son bon fonctionnement. L’altération de ces connexions est à l’origine de l‘épilepsie dans des pathologies cancéreuses. L’objectif de se projet est de comprendre comment les tumeurs se dévellopent et comment les connexions entre neurones et cellules cancéreuses induisent de l’epilepsie.
Bénéfices attendus
Le but de cette étude est d’identifier de nouvelles options thérapeutiques pour les patients atteints de certaines tumeurs cérébrales et souffrant d'épilepsie. Ce type d’épilepsie est souvent reistant aux traitements existants. Donc, la découverte de nouveaux mécanismes dans ces tumeurs peut fournir de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Chirugie avec analgésie et anesthésie – 45 min, une fois. Injection sous-cutanées, 30 sec, cinq fois. Inj intra-cerebrale, 5 sec, une fois.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut être source de douleur et de stress. Dans le modèle de tumeur cérébrale, les symptômes apparaissent après le délai fixé pour le prélèvement des tissus, de sorte qu'aucun symptôme n'est attendu.
Devenir
Tous les animaux seront utilisés pour le prélèvement d'organes et l'analyse phénotypique.
Remplacement
Cette étude nécessite l'utilisation de différents types de cellules au cours d'une période embryonnaire spécifique, ce qui ne peut être fait qu'avec des animaux.
Réduction
Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés
Raffinement
Nous veillerons en continu au bien-être des animaux par l’utilisation d’analgésiques et d’anesthésiques lors de la procédure opératoire et par un enrichissement de leur environnement dans les cages d’hébergement.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le fonctionnement des circuits neuronaux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. Des femelles adultes gestantes âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées pour l'électroporation d'embryons. Les embryons sont électroporés à E14.5 et seront utilisés pour le prélèvement de tissus à l'âge postnatal 5 ou 20 afin d'étudier les caractéristiques électrophysiologiques des néoplasmes à deux stades du développement tumoral.
Etude du rôle d’EZH2 sur un modèle expérimentale de polyarthrite rhumatoïde murin
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Deux injections d'une émulsion de collagène à la base de la queue, à vingt et un jours d'intervalle, déclenchent l'arthrite, ce qui peut provoquer des grattages et des plaies. Les articulations des pattes gonflent, avec des difficultés possibles à se déplacer, à saisir et donc à se nourrir, tandis que chaque souris est contenue cinq à dix minutes par jour et soumise jusqu'à une heure trente de tests de réponse à la douleur, deux à trois fois par semaine pendant six semaines. Le porteur conclut que la mesure de la réponse aux stimulations thermiques et mécaniques est une méthode "irremplaçable" pour estimer la douleur et que la procédure présente un "caractère de stricte nécessité".
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire chronique, caractérisée par une atteinte articulaire, souvent bilatérale et symétrique, évoluant par poussées vers la déformation et la destruction des articulations atteintes. Il s’agit du plus fréquent rhumatisme inflammatoire chronique, touchant entre 0,5 et 1% de la population mondiale, et touchant 4 fois plus les femmes que les hommes. Les premiers symptômes se traduisent par des douleurs articulaires, des rougeurs et des gonflements des articulations, en particulier des mains et des pieds. A l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement de la PR, seulement des moyens de soulager la douleur ou réduire l’intensité des symptômes. Il est donc nécessaire de développer des médicaments à la fois efficaces contre la progression de la maladie mais aussi ses symptômes et notamment la douleur. Différentes études suggèrent que la modulation d’EZH2, une histone méthyltransférase, pourrait être une cible thérapeutique intéressante pour le traitement de la PR. En effet, des études in vitro et in vivo ont démontré que l’inhibition d’EZH2 permet de réduire l’inflammation dans de nombreux contextes physiopathologiques. Plus particulièrement, le laboratoire a démontré que dans des modèles murins d’arthrose, une autre pathologie articulaire inflammatoire, l’inhibition d’EZH2 par l’EPZ-6438 permet de réduire la progression de la maladie (destruction de l’articulation), et la douleur associée. Dans la mesure où, comme dans l’arthrose, l’expression d’EZH2 est augmentée dans l’articulation des patients arthritiques, il a été proposé que l’inhibition d’EZH2 pourrait réduire la progression de la PR. Dans ce contexte, le but de cette étude est d’évaluer l’effet de l’inhibition d’EZH2 dans un modèle expérimental d'arthrite afin de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et d’envisager de nouvelles pistes de traitements. Contrairement à la plupart des études pré-cliniques qui visent à évaluer uniquement la capacité de nouveaux traitements à inhiber l’inflammation et la destruction des articulations, nous évaluerons ici à la fois ces paramètres (inflammation, destruction et/ou gonflement de l’articulation) mais aussi la capacité de l’inhibiteur d’EZH2 à réduire la douleur. En effet, c’est l’intérêt clinique majeur pour les patients.
Bénéfices attendus
Plusieurs laboratoires dont le nôtre ont démontré que l’inhibition d’EZH2 par l’EPZ-6438 ralentit la progression de l’arthrose en réduisant la dégradation du cartilage et l’inflammation articulaire, et améliore les fonctions motrices des souris ainsi que la douleur, ce qui suggère qu’EZH2 serait une cible thérapeutique intéressante dans le traitement de cette pathologie articulaire. Pour cette étude, nous nous attendons à des effets comparables voire plus prononcés dans la mesure où l’arthrite est une maladie articulaire à forte composante inflammatoire. Les bénéfices attendus sont donc l’identification d’une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la PR, capable d’induire une réduction des signes cliniques (réduction du gonflement et de l’inflammation sur les pattes des animaux, réduction de la douleur/sensibilité tactile). L’EPZ-6438 étant un traitement déjà utilisé en médecine humaine pour le traitement de certains cancers, une stratégie de repositionnement du médicament dans cette nouvelle indication pourrait être envisagée.
Procédures
Les animaux recevront deux injections à 21 jours d’intervalle pour induire l'arthrite ainsi que deux injections par semaine pendant 3 semaines pour le traitement. Une contention régulière afin d’observer les animaux et les signes cliniques de la maladie seront nécessaires quotidiennement (5-10 min par jour et par animal). Des tests de comportement permettant de mesurer la réponse à la douleur seront effectués 2 à 3 fois par semaine (1h30 par jour par animal maximum) pendant 6 semaines. Un prélèvement sanguin sera effectué sous anesthésie générale avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
L’induction de l’arthrite se traduit généralement par le gonflement des articulations des pattes ainsi que par l’apparition de rougeurs. Ces gonflements, s’ils atteignent un stade élevé, peuvent induire des difficultés à se déplacer et à la préhension et donc des difficultés à se nourrir et à une réduction de la mobilité. Une perte de poids peut donc être attendue. L'injection de l'émulsion de collagène à la base de la queue peut générer une irritation conduisant la souris à se gratter au point d'injection et à former des plaies. Aucun effet secondaire ou mortalité n’ont été mis en évidence sur les souris après administration répétées d’EPZ-6438 dans la littérature.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin de procéder à des analyses des tissus.
Remplacement
Au sein de notre projet scientifique, nous étudierons l’impact d’un traitement contre la PR, une maladie inflammatoire chronique qui touchent plusieurs articulations. La physiopathologie est complexe avec l’implication de nombreuses cellules immunitaires (lymphocytes, macrophages, etc) et articulaires (chondrocytes, synoviocytes), ne permettant pas de récapituler l’ensemble des processus in vitro. Ainsi, l’impact du traitement par l’EPZ-6438 sur l’évolution de la maladie (notamment gonflement des pattes et rougeurs) ne peut pas être évalué sur un modèle ex vivo ou in vitro. De même, l’analyse comportementale et notamment l’évaluation de la réponse à des stimulations thermiques et mécaniques est une méthode irremplaçable pour estimer la douleur, que nous ne pouvons pas substituer par des méthodes alternatives. Ainsi, la procédure expérimentale décrite dans ce projet a un caractère de stricte nécessité et ne peut pas être remplacée par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Notre projet scientifique applique le principe de la réduction puisque pour déterminer le nombre d’animaux prévu pour cette étude, des tests statistiques notamment le test de puissance a été réalisé. Le nombre d’animaux requis pour l’étude a été déterminé après avoir effectué un test statistique de puissance. En se basant sur les données de la littérature correspondant à notre étude (score clinique de l’arthrite et évaluation de la douleur), l’effectif par groupe a été déterminé à 15 animaux par groupe soit un total de 180 animaux. Cependant, les données cliniques de l’arthrite indiquent que le sexe a une influence significative sur le développement de la pathologie et notamment la mise en place de la réponse du système immunitaire, nous souhaitons donc étudier l'effet du sexe. Nous prévoyons donc des groupes composés de 15 souris mâles et 15 souris femelles. Un total de 90 animaux par modèle d’arthrite est donc nécessaire. Les deux modèles d’arthrite (modèle de poussée à fort caractère inflammatoire et modèle précoce) seront étudiés. Ce projet nécessite donc un total de 180 animaux.
Raffinement
Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Des points limites ont été definis pour chaque procédure. Les gestes susceptibles d’entraîner une douleur ou un stress seront réalisés sous anesthésie et l'administration d'un analgésique est prévu pour limiter la douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum (5 souris maximum par cage, ajout de matériel de nidication et igloo en carton).
Choix des espèces
Deux souches de souris seront utilisées dans ce projet. L'injection de collagène de type II chez la souris DBA/1J entraine le développement d’arthrites sévères par réaction auto-immune, ce qui représente un bon modèle des phases de poussées de la maladie. La deuxième souche de souris mime les phases précoces de la maladie chez l’homme, avec l’apparition d’une arthrite moins sévère. Les souris utilisées sont âgées de 7 semaines, elles sont alors adultes et ont fini leur croissance.
Etude de l’efficacité de composés pharmacologiques à visée prophylactique dans un modèle murin syngénique de cancer bronchique non à petites cellules.
- Recherche appliquée
- Cancers
900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chacune reçoit une injection de cellules de carcinome pulmonaire sur le flanc, puis des administrations répétées de principes actifs, son poids et le volume de sa tumeur étant mesurés deux fois par semaine pendant quatre semaines à six mois. L'hypothèse testée est qu'un vaccin à ARN messager dirigé contre les cellules souches cancéreuses empêche la formation de tumeurs bronchiques, les essais chez des personnes à haut risque restant renvoyés au conditionnel. Le porteur justifie le choix de l'espèce par le "souci d'utiliser un nombre minimum d'animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique", et retient une implantation sur le flanc, décrite comme moins douloureuse qu'une greffe dans le poumon.
Objectifs
Le cancer bronchique est la première cause de mortalité par cancer toutes populations confondues (33 100 décès en France en 2018). Il constitue la première cause de décès chez l’homme entre 45 et 64 ans. Il s’agit du deuxième cancer le plus fréquent chez l’homme parmi les tumeurs solides (31200 nouveaux cas ; 22800 décès en 2018) et le troisième chez la femme (15100 nouveaux cas ; 10300 décès en 2018). Le pronostic associé au cancer bronchique demeure sombre, avec une survie à cinq ans de moins de 5%. Les données de la recherche convergent vers l'idée que les cellules souches cancéreuses (CSCs) sont responsables de l'échappement pharmacologique et de l'échec thérapeutique. L'hypothèse émise pour ce projet est que la mise en place d'une vaccination prophylactique à ARN messager (ARNm) contre les CSCs, en ciblant ces protéines anormales produites par ces CSCs, permettra de freiner, voire d'empêcher la formation de tumeurs bronchiques. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l'efficacité d'un vaccin à ARNm prophylactique ciblant les CSCs pour empêcher la formation de tumeurs bronchiques.
Bénéfices attendus
Un vaccin contre le cancer bronchique représenterait une avancée majeure en termes de santé publique et suscite de ce fait beaucoup d'intérêt et de recherche. En cas de résultats positifs, ce projet déboucherait sur des études cliniques testant ce même vaccin à ARNm chez l’homme, chez des patients à haut risque de cancer bronchique. Le développement d'un vaccin contre le cancer du poumon reste un objectif ambitieux, mais les bénéfices potentiels justifient largement les efforts de recherche en cours. Une telle avancée pourrait transformer le paysage de la prévention et du traitement du cancer du poumon, améliorant considérablement les perspectives de santé pour des millions de personnes dans le monde.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les souris subiront les interventions suivantes : - L’induction des tumeurs se fera selon une procédure d’injection d’une suspension de cellules tumorale, réalisée sous anesthésie. L’intervention dure environ 10 minutes et n’est réalisée qu’une seule fois. - Une administration préventive ou curative de principes actifs évalués, en aigu ou chronique, qui sera délivrée aux souris vigiles ou anesthésiés selon une voie d’administration en adéquation avec les propriétés pharmacodynamiques et pharmacocinétiques du principe actif. Un suivi du poids des souris ainsi que de l’évolution des diamètres et volumes tumoraux dont les données seront récoltées 2 fois par semaine à partir de l’injection des cellules tumorales jusqu’à la mise à mort des animaux. - La durée totale du suivi est comprise entre 4 semaines et 6 mois. Des prélèvements d’organes et de sang total ainsi que des tumeurs seront effectués à la fin de l’étude après euthanasie des animaux pour évaluer les effets des traitements sur certains tissus ou afin d’évaluer des biomarqueurs.
Impact sur les animaux
Bien que l’injection de cellules tumorales soit réalisée sur des animaux anesthésiés, une sensation d’inconfort peut apparaître chez la souris après cette procédure. De même, l’administration des composés peuvent entraîner un stress et ou une sensation d’inconfort chez les souris. Enfin, le développement de la tumeur au cours du temps ainsi que la manipulation des souris afin de mesurer la taille des tumeurs peut constituer une source d’inconfort et de stress chez les souris.
Devenir
Les animaux seront injectés en sous-cutané par une suspension de cellules cancéreuses. L’efficacité des nouveaux traitements va être évalués par l’analyse de l’évolution de la taille des tumeurs sur les animaux vivants, ainsi que les différents prélèvements de sang, d’organes ou de tumeurs obtenu une fois les animaux euthanasiés. Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude.
Remplacement
Afin de proposer une thérapie vaccinale chez l’homme, il est important de démontrer l’efficacité thérapeutique des candidats vaccin dans un modèle pré-clinique pertinent chez l’animal. Les modèles in vitro ne suffisent pas seuls à évaluer l’efficacité de ces traitements. Le modèle syngénique de progression tumorale permet d’étudier l’efficacité d’interventions thérapeutique dans un contexte de système immunitaire compétent, ce qui se rapproche le plus de la pathologie humaine. De plus, le traitement prophylactique envisagé dans cette étude vise des cibles thérapeutiques qui sont à la fois présente chez la souris et chez l’homme, augmentant ainsi la pertinence du modèle choisi.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires à ce projet a été calculé de manière à minimiser le nombre de souris tout en assurant des résultats robustes sur le plan scientifique et statistique. Le modèle animal ainsi que le protocole expérimental choisis permettent une faible variabilité inter-individuelle, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires à une interprétation fiable des résultats. Enfin, une réduction du nombre d’animaux en testant plusieurs doses à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence.
Raffinement
Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible : - Les souris sont hébergés à au moins 3 souris par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un enrichissement de leur milieu sera effectué par un ajout de frisure de papier pour leur permettre de nicher et de bûchettes de peuplier pour ronger. - Un suivi quotidien de toutes les souris sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). - Des points limites sont fixés afin que les zootechniciens puissent signaler aux responsables des soins et du projet l’apparition des critères nécessitant les traitements nécessaires pour arrêter les souffrances. - L’administration de traitements ainsi que l’injection de cellules tumorales se font sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les souris sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et notamment dans le domaine du cancer. Le choix modèle de souris syngénique de CBNPC (modèle C57BL/6), inoculée avec la lignée Lewis Lung Carcinoma a été réalisé car présentant plusieurs avantages dont : - L’utilisation d’une lignée cancéreuse syngénique (pas de rejet des cellules greffées) ainsi que la présence d’un système immunitaire fonctionnel (souris C57BL/6 non immunodéficiente) sont des conditions sin qua non à l’étude d’efficacité d’un composé vaccinal. - L’induction de tumeur au niveau d’un site ectopique (sur le flanc de la souris) est modèle expérimental est très bien décrit dans la littérature, est relativement simple à mettre en place et présente moins de risque d’induire de la souffrance comparé aux modèles par injection orthotropique. - L’utilisation de souris consanguines C57BL/6 permet de réduire la variabilité inter-individuelle et de diminuer ainsi le nombre d’animaux utilisés. Des souris adultes de plus de 8 semaines seront employées, âge auquel les organes sexuels sont à maturité pour les deux sexes. Ce choix est justifié par la littérature scientifique.
Evaluation thérapeutique de virus oncolytiques seuls ou en combinaison avec une thérapie antitumorale dans des modèles de xénogreffes et de greffes syngéniques chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
Greffées de cellules tumorales sous la peau du flanc, dans le ventre ou dans une veine, des souris peuvent développer des tumeurs qui s'ulcèrent ou se nécrosent, des métastases pulmonaires qui gênent leur respiration ou des nodules qui remplissent leur abdomen de liquide. 5 408 souris, immunocompétentes ou immunodéficientes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour tester environ neuf virus anticancéreux par an, seuls ou associés à d'autres traitements. Elles reçoivent jusqu'à trois injections de virus, un traitement antitumoral jusqu'à cinq fois par semaine pendant trois semaines et des prises de sang jusqu'à 120 jours après le virus, gestes dont le porteur écrit que chacun "ne dure que quelques secondes". Les souris greffées en surnombre, pour compenser les greffes qui ne prennent pas, peuvent être réutilisées pour former des techniciens, jusqu'à 200 en cinq ans, ou sinon tuées, et toutes celles qui reçoivent les virus sont tuées au point limite ou à la fin de l'étude.
Objectifs
Le but du projet est d’évaluer sur différents modèles de xénogreffes et de greffes syngéniques chez la souris l’activité antitumorale de nos virus candidats-médicaments seuls ou en combinaison avec des therapies antitumorales. Nos virus oncolytiques sont produits en supprimant plusieurs gènes viraux afin de diminuer la réplication du virus dans les tissus sains, tout en gardant la capacité de réplication dans les tumeurs et ainsi de limiter sa toxicité. Avant d’être testés en modèles murins, les virus candidats ont été évalués sur des modèles alternatifs, notamment par culture cellulaire sur de nombreuses cellules tumorales établies et caractérisées, ainsi que dans des cellules primaires (non tumorales). Ne seront évalués chez l’animal que les virus ayant une activité antitumorale et ne présentant pas de cytotoxicité sur les modèles alternatifs. Concernant les combinaisons avec les thérapies antitumorales, ne seront évaluées chez l’animal, que les combinaisons efficaces. En conclusion, nous testerons chez l’animal uniquement les virus candidats-médicament et les combinaisons préalablement sélectionnée avec un rapport bénéfice/risque significatif.
Bénéfices attendus
Les progrès scientifiques de ces dernières années sur la compréhension de la croissance tumorale ont permis d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la lutte contre le cancer. La mise au point de ces nouveaux médicaments n’est possible qu’en passant par des modèles animaux adaptés. Les bénéfices portent sur la mise au point des traitements plus efficaces contre les cancers chez l’homme. Les virus oncolytiques du fait de leur réplication spécifique dans la tumeur induisent moins d’effets secondaires que les traitements standards (chimiothérapies, …) utilisés aujourd’hui. A court terme, ces bénéfices porteront sur l’amélioration de la prise en charge des patients atteints de cancer et à long terme sur l’allongement de la survie des patients.
Procédures
Dans ce projet, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Implantation des cellules tumorales par injection sur animal vigile ou sous anesthésie légère puis 3 injections maximum (espacées de 30h minimum) de virus sur animal vigile puis administration d’une substance antitumorale sur animal vigile (maximum 5 fois par semaine pendant 3 semaines), un minimum de 3h est respecté entre chaque substance, - Imagerie sous une anesthésie légère, -Prélèvement de sang (espacés d'une semaine minimum et jusqu'à 120 jours après l'administration du virus). Chaque geste ne dure que quelques secondes, sauf l’anesthésie pour l’imagerie qui dure environ 15 minutes.
Impact sur les animaux
Malgré toute l’attention portée aux évaluations précédentes des études chez l’animal, nous ne pouvons pas exclure la survenue d’effets secondaires des médicaments. Ils peuvent se manifester sous la forme d’une perte de poids, des troubles gastro-intestinaux ou de troubles du comportement. Les injections répétées peuvent être une source de stress, de douleur pour l’animal et peuvent parfois engendrer une induration ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Une ulcération ou nécrose des tumeurs sur le flanc peut être observée. Une gêne dans la mobilité de la souris peut également être observée en fonction de l’implantation sur le flanc. Le développement de métastases pulmonaires peut entrainer une difficulté respiratoire. La présence de nodules dans l’abdomen peut provoquer de l’ascite. Tous ces symptômes sont décrits dans une grille de score.
Devenir
Les animaux supplémentaires pourront être utilisés dans le cadre de la formation continue et/ou initiale de nos techniciens en s’appuyant sur un projet dédié et en accord avec le responsable de la SBEA (structure en charge du bien-être animal). Nous prévoyons la réutilisation de maximum 200 animaux sur 5 ans pour la formation. Dans le cas où aucune formation n’est nécessaire, ces animaux seront mis à mort. Toutes les souris inclues dans l’évaluation des virus seront mises à mort soit après atteinte d’un point limite, soit à la fin de l’étude pour le prélèvement de tissus. En raison des modèles et de l’utilisation de virus oncolytiques, ces animaux ne peuvent être réutilisés, replacés ou adoptés.
Remplacement
Avant d’être testés chez l’animal, les virus candidats et leur combinaison avec les thérapies antitumorales ont été évalués et sélectionnés pour leur rapport bénéfice/risque significatif dans les modèles alternatifs disponibles. Ces modèles étant incomplets, il reste indispensable de tester les candidats sélectionnés chez l’animal. L’étude de l’activité antitumorale d’un candidat médicament nécessite un modèle intégré faisant intervenir un ensemble complexe de phénomènes biologiques, impossible à modéliser, conduisant au développement de la tumeur, à la distribution, à la toxicité et à l’élimination des médicaments.
Réduction
La réalisation de ces procédures par un technicien rompu à ces manipulations, et la standardisation du protocole garantissent une bonne reproductibilité et permettent de réduire le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux par groupe est choisi selon des contraintes statistiques. Du fait de la variabilité des prises de greffes tumorales, des animaux supplémentaires sont intégrés dans chaque expérience. Ces animaux ne recevront qu’une injection de cellules tumorales pour assurer l’obtention d’un nombre suffisant de souris présentant la croissance tumorale attendue dans le modèle sous-cutané, ou pour vérifier la bonne prise tumorale dans les modèles d’implantation en intra-péritonéale ou intra-veineux. Des tests statistiques seront utilisés sur les données obtenues (volumes tumoraux). Il est prévu l’utilisation de 5408 souris pour l’évaluation d’environ 9 virus candidats-médicaments par an et la combinaison avec 4 thérapies antitumorales.
Raffinement
Seuls les virus oncolytiques et leur combinaison avec les thérapies antitumorales présentant le meilleur rapport efficacité/non toxicité dans nos modèles alternatifs seront étudiés chez l’animal. De précédents dossiers déposés et apptouvés nous ont permis et nous permettent de tester la toxicité des nouvelles souches de virus. Seuls les virus ne risquant d'induire une souffrance chez l'animal seront testés dans ce projet. Durant l’étude in vivo, nous portons une attention particulière au bien-être de l’animal. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux afin de réduire le stress et un enrichissement du milieu est prévu (coton et tunnel de change) dans chaque cage avec eau et nourriture ad libitum. Les animaux sont toujours manipulés en douceur. Une période d’acclimatation et d’habituation aux gestes sont respectées avant de démarrer un protocole pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et ainsi, diminuer le stress lié au transport et à la manipulation. Des points limites ont été établis pour permettre de soustraire l’animal à la souffrance. L’implantation des cellules en sous-cutanée, en intraveineux, l’injection des virus et l’administration des substances à activité anti tumorale s’effectueront sur animal vigile. Une anesthésie légère est prévue lors de l’injection des cellules en intra péritonéale ainsi que dans le cas de la mesure de bioluminescence. Afin d’éviter une hypothermie due à l’anesthésie, l’animal est placé sur un tapis chauffant de son endormissement à son réveil. Pour le prélèvement de sang terminal une anesthésie et une analgésie sont prévues. Nous veillons à limiter l’angoisse et la souffrance des animaux, en surveillant l’apparition d'éventuels effets secondaires occasionnés par les traitements et en appliquant le cas échéant des critères d’interruption de l’expérimentation en fonction de l’aspect clinique des animaux.
Choix des espèces
Tous les traitements standards que nous souhaitons tester en combinaison avec nos virus oncolytiques sont décrits dans la littérature dans de nombreux modèles de cancers de souris. Par conséquent, la souris est un modèle de référence en oncologie, avec de multiples modèles expérimentaux disponibles. De nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires sont disponibles dans cette espèce. Des souris immuno compétentes et immuno déficientes seront utilisées dans ce projet afin d’évaluer nos virus oncolytiques dans différents modèles de tumeurs solides de type carcinome. Animaux âgés entre 6 et 8 semaines lors de l’injection des cellules tumorales (avec un âge plus avancé il y a un risque non négligeable de prise tumorale moins homogène et par conséquent la nécessité d’augmenter le nombre d’animaux).
Evaluation de l’effet des antidépresseurs sur l’épilepsie des souris modèles de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Quinze jours seules en cage, des électrodes implantées dans le cerveau et reliées à un câble pour un enregistrement continu : 96 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Opérées sous anesthésie pendant 90 minutes au plus, elles reçoivent ensuite pendant dix jours, mêlé à leur eau de boisson, l'un des quatre traitements comparés, dont trois antidépresseurs. L'équipe soupçonne certains de ces médicaments d'aggraver l'épilepsie liée à la maladie d'Alzheimer, au risque, écrit-elle, de crises sévères et d'une mort précoce des souris. Le porteur qualifie cette lignée, qui développe des plaques amyloïdes et une activité épileptique, de "modèle idéal" pour cette étude.
Objectifs
Dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui développent la maladie d’Alzeihmer et des activités épileptiques. Nous étudierons les effets de 3 antidépresseurs sur les activités épileptiques présentes chez nos souris. Pour cela, nous utiliserons des techniques d’enregistrement continu de l’activité cérébrale par électroencéphalographie intracrâniale. Compte tenu des connaissances actuelles sur les mécanismes d’action des antidépresseurs et de nos travaux antérieurs, nous suspectons un effet aggravateur de certains anti-dépresseurs et un effet protecteur pour d’autres sur l’activité épileptique dans le cadre de la MA. Notre projet pourrait, à long terme, permettre de limiter la survenue de l’épilepsie chez les patients atteints de la MA en remplaçant les traitements antidépresseurs aggravateurs par d’autres traitements ayant des bénéfices au moins similaires mais non responsables de l’accélération du déclin cognitif
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de déterminer si certains antidépresseurs exacerbent les activités épileptiques présentes chez les souris modèles de la maladie d’Alzheimer et si d'autres antidépresseurs ont un rôle protecteur vis-à-vis de ces mêmes activités. Ainsi, si notre hypothèse se vérifie, ce projet justifiera la mise en place d’études cliniques permettant de tester cette hypothèse chez les patients. A long terme, ce projet pourrait donc permettre de mieux adapter les traitements et ainsi apporter un bénéfice considérable aux patients atteints de la maladie d’Alzheimer (MA) en évitant de majorer leur épilepsie.
Procédures
Les animaux anesthésiés et analgésiés auront une chirurgie implantatoire (d'une durée maximale de 90 minutes) pour la pose d’électrodes afin de réaliser des électro-encéphalogrammes. Les encéphalogrammes des animaux seront réalisés en continu pendant 15 jours. Les anti-dépresseurs seront administrés par voie orale en les mélangeant à l’eau de boisson durant 10 jours.
Impact sur les animaux
La chirurgie implantatoire est susceptible d’induire une douleur modérée au stade post opératoire durant 24-48 heures. L’isolement des animaux au cours des enregistrements électrophysiologiques durera 15 jours : ceci peut induire un stress modéré. Cet isolement est indispensable à la conduite des enregistrements. Habituellement, les évènements épileptiques des souris modèles de la MA sont essentiellement des pointes isolées qui surviennent pendant le sommeil et ne sont pas associées à une modification comportementale. Mais l’administration chronique de certains antidépresseurs pourraient exacerber ces activités épileptiques et provoquer des crises d'épilepsie sévères et ainsi provoquer une mortalité précoce des souris. Les pesées peuvent entrainer un stress léger de quelques dizaines de secondes. Le génotypage des animaux pourra entrainer une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récuperer leurs cerveaux en vue d'analyses histologiques.
Remplacement
Le projet a pour objectif d’évaluer les effets des antidépresseurs couramment utilisés en clinique sur l’épilepsie dans la maladie d’Alzheimer (MA). L'épilepsie comme la dépression dépendent d'interactions qui se font entre différentes régions cérébrales au sein de larges réseaux, qui ne peuvent pas, à l'heure actuelle, être mimées dans de simples cultures cellulaires. Une approche par modélisation informatique des interactions entre maladie d'Alzheimer, épilepsie et antidépresseur ne pourra se faire que sur la base de données expérimentales qui ne sont que parcellaires pour le moment. Ainsi, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle murin de la MA qui ne peut donc être remplacé par aucun autre modèle.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe (n=12) a été déterminé sur la base de nos études antérieures de l’activité épileptique des souris modèles de la MA, de sorte à avoir une puissance statistique suffisante pour les analyses nécessaires aux comparaisons intergroupes (4 différents traitements) et intragroupes (comparaisons entre chacun des 10 jours de traitement à la baseline).
Raffinement
Les souris sont hébergées à 4 dans des cages contenant du matériel de nidification ainsi qu'une buchette pour l'enrichissement. Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation de 10 minutes par souris (handling) avant le début des enregistrements. Les animaux seront suivis quotidiennement par des personnels formés au soin. Si une altération de l’état est observée, une grille de scoring sera utilisée pour déterminer la conduite à tenir. Les critères évalués sont : l’aspect général de l’animal (pelage, peau, yeux, bouche), les fonctions corporelles (respiration altérée), le comportement (posture, locomotion, isolement, réaction à la manipulation), le poids (pesée une fois par semaine puis quotidienne en cas de perte de poids). Pour ce dernier, le poids en fin de chirurgie sert de référence pour calculer le pourcentage de perte (pour prendre en compte le poids du connecteur). Nous avons identifié deux situations pour lesquelles une attention particulière sera portée aux souris : d’une part, la chirurgie (implantation intracérébrale des électrodes d’éléctroencéphalographie (EEG) et période post opératoire) qui pourrait provoquer de la douleur ou de la souffrance ou l'angoisse et, d’autre part, l’isolement lors des enregistrements EEG, qui pourrait affecter le bien-être des animaux. Pour les chirurgies (acte avec réveil), les animaux seront d’abord anesthésiés par inhalation d’isoflurane puis analgésiés 15 minutes avant le début de la chirurgie. Une injection d'anti-inflammatoires sera réalisée en fin de chirurgie et le lendemain pour éviter d’éventuelles douleurs post opératoires. Pendant les deux semaines qui suivront la chirurgie, les animaux seront inspectés tous les jours. Les animaux doivent rester isolés les uns des autres lors des enregistrements électrophysiologiques pour éviter qu’ils ne rongent les câbles les uns des autres et pour éviter qu’ils ne perturbent le sommeil de leurs congénères. Or, il a été montré qu’un isolement peut provoquer une souffrance de l’animal et des modifications neurologiques si l’isolement dure plusieurs semaines (les isolements durent 5 semaines dans la plupart des études sur le sujet). Une attention particulière a donc été portée à la réduction du nombre de jours d’isolement (15 jours). La procédure s’achèvera ainsi par la mise à mort les animaux dès que les enregistrements seront terminés.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous utiliserons des souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer. Cette lignée reproduit de nombreuses caractéristiques de la pathologie observées chez l’humain : plaques amyloïdes, déclin cognitif progressif et activités épileptiques, entre autres. Cette lignée constitue donc un modèle idéal pour l’étude des effets des antidépresseurs sur l’épilepsie dans la MA. Les animaux seront inclus dans le protocole à l’âge adulte, entre 3 et 5 mois. A cet âge, les souris modèles de la MA sont à un stade précoce de la maladie d’Alzheimer mais présentent déjà des activités épileptiques qui ne progressent pas avec l’âge.
Etude de l’impact de mutations Nr2f1 sur le développement du cerveau et des yeux chez des modèles de souris du syndrome d’atrophie optique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Les femelles gestantes porteuses d'embryons mutés sur leurs deux copies du gène Nr2f1 sont tuées avant la mise bas, faute de savoir, pour deux des trois lignées, si les souriceaux survivraient. 2 214 souris vont être utilisées, 600 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 1 554 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 60 un niveau léger. Il s'agit de comprendre comment des mutations du gène NR2F1 perturbent le développement du cerveau et des yeux dans le syndrome d'atrophie optique de Bosch-Boonstra-Schaaf, en injectant des traceurs fluorescents dans le cerveau ou dans l'œil des animaux, puis en les tuant dix jours après pour analyser leurs tissus. 60 souris sont transférées vers d'autres procédures, les autres tuées pour prélever cerveau, œil et gonades.
Objectifs
Le syndrome d’atrophie optique de Bosch-Boonstra-Schaaf (BBSOAS) est une maladie génétique qui touche le développement du cerveau et des yeux. Les personnes atteintes de ce syndrome rencontrent des problèmes de vue ainsi que des difficultés d'apprentissage, parfois associées à un retard cognitif. Cette maladie est causée par des variations dans un gène spécifique appelé NR2F1. Ces variations, appelées mutations, perturbent le fonctionnement normal du gène et peuvent entraîner des anomalies dans le développement du système nerveux central. Pour mieux comprendre comment ces mutations génétiques conduisent à la maladie, nous utilisons des modèles de souris génétiquement modifiées. Ces souris possèdent des mutations similaires à celles observées chez les patients atteints de BBSOAS. En étudiant ces modèles animaux, nous pourrons observer les effets des mutations sur le développement du cerveau et des yeux. Les objectifs principaux de ce projet sont de : 1. Identifier comment chaque mutation du gène NR2F1 contribue aux défauts observés dans le développement du système nerveux central. Certaines mutations pourraient affecter certaines parties du cerveau plus que d'autres, ce qui pourrait expliquer les variations de symptômes observées chez les patients. 2. Déterminer quelles cellules du système nerveux central sont impactées par les différentes mutations. Comprendre quelles régions du cerveau sont affectées et quelles cellules sont impliquées peut aider à mieux cibler les recherches sur de nouveaux traitements. 3. Comprendre comment ces mutations altèrent les mécanismes du développement du système nerveux central. Comprendre ces mécanismes peut fournir des informations cruciales sur les processus biologiques perturbés dans la maladie et aider à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. En comprenant mieux les mécanismes sous-jacents à la maladie et en identifiant les cellules et les processus biologiques impliqués, nous espérons ouvrir la voie à de nouveaux traitements et thérapies pour améliorer la prise en charge des personnes atteintes de BBSOAS.
Bénéfices attendus
De précédentes études ont déjà révélées des similitudes entre un modèle de souris et les jeunes patients atteints du BBSOAS, notamment une atrophie du nerf optique, des problèmes de myélinisation (l'enveloppe protectrice des nerfs) et des défauts dans la prolifération et la différenciation de certains types de cellules du cerveau. Pour approfondir notre compréhension de cette maladie, nous utilisons plusieurs modèles de souris ayant différentes mutations du gène NR2F1, similaires à celles observées chez les patients. Ces mutations ont été choisies pour représenter la diversité des altérations génétiques observées chez les patients. En étudiant ces modèles, nous pourrons examiner les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les symptômes spécifiques liés à chaque mutation. À moyen terme, cette approche devrait nous permettre de mieux anticiper les symptômes chez les jeunes patients en fonction de leur mutation génétique, ce qui pourrait améliorer leur prise en charge précoce. À long terme, nous espérons identifier des cibles thérapeutiques pour contrer les effets néfastes des mutations sur le développement du cerveau et des yeux, afin d'améliorer les soins et le bien-être des jeunes patients.
Procédures
Afin de suivre le comportement des cellules dans le cerveau et les yeux à différents stades de développement post natal, nous injecterons des traceurs fluorescent dans le cerveau ou les yeux des animaux. Ces interventions ne dépasseront pas 15 minutes et seront réalisées sous anesthésie générale. Après la chirurgie, les animaux recevront une injection sous cutanée d’antalgique et d’antibiotique répétée toutes les 24h sur 3 jours. Chaque animal ne subira qu’une seule injection et sera sacrifié 10 jours après pour analyser ses tissus. Pour suivre la prolifération cellulaire nous injecterons des nucléotides modifiés à différents stades de développement. L’injection unique, réalisée sur animal vigile sous contention, durera moins d’une minute. Si aucun signe de douleur ou d’inconfort n’est constaté dans les 15 minutes post injection, les animaux seront euthanasiés entre 2 et 24h après l’injection pour analyser leurs tissus.
Impact sur les animaux
Pour ce projet, nous utiliserons 3 lignées de souris transgéniques portant des mutations du gène Nr2f1, similaires à celles trouvées chez les patients atteints du syndrome d’atrophie optique. Pour la première lignée, dont la mutation entraîne la perte d’expression de Nr2f1, l'absence de phénotype dommageable chez les souris porteuses de cette mutation sur une seule des deux copies du gène (souris hétérozygotes) a été montré par de précédentes études. Pour les deux autres lignées étudiées, l'absence de phénotype dommageable chez les souris hétérozygotes est attestée par ceux ayant généré ces lignées. Nous savons, pour la première lignée, que l’absence totale de Nr2f1 (mutation présente sur les deux copies du gène) entraîne la mort des souris dans les 7 premiers jours de vie, mais aucune information n'est disponible pour les deux autres mutations étudiées. Par mesure de précaution, nous ne ferons naitre aucune souris portant des mutations sur les 2 copies du gène Nr2f1 et les femelles gestantes susceptibles d’avoir de tels embryons seront prélevées avant la mise bas. Ces trois lignées pourront être croisées avec une lignée rapportrice, dont l'expression du marqueur GFP n'affecte pas le phénotype des animaux. Les animaux pourront être impliqués dans diverses procédures nécessitant des injections ou interventions chirurgicales. Pour les animaux subissant une stéréotaxie, une douleur ou un inconfort au niveau de l’incision de la peau du crane peut persister après la chirurgie jusqu'à la cicatrisation complète. Dans le cas de l'injection intravitréale, l'utilisation d'une aiguille fine et de volumes de liquide très faibles minimise le risque de lésions ou de pression intraoculaire gênantes. De plus, les traceurs injectés ne devraient pas la physiologie de l'œil ou du cerveau. L'injection intrapéritonéale peut provoquer une douleur aiguë transitoire due à la piqûre, mais cette sensation disparaît rapidement. Pour les femelles gestantes, une attention particulière sera accordée à la surveillance post-injection, car leur état peut entraîner une douleur accrue, des saignements ou des contractions. Par mesure de sécurité, aucune injection ne sera administrée à des femelles ayant dépassé 16 jours de gestation.
Devenir
A la fin des procédures procédures tous les animaux seront euthanasiés pour pouvoir récupérer leur tissus (cerveau, oeil, gonades) et les analyser pour notre étude.
Remplacement
Afin de limiter autant que possible les expériences sur animaux vivants, nous utilisons, en parallèles des lignées de souris, des cultures cellulaires in vitro. Cependant, la détermination du programme de chaque cellule ne dépend pas seulement des facteurs génétiques. Les cellules communiquent entre elles et s’adaptent à leur environnement. Par conséquent, les facteurs spatiaux et temporels jouent un rôle crucial dans le bon développement du système nerveux central et sont impossibles à reproduire de manière identique in vitro. C’est pourquoi le recours à un modèle animal reste indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques qui mènent aux symptômes observés chez les patients. Les modèles animaux nous permettent de prendre pleinement en compte la complexité des interactions cellulaires et des influences environnementales dans le développement et la progression des maladies neurologiques, ce qui est essentiel pour notre compréhension globale de ces troubles et pour le développement de traitements efficaces.
Réduction
Nous utilisons une stratégie de croisement qui permet d'utiliser tous les animaux générés, indépendamment de leur sexe, réduisant ainsi le nombre total d'animaux produits. Pour optimiser au mieux l’utilisation de chaque animal, nous prélèverons systématiquement plusieurs organes (cerveau, yeux, gonades), et nous effectuerons une analyse complète des échantillons. Les protocoles utilisés ont été soigneusement choisis afin de réduire au maximum le nombre et l’ampleur des interventions pratiquées sur les animaux sans en compromettre l’efficacité.
Raffinement
Toutes nos interventions seront réalisées par des utilisateurs compétents et formés, réduisant ainsi le temps de manipulation et le stress pour les animaux. Les chirurgies seront effectuées sous anesthésie générale administrée par injection intrapéritonéale d'un mélange permettant à la fois une anesthésie générale, un bon relâchement musculaire et une couverture analgésique générale jusqu'à 24h après l'injection grâce à une combinaison d’un analgésique et d’un anti-inflammatoire. Pour les animaux maintenus en vie pendant et après la chirurgie, un protocole supplémentaire de prise en charge de la douleur sera mis en place. Ainsi, une anesthésie locale au niveau du site de la chirurgie sera administrée par une injection sous-cutanée pour les chirurgies crâniennes ou par l'application de collyre pour les injections dans les yeux. De plus, pour prévenir les infections post-opératoires, les animaux recevront un traitement antibiotique juste après la chirurgie. Ce traitement sera adapté à la nature spécifique de la chirurgie effectuée. Pour ce faire, une injection sous-cutanée de gentamicine ou l'application de crème ophtalmique antibiotique seront utilisées. Ces médicaments ont été choisis pour leur efficacité dans la prévention des infections et leur compatibilité avec les procédures chirurgicales réalisées. Enfin, un suivi quotidien des animaux en procédure sera assuré pour détecter tout signe de douleur avec une mise en place de points limites impliquant un arrêt immédiat de la procédure si la douleur ou l'inconfort détecté ne peut être soulagé dans les 24h.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris en raison de sa grande similarité génétique avec l'homme, ce qui en fait un modèle précieux pour étudier les gènes impliqués dans le développement du système nerveux central. De plus, les mécanismes neurodéveloppementaux que nous souhaitons étudier sont identiques chez la souris et l’homme et il existe déjà des lignées de souris transgéniques portant des mutations du gène Nr2f1 retrouvées chez les patients atteints du syndrome d’atrophie optique qui sont d’excellents modèles pour étudier cette maladie génétique. Dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment différentes mutations du gène Nr2f1 affectent le développement du cerveau et des yeux. Ces mutations peuvent entraîner des dysfonctionnements dans le développement de ces organes, conduisant aux symptômes observés chez les patients. Dans ce but, nous analyserons différents stades de développement embryonnaires et postnataux chez des modèles de souris de cette maladie. Nous commencerons notre étude à 10,5 jours embryonnaires où, chez la souris, les bases du cortex cérébral et des yeux sont établies. Puis nous progressons à travers plusieurs autres stades embryonnaires (12.5 ; 14.5 ; 16.5 et 18 jours embryonnaire) où les structures cérébrales et oculaires continuent à se former et à se différencier. Chez les souris, tout comme chez les humains, le système nerveux central continue à se développer et à mûrir après la naissance, notamment par la myélinisation des fibres nerveuses. Pour cette raison, nous étudierons également plusieurs stades postnataux, jusqu'à ce que le processus de myélinisation soit complet. L’expression de Nr2f1 étant maintenue à l’âge adulte, nous analyserons aussi des souris adultes pour voir l’impact des mutations étudiées sur un système nerveux central pleinement mature.
Immunisation chez la souris en vue de la génération d’hybridomes pour produire des anticorps.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Tuées pour qu'on récupère leur sang et leur rate, 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit cinq injections sous-cutanées d'un peptide mélangé à de l'adjuvant de Freund incomplet, dont le porteur indique qu'il provoque des douleurs articulaires, en plus d'une rougeur, d'une inflammation et d'une élévation de température pendant les 72 heures suivant chaque inoculation. Cinq prélèvements sanguins suivent, puis une thoracotomie et une ponction cardiaque de quinze à vingt minutes. Le porteur qualifie d'"indispensable" le recours à la souris faute de méthode in vitro fiable pour produire des anticorps spécifiques, tout en décrivant l'étape suivante du projet, l'immortalisation des cellules de rate prélevées, comme permettant une production infinie d'anticorps sans utiliser d'autres animaux.
Objectifs
Ce projet vise à développer des anticorps polyclonaux anti peptide et d’en dériver des lignées d’hybridomes monoclonaux sécrétant de façon infinie les anticorps ciblant ces peptides. 25 peptides d’intérêt majeur dans la lutte contre les infections bactériennes ont été identifiés et caractérisés par le laboratoire. La production d’anticorps dirigés contre ces peptides permettra dans un premier temps d’obtenir des outils utiles pour développer nos travaux de recherche et dans un second temps d’envisager leur utilisation dans des tests diagnostiques et dans des biothérapies. Le but final est de diminuer ou remplacer les antibiotiques dans le traitement de maladies infectieuses à germes multirésistants.
Bénéfices attendus
Dans un premier temps, il s'agit d’obtenir des outils pour développer nos travaux de recherches et définir plus précisément le rôle de chaque peptide dans la virulence et la pathogénicité de différents germes tel que Staphylococcus aureus ou Pseudomonas aeruginosa. Dans un second temps nous envisageons leur utilisation dans des tests diagnostiques et dans des biothérapies visant à remplacer les antibiotiques dans le traitement de maladies infectieuses à germes multi résistants.
Procédures
5 injections sous-cutanée à but vaccinal d'une durée de 5 à 10 minutes maximun suivant le temps d'endormissement, 5 prélèvements sanguins de 30 secondes pour un suivi sérologique de la réponse immune. Une thoracotomie et un prélèvement cardiaque d'une durée de 15 à 20 minutes. Toutes ces procédures seront effectuées sous anesthésie générale profonde
Impact sur les animaux
Comme dans la plupart des procédures vaccinales, on s’attend à une rougeur, une inflammation et une douleur au site d’injection pendant les 72h qui suivent l’inoculation ainsi qu’une élévation de la température corporelle. L’utilisation d’adjuvant de Freund incomplet induit aussi des douleurs articulaires.
Devenir
Le but final de ce projet est la production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux dirigés contre des peptides d'intérêt à visée thérapeutique anti-infectieux. Les animaux après vaccination suivront la procédure 2 et seront mis à mort pour récupérer leur sang contenant les anticorps polyclonaux et leur rate contenant les cellules productrices d'anticorps.l'immortalisation de ces cellules spléniques a pour but la génération d'hybridomes sécrétant de façon infinie des anticorps monoclonaux.
Remplacement
Concernant la première étape de ce projet il est indispensable d’avoir recourt à l’animal car il n’existe pas de méthode fiable in-vitro pour la production d’anticorps spécifiques de molécules. Cependant, afin de remplacer les animaux dans la production massive d’anticorps, nous allons procéder à l’immortalisation des cellules productrices de nos anticorps (générées durant la première étape au sein de la rate) pour obtenir des lignées cellulaires stables permettant une production infinie de nos anticorps sans avoir recourt à d'autres animaux.
Réduction
Dans le cadre de la réduction du nombre d’animaux nous utiliserons 4 souris maximum par peptide. Par expérience la quantité d’anticorps polyclonaux obtenue sera suffisante pour nos premiers travaux de recherche. La génération des lignées d’hybridome (sécrétant les anticorps monoclonaux) aura deux impacts sur la réduction des animaux utilisés. Le premier et le plus direct concerne la production en masse des anticorps en culture cellulaire animale et le deuxième est la mise en place après séquençage des régions variables de nos anticorps d’une production d’anticorps recombinant dans un système d’algue éliminant ainsi l’utilisation de sérum de veau fœtal très consommateur d’animaux.
Raffinement
Afin de répondre au principe de raffinement les prélèvements de sang permettant d’effectuer le suivi sérologique de l’apparition des anticorps seront effectués en sub-mandibulaire sous anesthésie générale à l’isoflurane. Les volumes seront limités à 50µl soit environ 2 gouttes. Durant les 72h suivant chaque injection d’immunogène les animaux recevront du paracétamol dans l’eau de boisson. Une surveillance particulière sera effectuée après le premier rappel et jusqu’à la fin de la procédure par la mesure d’un score clinique quotidien basé sur le mouse grimace scale. Pour un score allant de 2 à 3 les animaux seront maintenus sous paracétamol au-delà de 3 les animaux concernés seront mis à mort pour suivre la procédure de prélèvement final. L’ensemble des règles d’hébergement en accord avec l’agrément de notre établissement utilisateur sera évidemment respecté à savoir enrichissement, température, taille des cages, cycle jour/nuit et visite quotidienne.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus utilisée pour l’obtention d’anticorps. Elle permet d’obtenir une réponse immune avec très peu d’immunogène (facteur souvent limitant par le cout de production et de purification des immunogènes ici des peptides). De plus le myélome permettant l’immortalisation des cellules productrices d’anticorps est murin et facilite donc la création d’hybridomes sécréteur d’anticorps d’intérêt. Les souris auront un âge compris entre 6 et 10 semaines période où le système immunitaire est parfaitement fonctionnel.
Modèles chirurgicaux chez le rongeur
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 7500
Cochons d'Inde : 1500
Hamsters dorés : 750
Hamsters de Chine : 750
Des rongeurs sont opérés pour qu'on leur induise une maladie de Parkinson, d'Alzheimer ou un trouble cardiaque, afin que des clients de l'industrie pharmaceutique y testent leurs substances et leurs dispositifs médicaux. 13 500 rongeurs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 7 500 rats, 3 000 souris, 1 500 cochons d'Inde et 1 500 hamsters, 8 100 d'entre eux dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les opérations, d'une durée maximale de deux heures, consistent à déposer ou injecter une substance directement dans le cerveau ou dans le cœur, à poser un cathéter dans l'intestin grêle, ou à provoquer une insuffisance de la circulation sanguine dans le cœur. Le porteur écrit que les effets indésirables "ne dépassent pas deux semaines" et prévoit de tuer les animaux dont l'état ne s'améliore pas au-delà, l'établissement décrivant par ailleurs une prestation graduée pour ses clients, du développement du modèle à l'étude réglementaire.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de réaliser différentes chirurgies chez le rongeur pour induire une pathologie, comme des troubles neurologiques tels que Alzheimer ou Parkinson mais aussi différents troubles cardio-vasculaires, ou encore pour réaliser des administrations directes dans l’intestin sans passer par l’estomac. Le but est d’évaluer l’efficacité ou la toxicité de substances ou dispositifs médicaux pour l’industrie pharmaceutique.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’induire des pathologies par chirurgie afin de tester une substance ou un dispositif médical sur des modèles expérimentaux correspondants. In fine, le bénéfice attendu est de pouvoir développer et tester ces substances sur l’Homme.
Procédures
Tous les animaux sont anesthésiés et analgésiés avant le début de la chirurgie. Pour les modèles de chirurgie intracérébrales, les animaux subissent le dépôt d'une substance test au contact du cerveau ou une injection directement dans le cerveau. Pour le modèle de pose de cathéter intraduodénal, les animaux subissent la pose d'un cathéter dans la partie initiale de l'intestin grêle pour administrer en direct une substance test. Pour les modèles de chirurgies cardiaques, les animaux subissent le dépôt d'une substance test au contact du coeur, ou une injection dans le coeur, ou encore une insufissance de la circulation du sang dans le coeur. En fonction du projet, différents prélèvements sanguins peuvent être réalisés. A l'issue du projet, tous les animaux sont mis à mort pour des analyses vitro et ex-vivo. La durée maximale de tous les actes chirurgicaux énoncés est de 2h.
Impact sur les animaux
Les modèles d’injections intracérébrales peuvent générer de la douleur et potentiellement des troubles neurologiques à plus ou moins long terme. Le modèle d’administration intraduodénale peut générer de la douleur et potentiellement des troubles intestinaux à plus ou moins long terme. Les modèles de chirurgies cardiaques peuvent générer de la douleur et potentiellement des troubles cardiaques à plus ou moins long terme. Ces effets peuvent aboutir à une baisse d’activité ainsi qu’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, auto-mutilation,…). Ces effets sont limités dans le temps et ne dépassent pas deux semaines. Si les effets indésirables, provenant de la chirurgie ou du traitement, s’étendent au-delà de deux semaines sans aucun signe d’amélioration, alors les animaux seront mis à mort.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour des analyses vitro et ex-vivo.
Remplacement
Le développement de produits pharmaceutiques ou de dispositifs médicaux nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement non clinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe : - Développement du modèle sur un petit nombre d’animaux, inférieur à 10 - Validation du modèle sur un plus grand nombre d’animaux - Etude pilote : application de la substance test sur un petit nombre d’animaux - Etude réglementaire : application de la substance test sur un nombre d’animaux permettant une analyse statistique représentative. Des tests in vitro sont réalisés au préalable par nos clients ou par notre installation. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe.
Réduction
Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel, comme décrit dans les procédures internes. La distribution des données sera vérifiée et les tests statistiques seront sélectionnés en fonction de la normalité des données. Afin de réduire le nombre d’animaux, des échantillons de sang, d’urine, de salive, de LCR (liquide céphalo-rachidien), de fécès ou des organes peuvent être prélévés pour des analyses à posteriori.
Raffinement
Pour les rongeurs, de l’enrichissement comme des batonnêts à ronger, des huttes/tunnels et du papier kraft sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. Pour la chirurgie, une anesthésie générale, adaptée en fonction des espèces, est réalisée. Une couverture analgésique adaptée est appliquée et évaluée en fonction des observations quotidiennes des animaux. En fonction du projet, le poids des animaux est enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) peut être mis en place. La perte de poids est évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal ou du poids maximal de l’animal si celui-ci n'est pas adulte au début de l’étude. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale après chaque traitement peut être réalisée. Une observation accrue des animaux est réalisée 2 à 6 heures après les traitements. Des points limites adaptés sont mis en place.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant un organisme similaire à l’Homme. Leur génotype est connu et ils sont faciles à héberger. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire les différents modèles. En fonction de la demande de nos clients (liée aux caractéristiques de la substance ou du dispositif testé) les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.
Etude de pharmacocinétique d’une molécule administrée chez le rat ou la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rats : 4350
12 050 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chaque rat subissant jusqu'à onze prélèvements sanguins et chaque souris jusqu'à sept. Les composés sont administrés une à deux fois par jour pendant sept jours au maximum, par voie orale, intraveineuse, sous-cutanée ou intrapéritonéale, et jusqu'à quatre prélèvements par ponction rétro-orbitale ou submandibulaire sont pratiqués sous anesthésie gazeuse. Une partie des animaux arrive déjà cathétérisée, d'autres reçoivent une pompe osmotique implantée, et la collecte des excreta impose un séjour en cage à métabolisme dont le porteur reconnaît qu'il induit un stress. Le bénéfice mis en avant est de "réduire le nombre d'animaux utilisés en pharmacologie", pour un projet qui en mobilise lui-même 12 050.
Objectifs
L’objectif du projet est la mesure des paramètres pharmacocinétiques chez le rat et la souris. Les caractéristiques pharmacocinétiques sont les premières données générées in vivo après que les tests in vitro aient été concluants. Ils vont permettre de décrire les différentes phases que va subir le composé quand il entre dans l’organisme du rongeur par différentes voies. Les informations obtenues impactent la progression des produits dans le projet, le design par les chimistes d’analogues ayant des meilleures propriétés pharmacocinétiques, ou les protocoles d’études de pharmacologie in vivo (choix de la dose, de la voie d’administration, et de la fréquence d’administration (une fois ou deux fois par jour).
Bénéfices attendus
La connaissance des propriétés pharmacocinétiques d’un produit chez l’animal avant le design des études de pharmacologie permet d’utiliser le meilleur traitement (dose, voie d’administration) et participe à réduire le nombre d’animaux utilisés en pharmacologie. Ces études permettront un lien avec les prévisions faites à partir des modèles in vitro. Ce lien entre données in vivo et données in vitro est critique pour prédire la pharmacocinétique chez l’homme, où seulement des données in vitro sont disponibles aux stades précoces de la recherche. Les données fournies permettront la sélection de meilleurs candidats pour les tests précliniques. Toutes les données obtenues sur les produits d’un projet permettront aux chimistes de concevoir des molécules ayant des propriétés pharmacocinétiques optimisées donc de réduire le nombre d’animaux utilisés avant d’obtenir un candidat médicament.
Procédures
Administration des composés à tester, par voie intraveineuse, orale, sous-cutanée ou intra-péritonéale, une à deux fois par jour jusqu’à 7 jours : durée quelques secondes (ou quelques minutes de perfusion) à chaque administration, sur animaux vigiles sauf dosages IV (anesthésie isoflurane). Prélèvement sanguin, 7 fois maximum pour la souris et 11 fois maximum chez le rat pendant l’étude, durée quelques secondes sur animaux vigiles si prélèvements en veine caudale, saphène ou submentale. Les prélèvements en veine submandibulaire ou rétro-orbital (maximum 4 sur la durée de l’étude) sont effectués sous anesthésie isoflurane. Pose de pompes osmotiques sous anesthésie Isoflurane chez la souris : 15 min par animal avant le début de l’étude.
Impact sur les animaux
Au cours des études de ce projet, les composés sont en général testés pour la première fois sur l’animal entier. Tous les signes cliniques sont donc surveillés et enregistrés. Au cours des administrations ou prélèvements, les animaux seront manipulés avec douceur afin de leur éviter le stress de la manipulation. L’injection IV peut provoquer un inconfort passager de 30 secondes qui sera limité par l’anesthésie gazeuse légère de la souris. La toxicité cellulaire des composés est évaluée en amont des études in vivo et seuls les composés ne présentant pas de toxicité à la dose administrée en vivo seront testés chez l’animal. Dans ce contexte, nous n’attendons pas de réaction important lors de l’administration de nos composés en in vivo. Des points limites ont été établis, permettant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. La pharmacocinétique nécessite le prélèvement de petites quantités de sang à des intervalles répétés ce qui peut générer du stress et de l’inconfort. La pharmacocinétique nécessite le prélèvement de petites quantités de sang à des intervalles répétés. Le volume de sang prélevé et le nombre de prélèvements sera adapté en fonction du poids des animaux inclus dans l’étude. La collecte des excreta implique de mettre les animaux en cage à métabolisme, ce qui induira un stress pour ces animaux.
Devenir
A la fin de nos études, tous les animaux sont mis à mort de façon ethique. Pour des raisons éthiques, les animaux cathétérisés ne peuvent pas être réutilisés dans nos procédures pendant plus d’une semaine après réception. Pour les animaux non cathétérisés, nous prélevons des organes à la fin de nos administration afin d'évaluer la concentration des nos composés dans les tissus. De plus, nous pourrions observer des risques pour la validité des résultats car les animaux, réutilisés après la periode de réccuperation, seront décalés en poids, en âge et en physiologie par rapport à ceux utilisés dans les modèles de pharmacologie, donc moins prédictifs.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle fiable in vitro permettant de prédire de manière exacte et approfondie le comportement pharmacocinétique d’un produit chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques d’un composé et établir des corrélations in vivo/in vitro qui permettront d’avoir une prévision fiable des propriétés pharmacocinétiques chez l’homme.
Réduction
Les composés testés in vivo ont été sélectionnés sur la base de leurs propriétés in vitro. Un grand nombre de composés synthétisés sont donc éliminés sur la base des résultats des tests in vitro et ne sont pas évalués in vivo. Nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux qui permet d’obtenir des résultats avec une variabilité acceptable pour l’objectif de l’étude. Ainsi dans le premier test d’un nouveau composé en pharmacocinétique, 2 animaux sont utilisés pour la voie intraveineuse et 3 animaux pour la voie extravasculaire pour décrire la pharmacocinétique des produits. Une étude pharmacocinétique est réalisée par prélèvements multiples, qui permet aussi une réduction du nombre des animaux impliqués dans les études. Des mélanges de produits peuvent être administrés pour sélectionner les meilleurs produits en réduisant le nombre d’animaux nécessaires à l’étude (exemple : 3 produits administrés en mélange à 2 animaux au lieu de 3 fois 2 animaux si les composés sont administrés séparément).
Raffinement
A l’arrivée des animaux : Contrôler que le dispositif des animaux cathétérisés est bien mis en place et qu’il n’y a pas de lésion particulière. Si c’est le cas, mis à mort sur avis du vétérinaire. Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi dès leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton, carrés de coton et feuilles de cellulose). Cet enrichissement sera adapté pour les animaux cathétérisés (pas de maison, risque de dommages au cathéter). Afin de minimiser l'inconfort du au procédures, les animaux pourront recevoir une analgésie adaptée. Pour favoriser la vasodilatation de la veine caudale au moment des prélèvements, les souris pourront être placées quelques minutes dans une thermocage. Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière. Si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera euthanasié de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. Lors de la mise à mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane (induction 4% et maintien de 2%).
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat qui sont les espèces utilisées pour les modèles précliniques de notre établissement. Les rats et les souris utilisés dans ce projet seront des adultes afin que leur métabolisme soit mature.
Effets à court terme de six composés à visée thérapeutique en développement chez la souris sauvage soumise à une alimentation enrichie en graisse
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Six candidats médicaments d'un client pharmaceutique sont évalués sur leur capacité à réduire la prise alimentaire et le poids de souris nourries avec une alimentation enrichie en graisses. 78 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Hébergées seules en cage, elles reçoivent quatorze administrations par voie orale, sont pesées treize fois, puis anesthésiées et tuées pour le prélèvement de leur tissu adipeux. Le porteur reconnaît que l'isolement constitue une nuisance, la relativise par le maintien d'un contact visuel et olfactif, et affirme qu'il n'existe "aucune méthode de substitution" permettant d'étudier l'effet d'un composé sur le poids corporel.
Objectifs
L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'une famille de six candidats médicaments de notre client et vise à tester leur efficacité à réduire la prise alimentaire et le poids corporel à court terme chez la souris non obèse mais nourrie avec une alimentation enrichie en graisse. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement subaigu du candidat médicament sur l'appétit et le poids corporel du modèle d'obésité. Les composés les plus efficaces seront alors étudiés sur de plus longues durées, chez la souris obèse.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait, à terme, aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (13 mesures au cours de l’étude ; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule ou d’un candidat médicament par voie orale (14 administrations ; durée de la mesure : 1 minute); 3) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée : 10 minutes).
Impact sur les animaux
De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements par voie orale pourraient être source de de stress mais ne sont que très peu douloureux lorsque réalisés par des expérimentateurs habitués à ce type de pratique. Enfin, le maintien sous alimentation enrichie en graisse de courte durée (ici 14 jours) pourrait être une source de très léger inconfort pour les animaux du fait du changement d’habitudes alimentaires.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements de tissu adipeux sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.
Remplacement
Bien que le développement des composés testés ait fait l'usage d'approches in vitro dans ces premières étapes, l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques reste une étape obligatoire et règlementaires pour poursuivre le développement des candidats médicaments, notamment dans le but de poursuivre vers ders études cliniques. Par ailleurs, il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel et la prise alimentaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle employé et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non soumis à l'alimentation enrichie en graissees a été réduit à 8 animaux, contre 10 pour les autres groupes expérimentaux, compte tenu de la moindre variabilité des paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement des candidats médicaments, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle pour un des composés testés, une seconde étude sera menée en condition chronique chez les deux genres afin de s'assurer de son efficacité.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie orale seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. en utilisant des canules de gavage souples pourvues d'un embout en silicone, prévent ainsi toute lésion potentielle du carrefour aéro-digestif. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée (Buprénorphine).
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J nourris avec une alimentation enrichie en graisses est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte, afin de mimer au mieux la population humaine ciblée par les candidats médicaments.
Traitements visant à réduire les symptômes lors d’une coïnfection entre nématodes intestinaux et malaria
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par gavage avec un nématode intestinal, puis par injection dans l'abdomen d'un parasite du paludisme, subissent sept prélèvements de sang en vingt et un jours par incision de la queue puis retrait de la croûte de cicatrisation, et reçoivent jusqu'à six injections de traitement. La coïnfection provoque une anémie plus marquée et plus longue qu'une infection isolée, le porteur qualifiant par ailleurs l'infestation par le ver d'asymptomatique. Il conclut que les interactions entre l'hôte, le ver et le parasite ne peuvent pas être reproduites in vitro, et que les souris ne peuvent pas être réutilisées, leur système immunitaire n'étant plus naïf.
Objectifs
L’objectif du projet est d’identifier des traitements possibles en vue d’améliorer les symptômes de la coïnfection entre nématodes intestinaux et malaria. Les infections par des nématodes intestinaux sont toujours très prévalentes dans les pays en voie de développement et on estime que 3 milliards d’êtres humains souffrent d’au moins une infection par des helminthes au cours de leur vie. La carte de prévalence des infections par des helminthes coïncide en grande partie avec celle d’endémicité du paludisme, et on constate que souvent ces populations sont coïnfectées par les deux parasites. La coïnfection entraine des dynamiques différentes par rapport à celles observées quand les helminthes ou les Plasmodiums infectent seuls leurs hôtes et cela a des conséquences sur l’état de santé des individus coïnfectés. En particulier, lorsque Plasmodium infecte un hôte préalablement infecté par le nématode, on constate une aggravation des symptômes par rapport aux cas où les hôtes sont uniquement infectés par Plasmodium. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer l’efficacité de certains traitements pouvant contribuer à améliorer les symptômes en cas de coïnfection.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier les mécanismes pouvant jouer un rôle dans l’aggravation des symptômes produits par Plasmodium lors de coïnfections avec un nématode intestinal. Ces parasites infectent des millions de personnes chaque année dans les pays du Sud en voie de développement. On estime que 600.000 personnes décèdent chaque année des suites d’une infection par une des espèces de Plasmodium, essentiellement en Afrique subsaharienne. Ces mêmes personnes souffrent souvent d’infections chroniques par différentes espèces d’helminthes. Dans le cas de coïnfection, on constate souvent une aggravation des symptômes induits par Plasmodium. Notre projet vise donc à identifier des pistes thérapeutiques pouvant améliorer les symptômes observés dans les cas de coïnfection.
Procédures
Les animaux sont soumis aux interventions suivantes (tous les animaux ne sont soumis à toutes ces interventions, cela dépendant des groupes expérimentaux): gavage à l’aide d’une sonde souris, une seule fois, durée
Impact sur les animaux
Le nématode produit des infections asymptomatiques (aucun changement comportemental ou dans l’apparence de l’animal n’est constaté). Très rarement (< 1% des cas), l’émergence des vers peut provoquer une augmentation de la perméabilité intestinale. Etant donné que les animaux sont surveillés quotidiennement et deux fois par jours pendant la période d’émergence des vers, si on constate une détérioration de l’état de santé des souris elles sont immédiatement retirées de l’expérience et euthanasiées par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane. Plasmodium yoelii 17X NL est une souche non létale. L’infection produit une lyse des globules rouges entrainant une anémie transitoire (culminant entre les jours 14 et 16 post-infection). A partir de jour 24 post-infection les valeurs de concentration de globules rouges par microlitre de sang reviennent à la normale. Cependant, en cas de coïnfection on constate des niveaux plus importants d’anémie et un temps de récupération plus long. L’infection avec le nématode est effectuée par gavage (intervention réalisée en quelques secondes), à l’aide d’une sonde souris (rigide). Chaque individu n’est gavé qu’une seule fois avec un petit volume d’eau. L’infection avec Plasmodium est effectuée par injection intrapéritonéale (intervention réalisée en quelques secondes). Les traitements avec l’érythropoïétine et l’hémopexine nécessitent trois et six injections intrapéritonéales respectivement. Ces injections seront au minimum espacées d’un jour. Les prélèvements de sang sont réalisés en pratiquant une petite incision à la pointe de la queue pour le premier et en ôtant la croute de cicatrisation pour les prélèvements successifs. Deux prélèvements maximum par semaine sont réalisés. Ces différentes interventions ne concernent pas toutes les souris. Un chronogramme fourni en annexe indique les interventions pour chaque groupe expérimental.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort car ils ne peuvent pas être réutilisés dans d’autres expériences, n’ayant plus une réponse immunitaire naïve par rapport aux parasites utilisés.
Remplacement
L’objectif de notre étude est d’explorer des mécanismes pouvant conduire à l’aggravation des symptômes induits par Plasmodium chez les hôtes coïnfectés et de tester des traitements visant à améliorer ces symptômes. Ceci met en jeu des interactions complexes entre les trois acteurs (l’hôte, le nématode et le Plasmodium) qui ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
L’effectif de souris utilisé dans ce projet a été calculé afin d’en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Il s’agit en effet de 10 souris par groupe expérimental.
Raffinement
Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans ce projet. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Toutes les cages sont enrichies et ont du matériel pour la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Dans la mesure du possible, les animaux sont transférés d’une cage à l’autre grâce à la technique du tunnel (au lieu de la préhension par la queue) ce qui a été démontré réduire le stress des animaux. Enfin, tous les animaux sont surveillés au moins une fois par jour pour évaluer leur état général. Si une dégradation de l’état de santé est constatée, nous utiliserons une grille quantitative de notation qui permet de définir des points limites suffisamment prédictifs
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour ce type d’expérience. Les parasites sont des parasites spécifiques de souris qui reproduisent assez fidèlement les coïnfections observées chez l’homme entre nématodes intestinaux et malaria. Nous utiliserons des animaux entre 8 et 10 semaines. Il s’agit d’individus adultes avec une système immunitaire complétement développé.
Etude de la fonction des macrophages de la cavité péritonéale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une unique injection dans l'abdomen d'une dizaine de secondes, susceptible de provoquer une inflammation au point d'injection, avant que le contenu de sa cavité péritonéale ne soit analysé après sa mort. Le projet vise à décrire une population de cellules immunitaires, les petits macrophages péritonéaux, dont la fonction reste inconnue, avec l'espoir lointain d'applications lors de dialyses péritonéales humaines. Aucun calcul ne vient étayer l'effectif de 1 040 animaux, le porteur indiquant seulement qu'il utilisera un nombre minimum mais nécessaire à des analyses statistiques pertinentes.
Objectifs
La cavité péritonéale est l’espace physique contenant les organes de l’abdomen comme le foie, l’estomac et les intestins. Cette cavité contient du fluide péritonéal, qui agit comme un lubrifiant facilitant les mouvements et réduisant la friction entre les organes. De nombreuses cellules immunitaires résident au sein de cette cavité. Chez la souris comme chez l’Homme, la majorité de ces cellules immunes sont des macrophages et des cellules dendritiques qui jouent un rôle clé au cours des réponses immunitaires. En particulier, une population de cellules appelée « petits macrophages péritonéaux » (PMP) a été identifiée chez la souris et chez l’Homme. La fonction des PMP reste totalement inconnue. Des études préliminaires chez l’Homme et chez la souris ont révélé une forte ressemblance entre les PMP et les macrophages (ce qui explique leur nom), mais aussi des points communs avec d’autres cellules immunitaires appelées cellules dendritiques. Leur profil « hybride » suggère que ces cellules puissent avoir la capacité d’activer la réponse immunitaire adaptative, menant notamment à la production d’anticorps. Les PMP circulent librement au sein du fluide péritonéal, mais ils peuvent également adhérer à la surface des organes péritonéaux et en particulier à l’omentum. L’omentum est un organe juxtaposé à l’estomac, qui contient des aggrégats de cellules immunitaires. Les PMP peuvent également être recrutés à l’omentum et nous émettons l’hypothèse que ces cellules peuvent y intéragir avec d’autres cellules immunitaires pour les activer. Les objectifs du projet sont : 1/ Caractériser précisémment les PMP au sein de la cavité péritonéale. 2/ Caractériser la capacité des PMP à intéragir avec les autres cellules immunes au sein de l’omentum activer la réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
La cavité péritonéale contient de nombreuses cellules immunitaires ayant la capacité de phagocyter des pathogènes au cours de la réponse immunitaire innée, mais également de présenter des antigènes et activer le système immunitaire adaptatif. En particulier une partie de ces cellules appelées « PMP » sont parfaitement homologues chez la souris et chez l’Homme, cependant l’origine et la fonction de ces cellules restent indeterminées. Ce projet permettra d’étudier en détails la biologie des PMP afin de comprendre la fonction de ces cellules. Notre étude sur modèles murins est réalisées en parallèles d’une étude de PMP humains obtenus chez des patients nécessitant un recours à des dialyses péritonéales. A long terme, l’identification de facteurs régulant la génération, la survie et les fonctions des PMP permettrait de cibler ces cellules. Il est envisageable que nos approches d’édition génétique et transfert intrapéritonal soient applicables à l’Homme, au cours de dialyses péritonéales par exemple.
Procédures
La seule intervention réalisée au cours de nos protocoles est une injection intrapéritonéale, effectuée sur animaux vigiles. Chaque souris incluse dans notre protocole (1040 animaux) recevra une injection intrapéritonéale au cours de sa vie. La durée de cet acte (contention, injection et remise en cage) est d’environ 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les effets négatifs attendus sont liés au stress subit par les souris lors de la contention et de l’injection péritonéale. Lors de ces injections, une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure dans le but d’analyser le contenu cellulaire de la cavité péritonéale et répondre aux objectifs scientifiques définis.
Remplacement
Pour satisfaire au remplacement, des études in vitro seront réalisées sur des cellules primaires et lignées cellulaires. Cependant, pour comprendre en détails l’origine et les fonctions des PMP, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents types cellulaires présents dans la cavité péritonéale et entre les différents organes. Notamment, les cellules stromales de la cavité péritonéale sont source de facteurs de croissance permettant la différenciation et le maintien des cellules immunitaires. Ces cellules diffèrent selon leur localisation au sein de la cavité et l’aspect spatial est donc essentiel dans notre étude.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, les souris seront maintenues au sein de notre élevage, 100% d'entre elles pourront être utilisées pour l’expérimentation. Si une cohorte numériquement plus importante est nécessaire, nous achèterons ces souris auprès d’un fournisseur agréé pour répondre à ce besoin ponctuel. Afin de réduire davantage le nombre de souris, nous utiliserons une approche d’édition génétique, ce qui permettra d’éviter la génération de nombreuses lignées murines. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.
Raffinement
Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Dans le cas d’une injection intrapéritonéale, nous surveillerons l’aspect du site d’injection. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (dont la fréquence est adaptée à la procédure) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des grilles d’observation ont été établies et des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure. Un animal avec une blessure sans perte de substance sera isolé et la blessure sera traitée avec un antiseptique (une fois par jour s’il n’y a pas de suintement et 2 fois par jour s’il y a suintement). Nous éviterons l’utilisation de méthodes d’identification ou de biopsies pour ces animaux et confirmerons seulement leur genotype post mortem, ce qui permettra d'éviter un geste invasif sur ces souris.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. D’autre part, nous disposons des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. De plus, nous étudions des populations cellulaires présentes chez l’Homme comme chez la souris. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Ces critères font de la souris l’espèce la plus adaptée pour répondre à nos questions scientifiques. Nous utiliserons des souris âgées d’au moins 6 semaines, correspondant à un stade auquel le développement est complet et la maturité sexuelle est atteinte.