Souris

1 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir dix séances d'imagerie et six mesures de tumeur, toutes sous anesthésie. Une tumeur leur est implantée sous la peau, puis viennent cinq injections dans le péritoine, une injection dans la circulation sanguine et une injection directement dans la tumeur, avant l'échauffement par nanoparticules magnétiques. Le porteur annonce comme bénéfice de "développer de nouvelles nanoparticules performantes pour l'hyperthermie magnétique", en une phrase, quand les nuisances décrites incluent nécrose, douleur, perte de poids et fatigue liée aux anesthésies répétées. Le choix de la souris tient à la sensibilité de l'imagerie optique sur petit animal et à un poids qui, entre huit et douze semaines, reste "raisonnable" pour la manipulation.

Objectifs

Les thermothérapies regroupent un ensemble de méthodes basées sur l’utilisation d'un dépôt de chaleur local à des fins thérapeutiques incluant le traitement des cancers. Elles sont actuellement utilisées pour traiter directement la tumeur et/ou pour aider l'action des radiothérapies ou chimiothérapies. L’hyperthermie magnétique fait partie des thermothérapies et elle est déjà utilisée en clinique. Cependant les nanoparticules utilisées à l’heure actuelle pour réaliser cette hyperthermie doivent être améliorées afin d’augmenter leur efficacité. L’objectif de ce projet est de tester de nouvelles formulations de nanoparticules magnétiques in vivo dans l’optique de les transférer à la clinique.

Bénéfices attendus

Développer de nouvelles nanoparticules performantes pour l’hyperthermie magnétique afin de traiter les tumeurs solides.

Procédures

Injection sous la peau de cellules : 1 minute, 1 fois, durée anesthésie 5 minutes. Injection dans le péritoine : 10 secondes, 5 fois. Injection dans la circulation sanguine : inférieur à 1 minute, 1 fois, durée anesthésie 2 minutes. Injection dans la tumeur : 30 secondes, 1 fois, durée anesthésie 1 min 30. Imagerie : 10 fois, durée anesthésie 10 minutes. Mesure des tumeurs : 6 fois, durée anesthésie 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent provenir de : 1. L’injection des cellules cancéreuses en sous cutané : infection au niveau du site d’injection. 2. La présence d’une tumeur : douleur, gêne occasionnée, nécrose. Perte de poids liée à la croissance tumorale. 3. Hyperthermie et suivi en imagerie : fatigue et stress liés aux anesthésies répétées, stress lié à la contention.

Devenir

Les souris seront euthanasiées car elles auront une tumeur sous-cutanée.

Remplacement

Nous souhaitons développer de nouvelles nanoparticules qui permettraient d’améliorer la thérapie des tumeurs solides par hyperthermie magnétique. Même si leur potentiel thérapeutique, leur validité et l’absence de toxicité seront testés en amont sur des modèles de cultures cellulaires ou d'organoides quand cela est possible, la finalité est le test sur des modèles in vivo avant d’envisager un passage en clinique.

Réduction

Les nanoparticules seront préalablement testées et validées in vitro avant d’être injectées à l’animal. Seules les nanoparticules validées seront utilisées. Le suivi se fait par imagerie de bioluminescence qui est une technique d’imagerie non invasive permettant de faire un suivi du début à la fin sur un même animal. Chaque animal est son propre contrôle. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Les souris seront acclimatées pendant 7 jours après leur arrivée dans l’animalerie. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille) sur un portoir filtrant. Les étapes du projet sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Pour les anesthésie de longues durée de l’ocrygel est utilisé pour éviter l'asséchement des yeux. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur selon une grille de score. En cas de léger mal être un antidouleur sera administré à l'animal et de la nourriture sera déposée directement au fond de sa cage pour plus d'accessibilité.

Choix des espèces

L'imagerie optique est plus sensible et facilement réalisable sur le petit animal tel que la souris. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte entre 8 et 12 semaines. A cet âge les souris ont un poids et une taille raisonnable permettant leur manipulation.

Une partie des souris utilisées est immunodéficiente et porte une greffe de peau humaine, le méningocoque n'interagissant qu'avec des vaisseaux humains. 1 145 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffe de peau de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale, infection par injection intraveineuse, injections intrapéritonéales d'anticorps et d'inhibiteurs, jusqu'à cinq ponctions veineuses : le porteur indique que l'infection peut provoquer une baisse d'activité, une perte de poids et une hypothermie, des points limites devant permettre de tuer les souris avant que l'infection ne le fasse. Le sang est ensuite prélevé par ponction dans le cœur sous anesthésie, l'analyse des vaisseaux et des organes exigeant leur mort à toutes.

Objectifs

La méningite et le purpura fulminans sont des infections bactériennes foudroyantes et sévères qui touchent principalement les enfants et les jeunes adultes. La mortalité approche 100% en l'absence de prise en charge médicale. En France, malgré une prise en charge adaptée, le taux de mortalité reste élevé : 3%pour les cas de méningite et 30% pour les cas de purpura fulminans qui se traduit par des plaques hémorragiques cutanées et un choc septique foudroyant. De plus, lorsque l’évolution n’est pas fatale, les séquelles sont fréquentes, graves et handicapent leur vie durant les jeunes patients atteints : amputations, troubles de la vision, perte partielle ou totale de l’audition, déficience mentale permanente, difficultés d’apprentissage, mémorielles, dépression nerveuse… Le purpura fulminans est un syndrome infectieux très sévère, qui associe une septicémie à des lésions tissulaires nécrotiques disséminées sur la peau et les organes internes. Ces infections sont complexes et impliquent plusieurs organes et systèmes physiologiques à l’échelle de l’organisme. Une étape essentielle de ces infections sévéres est l'infection des vaisseaux sanguins. La bactérie responsable de ces infections n’interagit qu’avec les vaisseaux sanguins humains, nous utiliserons donc une lignée de souris gréffées avec de la peau humaine (modèle mimant le purpura fulminans). Différents variants bactériens seront utilisés afin de déterminer l’importance de différents facteurs de virulence. Nous analyserons le rôle des cellules du système immunitaire dans ces infections. Nous chercherons également à valider in vivo les effets d’agents pharmacologiques préalablement validés in vitro .

Bénéfices attendus

Les résultats attendus sont importants, car mieux comprendre les mécanismes de la méningite cérébro-spinale et du purpura fulminans, pourra conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cela permettra à terme de diminuer voire supprimer la mortalité et les séquelles dramatiques de ces infections sévères et fulgurantes.

Procédures

Ce projet comporte 5 types d'intervention : - 1 Greffe de peau humaine, durée : 45 min. sous anesthésie générale - 2 : Infections expérimentales à méningocoque par injection intraveineuse, durée de 4h pour les souris NOD/SCID gréffées et 72h pour les souris Balb/c. une infection par animal - 3: Injection d’anticorps et d'inhibiteurs par voie intra-péritonéale (moins de 5 min) (deux injections par animal, 24 et 48h avant l'infection). Injection d’agents pharmacologiques en association ou non avec un antibiotique (moins de 5 min) (une injection par animal). - 4 : Mesure de la bactériémie chez les souris par ponction veineuse (moins de 5min). (une mesure pour les souris NOD/SCID; 5 pour les souris Balb/c)- 5 : Prélèvement de sang par ponction intracardiaque sur des souris anesthésiées avant leur mise à mort 3 min.

Impact sur les animaux

La greffe peut provoquer un stress lié à l’anesthésie. La greffe peut produire une inflammation ou une infection. L’infection peut provoquer un stress chez les souris se traduisant par une diminution de leur activité, une perte de poids ainsi qu’une potentielle hypothermie, la définition des points limites permet de mettre à mort les animaux avant la léthalité due à l'infection. L’injection d’agents pharmacologique peut produire un stress. La mesure de la bactériemie peut produire du stress lié à la manipulation et la contention.

Devenir

L'analyse de l'impact de l'infection et des traitements sur l'intégrité vasculaire et l'analyse de différents organes, nécessite la mise à mort de tous les animaux.

Remplacement

Ces infections sont complexes et impliquent plusieurs organes et systèmes physiologiques à l’échelle de l’organisme (cellules endothéliales, circulation sanguine, coagulation, système immunitaire…), c’est pourquoi notre étude nécessite le recours à un modèle animal. Il est impossible de mener une telle étude sur les modèles in vitro existants.

Réduction

Nous utiliserons pour chaque expérience le nombre minimal d'animaux permettant d'observer une différence significative en se basant sur des données publiées. Pour les comparaisons statistiques entre les groupes de souris, nous utiliserons un test adapté aux petits effectifs in vivo. Afin de réduire le nombre d’animaux dans l’étude, nous avons développé des expériences permettant l'analyse de plusieurs paramètres sur un même animal, comme par exemple les analyses sanguines et les analyses sur les greffons de peau.

Raffinement

Pour réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des souris au cours de notre étude, de l’enrichissement sera ajouté dans chaque cage d’hébergement (coton et maison en carton) afin de limiter le stress des animaux. De plus, nous réaliserons les greffes sous anesthésie générale et des analgésiques seront utilisés en période péri- et postopératoire. L’analgésie per et post-opératoire sera réalisée par injection sous-cutanée d’un antalgique 30 min. avant la chirurgie et dans les deux jours suivants. Des points limites ont été définis et leur atteinte entraînera la mise à mort anticipée de l’animal.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle d'infection à méningocoque largement décrit dans la littérature. Il permet d'obtenir une bactériémie reproductible et prolongée après infection par voie intraveineuse. Ce modèle sera utilisé pour analyser les effets de différents variants bactériens et agents pharmacologiques sur l’initiation et la progression des lésions tissulaires. Souris femelles adultes âgés de 7 à 10 semaines car il est nécessaire que ces souris présentent une surface corporelle suffisante pour greffer des fragments de peau.

Les souris utilisées ici ont un système immunitaire fonctionnel, à la différence des lignées immunodéficientes des modèles précédents du même laboratoire, ce qui constitue l'intérêt déclaré du projet. 252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une ouverture de la paroi abdominale de trente minutes pour que leurs embryons, à 12,5 ou 13,5 jours, reçoivent une injection suivie d'un champ électrique déclenchant la formation d'une tumeur, avec des douleurs modérées que le porteur attribue aux gestations interrompues. Les tumeurs obtenues sont ensuite greffées par stéréotaxie dans le cerveau de souris adultes, qui présentent ataxie, perte d'équilibre, prostration et amaigrissement avant d'être tuées pour la conservation des tissus tumoraux.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de mettre au point des modèles de souris génétiquement modifiés de Gliome Diffus pédiatriques de la ligne médiane (DMG). Les gliomes sont l'ensemble des tumeurs cérébrales, bénignes ou malignes, issues du tissu de soutien neuronal appelé la glie. Ces tumeurs sont universellement incurables à ce jour. Ceci est dû à la résistances importantes de ces tumeurs aux peu de traitements disponibles aujourd’hui. Elle sont très différentes des gliomes de l’adulte et des tumeurs du cortex de l’enfant et il est nécessaire de pouvoir les étudier plus spécifiquement. Notre groupe a pu développer les premiers modèles in vivo au monde de Gliome Diffus de la ligne médiane à partir de biopsies de patients au diagnostic. Cependant, ces modèles présentent le défaut d'être développés dans des souris immunodéficientes. Nous avons deux objectifs finaux utilisant les modèles créés à l’aide de ces protocoles. D’une part, l'évaluation d'immunothérapies, de médicaments immuno-modulateurs ou de stratégies vaccinales afin d'éradiquer cette tumeur. Et d’autre part, l’étude des étapes précoces de la formation de la tumeur (oncogénèse) et le rôle du système immunitaire dans ce contexte.

Bénéfices attendus

Obtenir un modèle murin génétiquement modifié de DMG permettra de mieux comprendre les étapes précoces du développement de ces tumeurs, pour le moment encore inconnu. Cette compréhension permettra d’identifier les modifications précoces menant à l’apparition de cellules tumorales. L’induction de modification menant à des tumeurs dans des animaux ayant un système immunitaire compétant permettra l’exploration de nouvelles approches thérapeutiques, en prenant en compte l’environnement immunitaire de tumeurs, et tester ainsi des approches immuno-oncologiques (immunothérapie, médicaments immuno-modulateurs, stratégies vaccinales…).

Procédures

Les animaux femelles gestantes seront soumises à une intervention chirurgicale telle qu’une ouverture de la paroi abdominale (pour une durée de 30 minutes), précédés d’injections d’analgésiques et anesthésiques. Les embryons quant à eux auront des injections ainsi que l’utilisation d’un champ électrique (de moins d’une minute) menant à la formation de tumeurs. Ces futures tumeurs seront par la suite greffées dans des souris adultes, par stéréotaxie (sous anesthésie, avec une injection dans le cerveau d’une durée de 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liées aux symptômes tumoraux et à la chirurgie. On pourra observer des symptômes neurologiques modérés qui sont fréquemment observés en présence d’un volume tumoral conséquent (ataxie), perte d'appétit et donc perte de poids, prostration des animaux, perte d’équilibre. Chez les mères, on pourra également constater des douleurs modérées dues à des gestations interrompues.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour conservation et analyse de tissus tumoraux post-mortem.

Remplacement

Une singularité des gliomes de la ligne médiane (composée du thalamus, du pont et de la moelle épinière), résulte de leur phénotype systématique d’infiltration des structures de la ligne médiane dans un premier temps, puis plus largement de tout le cerveau au décours de la maladie. Ces particularités résultent des interactions des cellules tumorales avec leur environnement qui ne peuvent être appréhendées que dans des modèles vivo, où la variété et complexité du microenvironnement tumoral peut être reproduite. De plus, la barrière hématoencéphalique, qui isole le cerveau du reste de l’organisme, est une limitation très importante dans le traitement de cette maladie (barrière non rompue) et il est nécessaire de développer des modèles de greffes afin d’évaluer une nouvelle médication avant les phases cliniques. Les molécules médicamenteuses potentiellement identifiées par la suite serons testées sur des modèles de cultures cellulaires afin de limiter leur toxicité lors du traitement des animaux, en déterminant des concentrations et une posologie adéquat. Une des perspectives de ce projet, est également d’étudier le système immunitaire dans toute sa complexité, ce qui n'est possible que dans un animal vivant.

Réduction

Nos souris vont être suivies par bioluminescence. Ce suivi longitudinal permet d’éviter l’ajout d’animaux supplémentaires à sacrifier au cours de l’étude pour avoir des informations sur la présence ou non de tumeur. Cela permet donc de diminuer le nombre des animaux par procédures. Le nombre d'animaux a été déterminé par calcul de puissance, et les résultats seront étudiés par analyse de variance.

Raffinement

Pour limiter la souffrance liée, premièrement à la chirurgie , les femelles gestantes recevront une injection d’antalgique avant et après la chirurgie, puis une autre injection le lendemain. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale pour limiter la douleur et le stress des animaux. La température de l’animal est maintenue grâce à une plaque chauffante durant la chirurgie et le réveil. Des injections de sérum physiologique à la température de l’animal sont réalisées avant et après la chirurgie pour maintenir l’hydratation de l’animal. Un gel oculaire est également utilisé pour éviter la sécheresse oculaire ainsi que de la Betadine pour éviter tout risque d’infection. Suite à la chirurgie, les femelles sont placés seuls dans une cage chauffée le temps de leur réveil complet (+/-2h) et seront par la suite replacés en hébergement en groupe où ils reçoivent nourriture et boisson ad libitum. Pour limiter la souffrance liée à la progression tumorale chez les jeunes souris injectées, les animaux seront pesés plusieurs fois par semaine et observés tous les jours pour surveiller les signes cliniques. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

L'utilisation de souris ayant un système immunitaire est ici essentielle pour la poursuite de ce projet. De plus, ce modèle, déjà établi, a été réalisé chez la souris . Des femelles âgés de minimum 7 semaines seront mises en accouplement, ce qui correspond à l’âge du jeune adulte possédant les meilleures capacités de reproduction et ceci jusqu’à la limite de leurs capacités de reproduction, à partir de 8 mois. Les embryons seront injectés au jour embryonnaire 12.5-13.5. Lors de la greffe, les souris seront agées de 6 semaines au minimum.

Nourries pendant douze semaines avec un régime riche en graisses jusqu'à peser environ le double d'une souris témoin, mises à jeun six heures une fois par mois, gavées de boissons trois fois par semaine pendant six semaines, 64 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une goutte de sang est prélevée à leur queue tous les quinze jours pendant trois mois pour mesurer leur glycémie. Le porteur reconnaît que l'obésité induite réduit leur mobilité, peut dégrader leur toilettage jusqu'à l'alopécie et provoquer une polyurie, et prévoit de changer leur litière deux fois par semaine à cause des souillures. Toutes sont tuées par ponction cardiaque pour prélever le maximum de sang et neuf tissus, dont le cœur, le foie, le cerveau et le contenu du cæcum, l'objet du projet étant de tester l'effet prébiotique de tisanes de plantes médicinales réunionnaises.

Objectifs

Le projet vise à évaluer les effets prébiotiques et anti-diabétiques de tisanes riches en polyphénols de plantes médicinales réunionnaises chez un modèle de souris obèse. Ce projet s’insère dans un programme de recherche visant à développer des thérapies innovantes contre l’obésité et l’état diabétique associé qui sont des problèmes de santé publique majeurs dans le Monde. En effet, l’accumulation de graisses causant l’obésité engendre des désordres métaboliques et inflammatoires conduisant à une résistance à l’insuline et au diabète de type 2. L’obésité s’accompagne également d’une dérégulation des communautés bactériennes du microbiote intestinal, appelée dysbiose, et d’une perméabilité de la barrière intestinale. Il en résulte une translocation dans le sang de composés bactériens comme des endotoxines de type lipopolysaccharides (LPS) et des métabolites comme la triméthylamine métabolisée en oxyde de triméthylamine (TMAO) par le foie. Ces métabolites d’origine bactérienne atteignent des organes métaboliquement actifs tel que le tissu graisseux et aggravent l'inflammation, la résistance à l'insuline et l’état diabétique au cours de l’obésité. Des études montrent que la réduction de la dérégulation du microbiote intestinal par des agents prébiotiques naturels comme les fibres et les polyphénols végétaux, diminue le risque de complications de l’obésité. En effet, les prébiotiques sont des composés utilisés comme substrats nutritifs par des communautés bactériennes spécifiques et sont en faveur de leur croissance. Notre hypothèse de recherche est que les polyphénols contenus dans des tisanes, servent de substrats aux bactéries intestinales et protègent contre la dérégulation du microbiote intestinal liée à l’obésité. Pour vérifier cette hypothèse, notre projet a pour but d’évaluer pour la première fois la capacité de tisanes riches en polyphénols issues de deux plantes médicinales réunionnaises à exercer une action prébiotique sur les bactéries intestinales chez un modèle de souris obèses. De plus, le projet vise à déterminer l’impact des tisanes riches en polyphénols sur la production de métabolites bactériens de type LPS et TMAO, pour limiter le développement de l’état inflammatoire et diabétique des souris obèses.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : - d’ordre scientifique et médical : la preuve du lien entre les métabolites bactériens et les désordres métaboliques et inflammatoires au cours de l’obésité contribuera à l’apport de nouvelles connaissances sur le rôle de la dysbiose du microbiote intestinal comme facteur de risque et cible thérapeutique potentielle. De nouvelles perspectives thérapeutiques utilisant des prébiotiques pourront être développées pour la prise en charge de patients en situation d’obésité et à risque diabétique. - d’ordre biotechnologique : la preuve de l'efficacité de thérapies riches en polyphénols de plantes médicinales visant à améliorer la composition du microbiote intestinal, à moduler la production de métabolites bactériens atteignant les tissus métaboliquement actifs et à réduire les troubles métaboliques comme le diabète au cours de l'obésité permettra de valoriser le potentiel nutrition-santé de ces molécules naturelles issues de la biodiversité végétale.

Procédures

Les nuisances prévues sont associées à 4 types d'interventions chez les animaux : 1- Prélèvement d’une goutte de sang au niveau de l’une des veines latérales de la queue pour la mesure de la glycémie (durée 1 min, 1 fois tous les 15 jours pendant 3 mois, 8-10 µL). 2- Gavage de boissons (durée 2 min, 3 fois par semaine pendant 1,5 mois). 3- Gavage d’une solution de glucose pour le test de tolérance au glucose (durée 2 min, 1 fois par mois pendant 3 mois). 4- Ponction cardiaque terminale sous anesthésie générale (euthanasie, durée 2 min).

Impact sur les animaux

Le régime riche en graisses provoque une augmentation du poids/état d’obésité des souris générant des contraintes physiques (mobilité réduite/inactivité, diminution possible de toilettage/alopécie, modification des fécès, polyurie) voire psychologiques (stress/angoisse), engendrant une augmentation de la souillure des litières. Pour détecter ces possibles effets indésirables et garantir au mieux le bien-être des animaux, un suivi quotidien du comportement des animaux, et de leur poids et de leur prise alimentaire toutes les semaines sera effectué. Le test oral de tolérance au glucose réalisé une fois par mois va induire un stress vu que les souris seront mises à jeun pendant 6 h pour évaluer l’hyperglycémie provoquée. Les mesures de glycémie seront réalisées grâce à un glucomètre à partir d’une goutte de sang prélevée par ponction au niveau d’une des veines latérales de la queue, après application sur la queue d’une crème analgésique. Pour limiter le stress et la douleur, les manipulations seront réalisées par un personnel habilité et dûment expérimenté. L’étape de gavage des boissons prévue 3 jours par semaine pendant 6 semaines peut aussi induire un état de stress chez les animaux. Pour limiter ce stress, les manipulations seront réalisées par le même personnel habilité et expérimenté. Un suivi quotidien du comportement des animaux et une mesure de leur poids et de leur prise alimentaire toutes les semaines permettront de détecter des possibles effets indésirables afin de garantir au mieux le bien-être des animaux.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer chez les animaux un volume de sang maximal ainsi que différents tissus (tissu adipeux sous-cutané et épididymal, foie, coeur, crosse aortique, cerveau, caecum et contenu cécal) qui sont requis pour réaliser des dosages de marqueurs métaboliques et inflammatoires circulants permettant de caractériser l’état diabétique des souris.

Remplacement

Au laboratoire, nous développons des études mécanistiques sur modèles in vitro de cellules graisseuses, sur lesquelles des composés bactériens et polyphénols végétaux sont testés. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas de mimer la complexité de l’organisme vivant, avec les échanges inter-organes impliqués dans le métabolisme énergétique comme entre l’intestin, le tissu graisseux et le foie, ni de mesurer la bioaccessibilité tissulaire des métabolites bactériens et des polyphénols en condition d’obésité. Il est aussi question d’évaluer l’impact du régime obésogène associé aux boissons à potentiel prébiotique sur la composition du microbiote intestinal et l’état inflammatoire des souris en situation d’obésité. Seul un modèle animal permet de reproduire ces conditions physiopathologiques liant dysbiose du microbiote intestinal, obésité et complications métaboliques et inflammatoires. L’utilisation d’animaux vivants permet d’évaluer l’efficacité de la stratégie nutritionnelle envisagée à base de molécules prébiotiques et anti-diabétiques, car celles-ci nécessitent un métabolisme dans le tractus digestif par les bactéries puis une absorption intestinale pour un impact sur les échanges métaboliques inter-organes intestin-foie-tissu graisseux impliqués dans la pathologie de l’obésité et l’état diabétique qu’elle engendre. Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour tester notre hypothèse de recherche selon laquelle les polyphénols de tisanes issues de plantes médicinales pourraient exercer des effets prébiotiques et anti-diabétiques dans le contexte de l’obésité.

Réduction

Au laboratoire, nous disposons uniquement de souris transgéniques ne permettant pas la réutilisation d’animaux. Les expériences seront conçues en utilisant le moins d’animaux possible, tout en permettant de réaliser des études statistiques exploitables. Une approche statistique a permis de déterminer qu’il faut au moins 8 souris par groupe pour atteindre des résultats significatifs. Pour comparer les effets du régime alimentaire standard et du régime riche en graisses, supplémenté ou pas par une des deux tisanes ou par des fibres alimentaires, le projet impliquera 8 groupes de 8 souris, soit un total de 64 souris. Cet effectif prend aussi en compte les études précédentes du laboratoire ayant mesuré la variabilité des expérimentations visées et établi le nombre d’animaux nécessaire pour atteindre une puissance statistique permettant de valider l’hypothèse de recherche testée.

Raffinement

Les souris seront placées dans des conditions optimales, au nombre de 4 par cage maximum, et l’atmosphère contrôlée en température, humidité, lumière, ambiance sonore. Les animaux bénéficieront d’un accès facilité à la nourriture et à l’eau, et d’un enrichissement de leur environnement pour favoriser leur comportement naturel et limiter leur stress et anxiété. Les animaux seront séparés en cas de bagarre ou de barbering important. Le change des litières sera effectué une fois par semaine et adapté à 2 fois par semaine pour les souris en situation d’obésité en cas de souillures plus fréquentes. Dans un objectif de respect du bien-être animal et de réduction de la douleur, les mesures seront prises telles qu’une habituation des souris par un personnel habilité et expérimenté ainsi que l’utilisation d’anesthésie générale par inhalation d’isoflurane 2% et d’administration de buprénorphine (0,05 mg/kg) lors des expérimentations. En cas d’atteinte d’un point limite strict, une mise à mort par dislocation cervicale sera effectuée.

Choix des espèces

La souris est un modèle largement utilisé pour les expérimentations in vivo. Les procédures, les manipulations, l’évaluation de la douleur ou de la souffrance sont par conséquent bien établies. Les souris C57BL/6 sont choisies car c’est un modèle sensible au développement de l’obésité et du diabète de type 2 induit par un régime riche en graisses. De plus, la littérature évoque chez ces souris la présence d’un microbiote intestinal et la production de métabolites bactériens comparables à ceux détectés chez l’homme, de par l’existence de principaux phyla bactériens (Actinobacteria, Bacteriodetes, Firmicutes, Proteobacteria) qui permettent d’évaluer la dysbiose du microbiote intestinal causé par le régime obésogène. Ce modèle animal est donc idéal pour la réalisation de notre projet et l’ensemble des procédures est maîtrisé sur ce modèle, notamment au laboratoire. Les 64 souris C57BL/6 utilisées seront des souris mâles (32) et femelles (32) âgés de 10 semaines au démarrage de l’étude qui durera ensuite 12 semaines. La pathologie de l’obésité et l’état diabétique qu’elle engendre touchent principalement les adultes, il est donc indispensable d’avoir des animaux de cet âge afin de donner une perspective thérapeutique à ce projet de recherche. Nos résultats antérieurs issus de projets similaires ont été obtenus à ces stades de développement des animaux, ce qui permet de réaliser des analyses comparatives dans le but de limiter le nombre d’animaux. Poids d’une souris nourrie avec un régime équilibré standard (ND) : environ 20-25 g. Poids d’une souris nourrie avec un régime riche en graisses (HFD) : environ 45-50 g.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection intramusculaire d'une formulation de nanoparticules lipidiques et trois injections dans le péritoine, puis des séances répétées d'imagerie sous anesthésie, le porteur citant comme nuisances une infection possible au point d'injection, de la douleur, une inflammation et la fatigue liée aux anesthésies répétées. L'ARN messager injecté ne code aucun principe actif mais une protéine luminescente, servant seulement à visualiser où les nanoparticules se rendent. Le bénéfice avancé se limite à "évaluer le potentiel" de nouvelles formulations dans l'optique d'améliorer les vaccins à ARN, quand les atteintes décrites sont, elles, immédiates.

Objectifs

L’objectif est de tester différentes formulations de nanoparticules lipidiques qui pourraient être utilisées pour la fabrication de vaccin. Afin de visualiser l’efficacité des nanoparticules, un ARN messager permettant l’expression d’un rapporteur d’imagerie sera utilisé dans les formulations.

Bénéfices attendus

Evaluer le potentiel de nouvelles formulations de nanoparticules lipidiques dans l’optique d’améliorer les vaccins ARN.

Procédures

Injection dans le muscle des formulations : 30 secondes, 1 fois. Injection dans le péritoine : 10 secondes, 3 fois.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent provenir de : 1. L’injection intramusculaire : infection au niveau du site d’injection, douleur, inflammation. 2. Suivi en imagerie : fatigue et stress liés aux anesthésies répétées, stress lié à la contention.

Devenir

Nous envisageons de prélever des organes après l'euthanasie afin de faire des tests complémentaires.

Remplacement

L’objectif est de développer de nouvelles formulations de nanoparticules lipidiques qui pourraient être utilisées pour la fabrication de vaccin . Même si les formulations seront validées en amont sur des cultures cellulaires, la finalité est le test sur des modèles in vivo avant d’envisager un passage en clinique.

Réduction

Les formulations seront préalablement testées et validées in vitro avant d’être injectées à l’animal. Seules les formulations validées seront utilisées. Le suivi se fait par imagerie de bioluminescence qui est une technique d’imagerie non invasive permettant de faire un suivi du début à la fin sur un même animal ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Chaque animal est son propre témoin. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Les souris seront acclimatées pendant 7 jours après leur arrivée dans l’animalerie. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille) sur un portoir filtrant. Les étapes du projet sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur. En cas de léger mal être un antidouleur sera administré à l'animal.

Choix des espèces

L'imagerie optique est plus sensible et facilement réalisable sur le petit animal tel que la souris. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte entre 8 et 12 semaines. A cet âge les souris ont un poids et une taille raisonnable permettant leur manipulation.