Souris
Elevage avec identification et génotypage invasifs
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
25 000 souris vont être utilisées dans une procédure impliquant un niveau de souffrance léger, l'identification par puce sous-cutanée et une biopsie de la queue par amputation de son extrémité, réalisées sur souriceaux vigiles âgés de 7 à 12 jours. Le porteur indique que ces gestes provoquent une douleur légère et, plus rarement, une hémorragie ou le rejet du nouveau-né par la mère. Tous les animaux sont gardés vivants à l'issue de cette procédure, mais leur devenir varie ensuite, affectation à d'autres projets, entretien des colonies, mise à mort pour prélèvement d'organes ou mise à mort au sevrage pour ceux dont le génotype ne convient à aucun usage. Le porteur revendique la "nécessité" d'un génotypage fiable et affirme qu'aucune méthode non invasive n'égale à ce jour la biopsie de queue.
Objectifs
L'objectif de cette demande est d'identifier et de génotyper les animaux produits dans l’animalerie. Il s’agit d’un double geste invasif consistant à l'injection sous-cutanée au niveau du cou d'une puce émettrice de très petite taille pour l'identification de l'animal, suivi d'une biopsie de queue pour génotypage réalisé sur animal vigile âgé de 7 à 12 jours. Cette demande d'autorisation de projet pour identification et génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation (inclus dans d'autres demandes) - sélectionner les animaux d'entretien des colonies - sélectionner les animaux pour la formation, le maintien des compétences et les prélèvements d’organes ou de tissus pour des études ex vivo. Les animaux dont les génotypes ne conviennent pas pour les projets expérimentaux soumis, et n’étant pas utilisés pour les prélèvements post mortem, pour les activités d’élevage ou encore pour la formation seront mis à mort selon une méthode réglementaire.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la procédure d’identification et de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt nécessaire dans les projets de recherche. L’identification par puce émettrice permet : - d’identifier individuellement les animaux ; - d’identifier les animaux de manière permanente ; - de ne pas mutiler les animaux. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables grâce à une quantité et une qualité du matériel génétique obtenu pour le génotypage; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons.
Procédures
Tous les animaux de cette demande d'autorisation de projet seront soumis à deux gestes techniques invasifs consécutifs : 1/ l'identification par injection sous-cutanée d'une puce émettrice : 1 fois – durée : quelques secondes 2/ la biopsie de queue : 1 fois – durée : quelques secondes Ces gestes sont réalisés sur animal vigile.
Impact sur les animaux
La procédure d'identification et de génotypage décrite dans cette demande est composée de deux actes techniques invasifs : - l'identification par injection sous-cutanée d'une puce émettrice de taille réduite (1,4x8mm) - la biopsie de queue, qui consiste en l’amputation de l’extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une légère douleur. L’animal est maintenu en contention pendant les 2 actes et donc tout au long de la procédure, ce qui est une source de stress. Dans de très rares cas, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir: -une légère hémorragie à la queue -le rejet du nouveau-né par la mère.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure. Leur devenir diffère ensuite selon les résultats du génotypage : a/ ils sont sélectionnés pour un projet, pour la formation ou pour le maintien des compétences (inclus dans d'autres DAP); b/ ils sont conservés pour l’entretien des colonies ; c/ ils sont mis à mort pour prélèvements de tissus post mortem ; d/ ils sont mis à mort dès sevrage si leurs caractéristiques ne répondent pas aux besoin du projet et si aucune autre utilisation n’est possible.
Remplacement
Des essais sont en cours afin de réaliser les génotypages sur un prélèvement non invasif de follicules pileux mais à ce jour ils ne sont pas concluants. Un doute sur les résultats des génotypages conduirait à la nécessité de procéder à nouveau à des prélèvements et génotypages. Une erreur de génotypage se traduirait par la mise en accouplement d’animaux n’ayant pas les caractéristiques attendues. Cela impliquerait : - une augmentation du nombre d’animaux produits inutilement ; - la naissance d’animaux avec des phénotypes potentiellement délétères ; - l’utilisation d’animaux génétiquement sans intérêt dans des projets expérimentaux induisant des résultats erronés et non exploitables (si l’erreur n’est pas détectée précocement). Il est donc indispensable de recourir à une méthode de génotypage fiable. Or il n’existe pas actuellement de méthode de prélevement non invasive aussi performante que la biopsie de queue.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Le responsable de l'animalerie établit les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’animalerie.
Raffinement
Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté, formé par tutorat. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel approprié permettant un geste rapide et précis dans le respect des conditions d’asepsie établies dans l’animalerie. Des points d'attention précis (points limites gradés) et des mesures conservatoires adéquates sont établis en cas notamment de saignement, rejet de la mère ou perte d'appétit. Si les actions mises en place n'ont pas les résultats attendus, l'équipe de zootechnie prend la décision finale, sans délai, de mettre à mort l’animal. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme ce qui permet une extrapolation des résultats à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle moléculaire ou comportementale. De plus, la souris permet l'obtention aisée de modèles génétiquement altérés par différentes méthodes et donc de créer des modèles murins de pathologies neurologiques bien caractérisés. Pour la plus grande majorité des lignées, les animaux sont identifiés et génotypés entre 7 et 12 jours. A cet âge : - les animaux sont aisément manipulables ; - le cartilage est souple ; - les groupes sociaux constitués sont stables. Toutefois, certains animaux peuvent être identifiés et génotypés précocement si les projets expérimentaux auxquels ils sont destinés l’exigent. Nous éviterons autant que possible l’identification et le génotypage d’animaux adultes avec ces méthodes.
Etude de l’impact de la perte de fonction de CFTR sur le développement de l’ostéoporose chez la souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
92 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent le retrait chirurgical des ovaires sous anesthésie générale pour induire une ostéoporose, puis jusqu'à trois séances d'imagerie par an, pour étudier le lien entre une anomalie génétique de la mucoviscidose et la perte osseuse. Le porteur indique que la chirurgie comporte un risque de mortalité et prévoit d'abandonner la procédure si ce risque dépasse certains seuils. Il affirme qu'à sa connaissance il n'existe "pas d'alternative non animale efficace" et que les régulations en jeu ne sont pas modélisables sans un "animal complet".
Objectifs
L’ostéoporose est une problèmatique de santé publique. Cette pathologie, qui touche près de 40% des femmes et 15% des hommes de plus de 65 ans dans le monde, se traduit par une perte excessive de la masse osseuse et une diminution de la résistance des os, induisant une augmentation considérable du risque de fractures (377 000 nouvelles fractures dues à l’ostéoporose sont recencées chaque année en France). Il en résulte un important impact pour la société en raison des prises en charges hospitalières et thérapeutiques nécessaires à ces patients. Les patients souffrant de mucoviscidose présentent une forme particulière d’ostéoporose appelée maladie osseuse liée à la mucoviscidose. Cette maladie est due à un problème génétique dont l’effet précis sur l’os n’est pas aujourd’hui connu. Ce projet qui se déroule dans deux établissements utilisateurs a pour objectif donc de consolider les données dores et déjà acquises sur l’effet biologique de la problématique génétique sur la qualité osseuse, en étudiant les os de souris où l’ostéoporose sera induite par le retrait chirurgical des ovaires au cours du temps. Ces approches expérimentales permettent de récapituler les changements majeurs intervenant dans le cadre de la survenue de la ménopause chez la Femme, et de façon plus globale dans les deux sexes en lien avec le vieillissement de l’organisme. Ce travail permettra donc, à terme, de mieux comprendre l’impact de la problématique génétique sur les altérations osseuses dans des populations de plus en plus agées et donc de proposer de nouvelles molécules pour lutter contre la pathologie osseuse liée à la mucoviscidose et plus généralement contre l’ostéoporose.
Bénéfices attendus
L’ostéoporose se traite actuellement par des moyens non médicamenteux et médicamenteux. La prise en charge non médicamenteuse fait ainsi appel à l’optimisation de la prise de calcium, le plus souvent d’origine alimentaire, une activité physique adaptée et régulière, couplées à la réduction de tous les facteurs favorisant la perte accélérée du capital osseux et les facteurs favorisant les chutes. Les traitements médicamenteux de l’ostéoporose se basent essentiellement sur des médicaments bloquant la résorption osseuse, ou des substituts des hormones, mais toutes ces approches thérapeutiques doivent être adaptées en fonction de différents facteurs de risques et ne présentent qu’une efficacité limitée chez les patients souffrant de mucoviscidose. Les résultats de cette étude permettront une meilleure compréhension de l’impact de la problématique génétique dans l’établissement de l’ostéoporose post-ménopause ou liée à l’age et pourront orienter vers de nouvelles pistes thérapeutiques potentielles.
Procédures
Les animaux recevront une intervention chirurgicale de 30 min sous anesthésie générale pour la procédure de retrait des ovaires au sein du premier établissement utilisateur. Ils seront également soumis au maximum à trois séances d’imagerie de 30 min, sous anesthésie générale, par an, au sein du second établissement utilisateur
Impact sur les animaux
Toute approche chirurgicale implique un risque de mortalité lors de l’intervention et après. Néanmoins, si la mortalité en lien avec la réalisation de la chirurgie est supérieure à 10% pour le groupe d’animaux ne portant pas de problème génétique et supérieure à 50% pour le groupe portant l’anomalie génétique, la procédure complète sera abandonnée. Un gonflement, une perte de liquide et une irritation, susceptibles d’engendrer une diminution de l’activité de l’animal, peuvent nuire à la bonne alimentation et donc mener à une perte de poids voire à un comportement de repli. Une légère perte de poids des animaux, classiquement constatée après les interventions chirurgicales est attendue dans les tous premiers jours avant une reprise de poids classique ensuite. A notre connaissance, aucun autre effet indésirable n’est attendu.
Devenir
A l’issue des procédures tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tissus osseux et observer la microarchitecture osseuse par scanner à haute résolution et analyses histologiques et immunohistochimiques et biomécaniques.
Remplacement
A notre connaissance il n’y a pas d’alternative non animale efficace qui permet d’étudier la perte osseuse induite par chute des taux hormonaux, mimant l’ostéoporose post-ménopause chez l’Homme, ou en lien avec le vieillissement de l’organisme. Les mécanismes complexes de régulation en cascade des différents tissus, chacun contenant plusieurs types cellulaires, et du système immunitaire notamment via la mise en place d’une mobilisation augmentée des cellules résorbant l’os par exemple n’est pas réalisable en dehors de modèles in vivo impliquant un animal complet. Les données sur ces régulations complexes et multifactorielles sont encore trop minimalistes en l’état actuel des connaissances scientifiques pour envisager une modélisation numérique susceptible de répondre à notre hypothèse.
Réduction
Sur la base de nos expériences précédentes, un nombre optimisé d’animaux (10 par groupe) sera employé pour ces procédures afin que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique en fin d’expérimentation. Une logique d’arrêt des procédures est de plus mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux par groupe des points limites, la procédure sera interrompue. Des tests statistiques adaptés à nos effectifs seront utilisés.
Raffinement
Lors de leur arrivée à l'animalerie, une période de d’acclimatation d’une semaine sera appliquée afin que les souris s'acclimatent à leur nouveau lieu d'hébergement. Les cages seront enrichies d’abri et roues ainsi que de matériaux (morceau de coton ou de sopalin, tube en carton...) permettant aux animaux d'améliorer leur cage. A chaque intervention les animaux seront endormis afin de limiter le stress et la douleur. Du fait de l’intervention chirurgicale pour la procédure portant sur l’ostéoporose post-ménopause, une douleur après l’opération sera anticipée avec l’utilisation de médicaments antidouleurs. Un suivi rapproché (2 fois par jour) sera effectué sur les deux jours suivants la chirurgie et si des signes d’inconfort étaient détectés. Le suivi des animaux se fera tous les deux jours ensuite sur la première semaine puis deux fois par semaine ensuite. Les animaux engagés pour la procédure 2 seront visités deux fois par semaine. Le poids des animaux sera mesuré à chaque temps de traitement. Les animaux seront finalement euthanasiés après anesthésie générale. Afin de réaliser les analyses par imagerie, sur un site distant abritant la plateforme dédiée, les animaux seront transportés par véhicule personnel climatisé afin de consevrer une température optimale pour les animaux de 20°C, (8 km, environ 10 minutes). Le transport sera effectué dans des cages de transport propres, spécifiquement préparées, et les animaux seront remis dans des cages habituelles avec eau et nourriture à volonté dès leur arrivée. Le retour s’effectuera de la même manière.
Choix des espèces
La réalisation de ces études chez la souris via le modèle est décrite et validée. Les expériences antérieures ont donné des résultats exploitables. La souris étant un animal de petite taille, son hébergement en groupe sociaux de plusieurs individus est facilité au sein de notre établissement utilisateur en regard du matériel à disposition. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines à l’initiation de la procédure.
Evaluation de l’effet du vieillissement du collagène du type I sur l’efficacité des traitements dans des modèles de xénogreffe de tumeurs de mélanome chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules de mélanome enrobées dans du collagène d'âges différents, puis des mesures et des injections de traitement trois fois par semaine sous anesthésie gazeuse pendant une cinquantaine de jours, pour tester si le vieillissement de l'environnement tumoral réduit l'efficacité d'une thérapie ciblée. Le porteur classe la procédure en modérée en raison d'un risque de métastases ou d'ulcération qu'il ne peut exclure. Il affirme que les méthodes in vitro ne prennent pas en compte la complexité d'un organisme et qu'il est "indispensable" de confirmer l'hypothèse sur un modèle vivant.
Objectifs
Le mélanome est le cancer de la peau le plus mortel du fait de son agressivité. Environ la moitié de ces cancers développent une protéine anormale responsable de cette agressivité. De nouvelles thérapies ont été développées, elles ciblent spécifiquement cette protéine anormale afin de bloquer son effet. Elles ont permis d'améliorer la survie globale des patients en stoppant la progression du cancer. L’effet anticancéreux de cette thérapie ciblée est rapide mais, après quelques semaines de traitement la tumeur peut développer une résistance. La résistance à cette thérapie est peu étudiée dans les cancers chez des patients âgés. Pourtant, le facteur vieillissement pourrait être impliqué dans l'échec de la réponse à ces nouvelles thérapies ciblées et, plus précisément, le vieillissement de l’environnement dans lequel se trouvent les cellules cancéreuses. En effet, la peau en vieillissant subit processus naturel qui modifie son organisation et qui pourrait empêcher le bon fonctionnement de la thérapie anticancéreuse. La population âgée étant en constante augmentation, il est indispensable d’évaluer les bénéfices/risques de cette nouvelle thérapie sur des organismes vivants tels que des souris. Les techniques d’étude du vieillissement du collagène en laboratoire se sont améliorées pour s’approcher au mieux de ce qu’il se passe dans le corps humain. Cependant, ces techniques ne tiennent pas compte de la complexité d'un organe ou d'un organisme vivant complet. C'est pourquoi nous devons confirmer nos hypothèses en utilisant des modèles vivants. Notre projet de recherche se concentre sur l'impact du vieillissement sur l'efficacité d'un traitement. Nous avons plusieurs objectifs : d'abord, confirmer que nous pouvons effectuer nos observations sur notre modèle vivant ; ensuite, comprendre comment l'environnement autour des tumeurs change avec l'âge et comment cela affecte leur évolution ; enfin, examiner comment le vieillissement de cet environnement influence la réaction des tumeurs à un traitement médicamenteux.
Bénéfices attendus
Ce protocole est un nouveau modèle d’étude mimant le vieillissement de l’environnement tumoral. En effet si le protocole d'injection de cellules cancéreuses enrobé de collagène a déjà été décrit, l'injection de ces mêmes cellules enrobées dans du collagène de différents âges n'a jamais été réalisée. Le bien-être animal sera amélioré avec un temps d’expérimentation réduit. Ce protocole représente donc une approche innovante dans l’étude de l’efficacité de traitements anticancéreux dans un organisme âgé.
Procédures
Injections des cellules cancéreuses (1 fois, sous anesthésie gazeuse), mesure des tumeurs (3 fois par semaine sous anesthésie gazeuse) , injections pour le traitement tumoral (3 fois par semaine pendant 4 semaines, sous anesthésie gazeuse). L'anesthésie gazeuse 3 fois par semaine pendant maximum 50 jours consiste en un flash anesthésique durant quelques secondes et permettant de réaliser nos mesures et nos injections en diminuant le stress chez la souris.
Impact sur les animaux
L'injection des cellules cancéreuses et l'injection du médicament pour traiter les tumeurs peut entrainer chez les souris de la douleur et du stress. La manipulation pour l’anesthésie peut entrainer du stress. Il n’est pas rapporté d’impact propre à notre protocole d'injection de cellules cancéreuse. Nous utilisons un protocole sans substance irritante ou inflammatoire. Cependant, le nombre d'étude reste relativement pauvre sur le sujet. Le suivi que nous mettrons en place, conforme aux exigences de l’éthique animale sera à même d’identifier de manière précoce le possible impact de notre protocole. Les cellules cancéreuses sont agressives, la procédure a été classée en catégorie modérée du fait d’une possibilité de survenue de métastases ou d'ulcération qui ne peut être exclue. Nous surveillerons ce risque. Les observations mises en œuvre durant la première partie du protocole nous permettront de réduire si justifié la durée de la procédure pour limiter la prévalence de métastases à l’origine de souffrances.
Devenir
L’euthanasie des animaux sera rendue nécessaire car les tumeurs seront prélevées afin d’être analysées. Dans le cas où le traitement anticancéreux administré serait seul efficace (réponse complète), la réutilisation de l’animal ne serait pas possible du fait du traitement préalable et du risque de moindre réponse à un nouveau traitement (source de variabilité inter-individuelle des sujets).
Remplacement
Les méthodes d’étude du vieillissement du collagène en laboratoire se sont perfectionnées afin de rendre les recherches in vitro plus proche de la réalité in vivo. Certaines d’entre elles connues et utilisées dans notre laboratoire ont permis d’obtenir de premiers résultats. Cependant elles ne prennent pas en compte la complexité d’un organe ou d’un organisme et ne peuvent être la méthode unique de remplacement de l’animal. Il est donc indispensable de confirmer notre hypothèse sur des modèles in vivo pertinents.
Réduction
Nous testerons dans un permier temps 2 lignées de souris différentes soit 1 male et 1 femelle par lignée (donc 4 souris). Ceci nous permettra de choisir le type de souris le plus adapté à notre protocole. Ceci s'intègre à terme dans la démarche de réduction. Après validation de la lignée de souris, Un nombre de 8 animaux par groupe sera nécessaire afin de pouvoir interpéter les résultats. Les expérimentations seront réalisées en deux temps, dans un premier temps ce protocole étant très peu réalisé nous souhaitons confirmer son efficacité sur un petit nombre de souris. En cas de résultats concluant dans cette première partie d’expérimentation, 4 lots de 8 souris seront nécessaires afin de répondre au dernier objectif : étude de l’impacte du vieillissement de l’environnement des tumeurs sur la réponse au traitement anti-cancéreux. Ce programme en 2 temps permet de réduire le nombre de souris, et de l’adapter préalablement aux expérimentaitons en fonction des résultats obtenus.
Raffinement
L'hébergement des souris sera adapté à la de lignées des souris (Armoire ventilées) en groupe de 4 stables et harmonieux, nous surveillerons le risque d’agression entre congénères. Les cages seront enrichies en copeaux de papier permettant aux souris de se faire un nid / se cacher. Elles présenteront également des tunnels en carton leur permettant de ronger / se cacher, ainsi qu’un dôme avec une roue leur permettant de se dépenser (mobilité/exercice). Afin de réduire la perte de chaleur due à l’absence de poil, du coton sera ajouté dans la cage et la température de la table de manipulation sera augmentée d’un degré. Les souris seront stabulées en bas du portoir ventilé afin de limiter l’agression lumineuse. Les expérimentations ont été pensées pour être très courtes, permettant de diminuer les risques de chutes de températures et de stress de l’animal. L’injection des cellules cancéreuses, l’injection du médicament et la mesure des tumeurs se feront sous anesthésie gazeuse (flash anesthésie de quelques secondes) ceci permettra de réduire le stress lié à la procédure. La xénogreffe sera réalisée en sous cutanée sur le flanc des souris, ce site d’implantation étant considéré comme causant le moins de stress chez l’animal.
Choix des espèces
Des travaux antérieurs utilisant un protocole proche de celui que nous utiliserons ont été réalisés sur ces souris, ce qui justifie l’utilisation de cette espèce. Le traitement que nous allons tester a déjà été utilisé chez ces souris, aucun effet indésirable n’a été montré. Ces souris ont une éspérance de vie courte (8 à 9 mois), ce qui ne permet pas d’étudier le vieillissement naturel, mais qui justifie notre modèle. A notre connaissance il n’existe pas d’autre modèle animal rongeur adapté à ce protocole. Les tumeurs étudiées sont de tumeurs de l’adulte, c’est pourquoi dans le but de se placer dans conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité clinique, les souris seront âgées de 8 semaines ce qui correspond à un stade adulte. C’est l'âge de l’environnement qui sera injecté avec les cellule cancéreuses qui reproduira le vieillissement de l'environnement autour de la tumeur.
Génération d’une lignée de souris transgénique surexprimant la protéase HTRA3 comme modèle d’étude du vieillissement prématuré observé dans le syndrome de Cockayne
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur génère une lignée transgénique surexprimant une protéine pour provoquer un vieillissement prématuré, et décrit les atteintes attendues, perte de poids et de masse musculaire, baisse de la mobilité et des fonctions cognitives, douleurs chroniques, jusqu'à la mise à mort pour prélèvement d'organes. Les injections pharmacologiques sont administrées en une fois ou chaque jour sur dix jours. Il justifie le recours à l'animal par la rareté et la fragilité des patients atteints du syndrome de Cockayne et affirme qu'aucun système in vitro ne peut reproduire le vieillissement d'un tissu.
Objectifs
L’analyse de cellules dérivées de patients avec le syndrome de Cockayne (CS) a montré que la réparation défectueuse de l'ADN, due à l'altération de l’une ou l’autre des protéines n'était vraisemblablement pas la cause principale de la maladie, mais plutôt d’autres fonctions de ces mêmes protéines. Le vieillissement précoce et la neurodégénérescence dans le CS ont été réfractaires à l'expérimentation car les modèles murins ne récapitulent pas complètement la maladie, et car le matériel biologique provenant de patient est difficile à obtenir (les patients CS sont extrêmement fragiles). La faible représentativité des modèles animaux pour le CS représente un handicap majeur pour l'investigation et le développement éventuel de stratégies précliniques pour le CS. Au vu des données indiquées au-dessus, il est fort possible que la surexpression d’une protéine candidate soit une cause majeure de la maladie. Nous prévoyons donc de générer une nouvelle lignée de souris inductible cette protéine pour vérifier cette hypothèse.
Bénéfices attendus
Nous nous attendons à ce que cette lignée de souris exprime de manière ubiquitaire (dans tous les organes/tissus) des niveaux élevés de la protéine , de manière constante ou pendant des périodes données lorsqu'elle est supplémentée ad hoc avec un inducteur. Les souris surexprimant la protéine en permanence et/ou pendant des périodes données devraient présenter des signes de vieillissement prématuré et/ou de neurodégénérescence. Nous nous attendons à une durée de vie plus courte que les souris non supplémentées en inducteurs ou les souris contrôle (non transgéniques) ainsi qu’à une apparition plus précoce de la dégénérescence de plusieurs organes et du cerveau, ce qui se traduit par une mobilité, une flexibilité et une cognition affectées. Enfin, ce modèle de souris sera d'une grande importance pour les études mécanistes et précliniques du syndrome de Cockayne, y compris pour les thérapies, puisque nous avons identifié plusieurs molécules antioxydantes effectives in vitro.
Procédures
Les animaux recevront un traitement pharmacologique en injection unique (durée 15 sec/animal) ou en injections répétées de façon quotidienne (durée 15 sec/animal) sur une durée de 10 jours
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont ceux caractéristiques du processus de vieillissement ; incluant une perte de poids (musculaire), une réduction de la mobilité et des fonctions cognitives, et des douleurs chroniques (posturale, fibrotique), et ceux jusqu’à la mise à mort des animaux à la fin du protocole expérimental.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin du protocole expérimental ou en cas d’atteinte d’un point limite pour prélèvement d’organes pour analyse des défauts au niveaux moléculaire et/ou cellulaire et/ou histologique (les animaux ne pourront donc pas, ni être réutilisés, ni replacés, ni adoptés)
Remplacement
Aucun système in vitro ne peut récapituler la complexité des interactions et reproduire fidèlement les conditions naturelles au sein d’un tissu normal ou en vieillissement. Ceci est particulièrement justifié pour le vieillissement qui se définit par la dégénération d’un tissu ou organe avec le temps. Il est par conséquent difficile d’étudier l’ensemble des composantes du vieillissement à l’échelle cellulaire. En plus de ces limitations, le matériel biologique issu des patients (sang, biopsies) est très difficile à obtenir du fait de leur faible nombre (incidence : 1/200000) et de leur fragilité extrême. Le processus de vieillissement implique une multitude de réponses et d’interactions cellulaires avec leur environnement au sein d’une ultrastructure tridimensionnelle complexe (matrice extracellulaire tridimensionnelle, types cellulaires variés, facteurs de croissance, etc), qui ne peuvent être appréhendé dans leur globalité qu’in vivo.
Réduction
Les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en fonction de la nature de l'expérience et des paramètres mesurés, - de la variabilité de ces paramètres, - de façon à produire des résultats statistiquement interprétables. Un nombre de 6 animaux, pour les groupes contrôles et les groupes expérimentaux, sont utilisés pour réaliser les expériences. Les résultats obtenus entre les groupes expérimentaux et les groupes contrôles sont analysés par des tests d’hypothèse paramétrique ou non paramétriques.
Raffinement
Un suivi régulier des animaux selon leur état général de santé et le développement des signes caractéristique du vieillissement (aspect pelage, motricité/activité, appétit) est prévu. Le poids des souris sera également enregistré. Les cages seront également garnies avec des éléments d’enrichissement pour réduire l’impact d’un environnent stressant pour les animaux. En cas d’identification d’une douleur ou souffrance quelconque de l’animal, liée ou non au vieillissement induit, des traitements sont prévus avec administration d’analgésique pour assurer un confort total des animaux. Si les signes cliniques de souffrance ne s’améliorent pas dans les jours suivants, ou en présence d’une perte de poids trop importantes, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Les souris sont des petits mammifères. Ils partagent donc de nombreuses similarités avec l’Homme. Elles constituent un modèle très maîtrisé par l’ensemble des équipes de recherche. Leur temps de génération est court et les effectifs des portées élevés, ce qui permet d’avoir rapidement accès à un grand nombre d’animaux. De nombreuses lignées existent (souris génétiquement modifiées). Cette richesse de ressources permet des croisements facilités afin d’étudier des composantes multifactorielles, particulièrement appropriées pour l’étude du vieillissement et surtout des maladies liées à l’âge, qui ne sont pas causées par l’altération d’un seul gène. Ceci entre dans le cadre du raffinement avec la possible valorisation d’animaux non utilisés pour d’autres projets. L’évaluation du phénotype de la nouvelle lignée nécessite l’utilisation des animaux à la naissance, au sevrage et à l’âge adulte. Dans l’autre procédure les animaux seront utilisés à partir de l’âge adulte (6 à 8 semaines) pour que le sevrage permette l’accès aux produits administrés dans l’eau de boisson ou la nourriture et ainsi réduire les injections. Notre objectif étant de générer un phénotype de vieillissement précoce par induction d’un transgène, les animaux seront utilisés jusqu’à l’apparition de signes phénotypiques d’un vieillissement sévère (souris gériatrique), et donc potentiellement pour les animaux contrôles jusqu’à 24-36 mois sous réserve d’un état général satisfaisant.
Evaluation préclinique d’une immunothérapie combinée dans la Maladie d’Alzheimer et autres pathologies liées à la protéine Tau chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
1 958 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles portent un modèle de maladie neurodégénérative ou un système immunitaire déficient, subissent une biopsie d'identification sur souriceau vigile, jusqu'à 35 injections dans l'abdomen, jusqu'à deux injections dans le cerveau sous anesthésie et des prélèvements sanguins répétés, pour tester une immunothérapie ciblant les cellules immunitaires dans la maladie d'Alzheimer. Les retombées annoncées pour les patients sont renvoyées à de futurs essais cliniques, alors que le porteur a déjà lancé un essai pilote. Sur le remplacement, il affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent qu'une fraction des interactions en jeu et conclut qu'un modèle animal est "totalement indispensable".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est une pathologie neurodégénérative caractérisée par la perte progressive de la mémoire et des fonctions cognitives. Elle est définie par deux types de lésions cérébrales : celles liées à la protéine A-Béta, et celles liées à la protéine Tau. Ces agrégats protéiques induisent une réaction immunitaire à plusieurs composantes. La première composante, consiste en une inflammation chronique cérébrale pouvant avoir des effets bénéfiques ou délétères. Des études récentes ont montré l’existence d’une seconde composante, par laquelle des cellules immunitaires infiltrent le cerveau et promeuvent la progression du déclin cognitif. Plusieurs analyses chez l’Homme et dans des modèles expérimentaux suggèrent que ces cellules ont un rôle délétère dans la MA. Des études ont montré que la modulation de ces cellules immunitaires délétères permet de réduire la perte de mémoire et de modifier l’inflammation cérébrale dans un modèle murin de pathologie A-Béta. Ces cellules immunitaires régulatrices pourraient également contrôler les réactions immunitaires pathogènes liées à la protéine Tau pathologique. Sur la base d’études pré-cliniques dans un modèle murin de pathologie Tau, l’objectif de ce projet est d’évaluer une approche thérapeutique innovante ciblant les cellules immunitaires dans la MA et d’autres pathologies liées à la protéine Tau.
Bénéfices attendus
La Maladie d’Alzheimer (MA) touche environ 1 million de personnes en France, avec 225 000 nouveaux cas chaque année. Cette maladie, sans traitement, nécessite une prise en charge importante liée à la perte d’autonomie des patients. Des études précliniques antérieures dans un modèle murin de MA ont apporté la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique d’un traitement à faible dose d’une molécule. Cette preuve nous a permis d’initier un premier essai clinique pilote pour évaluer l’efficacité thérapeutique de ce traitement modulant les réponses immunitaires délétères dans la MA précoce. Ce projet vise à présent à évaluer et établir la preuve de concept pré-clinique de l’efficacité accrue d’une nouvelle approche ciblant les réponses immunitaires pathogènes associées aux agrégats de protéine Tau. Ces études devraient ouvrir la voie au développement de nouveaux essais cliniques thérapeutiques dans la MA et dans d’autres maladies neurodégénératives, dans le but de proposer une prise en charge plus efficace aux nombreux patients touchés par ces maladies.
Procédures
Les animaux modèles de la Maladie d’Alzheimer développent une maladie neurodégénérative avec des déficit cognitif au cours du temps. Un autre modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Les animaux seront identifiés génétiquement à l’aide d’une biopsie (>1mm) effectuée de manière précoce sur animal vigile. Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des injections répétées au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale) à raison d’un maximum d’une injection quotidienne durant 10 jours à l’âge de 3 mois puis de rappel toutes les 3 semaines durant 5 jours jusqu’à l’âge de 9 mois (environ 20 secondes par injection). Les injections seront réalisées sur animal vigile avec au minimum 1 injection et au maximum 35 injections intra-péritonéales sur la durée du traitement. Ils auront également au maximum deux injections au niveau du crâne (intracérébroventriculaire) à l’âge de 3 mois pour la première et la seconde à un temps qui sera défini au cours du projet (environ 30 minutes par procédure chirurgicale). Ces injections seront réalisées sous analgésie et anesthésie. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile à la fin des 10 premiers jours puis au maximum toutes les 2 semaines sur la durée du traitement (environ 30 secondes à 1 minutes par prélèvement). Les animaux seront prélevés entre 1 et 9 fois sur la durée du traitement. Des tests comportementaux seront effectués à l’âge de 9-10 mois. Ces tests durent entre 5 et 20 minutes chacun ; certains ne sont effectués qu’une seule fois, d’autres sont répétés tous les jours pendant 6 jours. Les souris seront habituées au lieu d’évaluation au préalable et auront un repos de 24h minimum entre chaque test. Enfin, les animaux seront euthanasiés selon différentes méthodes réglementaires à l’issue de la période de maintien prévue en vue des prélèvements et analyses.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entraîner des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). Un autre modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensibles aux infections. La biopsie (
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires. Une première partie dans le cadre du maintien des lignées sera euthanasiés en fin de période reproductive sans réalisation de prélèvement. Une seconde partie euthanasiée afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact du traitement sur les différents marqueurs de progression de la pathologie.
Remplacement
L’ensemble de ce projet vise à mieux comprendre les interactions neuroimmunes au cours des maladies neurodégénératives. Il nécessite donc l’utilisation d’un système expérimental intégré, permettant de comprendre la physiologie du système nerveux central et ses interactions encore mal connues avec le système immunitaire. Ces interactions ne peuvent être reproduites par des cultures cellulaires, qui ne permettent que l’étude du contact entre les cellules immunitaires et les cellules nerveuses. Or, ce type d’interaction ne constitue qu’une fraction minoritaire des échanges en jeu dans les maladies neurodégénératives. Des simulations informatiques ont également été effectuées et nous ont permis de valider que des réponses immunitaires spécifiques contre la protéine Tau étaient possibles. Cependant, l’effet de la modulation de ces réponses sur les maladies neurodégénératives ne peuvent être évaluées que dans un organisme vivant. Un modèle animal est donc de ce fait totalement indispensable.
Réduction
Le projet impliquera un total de 1958 souris. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Les souris utilisées pour une partie des analyses biologiques seront les mêmes animaux que ceux utilisés pour les tests comportementaux. Par ailleurs, une analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
L’ensemble des procédures réalisées au cours de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.) quand cela est compatible avec les expériences. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi, etc.). De plus, la lignée utilisée est déjà bien caractérisée et connue de l’équipe, et les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est une espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. Il s’agit également d’une espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux des pathologies neurodégénératives et de lignée immunodéficiente nécessaire à la mise en œuvre de ce projet. Justification des stades de développement : Dans le cadre de l’entretien des modèles transgéniques à phénotype potentiellement dommageable, les animaux seront utilisés à partir de la maturité sexuelle (8 semaines). Dans le cadre des traitements, ils seront initiés à l’âge de 3 mois, correspondant au stade précoce de la pathologie. Les animaux seront ensuite analysés à 9-10 mois (âge normal d’apparition des troubles cognitifs). Justification du sexe : Concernant les modèles transgéniques utilisés, nos résultats préliminaires indique qu’il existe une différence de phénotype comportemental et neuroimmunitaire entre mâles et femelles. Ainsi, l’ensemble des expériences sera réalisé sur les deux sexes de manière indépendante.
Impacts précoces d’une suralimentation postnatale sur le métabolisme et sur la prolifération cellulaire cardiaque chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'au sévère. Une partie subit une chirurgie cardiaque d'ischémie-reperfusion d'environ 1h15 sous anesthésie et des tests glycémiques avec injections, puis est tuée pour analyser le tissu cardiaque, tandis que douze femelles allaitantes sont replacées ou données à d'autres équipes après prélèvement de lait. Le projet cherche à relier suralimentation juste après la naissance et maladies cardiaques à l'âge adulte. Le porteur affirme qu'apprécier la fonction cardiaque impose de travailler sur "l'organisme entier" et qu'aucun modèle cellulaire ne reflète l'environnement neuro-hormonal.
Objectifs
L’environnement au cours des premières étapes de la vie, pendant les périodes fœtales et postnatales, joue un rôle important dans la détermination de la santé d’un individu. Dans ce cadre, on sait désormais que l’alimentation avant et après la naissance peut influencer non seulement le poids corporel et le pourcentage de masse grasse, mais aussi favoriser à long terme le développement de maladies cardiaques et métaboliques. Un modèle rongeur permettant l’étude des conséquences d’une suralimentation juste après la naissance à été développé et est pertinent car il rassemble plusieurs des critères d’une maladie très commune chez l’Homme : le syndrome métabolique. Le syndrome métabolique est une maladie complexe regroupant plusieurs facteurs de risque très répandus chez l’Homme comme : un tour de taille trop important, des taux élevés de glucose, de lipides et de « mauvais » cholestérol dans le sang, mais aussi une tension artérielle trop importante. Une des originalités du modèle rongeurs de suralimentation postnatale repose sur l’apparition à l’âge adulte d’une diminution de la fonction contractile du cœur qui serait due à une diminution de la capacité des cellules contractiles du cœur, appelées cardiomyocytes, à battre correctement et à permettre au cœur d’envoyer une quantité de sang suffisante à tout l’organisme. Ces cardiomyocytes ont la capacité de se multiplier, c’est-à-dire de proliférer, juste après la naissance et pendant quelques jours encore. Mais cette capacité disparait 10 jours après la naissance, et le nombre de cardiomyocytes est fixe pour le reste de la vie. Notre hypothèse est que des changements au niveau des cardiomyocytes pendant les premiers jours de la période postnatale, aient une répercussion à long terme sur le fonctionnement du cœur et sur sa capacité à faire face à une privation en oxygène. Notre objectif sera de déterminer si la suralimentation postnatale peut altérer la capacité de prolifération des cardiomyocytes dans les jours qui suivent la naissance et quelles voies de signalisation cellulaires sont impliquées.
Bénéfices attendus
En termes de santé publique, ce travail permettra de confirmer que des perturbations nutritionnelles périnatales, c’est-à-dire pendant la grossesse et juste après la naissance, ont un impact à long terme sur la santé cardiovasculaire et métabolique des individus, et que des mesures de prévention appropriées appliquées précocement seraient utiles et nécessaires. Les résultats de nos travaux pourraient apporter de nouveaux messages afin d’accroitre la prise de conscience du Grand Public sur la nécessité de prévenir précocement les maladies cardiovasculaires par des mesures préventives adaptées. D’un point de vue socio-économique, l’impact du surpoids sur des maladies cardiovasculaires est clair, et la prévention du surpoids infantile pourrait aussi améliorer les conditions dans le domaine économique et sociétal.
Procédures
Le prélèvement de lait sera réalisé sur des femelles allaitantes anesthésiées à l’isoflurane et suite à une injection intrapéritonéale d’ocytocine (injection de 2 UI par souris, dans un volume de 100 µL, à l’aide d’une aiguille de 26 gauge). Une chirurgie cardiaque conduisant à une ischémie (privation en oxygène et nutriment d’un tissus) reperfusion du tissu cardiaque sera réalisée sur des souris âgées de 6 mois. La durée moyenne d’anesthésie pour ce type de chirurgie est de 1h15, avec une durée d’ischémie de 45 mins, suivi de 24 h de reperfusion. Les tests glycémiques représentent deux sessions de 2h15 chacune avec le prélèvement d’une faible quantité de sang par souris (20µL approximativement au total) précédés d’une injection intrapéritonéale de glucose ou d’insuline (100µL de solution diluée pour 10g de souris). Une semaine est nécessaire entre les deux tests glycémiques, ce qui représente deux injections IP à une semaine d’intervalle.
Impact sur les animaux
La préhension des animaux lors de l’induction de l’anesthésie pour les chirurgies cardiaques pourrait causer un certain stress. La chirurgie peut provoquer des douleurs per et post opératoires qui seront maitrisées par l’utilisation d’un anesthésique local ainsi que deux injections intrapéritonéales d’analgésique général. De plus, La chirurgie cardiaque peut engendrer chez les souris des difficultés d’accès à l’alimentation pouvant entrainer une perte de poids. Pour faciliter l’accès à la nourriture, de la nourriture en gelée ainsi que des croquettes seront placées dans la cage. Les souris peuvent avoir froid pendant et après la chirurgie par conséquent les animaux se réveilleront en couveuse chauffée et seront ensuite placées dans des cages thermorégulées grâce à l’utilisation de tapis chauffant. Enfin, la chirurgie peut induire une perte modérée du poids corporel des animaux qui sera méticuleusement suivi et toute perte de poids égale à 20% entrainera l’euthanasie des animaux. Toutes les pièces de manipulation sont dédiées à l’expérimentation animale et sont tempérées et calmes.
Devenir
Les animaux de la procédure 1 seront replacés (utilisation pour des mises au point, don à d’autres équipes), soit 12 femelles allaitantes. Les animaux issus de la procédure 2 seront euthanasiés afin d’analyser les caractéristiques du tissu cardiaque pour mieux comprendre les altérations cardiaques induites par une Suralimentation postnatale, reflet de la cardiomyopathie induite par le surpoids et l’obésité chez l’Homme.
Remplacement
Le syndrome métabolique est une pathologie multifactorielle. Pour apprécier son incidence sur la fonction cardiaque, il est indispensable de travailler sur un organisme entier mais aussi sur des cardiomyocytes fraichement extraits. De plus, l’étude de la fonction et du métabolisme cardiaque ne peut se passer d’une étude chez l’animal entier. En effet, les modèles cellulaires ne reflètent pas l’environnement neuro-hormonal, ni la fonction cardiaque dans son ensemble (contraintes de pression par exemple).
Réduction
Ne seront utilisés que le nombre d’animaux strictement nécessaire à la conduite du projet et à l’obtention de statistiques suffisantes. Le nombre de 9 animaux par groupe est suffisant pour obtenir des résultats statistiques.
Raffinement
Les souris seront constamment hébergées en groupe avec un enrichissement de leur milieu de vie, dans une pièce calme et tempérée. Les aliments et l’eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié et des soins pourront être apportés si l’état de santé des rongeurs le nécessite. L’évaluation de la douleur se fera à l’aide d’une grille de score et sa prise en charge sera faite par l’utilisation d’anesthésiques locaux et généraux. Enfin, des points limites ont été définis et seront respectés pour l’ensemble des procédures.
Choix des espèces
La souris nous permet d’envisager les effets de la suralimentation sur un modèle très étudié dans différents projets, au niveau national et international, et qui sert de témoin « sauvage » aux études sur animaux génétiquement modifiés. De surcroît, les mécanismes physiologiques des souris sont semblables à ceux de l’Homme, ce qui nous permet de réaliser des études translationnelles. Des femelles allaitantes seront nécessaires pour le prélèvement et l’analyse du lait maternel, elles seront âgées au minimum de 8 semaines de vie, âge à partir duquel les animaux sont matures sexuellement et peuvent se reproduire. Pour l’étude de l’impact à plus long terme d’une suralimentation post natale sur le risque cardiométabolique, les animaux auront 6 mois, ce qui correspond à un âge adulte chez la souris et à l’âge d’apparition des maladies cardiaques chez l’humain.
Induction de structures lymphoïdes par des virus oncolytiques modifiés chez la souris immunocompétente C57Bl/6
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales puis jusqu'à trois injections de virus oncolytiques modifiés, avant un prélèvement de tumeurs et d'organes. Le porteur indique surveiller d'éventuels effets auto-immuns et fixe des points limites détaillés, dont une tumeur pouvant atteindre 1000 mm³. Il décrit disposer de cultures en trois dimensions et de puces microfluidiques, mais affirme que l'étude des effets sur "l'organisme entier" impose le recours à l'animal.
Objectifs
Les virus "oncolytiques" sont de nouveaux agents thérapeutiques capables de détruire spécifiquement les cellules tumorales sans attaquer les cellules saines. Deux virus oncolytiques sont actuellement approuvés comme traitements contre le mélanome métastatique (cancer de la peau) et le glioblastome (cancer du cerveau). Les virus oncolytiques présentent trois modes d’actions principaux, à savoir la capacité à 1) tuer directement les cellules tumorales, 2) induire une réponse immunitaire anti-tumorale et 3) vectoriser des protéines thérapeutiques qui seront produites uniquement dans les tumeurs. Cette dernière propriété fait actuellement l’objet de nombreuses recherches au niveau international mais des questions importantes demeurent quant aux protéines à utiliser et aux conditions dans lesquelles les virus doivent être administrés in vivo. Notre projet vise ainsi à étudier, chez la souris immunocompétente, les effets thérapeutiques de virus oncolytiques codant pour différentes protéines impliquées dans la formation de structures lymphoïdes. Ces structures sont constituées de cellules immunitaires et permettent la mise en place de réponses anti-tumorales. Si les virus oncolytiques donnent des résultats très encourageants in vitro, l’évaluation des différents mécanismes impliqués requiert l'utilisation de modèles animaux vivants qui reproduisent la physiologie des tumeurs et les réponses immunitaires associées avant d'envisager un transfert vers la clinique.
Bénéfices attendus
Les efforts réalisés pour comprendre la biologie des tumeurs ainsi que l’amélioration continuelle des traitements tels que la chimiothérapie, la radiothérapie, et plus récemment l’immunothérapie ont déjà permis d’augmenter la survie des patients atteints de cancers. Cependant, dans de nombreux cas ces traitements présentent une efficacité limitée. De nouvelles molécules thérapeutiques potentiellement très efficaces nécessitent une vectorisation appropriée pour profiter de leur efficacité tout en limitant les effets secondaires. Il a ainsi été montré qu’une vectorisation des agents anti-cancéreux permettait de diminuer la morbidité associée au traitement mais aussi d’en améliorer l’efficacité et de limiter l’établissement d’une résistance dans les cellules tumorales. Ce type de stratégie thérapeutique est d’autant plus intéressant dans le cas de cancers très agressifs pour lesquels nous ne disposons pas encore d’options thérapeutiques satisfaisantes. L’utilisation de virus oncolytiques pour vectoriser des molécules au sein même des tumeurs est une approche innovante destinée à répondre à ces problématiques. En créant de nouveaux virus oncolytiques immunoactivateurs, nous espérons pouvoir apporter des réponses thérapeutiques à des problèmes actuels en cancérologie.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales puis à des injections intraveineuses, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales répétées de traitements. Chaque injection durera une trentaine de secondes, à raison d'un maximum de 4 injections (1 challenge + 3 traitements) par animal.
Impact sur les animaux
Nous avons préalablement pu vérifier que l’injection de virus oncolytiques aux doses prévues n’entraîne pas de morbidité particulière ou de douleur chez les animaux. Concernant les protéines thérapeutiques codées par ces virus, il s’agit de cytokines et chimiokines connues. Les données de la littérature suggèrent que des effets secondaires auto-immuns pourraient être observés. Une attention particulière sera apportée au suivi de ces effets éventuels (peau, intestin et foie notamment). Chacune des procédures nécessitera la réalisation d'injections intraveineuse, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales qui peuvent être à l'origine d'une douleur légère et générer un stress modéré et ponctuel chez les animaux. Dans toutes les procédures, l'établissement et la croissance des tumeurs pourra aussi générer des douleurs qui seront détectées précocement grâce aux points limites préalablement établis pour chaque procédure.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour prélever des échantillons (tumeurs, rate, ganglions, autres tissus) qui serviront à obtenir des données supplémentaires sur ces expérimentations.
Remplacement
Notre laboratoire a développé au cours des dernières années des systèmes de culture in vitro complexes (sphéroïdes, puces microfluidiques) qui nous permettent de nous affranchir de l'utilisation d'animaux pour une majorité de nos expériences. L'approche sur organisme entier nous permet cependant d’évaluer l’effet thérapeutique des virus et de leurs transgènes mais également les effets toxiques potentiels sur divers tissus tels que le compartiment hématopoïétique par exemple. Une telle complexité n’est malheureusement pas encore reproductible in vitro. Dans la mesure où nous souhaitons étudier le ciblage in vivo des cellules tumorales dans un environnement complexe après administration des virus oncolytiques, ces expériences nécessitent d’être réalisées sur l’animal. Nous avons déjà validé la spécificité de nos virus sur un large panel de lignées cellulaires, en 2D et en 3D. Cependant, ces expériences ne permettent pas de présumer de la biodistribution réelle et des effets systémiques de nos traitements une fois injectés dans un organisme, en particulier les effets immunitaires.
Réduction
Les différents paramètres mesurés seront comparés par des tests statistiques adaptés aux très petits échantillons (n
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Toutes les procédures prévues dans ce projet sont de classe modérée. L’utilisation d’antalgiques morphiniques n’est pas envisagée car les animaux seront immédiatement euthanasiés en cas d’absence de réponse au traitement ou d’atteinte d’un point limite. Des points limites adaptés à l’espèce utilisée ont été prévus pour chaque procédure. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. En cas d’atteinte d’un des points limites suivants un signalement sera fait au responsable de la SBEA ainsi qu’au responsable de l’étude ou à son suppléant. Les animaux seront alors euthanasiés directement afin de prévenir toute douleur au stade le plus précoce possible et d’éviter la collecte de données altérées en raison d’un stress chez les animaux. •Critères cliniques : - Mauvais état du pelage (diminution du toilettage, poil ébouriffé, perte excessive de poils, plaies) - Faciès contracté et position anormale des vibrisses - Yeux clos et larmoyant - Gonflement abdominal pouvant être causé par l’accumulation de liquide d’ascites en raison des tumeurs - Fèces liquides ou absence de fèces - Taille de tumeur égale ou supérieure à 1000mm3 •Critères comportementaux : - Position recourbée (dos voûté, prostration) - Diminution de la mobilité interférant avec l’activité de base de l’animal (alimentation, toilettage) - Réduction de l’activité, isolement - Signes de stress (hyper-sensibilité aux bruits, agressivité, stéréotypie) •Critères zootechniques - Perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental
Choix des espèces
L’objectif principal étant d’évaluer les effets immunitaires de nos nouveaux virus oncolytiques, l’utilisation de souris immunocompétentes et de modèles tumoraux syngéniques est essentielle. L’implantation sous-cutanée des cellules tumorales se justifie par le suivi facilité de la croissance tumorale et la comparaison avec les données de la littérature qui utilisent des approches similaires. Nous utiliserons des animaux âgés de 7 à 10 semaines (jeunes adultes). Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes ayant un système immunitaire mature.
Evaluation préclinique de produits de santé pour la cicatrisation
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 550
Cochons d'Inde : 250
Cochons : 300
Pansements, crèmes et sutures sont testés ici pour le compte d'un donneur d'ordre, en vue de leur autorisation de mise sur le marché. 1 500 animaux non-humains, 400 souris, 550 rats, 250 cochons d'Inde et 300 cochons, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués à l'issue pour l'examen des tissus au contact du produit. Tous sont opérés sous anesthésie, de 30 minutes à 1 h 30, pour créer les plaies où le produit est appliqué, puis subissent des changements de pansements, avec ou sans anesthésie selon l'espèce, et parfois des prises de sang. Le porteur affirme que leur utilisation est "requise dans la réglementation", et déclare un niveau de souffrance sévère sans dire quelles procédures l'atteignent, les effets décrits se limitant à la douleur opératoire, à la gêne du pansement, au risque d'infection et à une perte de poids de quelques jours.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en cicatrisation (exemple : pansements, crèmes, sutures...). Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux des données de performance et/ou de tolérance des produits de santé en cicatrisation. Ainsi, il est possible d'étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l’offre et améliorant ainsi les chances de guérison et le confort des patients humains traités.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin de créer les plaies et y appliquer le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 30 minutes et 1h30). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et/ou gazeuse) et analgésie. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). Des observations des plaies et des changes de pansements auront régulièrement lieu, avec ou sans anesthésie selon les espèces.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - douleur et stress liés à la chirurgie, contrôlés par la prise d’analgésique (morphinique) et par la réalisation d’une anesthésie générale. Un suivi a minima quotidien des animaux permet de détecter les signes de douleur et d’adapter le traitement analgésique en conséquence pour diminuer autant que possible ces nuisances. - présence d’un pansement secondaire pour protéger les plaies et les articles appliqués ainsi que les risques d’infection. L’intégrité de ce pansement secondaire est vérifiée quotidiennement et peut éventuellement gêner l’animal. - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours, contrôlée par le suivi quotidien du transit et/ou de l’alimentation et la mise en place de mesures de soutien, jusqu’à la reprise d’un comportement alimentaire normal et spontané. Les mesures mises en place peuvent être par exemple : mise à disposition d’aliments plus appétant (friandises), distribution d’un aliment de convalescence (prise spontanées ou assistée) ...
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé. En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé en cicatrisation.
Réduction
Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Par ailleurs pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu), pour plusieurs groupes "test". Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêts à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc).
Raffinement
Des mesures sont mises en place pour limiter : - Le stress des animaux : une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ensuite, et avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (en fonction de l'espèce : jouets, éléments de nidification…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…) - La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). En phase post-opératoire, ces suivis sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (surveillance et éventuellement réfection additionnelle des pansements (en plus de ceux prévus les jours de lecture), nettoyage des plaies à chaque réfection de pansement, prolongation du traitement analgésique post-opératoire). La douleur liée aux prises de sang éventuelle peut être maitrisée par la réalisation de la prise de sang sous anesthésie générale (injectable et/ou volatile, lors d'une phase de chirurgie par exemple), ou locale, ou encore sous sédation légère.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie en fonction des attentes du test et les similarités avec l’homme : - Structure de la peau et processus de cicatrisation similaires chez les porcins. - Plus d’exsudation des plaies chez les porcins que chez les rongeurs. - Processus normal de cicatrisation des rongeurs par contraction, comme certains types de plaies chez l’Homme (par exemple, plaies de brulures) - Lorsqu’un phénotype/génotype diabétique est nécessaire pour une étude, les espèces de petite taille, telles que les rats et les souris, sont privilégiées car ces lignées sont plus facilement générées et maintenues. - Les petits animaux (rat, souris, cobayes) sont souvent utilisés pour des raisons de facilité d’utilisation (actes techniques plus facilement réalisables car animaux moins lourds, hébergement de plus petite taille). Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1.Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2.Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requière, le stade de développement est pertinemment sélectionné. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. 3.Cas particulier des porcs Pas de recommandation spécifique réglementaire d’où choix d’utiliser des porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines). Etant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs en croissance est la plus appropriée dans ce projet.
Thérapie génique expérimentale pour le traitement de la myopathie congénitale liée à la myopalladine
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Quatre tests de force et d'endurance musculaire répétés à 1,5 mois, puis à 3, 6, 8 et 12 mois, et la mise à mort pour prélever muscles et organes : 97 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Une partie reçoit en plus deux prises de sang et une injection unique d'un vecteur viral, dans un muscle de la patte ou dans la veine de la queue, sous anesthésie générale. Dépourvues de myopalladine par modification génétique, ces souris sont exploitées pour décrire une myopathie congénitale rare et tester une thérapie génique, le porteur affirmant qu'elles reproduisent les caractéristiques cliniques de la maladie humaine tout en écrivant qu'elles "ne semblent pas génées par l'absence de myopalladine". Il ne nomme pas les quatre tests, et fixe l'effectif à huit souris par condition d'après un calcul statistique fait sur des rats d'une lignée de myopathie de Duchenne.
Objectifs
Les myopathies congénitales constituent un groupe hétérogène de troubles neuromusculaires héréditaires dont les symptômes sont une faiblesse musculaire et des déformations squelettiques, ayant pour certaines un fort impact sur la survie et la qualité de vie des patients. Ce projet vise à combler une lacune majeure dans le traitement d'une myopathie congénitale très rare liée à des mutations du gène mypn engendrant un défaut de production de la protéine myopalladine (MYPN-CM, MYPN-associated congenital myopathy). Les mutations dans ce gène mypn entraînent une absence totale ou une diminution de la quantité de protéine MYPN fonctionnelle specifiquement dans les muscles, altérant l’intégrité du tissu musculaire cardiaque et squelettique, à l’origine de myopathies congénitales rares diagnostiquées généralement dès la naissance ou durant l’enfance. Le but du projet présenté pour une durée de 5 ans vise à caractériser plus précisément l'une de ces myopathies congénitales et de mettre au point une thérapie génique pour traiter cette maladie encore incurable, en rétablissant l’expression de la myopalladine manquante. Dans ce but, un modèle murin déficient pour cette protéine MYPN (souris MKO) sera utilisé, reproduisant les caractéristiques de la maladie humaine du point de vue clinique . Un premier objectif de l'étude est de mieux caractériser les souris MKO à différents âges afin de mieux comprendre l'évolution de la maladie dans ce modèle. Cette première étude permettra également d'établir les paramètres à évaluer lors de la thérapie génique expérimentale qui constitue le deuxième objectif. Les différents paramètres seront analysés avant et après administration d'un vecteur viral permettant une expression de la protéine MYPN chez les souris MKO, afin de déterminer les bénéfices thérapeutiques de ce traitement, mais également d’écarter tout potentiel effet indésirable sur les autres organes.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à répondre à un besoin médical non satisfait en fournissant une approche de traitement novatrice pour la MYPN-CM qui consiste en une approche de thérapie génique. Ce projet devrait produire un bénéfice à court terme avec la caractérisation en profondeur du modèle murin MKO qui pourra ensuite être comparé à la trajectoire de la maladie chez l’humain. Cela permettra de caractériser la maladie et de mieux comprendre son évolution au fil du temps. Le bénéfice à long terme sera obtenu après l’achèvement du projet grâce auquel il est attendu une rapide évolution vers une phase pré-clinique puis clinique pour la thérapie génique de la MYPN-CM.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une étude de leur force/résistance musculaire par 4 tests non invasifs de courte durée. Chaque test sera réalisé à différents âges des souris 1.5, 3, 6, 8 et 12 mois. Certaines souris seront également soumises à deux prélèlements sanguins au niveau de la veine de la queue et une 1 injection unique de vecteur viral dans un muscle de la patte ou dans la veine de la queue sous anesthésie générale ne dépassant pas 10 min afin d'éviter stress et douleur.
Impact sur les animaux
Dans les conditions de vie courante en cage, les souris MKO sont de plus petites tailles mais ont une longevité comparable aux souris sauvages et du fait d'une activité réduite elles ne semblent pas génées par l'absence de myopalladine. La réalisation des tests fonctionnels d'effort peut engendrer un léger stress, un essoufflement et une faiblesse musculaire. L’injection des vecteurs viraux par voie intramusculaire ou dans la veine de la queue peut engendrer une légère douleur jusqu’à quelques heures après l’injection qui sera prise en charge par un traitement antalgique.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, toutes les souris seront mises à mort afin de pouvoir procéder à une caractérisation moléculaire et histologique de différents tissus. Selon les procédures, les muscles et plusieurs organes d’intérêt seront prélevés afin de vérifier les bénéfices et éventuels effets indésirables sur d'autres organes (foie, cœur, rate, etc…) que ceux ciblés par la thérapie (les muscles).
Remplacement
En amont de l'étude expérimentale chez les souris MKO déficientes en myopalladine, les vecteurs développés seront d’abord testés sur des cellules musculaires in vitro, ce qui permettra de valider leur effeicacité avant l’injection chez l’animal, et ainsi réduira le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Du fait de la visée thérapeutique de ce projet, il est cependnat essentiel de réaliser des tests pré-cliniques dans le modèle animal afin de vérifier l'expression de la myopalladine in vivo suite à l'injection des vecteurs viraux dans le muscle, et ceci sans effets secondaires tels qu'une réaction inflammlatoire violente et une hépatotoxicité, toutes deux malheureusment déjà observées dans d'autres thérapies géniques. A ce titre, il est nécessaire de tester l'efficacité de la thérapie génique in vivo, dans un organisme entier dont l’ensemble des organes est en interrelation constante afin de vérifier le tropisme et l'inocuité du traitement.
Réduction
Pour la caractérisation clinique (force et endurance), les mêmes animaux seront utilisés à différents âges (1.5, 3, 6, 8 et 12 mois), ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées. Ces souris seront ensuite mises à mort afin de prélever tous les muscles qui serviront pour plusieurs analyses. Pour les analyses histologiques et moléculaires à 1.5, 3, 6, 8 et 12 mois d’autres souris, seront mises à mort hors procédure pour prélèvement d'organes uniquement. Le modèle MKO n’a fait l’objet que d’une seule publication et les auteurs se sont principalement concentré sur les défauts cardiaques du modèle et n’ont pas caractérisé en profondeur le phénotype musculaire ce que nous souhaitons faire. Cette myopathie est extrêmement rare chez l’homme et n’est donc que très mal caractérisée également. La faiblesse musculaire est par ailleurs légère comparée à d’autres myopathies telle que la dystrophie musculaire de Duchenne ou même celle de Becker. Les marqueurs conventionnels utilisés comme la phosphocréatine kinase ne sont pas appropriés pour comparer les animaux sauvages et les MKO c’est pourquoi nous souhaitons conduire cette étude. Pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes donc basés sur notre expérience avec d’autres modèles de myopathie notamment les rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Dans ce modèle, il a été calculé par une approche statistique que 8 rats seraient nécessaires afin d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution de la maladie. Il se trouve que ce nombre est également celui utilisé dans la première étude de ce modèle, c'est pourquoi nous avons choisi ce même nombre de souris par condition pour cette étude. Enfin, en travaillant par étape, cela nous permettra d’appréhender et d’optimiser les expérimentations au fur et à mesure afin de réduire au mieux le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont dans des cages ventilées dans des zones dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les souris ont en permanence accès à l’eau et à la nourriture et ne sont jamais isolées, elles restent avec leurs congénères et sont uniquement séparées par sexe afin d’éviter les accouplements non contrôlés. Les souris sont dans un environnement avec un cycle d’éclairage de 12h par jour. Les animaliers sont formés à procéder à l’amélioration des conditions d’hébergement par ajout de papier et d’abris en carton dans les cages. Les animaux sont régulièrement surveillés et manipulés par du personnel qualifié afin de s’habituer à l’homme et éviter tout stress lors des procédures animales. Les méthodes expérimentales ont été choisies pour éviter au maximum les douleurs lors des interventions sur les animaux. Les tests cliniques ne sont pas douloureux et ne correspondent qu’à des exercices physiques, et les injections des vecteurs dans le muscle ou dans les veines de la queue se feront sous anesthésie et n'entraîneront qu’une très légère douleur. Après chaque injection, les souris seront surveillées (signes de détresse, comportement, poids corporel, prise de nourriture) et en cas de signes de douleur, un anti-douleur sera administré pendant 24h. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleurs chez les animaux.
Choix des espèces
La souris MKO présente des similarités cliniques et histologiques avec les patients MYPN-CM que nous souhaitons caractériser plus en profondeur. La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée des expériences proposées, particulièrement pour la caractérisation des souris à 12 mois. Les approches de thérapie génique expérimentale sont facilement réalisables sur ce petit modèle, et sont essentielles avant de passer à une étude pré-clinique chez un modèle animal plus gros comme le chien, puis à une étude clinique chez l’homme. Les caractérisations phénotypiques se feront à partir de 1.5 mois, âge qui correspond au début de la puberté chez l’homme. En effet, nous savons que les phénotypes apparaissent à la naissance ou durant l’enfance. Ensuite, la maladie est progressive et à 3 mois, les souris MKO commencent à montrer une faiblesse musculaire. La caractérisation phénotypique se poursuivra entre 3 mois, âge correspondant au jeune adulte dont les muscles sont complètement formés, et 12 mois, âge adulte avancé chez l’homme. Cette stratégie permettra d’établir une trajectoire précise de la maladie au fil du temps, ce qui aidera à mieux comprendre l’évolution de la maladie chez l’homme. Puis ce modèle servira à évaluer les effets bénéfiques du traitement lorsque celui-ci est administré (1) avant l'apparition des symptômes (6 semaines) pour voir s’il est possible d’empêcher ou retarder l’apparition de la maladie ; et (2) après l'apparition des symptômes de la maladie (6 mois), pour voir s’il est possible de ralentir voir d’arrêter la progression de la maladie ou d’en promouvoir le décours.
Thérapie pour la myopathie à agrégats tubulaires en utilisant des ASOs dans le modèle souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une myopathie rare, elles subissent des tests de force répétés chaque mois, des prises de sang sous anesthésie, des injections du traitement et une mesure terminale de la force musculaire sous anesthésie sans réveil. Le porteur indique que les souris malades sont plus petites et présentent des atteintes du muscle, de la peau, de la rate et des os. Il affirme qu'un modèle cellulaire ne permet pas d'évaluer la contractilité du muscle ni les effets sur "l'organisme entier".
Objectifs
La myopathie à agrégats tubulaires (TAM) est une maladie rare caractérisée par une faiblesse musculaire progressive, des crampes, et des myalgies. La majorité des patients montrent des anomalies de la peau, des os, des plaquettes, et de la rate. La présentation complète de ces signes multi-systémiques est appelé syndrome de Stormorken (STRMK). TAM et STRMK forment un spectre de la même maladie. Afin de corréler les dysfonctions cellulaires avec le développement de la maladie, nous avons généré et caractérisé un modèle murin portant la mutation TAM/STRMK la plus commune. Les souris présentent les principaux signes cliniques des patients. A ce jour, aucun traitement n’est disponible ni pour prévenir ni pour atténuer ces signes mutisystémiques. Nous avons l’intention d'inverser les symptômes des souris TAM/STRMK par une régulation négative d'un gène important pour la maladie, afin de fournir une approche translationnelle pour les essais thérapeutiques prospectifs chez les patients. Nous avons effectué des études cellulaires et déterminé une réduction de l'expression du gène d'intérêt. Ces résultats préliminaires nous encouragent à tester la même approche dans un modèle murin de la maladie, afin de pouvoir à la fois prévenir et inverser le phénotype multisystémique des souris TAM/STRMK.
Bénéfices attendus
Il est attendu que cette étude apporte la première preuve que ce concept de traitement soit efficace pour la TAM/STRMK. Etant donné que nos résultats préliminaires ont montré un effet au niveau cellulaire, il reste à démontrer qu'il en est de même au niveau musculaire après l'administration du traitement, avec la même efficacité. Et vérifier egalement l'amélioration du phénotype des plaquettes, de la peau, de la rate, et des os, après traitement par injections systémiques. L'étape suivante sera de vérifier l'effet thérapeutique chez des patients TAM/STRMK dans des tests cliniques ultérieurs.
Procédures
Des tests de comportement seront réalisés une fois par mois chez l’animal vivant, à partir de l'âge de 4 ou 16 semaines selon la cohorte jusqu’à 4 ou 8 mois d’âge. Le test de comportement permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour, avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque test. Chaque essai durera au maximum 60 secondes. Le test de comportement permettant de mesurer la force musculaire des pattes antérieures de l’animal dure 10 secondes, et sera répété 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes. Le test permettant de mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 24h, et sera répété 2 fois dans la vie de la souris. Le test nécessitant le prélèvement de sang est utilisé pour évaluer la coagulation sanguine et la capacité de l'organisme à former un caillot en cas de lésions vasculaires. L'animal sera anesthésié avant chaque prise de sang afin de réduire la douleur et le stress que cela pourrait causer. Le prélèvement du sang sera répété 2 fois dans la vie de la souris, et durera 1 minute. La mesure de la production de force du muscle est une procédure sans réveil, qui durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera mis à mort. Des injections musculaires et intraveineuse seront réalisées pour administrer le traitement. Entre l'anesthésie et l'injection, la procédure prendra environ 2 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les souris malades sont plus petites que les souris sauvages et manifestent des problèmes dans le muscle, la rate, la peau, les plaquettes et l'os, tout comme pour l'homme. Le modèle murin est un outil approprié pour étudier le développement de la maladie et l'effet thérapeutique attendu des traitements étudiés. Les tests de comportement peuvent induire du stress chez l'animal. Les injections du traitement peuvent causer douleur chez l'animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issu des tests pour prélever les muscles nécessaires aux analyses moléculaires.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme ce qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.
Réduction
Pour la partie expérimentale, les tests phénotypiques réalisés de manière non invasive offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui permet de s’affranchir de générer une nouvelle cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. L’organisation de nos procédures vise à utiliser le plus possible de tissus différents provenant de la même souris afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un maximum d’un test par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en veillant à obtenir une puissance statistique suffisante. Ainsi, nos précédentes études montrent que 15 souris au maximum par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, de la couleur de la peau, ainsi que l'évaluation de la nécéssité de la présence d'une poche de lait sera faite tous les 2 à 3 jours. Après le sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante. La qualité de l’air sera assurée par une ventilation et un cycle de 12 heures jour/nuit sera respecté. Les animaux auront accès à de l'eau et de la nourriture ad libitum. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire afin de maintenir les animaux au propre et au sec. L'environnement sera enrichi avec des nids. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. En cas de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l'aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo, ce qui limite le développement de la douleur. Afin de réduire le stress lié aux différents tests, une session de familiarisation sera effectuée avant le début du suivi longitudinal pour chaque test. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Si l'un des points limites est atteint, les souris seront euthanasiées.
Choix des espèces
Les souris sont nécessaires pour ces expériences afin de nous permettre d'évaluer les changements des propriétés physiologiques des différents muscles et organes après une modification génétique. Le modèle murin nous permet d'étudier l'amélioration potentielle du phénotype musculaire, ainsi que du phénotype observé sur d'autres organes, dans ce modèle de maladie murine multisystémique. Nous devons réaliser des expériences physiologiques in vivo chez la souris. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur des espèces plus éloignées de l'homme, car la structure musculaire diffère davantage. C'est pourquoi nous proposons d'utiliser des lignées de souris disponibles dans nos laboratoires pour réaliser ces techniques. Les tissus de souris peuvent ensuite être utilisés pour d'autres analyses, maximisant ainsi les résultats obtenus par souris et réduisant le nombre total d'animaux utilisés. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal, caractérisé par une faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît à l'âge de 2 mois et s'accentue avec l'âge, présentant un phénotype modéré à l'âge de 9 mois. Les souris seront utilisées à l'âge adulte, à partir de 4 semaines (pour la prévention de la maladie) jusqu'à 4 mois, puis à partir de 16 semaines jusqu'à 7 mois (pour le traitement de la maladie), afin d'observer le développement des souris après le traitement.
Rôle de la coagulation et de l’inflammation dans l’ischémie intestinale chez la souris et évaluation de l’efficacité de différents traitements.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
720 souris femelles vont être utilisées dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Leur abdomen est ouvert et l'artère irriguant l'intestin est clampée pendant une heure pour provoquer une ischémie, suivie d'une reperfusion et de prélèvements sanguins, certains animaux recevant un anticoagulant ou un anti-inflammatoire. Le porteur indique que la pathologie provoque des lésions de l'intestin et une contamination du sang par des bactéries, ce qui justifie selon lui l'euthanasie en fin de procédure. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne simule la circulation complexe en jeu et juge la simulation informatique "peu prédictive".
Objectifs
L’ischémie mésentérique aigue est une affection grave provoquée par une obstruction des vaisseaux irriguant l’intestin, diminuant le flux sanguin et l'apport d'oxygène dans ce dernier et entraînant une détresse intestinale. Ce projet a pour but de comprendre les mécanismes de la formation de caillots et de l’inflammation dans les vaisseaux sanguins irriguant l’intestin dans cette pathologie. En effet, l’intervention chirurgicale permettant la désobstruction des vaisseaux sanguins, induit une réoxygénation trop rapide du tube digestif, et conduit paradoxalement à des lésions des vaisseaux et de l’intestin importantes. Certaines études expérimentales animales ont montré́ que les lésions intestinales étaient initiées par le retour du sang oxygéné vers les tissus de l’intestin qui n’étaient plus irrigués. Cela est appuyé par certaines études, utilisant des modèles expérimentaux animaux, qui suggèrent l’idée qu’une réoxygénation progressive du tissu réduiraient les lésions intestinales. Notre hypothèse de recherche est que les mécanismes associés à la formation des caillots obstruant les vaisseaux et l'inflammation sont impliqués dans les lésions vasculaires et intestinales observées dans la pathologie. Nous avons également émis l'hypothèse que l'inflammation dû à la contamination du sang par des bactéries provenant de l’intestin pouvait être un facteur aggravant, qui pourrait participer à l'amplification des phénomènes observés. Deux objectifs sont décrits pour ce projet : 1) Caractériser les mécanismes conduisant à la formation d’un caillot et à l’inflammation contribuant à l’obstruction des vaisseaux sanguins irriguant l’intestin. 2) Explorer l’intérêt de différents traitements (Anti-coagulants, anti-inflammatoires) dans la limitation des lésions intestinales en thérapeutique expérimentale chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de mieux comprendre pourquoi il est difficile de restaurer une circulation sanguine efficace dans les vaisseaux irriguant l’intestin après l’élimination de caillots obstruant ces derniers et empêchant l’apport d’oxygène au niveau de l’intestin. Nous étudierons également, l'intérêt d’utiliser des traitements anti-coagulants et anti-inflammatoires dans cette pathologie. En effet, l’évaluation de nouveaux traitements susceptibles de contrôler les phénomènes responsables des lesions des vaisseaux et de l’intestin est primordiale afin d’améliorer le pronostic des patients atteints d’ischémie intestinale. La perfusion d’anti-thrombotiques tels que l'héparine, d’anti-inflammatoire comme l’aspirine ou des agents limitant les phénomènes d’inflammations dus à la contamination du sang par des bactéries provenant de l’intestin, pourraient diminuer la mortalité des patients atteints d’ischémie intestinale dans toutes ces applications cliniques encore insuffisamment comprises et efficacement traitées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une unique procédure sans réveil. Ils seront opérés sur une table chauffante à 37°C, après une anesthésie générale et un traitement antalgique. Après ouverture abdominale, un clamp sera posé sur l'artère principale permettant l’irrigation de l’intestin (artère mésentérique supérieur) induisant l’interruption temporaire de la circulation sanguine au niveau intestinal. Le clamp sera maintenu en place pendant 1 heure avant d’être retiré afin de rétablir la circulation sanguine intestinale. Nos observations commenceront dès la pose du clamp (ischémie) et jusqu’à 1 heure après le retrait du clamp (reperfusion). Un prélèvement sanguin sera effectué en début et en fin de procédure. Afin d'évaluer l'efficacité de différentes molécules thérapeutiques, certains animaux se verront administrer par injection intra-veineuse un traitement anti-coagulant ou anti-inflammatoire au cours de la procédure. Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables de la pathologie attendus sont des dommages de l’intestin et une contamination du sang par les bactéries provenant de l’intestin, justifiant l'euthanasie sous anesthésie générale en fin de procédure. Les effets indésirables liés à la procédure sont : une douleur liée à l’injection de l’analgésique et une douleur liée à la procédure chirurgicale en cas de réveil de l’animal (évité avec une surveillance continue et un maintien de l’anesthésie tout au long de la procédure).
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées après la reperfusion intestinale afin de prélever l’intestin grêle pour des analyses des tissus biologiques et d'éviter toute douleur liée à la souffrance irréversible de l'intestin et ses complications en cas de réveil.
Remplacement
L’ischémie intestinale et les lésions associées à la reperfusion intestinale sont une maladie grave, d'une mortalité extrême (80% chez l'Homme), avec des formes très hétérogènes et encore très mal connue. L'utilisation d'un modèle non animal n'est pas réalisable et pas pertinent pour cette pathologie. En effet, aucun modèle non animal ne permet de simuler le circuit complexe de circulation et les nombreuses interactions impliquées dans le développement de la pathologie. Ces multiples paramètres et l’hétérogénéité de la pathologie en font un modèle difficilement reproductible en milieu artificiel et peu prédictif via l’utilisation de logiciel informatique.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux a été déterminé d’après une analyse statistique. Nous avons estimé qu’il faut inclure 10 animaux par groupe au minimum pour assurer des résultats statistiquement pertinents. Une revue bibliographique nous a permis de sélectionner les doses pour les traitements ciblés les plus pertinentes afin de diminuer le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
Avant les procédures expérimentales, les animaux sont dans une cage spacieuse qui permet aux souris de se déplacer librement et d'adopter des comportements naturels, en groupe pour permettre une interaction sociale entre les souris et avec litières (copeaux de bois) et boites pour encourager les comportements de nidification. Les souris seront opérées sur une table chauffante à 37°C sous anesthésie générale. Après une analgésie pour réduire les douleurs durant la procédure, les animaux seront anesthésiés à l'aide d'un gaz (induction dans une chambre dédiée et maintien à l’aide d’un masque). Les effets de l’anesthésie et l’analgésie seront suivis tout au long de la procédure. En cas de signe de réveil, la quantité d’agent anesthésiant sera augmentée. Si les signes persistent ou d’autres signes indiquant une souffrance de l’animal apparaissent, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle de l’ischémie mésentérique aigue chez la souris est déjà décrit dans la littérature et notre équipe est déjà formée à la procédure qui a montré des résultats applicables à ce qui peut être observé chez l’homme. Des souris femelles adultes (7 à 9 semaines) seront utilisées pour que les vaisseaux irriguants l'intestin puissent être facilement visualisés sous loupe. Des souris plus âgées ou un autre modèle animal risqueraient de présenter des zones grasses autour des vaisseaux, compromettant leur observation. De plus, notre laboratoire est habitué à travailler avec les souris, et cela à chaque étape de l’expérimentation : soins préalables, maniement et gestion du stress, matériel anesthésique, opératoire et de monitorage, analgésie et euthanasie.
Etude du système vasculaire intra-nerveux et des effets de molécules vasodilatatrices dans le cas d’une neuropathie périphérique chimiquement induite à des souris développant une carcinose péritonéale, une tumeur intra-caecale ou souscutanée.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'au sévère. Elles reçoivent des injections de chimiothérapie qui déclenchent une neuropathie douloureuse, une greffe de cellules tumorales et une incision exposant le nerf sciatique, puis un test de sensibilité sur plaque froide. Le porteur indique que les symptômes neuropathiques ne seront pas soulagés, aucun traitement efficace n'existant chez les patients, ce qui laisse ces douleurs sans prise en charge. Il affirme que la mesure de paramètres comportementaux et physiologiques ne permet pas de se passer de l'animal.
Objectifs
Nous avons mis au point un modèle murin de neuropathie périphérique induite par la chimiothérapie sur des souris mâles. Le modèle est généré par des injections intraveineuses de cette chimiothérapie car nous étudions l’implication des vaisseaux sanguins intranerveux dans le développement de la pathologie. Nous sommes ainsi surs de ne pas passer à côté d’un éventuel phénotype vasculaire. Nos résultats suggèrent que l’administration de molécules vasodilatatrices améliore les symptômes d’une neuropathie périphérique chimiquement induite. Afin d’évaluer cette piste thérapeutique, il est important de vérifier qu’elle n’interfère pas avec l’efficacité anti-tumorale de la chimiothérapie. Pour ce faire, nous souhaitons induire une neuropathie périphérique chez des souris présentant une tumeur abdominale (carcinose péritonéale), sous-cutanée ou intra-caecale par une injection de cellules cancéreuses du côlon murin. Puis, nous pourrons évaluer la taille de la tumeur ou mesurer son développement par bioluminescence car les cellules expriment la luciférase, à savoir si elle est inhibée avec l’administration conjointe de chimiothérapie et de différentes molécules vasodilatatrices, seules ou combinées. Ce projet permettra donc de statuer sur l’utilisation de ces molécules vasodilatatrices dans le traitement des symptômes neuropathiques induits par la chimiothérapie aux stades aigus et chroniques.
Bénéfices attendus
Les neuropathies périphériques chimiquement induites sont un problème de santé publique majeur. Pour une chimiothérapie, traitement majoritairement utilisé pour traiter les cancers du côlon, 80% des patients développeront des symptômes neuropathiques à la suite des cycles de chimiothérapie. Ces patients ont une qualité de vie réduite avec des symptômes douloureux qui peuvent devenir insupportables et conduisent alors à la réduction ou à l’arrêt du traitement anticancéreux. Nos données suggèrent que l’administration de molécules vasodilatatrices permet d’atténuer les symptômes neuropathiques à un stade aigu. Afin d’évaluer cette piste thérapeutique, il est important de définir si l’administration conjointe d’une chimiothérapie et de molécules vasodilatatrices, seules ou en combinaison, n’interfère pas avec l’efficacité du traitement anti-cancéreux. Ce projet permettra donc de statuer sur l’utilisation de ces molécules vasodilatatrices dans le traitement des symptômes neuropathiques induits par une chimiothérapie aux stades aigus et chroniques. Si la taille de la tumeur régresse de la même manière entre les groupes traité à la chimiothérapie et traité à la chimiothérapie et aux molécules vasodilatatrices, nous pourront alors les envisager dans le traitement des neuropathies périphériques induites par cette chimiothérapie.
Procédures
Les animaux recevront plusieurs injections intraveineuses de chimiothérapie ou de glucose pour 2 ou 8 semaines. Ils seront éveillés pendant la procédure d’injection, maintenus dans un dispositif de contention laissant libre accès à leur queue, endroit de l’administration. Ces animaux pourront recevoir, tous les jours ou tous les deux jours, par voie intrapéritonéale ou orale, des molécules vasodilatatrices dans le but de réduire les symptômes neuropathiques induits par la chimiothérapie. L’efficacité anti-tumorale de la chimiothérapie en combinaison avec des molécules vasodilatatrices sera mesurée par l’induction et le suivi d’une tumeur abdominale. Il recevront également une injection de cellules tumorales en intrapéritonéale (IP), sous-cutanée (SC) ou intra-caecal (IC) puis plusieurs injection intrapéritonéale (IP) (3 pour le modèle aigu 8 pour le modèle chronique) afin de suivre la progression tumorale par bioluminescence de façon non invasive. Pour le laser doppler, les animaux seront soumis à une incision cutanée afin d’exposer le nerf sciatique. Enfin,les animaux seront soumis au test de la plaque froide afin d’établir leur sensibilité au froid (maximum 8min, 6 fois pour le modèle aigu, 2 fois par semaine pour le modèle chronique)
Impact sur les animaux
Les souris recevant une dose cumulée de chimiothérapie, nous pouvons nous attendre à une petite perte de poids de nos animaux. Les souris traitées à la chimiothérapie développeront une neuropathie périphérique avec des sensations d’inconfort au niveau des pattes notamment. Nous étudions cette pathologie car il n’y aucun moyen de traiter les symptômes neuropathiques chez les patients. Les souris ne pourront donc pas être soulagées avec des médicaments qui se sont avérés inefficaces. Une sensation d’inconfort pourra être ressentie après l’incision cutanée nécessaire à la réalisation du laser doppler.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue de chacune des procédures et nous prélèverons les organes (cerveaux, nerfs sciatiques et peaux de pattes) afin de conduire des études post mortem.
Remplacement
Ce projet modélise une pathologie humaine, la neuropathie périphérique chimiquement induite à un stade chronique et l’effet d’une potentielle solution thérapeutique. Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres comportementaux et physiologiques ; il n’est pas possible de s’affranchir de l’expérimentation animale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé correspond au minimum nécessaire pour obtenir un résultat scientifique valide car il prend en compte le risque de 10-15% de non prise de greffe et le risque de mortalité lié aux différents traitements. Statistiquement, nous utiliserons des tests non paramétriques (Wilcoxon et Kurskal-Wallis pour les comparaisons des moyennes). Ces tests ne faisant pas l’hypothèse de normalité de distribution des échantillons, il n’existe pas de nombre minimal d’échantillons pour les utiliser, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat statistiquement pertinent.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine ou plus. Une incision abdominale médiane d’environ 1 cm sera pratiquée sur l’abdomen de la souris. Ce geste nécessitera une anesthésie générale gazeuse et une analgésie en sous-cutanée. Afin de suivre la progression de la maladie en Intrapéritonéale et Intracaecal, les souris feront l’objet d’un examen non invasif par bioluminescence. La sensibilité au froid est mesurée par le test de la plaque froide, test que nous avons adapté afin qu’il soit plus éthique en soustrayant l’animal d’une température qui l’incommoderait. Pour cela, il sera placé sur la surface de la plaque métallique à une température initiale de 20°C. L’acquisition sera alors lancée et la plaque perdra 2°C par minute jusqu’à maximum 4°C. L’électromyogramme et l’analyse laser doppler seront réalisés sur des animaux sédatés par anesthésie gazeuse. Leur température corporelle sera maintenue à 37° à l’aide d’une couverture chauffante couplée à un appareil de thermorégulation. Le développement tumoral en SC sera suivi par la mesure de la taille de la tumeur 2 fois par semaine (3 fois pour le modèle aigu) dont le plus long côté ne devra pas dépasser 2cm sur animal vigile. Dans l’éventualité d’apparitions de points limites, les mesures retenues seront mises en œuvre.
Choix des espèces
Nous utiliserons pour ces expériences des souris mâles immunocompétents Balb/c et C57BL/6, espèces largement utilisées dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. La neuropathie périphérique chimiquement induite est un effet secondaire de nombreux traitement anti-cancéreux. C’est donc une pathologie qui touche majoritairement les adultes. Nous travaillons alors chez la souris adulte, âgée entre de 3 et 6 mois.