Souris

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Placées seules en cage pendant les 14 semaines du protocole, une contrainte que le porteur reconnaît comme une source de stress modérée, elles subissent des gavages, des prélèvements de sang répétés à la queue et à la joue, puis une ponction intracardiaque terminale. Le projet utilise une lignée transgénique fat-1 dont les tissus sont enrichis en oméga3, pour étudier l'effet de ces lipides sur la barrière intestinale et le microbiote dans un contexte d'obésité alimentaire. Le porteur affirme que ni la culture cellulaire ni un autre modèle murin ne peuvent reproduire cet enrichissement et ces interactions, et conclut à la "nécessité" de l'animal.

Objectifs

L’obésité est une pathologie ayant de multiples origines qui est associée à des altérations métaboliques comme le diabète de type 2 ou des perturbations lipidiques sanguines. Au cours de l’installation de l’obésité alimentaire, une altération (quantité et qualité) de la flore intestinale contribue à perturber la fonction barrière de l’intestin en détériorant à la fois la perméabilité de l’épithélium intestinal et la couche de protection qui le tapisse. Ces altérations conduisent au passage dans le sang de molécules provenant de certaines bactéries de la flore microbienne intestinale conduisant à une inflammation générale légère mais chronique. En tant qu’aliment thérapeutique, les lipides dits en oméga3 (particulièrement présents dans les poissons ou certaines huiles alimentaires comme l’huile de colza) sont connus notamment pour améliorer la fonction barrière intestinale et réduire les altérations de la perméabilité intestinale. Dans ce contexte d’obésité alimentaire, nous étudions ainsi l’impact des lipides dits en oméga3 sur la fonction barrière de l’intestin et en particulier sur l’intégrité de la couche de protection qui le tapisse et la contribution relative de la flore intestinale. Nous avons montré précédemment que des souris dont les tissus contiennent beaucoup de lipides en oméga3 sont protégées de l’obésité alimentaire, de l’altération de la perméabilité intestinale et du passage de molécules issues de bactéries de la flore intestinale dans le sang. Cette protection est transmissible à d’autres souris par la transplantation de la flore intestinale des souris dont les tissus sont riches en lipides en oméga3. Ainsi, un enrichissement tissulaire en lipides en oméga3 pourrait représenter une cible potentielle dans la prévention de l’obésité et de l’inflammation intestinale due aux molécules issues de la flore microbienne. L'objectif de ce projet est donc d'étudier et de comprendre le rôle des lipides en oméga3 dans cette protection un contexte d’obésité alimentaire et plus particulièrement l’effet de ces lipides en oméga3 dans la contribution relative de la flore intestinale et de la couche de protection qui tapisse l’intestin.

Bénéfices attendus

L’obésité, qualifiée aujourd’hui de pandémie, est associée à des pathologies comme le diabète ou le foie dit gras ainsi qu’à une altération de la perméabilité intestinale entrainant un passage de molécules issues de la flore intestinale dans la circulation sanguine qui pourrait être en partie responsable d’une inflammation générale légère et chronique. Le traitement de l’obésité et de ses désordres est donc un enjeu majeur de santé publique. L’impact de l’alimentation et en particulier des lipides en oméga3 est une piste privilégiée dans l’enrayement de cette pandémie. Cependant, les études nutritionnelles, tant chez l’homme que le rongeur, présentent de nombreux biais rendant les données existantes peu concluantes quant aux effets et aux modes d’action des lipides en oméga3. Les souris dont tous les tissus sont riches en lipides en oméga3 représente donc une alternative de choix dans l’étude de l’impact de ces lipides sur les maladies associées à l’obésité alimentaire, bénéfique que nous avons déjà montré sur la prise de poids ou le diabète. Nous avons par ailleurs récemment montré que le seul transfert de la flore de souris aux tissus riches en lipides en oméga3 à d’autres souris sans enrichissement en lipides en oméga3 les protègent également efficacement de ces pathologies mais également des altérations de la couche de protection qui tapisse l’intestin. Ce projet a maintenant pour but de mieux comprendre le rôle de ces lipides en oméga3 et la contribution relative de la flore intestinale dans les mécanismes intimes impliqués dans la structuration de cette couche de protection de l’intestin. Ce projet pourrait également permettre l’identification de souches bactériennes favorables, éventuelles futures cibles probiotiques, essentielles au bon fonctionnement de la barrière intestinale lors de l’obésité.

Procédures

Les animaux seront manipulés de façon hebdomadaire afin d’évaluer leur poids. De plus, - Au début du régime, les animaux seront placés en cages individuelles avec couvercle filtrant - Au départ de la mise sous régime puis aux semaines 2 et 13 des fèces seront collectés (3 à 4 crottes sur une durée d’une dizaine de minutes) - Prélèvement de sang aux semaines 2 et 13 d’expérimentation, 4 heures après le gavage avec une solution de Dextran au niveau de la région submandibulaire afin de mesurer la perméabilité intestinale. Chaque prélèvement sanguin sera réalisé en une vingtaine de seconde par souris. - Prélèvement de sang, 4 heures après le gavage avec une solution de glucose, aux semaines 1 et 12 d’expérimentation. Le prélèvement est réalisé au niveau de la partie terminale de la queue de la souris aux temps 0, 15, 30, 60, 90, 120 minutes après le gavage au glucose pour mesurer la glycémie (chaque prélèvement sanguin sera réalisé en une vingtaine de seconde par souris). - Prélèvement de sang, 4 heures après l’injection d’insuline, au départ de la mise sous régime puis à la semaine 10 d’expérimentation. Le prélèvement est réalisé au niveau de la partie terminale de la queue de la souris aux temps 0, 15, 30, 60, 90, 120 minutes après l’injection d’insuline pour ensuite mesurer la glycémie (chaque prélèvement sanguin sera réalisé en une vingtaine de seconde par souris). - Un prélèvement terminal sera effectué à la fin de la semaine 14 via une ponction intracardiaque nécessitant une à deux minutes par animal.

Impact sur les animaux

L’isolement en cage individuelle représente une source de stress attendue pour l’animal, d’autant plus qu’il sera maintenu durant toute la durée de l’expérimentation (14 semaines). Cette nuisance peut être classée en modérée. Le prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la partie terminale de la queue (à l’aide d’une aiguille 26G) pour la mesure de la glycémie lors du test de tolérance au glucose), les gavages oro-gastriques (pour les instillations de microbiote) et l’injection intrapéritonéale d’insuline (aiguille 26G) sont des gestes pour lesquelles peu ou pas de douleur sont attendus puisqu’ils seront réalisés par un personnel maitrisant très bien ces gestes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue du projet afin de réaliser des prélèvements de différents tissus (sang, colon)

Remplacement

Le modèle de souris transgénique fat-1 est un modèle précieux car cette souris possède intrinsèquement (grâce au transgène fat-1) un niveau d’enrichissement des lipides tissulaires en AGPI oméga3 qui n’existe dans aucun modèle murin. D’une part, l’ubiquitisme de l’enrichissement tissulaire en AGPI oméga 3 et d’autre par les taux tissulaires obtenus rend impossible le remplacement du modèle de souris Fat-1 par des modèles in vitro. De plus, le protocole décrit vise à étudier les mécanismes impliqués dans la régulation de la fonction barrière de l’intestin et en particulier de la formation du mucus colique et les interactions de ce dernier avec le microbiote intestinal. Il est impossible de complètement modéliser ce processus et ces interactions à travers des approches in vitro. En effet, si des modèles de lignées cellulaires coliques secrétant de mucus existent (LS174T/HT29MTXE12), ces modèles ne permettent pas de reproduire in vitro la complexité des interactions entre microbiote et cellules coliques ainsi que la structuration de cette couche de mucus qui apparait in vivo en bicouche et avec une structuration lamellaire. Cette structuration représentant une niche écologique pour le microbiote intestinal. Enfin, cette étude est menée dans un contexte d’obésité alimentaire. Ce contexte est difficile à modéliser en raison de la complexité des impacts métaboliques observés et de la diversité des approches de régimes utilisés. Cet aspect ne peut donc également pas s’affranchir de l’utilisation d’animaux. Cette étude est donc unique dans l’approche de l’impact des AGPI oméga3 sur le mucus et le microbiote intestinal dans un contexte d’obésité alimentaire et de ses pathologies associées.

Réduction

Les effectifs ont été optimisés sur la base des coefficients de variabilité reportés dans la littérature et les différences attendues entre les différents groupes pour les paramètres clés de l’étude. Lors de la conception du protocole expérimental nous avons déterminé le nombre de 8 animaux par groupe nécessaire et suffisant à l'obtention de résultats statistiquement exploitables. Afin de réduire le nombre d’animaux intégrables dans le protocole, en amont de la production des animaux, les souris WT sont croisées entre elles et les souris Fat-1 homozygotes entre elles générant des descendants tous intégrables dans le protocole et ce sans génotypage.

Raffinement

La mise en isolement en cage individuelle représentant une source attendue de stress générant une nuisance pour l’animal, d’autant plus qu’il sera maintenu durant toute la durée de l’expérimentation (14 semaines), une attention particulière sera apportée à l’enrichissement du milieu afin de minimiser cette nuisance qui peut être qualifiée de modérée. En effet, toutes les souris auront accès à des enrichissements de milieu dans chaque cage, constitués de carré de coton et/ou papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Une attention particulière sera également portée à la surveillance de la prise de nourriture et aux comportements liés au stress. Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée en secteur conventionnel et intégration dans le projet. A la suite des interventions (OGTT, ITT, instillations de microbiote par gavage) chaque animal sera examiné. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Bien que n’étant pas réalisés tous les jours, nous pourrions être amenés à utiliser une sonde de gavage souple lors des gavages pour l’instillation de microbiote. Des points limites adaptés en lien avec l’obésité attendue ou les gestes pratiqués (gavage, prélèvement de sang) ont été définis. Si ces points limites définis sont atteints, un arrêt de la souffrance engendrée sera effectué par mise à mort de l’animal après anesthésie profonde puis dislocation cervicale.

Choix des espèces

La détermination de l’impact d’un régime obésogène sur la perméabilité intestinale et la relation entre microbiote/mucus est primordiale à notre étude. Cet aspect ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux afin de mimer au mieux un contexte d’inflammation bas grade. Bien que relativement éloignée de l’Homme, l’espèce murine est l’espèce animale de référence dans ce domaine de recherche et la plus utilisée en recherche préclinique avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le modèle de souris transgénique fat-1 est un modèle précieux qui rend cette étude unique dans l’approche de l’impact des AGPI oméga3 sur la prévention de l’hyperperméabilité intestinale induite par un régime obésogène. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 12 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids supérieur à 20g. En effet, nous nous intéressons à l’obésité et aux conséquences métaboliques associées développées par les jeunes adultes car il a été montré que l’augmentation en France de l’obésité touche toutes les tranches d’âge mais que la fréquence semble plus élevée dans les tranches 25-34 et 35-44 (de l’ordre de 8% par an). De telles données sur le jeune adulte ont été également confirmées aux Etats-Unis et récemment en France. De plus, les études précédentes mettant en évidence la transmission de la résistance partielle de l’induction de l’obésité alimentaire par le microbiote de souris fat-1 à des souris WT au laboratoire a porté sur l’animal jeune adulte. Nous souhaitons pouvoir inscrire ces nouvelles expérimentations dans notre objectif thématique plus global.

618 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer colorectal sur le flanc, puis des injections répétées de chimiothérapies et d'un médicament donneur de monoxyde d'azote, avec un suivi de la tumeur qui peut gêner la mobilité de la patte arrière, pour tester si cette association améliore le traitement. Le porteur fixe un point limite de mise à mort à un volume tumoral de 2 centimètres cubes ou en cas de souffrance. Il affirme que les cultures cellulaires ne peuvent se substituer à l'étude du microenvironnement tumoral dans un organisme entier.

Objectifs

Le traitement du cancer demeure un défi nécessitant de trouver de nouvelles solutions de traitement pour améliorer l’espérance de vie des patients. L’objectif principal de ce projet est d’améliorer l’efficacité des traitements (chimiothérapies) couramment utilisés pour le cancer colorectal. Pour cela nous proposons d’associer aux traitements existants un autre médicament. Certaines tumeurs cancéreuses peuvent libérer des facteurs suite à la chimiothérapie pour se protéger de leurs effets ce qui diminue l’efficacité du traitement. Le médicament étudié a la particularité d’éliminer les cellules cancéreuses lorsqu’il est en présence de ces types de facteurs. Des travaux préliminaires ont montré, dans un modèle de cancer colorectal chez la souris, que ces facteurs augmentaient en réponse au traitement par certaines chimiothérapies utilisées pour le traitement du cancer colorectal. Dans ce contexte, l’ajout du médicament après la chimiothérapie, en présence de ces facteurs, ralentirait le développement de la maladie. L’étude sera structurée en 2 parties qui permettront (1) d’étudier précisément le rôle des facteurs d’intérêts dans l’effet de la combinaison chimiothérapies/médicament contre la tumeur dans un modèle de cancer colorectal chez la souris ; (2) d’étudier l’effet de la combinaison chimiothérapies/médicament dans un autre modèle d’étude du cancer colorectal chez la souris. Les cancers colorectaux étant des pathologies très hétérogènes, l’utilisation du modèle animal souris est majeur en cancérologie car il permet de reproduire les caractéristiques de la pathologie cancéreuse humaine. Ce projet vise à démontrer que l’administration du médicament en question après les chimiothérapies (lorsque ces facteurs sont présents) peut s’appliquer à différents modèles de cancers colorectaux.

Bénéfices attendus

Les deux modèles d’étude du cancer colorectal chez la souris que nous proposons d’utiliser dans ce projet se distinguent par la capacité des cellules immunitaires à infiltrer la tumeur. Les tumeurs sont qualifiées de « froides » lorsqu’elles sont peu infiltrées par les cellules du système immunitaire. Au contraire, les tumeurs sont qualifiées de « chaudes » lorsqu’elles sont fortement infiltrées par les cellules immunitaires. Grâce aux deux modèles d’étude du cancer colorectal chez la souris que nous proposons d’utiliser dans cette étude, nous pourrons mimer deux microenvironnement tumoraux différents, proches de la pathologie humaine. Nous nous attendons à valider l’hypothèse initiale de notre stratégie de traitement qui repose sur l’administration du médicament sur la base de la présence des facteurs d’intérêts faisant suite au traitement par chimiothérapies. Ainsi, au travers de ce projet nous nous attendons (1) à démontrer le rôle charnière de ces facteurs pour l’utilisation du médicament dans une stratégie de traitement à base de chimiothérapies (2) à démontrer que la stratégie de traitement peut être appliquée à un autre type de cancer colorectal. A long terme ce projet a pour bénéfice d’améliorer l’efficacité thérapeutique des chimiothérapies standards utilisées chez les patients atteints de cancers colorectaux. Ce projet s’inscrit dans le développement d’une thérapie anticancéreuse innovante.

Procédures

Anesthésie générale Inhalation d’anesthésiant pendant 5 minutes. Puçage Une puce sera injectée à l’aide d’un injecteur de puce en 3 secondes sous anesthésie générale, une seule fois au début de l’expérience. Rasage Le flanc droit de l’ensemble des souris sera rasé à l’aide d’un rasoir vétérinaire pour injecter les cellules tumorales et mesurer le volume tumoral au cours du temps. L’intervention durera environ 1 minute et sera réalisée une seule fois sur souris vigile au début de l’expérience. Injection des cellules tumorales Les cellules resuspendues dans du sérum physiologique seront injectées en sous cutanée sur le flanc droit de l’ensemble des souris sous anesthésie générale. L’injection des souris durera environ 5 secondes et sera réalisée une seule fois au début de l’expérience. Injection en intra-péritonéale Les injections de chimiothérapies, sérum physiologique, ou d’inhibiteurs d’un des facteurs étudié seront injectés individuellement. Les injections seront réalisées sur souris vigile et dureront environ 3 secondes. Injection en sous cutanée Le médicament/sérum physiologique seront injectés en sous-cutané au niveau du cou. Une seule injection de 3 secondes sera réalisée deux fois par semaine en vigile pendant environ 4 semaines. Mesure des tumeurs Un suivi de la croissance tumorale sera réalisé 3 fois par semaine pendant 4 semaines en vigile à l’aide d’un pied à coulisse. L’intervention durera environ 1 minute par souris. Prélèvement de sang en mandibulaire Le sang sera prélevé au niveau de la veine mandibulaire après anesthésie générale. Les souris seront maintenues endormies à l’aide d’un masque libérant l’anesthésiant pendant tout le temps du prélèvement. Le prélèvement durera environ 1 minute par souris et sera suivi du réveil de l’animal. Prélèvement de sang en intra-cardiaque Le sang sera prélevé en intra-cardiaque après anesthésie générale. Les souris seront maintenues endormies à l’aide d’un masque libérant l’anesthésiant pendant tout le temps du prélèvement. Le prélèvement durera environ 5 minutes par souris et sera suivi d’une euthanasie sans réveil préalable. Euthanasie des souris Les souris seront euthanasiées après anesthésie générale. L’intervention durera 3 secondes par souris et sera suivi du prélèvement des tumeurs.

Impact sur les animaux

Nuisances dues à l’anesthésie générale pour le puçage, l’injection des cellules tumorales et le prélèvement sanguin mandibulaire : - Stress au moment de l’endormissement dans la boite d’anesthésie - Diminution de la chaleur corporelle - Douleur au point d’injection de la puce Nuisances dues aux injections des chimiothérapies et du Nitronal : - Stress de la manipulation et de l’injection - Douleur au point d’injection - Effets indésirables dus aux traitements (perte de poids éventuelle) Nuisances dues au suivi de la croissance tumorale : - Stress de la manipulation lors de la mesure du volume tumoral Gêne occasionnée par la tumeur (gêne au niveau de la patte arrière, perte de mobilité)

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront anesthésiés avec un anesthésiant pendant 5 minutes puis euthanasiés. En effet, tous les animaux étant porteurs de tumeurs colorectales, aucun ne pourra être réutilisés, replacés ou adoptés. De plus, même en cas de guérison, l’ensemble des souris auront reçu des traitements (chimiothérapies et/ou médicament) ce qui pourrait altérer leur état général en cas d’adoption ou les résultats de nouvelles expériences en cas de réutilisation.

Remplacement

Les modèles de culture cellulaire in vitro ne peuvent pas se substituer totalement aux expérimentations in vivo étant donné que nous cherchons à étudier l’impact des traitements, d’une part sur le taux des facteurs d’intérêts issus de l’hétérogénéité du microenvironnement tumoral et d’autre part sur la croissance des cellules cancéreuses au sein de son microenvironnement, ce qui nécessite pour ces deux points un organisme vivant entier.

Réduction

Ce projet nécessitera l’utilisation de 618 souris sur une période de 5 ans. La maîtrise du modèle animal chez la souris au laboratoire permet de réduire le nombre d’animaux utilisé au minimum nécessaire pour les expérimentations envisagées afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Des études préliminaires ont été réalisées afin de définir les conditions de traitement et les doses de chimiothérapies et du médicament à utiliser. Ces études préliminaires ont également permis d’éliminer certains groupes témoins pour lesquels les effets des traitements seuls sont suffisamment connus pour ne pas avoir à les refaire. Une étude pilote sera réalisée pour déterminer la dose optimale et la fréquence d’injection d’un inhibiteur pour l’un des facteurs étudiés. Ces mises au point préalables permettent donc de réduire au maximum le nombre de groupe de souris utilisé. De plus, les expériences seront réalisées sur des groupes de souris randomisés pour limiter au maximum les biais expérimentaux et éviter de recommencer les expériences plus de fois que nécessaire.

Raffinement

Pour limiter au maximum les nuisances causées aux animaux et détecter le plus précocement possible toute forme de souffrance ou de mal-être potentiel, quotidiennement de façon à vérifier leur bien-être (absence de perte de poids, d’appétit, de déshydratation ou d’immobilité). Les animaux seront toujours hébergés en petits groupes pour limiter l’angoisse/le stress. De plus un enrichissement sera ajouté (matériel de nidification, petit récipient en verre) visant à améliorer la zone de confort tout au long de leur hébergement. Les manipulations (injections des cellules, prélèvements sanguins, puçage) pouvant générer un inconfort pour l’animal seront réalisées sous anesthésie générale. Une grille de score regroupant les point limites a été mise en place (Annexe V) de manière à déterminer les critères d’arrêt. Dans tous les cas, un animal sera anesthésié puis euthanasié si 1) le volume tumoral atteint 2 centrimètre cube, 2) s’il présente une baisse de la masse corporelle ou des signes (comportementaux/posture) indiquant une souffrance ou une douleur significative qui ne peut pas être supprimée, 3) si la tumeur présente une plaie.

Choix des espèces

Les expériences que nous avons préalablement réalisées in vitro ont été menées sur des lignées cellulaires (cancéreuses) de souris. Nous utiliserons les espèces de souris dont sont issues les cellules préalablement utilisées in vitro. Les souris seront âgées d’environ 8 semaines de manière à ce qu’elles aient un système immunitaire suffisamment mature pour étudier les facteurs d’intérêts en réponse au traitement, sur la croissance tumorale.

1 528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sur l'oreille, sous anesthésie, des applications répétées d'imiquimod pour induire une maladie proche du lupus, ainsi que des traitements par diverses voies, des prélèvements sanguins et des recueils d'urine par isolement de quatre heures, sur une durée pouvant atteindre dix semaines, pour tester des candidats médicaments. Le porteur décrit un modèle encore à mettre en place et sans expérience préalable sur les nuisances. Il affirme que l'efficacité d'un candidat médicament ne peut être démontrée que chez l'animal, dans un organisme complet.

Objectifs

Le lupus est une maladie auto-immune caractérisée par la production d’auto-anticorps qui conduisent à de nombreuses affections des organes notamment des reins, des articulations, de la peau et du système nerveux. Le lupus néphrétique, une lésion rénale associée au lupus, affecte 30 à 70% des patients lupiques et a un impact négatif sur le pronostic des patients. Ce lupus néphrétique est divisé d’un point de vue médical en 6 classes. L’objectif de ce projet est de mettre en place un modèle induit par l’imiquimod (substance médicamenteuse dont les propriétés sont de modifier la réponse immunitaire) appliqué en local chez la souris qui récapitule la classe II du lupus néphrétique. Cette induction topique entraine une activation de cellules clés du système immunitaire nous permettant ainsi de mieux comprendre l’interaction entre les différents mécanismes d’action et de pouvoir étudier l’impact de nos candidats médicaments sur ces différents mécanismes d’action. Dans le processus de développement d’un candidat médicament, ce type d’étude se situe en aval des études in vitro et in silico. Il permet de sélectionner les candidats sur la base de leur capacité à diminuer l’activité du système immunitaire dans le domaine des maladies auto-immunes et également d’étudier la biodisponibilité de ces candidats (distribution de la molécule dans le corps durant les traitements). Les études conduites dans le cadre ce projet prévoient des évaluations cliniques et biologiques (prélèvements sanguins pour notamment doser la présence des anticorps en cours d’étude et prélèvements d’organes terminaux pour valider l’expression des cibles thérapeutiques). Ces prélèvements sont adaptés en termes de volume/fréquence conformément aux standards éthiques et réalisés avec les méthodes les moins contraignantes possibles (ex : prélèvement de petit volume sanguin à la veine saphène)

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir évaluer l’impact de nos candidats médicaments sur les maladies auto-immunes dans un modèle préclinique en amont de toute étude clinique et de pouvoir étudier l’impact de nos candidats sur les différents mécanismes d’action impliqués dans cette pathologie

Procédures

Selon la phase de développement du modèle et la procédure expérimentale associée mise en oeuvre : - Application de la crème sous anesthésie : temps d’absorption 10 min (? à consolider après réalisation de la procédure 1), 3 fois par semaine, 10 semaines max -traitement iintra veineux, intra péritonéal, sous cutanée ou per os, per os : moins d’une minute, fréquence suivant le protocole de l’étude, 10 semaines max - Prélèvement de sang par microsampling : (prélèvement de petit volume sanguin à la veine saphène) (moins de 30 secondes) avec une fréquence dans la limite des recommandations de la structure de Bien-Etre Animal -Urine : jusqu’à 4 heures sur sable hydrophobe (mais un suivi sera établi pour réduire ce temps au maximum), tous les 15 jours (hébergement individuel durant 4 heures max), 10 semaines max -Pesée de la souris : moins de 30 secondes

Impact sur les animaux

Selon les données de la littérature et sans expérience sur ce modèle, les nuisances estimées sont les suivantes : -Administration de composés candidats médicaments selon les voies classiques intra-péritonéale, intra-veineuse, sous-cutanée ou per os pouvant induire stress et douleur ponctuels -Inflammation de l’oreille pouvant induire éventuellement rougeur, gonflement douleur transitoire (durée d’une heure après l’application de la crème) -Prélèvements de sang pouvant induire stress et douleur ponctuels

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour la collecte des organes et tissus et les analyses in vitro des échantillons (immohistochimie, etc).

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans la prise en charge des maladies auto-immunes repose sur une première phase d’identification de candidats médicaments efficaces sur leur cible au moyen de modélisations in silico et in vitro. L’efficacité thérapeutique d’un candidat médicament ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal, dans le contexte d’un organisme complet et complexe incluant l’ensemble des mécanismes physiopathologiques. Les pathologies auto-immunes sont par essence multifactorielles et impliquent un grand nombre de types cellulaires et de médiateurs, qu’il n’est donc pas possible de modéliser complètement in vitro. Seules les molécules les plus abouties et les plus avancées dans leur développement sont administrées in vivo. Pour ce projet spécifiquement, le modèle présenté permettrait d’évaluer plusieurs cibles cellulaires impactés dans les maladies auto immunes dans l’organisme de la souris avec toute sa complexité et l’intégralité des différents composants du système immunitaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera affiné au fur et à mesure de la mise en place de ce modèle. Les conditions expérimentales des premières étapes sont directement basées sur les données de la littérature pour ce modèle, un accompagnement par le service Biostatistique sera assuré afin d’affiner les designs expérimentaux, d’estimer la variabilité des paramètres et in fine le nombre d’animaux nécessaire par groupe pour l’évaluation des candidats médicaments

Raffinement

L’application de la crème sur le pavillon de l’oreille de la souris sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse pour éviter que l’animal n’enlève la crème et que celle-ci ne soit absorbée par l’animal par une voie d’administration non désirée (par lechage par exemple). Des prélèvements de sang répétés sont réalisés à différents temps afin de mesurer en cinétique les paramètres biologiques d’intérêt et/ou le taux plasmatique du médicament. Les prélèvements de sang sont effectués selon la technique du « microsampling » à la veine latérale de la patte, méthode systématiquement privilégiée par rapport aux autres techniques usuelles car rapide, réalisable plusieurs fois sur un même individu en respectant les recommandations de la SBEA, et respectant les volémies et les conditions physiologiques de la souris. Cette technique permet également de réduire considérablement le nombre d’animaux inclus par étude. Les recueils d’urine pour examens biologiques seront réalisés sur litière de sable hydrophobe en remplacement des cages à métabolisme, maintenant ainsi les animaux dans de meilleures conditions de stabulation. Le volume de recueils sera régulièrement contrôlé pour ainsi arrêter la diurèse si le volume nécessaire est obtenu et sans dépasser une durée maximale de 4h pour limiter le stress des animaux dû à la séparation des congénères durant le recueil. Projet dédié à identifier de nouveaux mécanismes afin de rechercher des candidats traitements les modulants : l’objectif n’est pas d’atteindre l’installation complète de la pathologie de lupus néphrétique mais d’identifier les modulations des biomarqueurs et autres données relevantes et permettant les réponses scientifiques. Les études n’iront donc pas au-delà de 10 semaines et pourront même potentiellement être plus réduites Une coupe des griffes de pattes arrières pourra être réalisée, à l’occasion d’une anesthésie pour application de la crème, afin d’éviter des complications supplémentaires dues au grattage si des premiers signes de prurit apparaissent. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé par les expérimentateurs et le personnel assurant leur soin. Ce suivi permettra d’identifier tout signe de souffrance et d’appliquer les mesures nécessaires au soulagement des souris en cas d’atteinte de points limites prédéfinis. Les souris seront hébergées en groupes sociaux et disposeront de matériel de nidification dans leur cage d’hébergement.

Choix des espèces

La souris présente certains traits caractéristiques similaires à l’Homme dans la biologie des réactions immuno-inflammatoires rendant ainsi pertinente son utilisation. De nombreux modèles ont montré un fort parallélisme dans les différents médiateurs mis en jeu lors des maladies auto-immunes (auto-anticorps, cellules du système immunitaire, cytokines, …). Par ailleurs, l’évaluation de candidats médicaments comme les anticorps nécessite souvent l’utilisation de modèles murins dits humanisés, dans lesquels le gène cible a été remplacé par manipulation génétique par le gène cible humain sans incidence sur le phénotype. La protéine humaine exprimée pourra alors être détectée par le ou les anticorps candidats. Idéalement, les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 6 semaines, tel que décrit dans la littérature de ce modèle

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, une chimiothérapie par anthracyclines et des injections et prélèvements répétés au niveau du sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, avec un suivi de la tumeur par bioluminescence, pour étudier l'effet d'une protéine sur la cardiotoxicité de la chimiothérapie. Le porteur indique que la croissance de la tumeur et la chimiothérapie peuvent être douloureuses. Il affirme que l'effet du traitement doit être vérifié in vivo, les cultures cellulaires ne représentant pas la complexité d'un organisme.

Objectifs

Depuis longtemps la cardio-toxicité des agents chimiothérapiques est établie chez l'Homme, cependant la chronologie et les facteurs aggravant de la maladie ne sont pas connus. Aussi, aucune stratification des patients n’est réalisable en amont du traitement car les mécanismes précis de cette cardiotoxicité restent complexes et imparfaitement étudiés. L’objectif du projet est de déterminer l’impact de l’inhibition de la Dipeptidyl Peptidase 3 (DPP3), une protéine fréquemment surexprimée dans différents cancers, sur le devenir des animaux traités aux anthracyclines , un des traitement de base du cancer du sein. Ce qui nous intéresse tout particulièrement sera la capacité du coeur à se contracter lorsque nous initierons le traitement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples : 1. De valider l’hypothèse que les effets toxiques de la tumeur sur le coeur pré-traitement sont médiés par le DPP3 retrouvé dans la circulation 2. De confirmer l’intérêt d’utiliser le DPP3 dans la circulation comme biomarqueur prédictif de cardiotoxicité associée à la chimiothérapie 3. De prévenir la cardiotoxicité associée aux anthracyclines par l’utilisation d'un anticorps dirigé contre notre protéine DPP3.

Procédures

Anesthésies par voie intrapéritonéales: 1 à 2/semaine pendant 6 semaines, durée 20 minute. Prélèvements rétroorbitaires sur animaux anesthésiés: 1/semaine pendant 6 semaines, durée 5 min. Injection rétro-orbitaires 1/semaines pendant 3 semaines, durée 5 min. Injection sous cutané 1 fois en début de protocole, durée 5 min. Les produits utilisés seront un réactif luminescent présent chez les lucioles afin de suivre la croissance tumorale avec un appareil de bioluminescence, une chimiothérapie pour mimer le traitement de la tumeur chez l'homme, un anesthésiant à action rapide pour l'anesthésie en vue de l'échographie ou des injections/prélèvements sanguins dans le sinus rétroorbitaire, un analgésique à action rapide pour l'analgésie durant l'anesthésie, et notre anticorps dirigé contre la protéine d'intéret.

Impact sur les animaux

A la suite de l’injection sous-cutanée des cellules cancéreuses, les souris développeront une tumeur qui sera suivie au cours du temps par bioluminescence. Ce suivi est indolore mais nécessite une injection de réactif 3 fois par semaine et peut donc engendrer un stress pour l’animal. La croissance de la tumeur pourrait être douloureuse. La chimiothérapie utilisée peut elle aussi engendrer des douleurs pour l’animal.

Devenir

L'euthanasie de tout les animaux à la fin de la procédure permettra une analyse histologique des organes d'intérêts, ainsi qu'une analyse protéique et génétique de divers tissus selon les groupes d'appartenance des animaux.

Remplacement

Les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d’un organisme vivant. L'effet d'un traitement sur une monocouche de cellules cancéreuses in vitro nous permet de montrer l'efficacité de ce traitement sur ce type cellulaire mais le traitement devra être étudié in vivo pour être sûr de son efficacité dans un organisme vivant complexe qui contient une multitude de tissus et organes qui peuvent être touchés.

Réduction

Nous avons effectué un calcul nous permettant d’avoir le nombre précis de souris nécessaire à l’étude. En utilisant les résultats d’une précédente étude de notre laboratoire sur un projet relativement similaire, nous sommes arrivés au chiffre de 12 souris par groupe en fin de protocole au moment dde l'euthanasie. Enfin, le suivi par bioluminescence permet également une réduction du nombre d'animaux car cette technique permet un suivi longitudinal sur le même animal sans mise à mort à des temps intermédiaires.

Raffinement

Les animaux disposeront d’une période d'acclimatation de 5 jours et seront observés quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie ainsi que par l'expérimentateur. Différents points limites seront particulièrement surveillés et seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux tous les jours. Les animaux âgés de 12 semaines recevront une injection sous cutanée de 200 microlitres de cellules cancéreuses du sein. A cette occasion, ils seront surveillés de manière visuelle (fréquence respiratoire) pendant 2h après injection. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé 3 fois par semaine par une technique d'imagerie par chimioluminescence qui permet: 1- une surveillance non invasive des points limites pour limiter le stress des animaux; 2- une réduction du nombre d'animaux nécessaires car cette technique permet un suivi longitudinal sur le même animal sans mise à mort à des temps intermédiaires. Les animaux seront préliminairement anesthésiés et après l'injection de produit fluorescent, ils seront placés dans l'appareil d'imagerie pour visualiser la taille de la tumeur. La manipulation dure 5 min max/animal. Ceux-ci seront ensuite replacés dans leurs cages d'origine à la fin de ce protocole. Deux semaines après l'injection de la tumeur, les animaux, mâles et femelles, recevront une injection intrapéritonéale de chimiothérapie tous les jours pendant 6 jours, laquelle peut engendrer des douleurs et donc une analgésie adaptée sera administrée en cas de besoin. Chaque semaine pendant 6 semaines, le prélèvement sanguin et l’échocardiographie seront faits l’un après l’autre pour limiter le nombre d’anesthésie hebdomadaire. Nous évaluerons la fonction cardiaque par échographie sous anesthésie légère, puis nous ferons des prélèvements sanguins via le sinus rétro-orbitaire, environ 100 microlitres à chaque prélèvement. Une pommade ophtalmique afin de réhydrater l'oeil de l'animal sera utilisée post prélèvement. La même procédure aura lieue pour l'injection de notre médicament candidat, avec l'ajout d'une pommade anesthésiante en amont. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement, l’apparence physique et la gêne pour se déplacer. En cas d’atteinte des points limites, les souris concernées auront alors un suivi adapté avec analgésie quotidienne, nourriture en gelée dans la cage, et si les points limite persistent, elles seront alors exclues de l'expérience.

Choix des espèces

La souris est utilisée en sciences expérimentales pour plusieurs raisons essentielles. Tout d’abord les souris partagent une grande homologie génétique et physiologique avec les humains, ce qui permet de mieux comprendre les processus biologiques et les maladies chez l’humain. Ensuite, les souris se reproduisent rapidement et sont relativement peu coûteuses à élever, ce qui permet d'obtenir rapidement des cohortes expérimentales. Troisièmement, les souris peuvent être facilement génétiquement modifiées pour étudier l'impact de gènes spécifiques sur les processus biologiques, offrant ainsi des informations précieuses sur la fonction des gènes. Pour notre étude, nous avons choisis des souris mâles et femelles d'une lignée de souris fréquemment utilisée dans la recherche en cancérologie pour sa capacité à développer des tumeurs injectées manuellement. Les animaux seront agés de 12 à 16 semaines dans un but de prendre des souris adultes, car le cancer du sein est une maladie fortement liée à l'âge. Prendre des souris plus jeune ne serait pas justifé pour ce protocole.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues d'une lignée hypercholestérolémique, elles reçoivent jusqu'à 42 gavages, une injection intraveineuse et plusieurs prélèvements sanguins, un lot subissant une chirurgie terminale sans réveil, pour tester l'effet d'extraits végétaux sur le cholestérol. Le porteur présente ces extraits comme des actifs "100% naturels" et attend une amélioration sans effets indésirables. Il affirme être "contraint" d'utiliser le modèle animal, le métabolisme du cholestérol ne pouvant selon lui être étudié in vitro.

Objectifs

Notre projet s’inscrit dans le cadre de la lutte contre les maladies cardiovasculaires (infarctus, Accident Vasculaire Cérébrale) et en particulier dans la détermination de nouvelles pistes thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des dyslipidémies. L’objectif de notre programme de recherche est de caractériser d’extraits végétaux sur les niveaux de cholestérol sanguins et de comprendre l'impact sur les voies métaboliques impliquées.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d’identifier le pouvoir hypolipémiant d’extraits végétaux administrés 1) par voie orale ; 2) ou dans un régime. En outre, il permettra de valider son intérêt thérapeutique en démontrant que les extraits exercent des effets anti-athérogéniques.

Procédures

Deux lots de souris recevront 42 gavages oraux (environ 5-10 secondes par gavage), une injection intraveineuse (environ 5-10 secondes par injection) et des six prélèvements sanguins (environ 30 secondes par prélèvement). Un dernier lot de souris sera soumi à 10 prélèvements sanguins (environ 30 secondes par prélèvement) et subira une chirurgie terminale sans réveil (environ 1 heure/ souris).

Impact sur les animaux

Nous utilisons une lignée de souris présentant une hypercholestérolémie. A l'exception des souris contrôles recevant la solution véhicule. Les autres souris devraient voir leur homéostasie du cholestérol s’améliorer sans nuisances ou effets indésirables attendus. Nos expérimentations impliquent des gavages oraux, des prélèvements sanguins et des injections intraveineuses susceptibles d'induire en dépit de nos précautions une altération du bien-être, du stress et des douleurs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issu des procédures. Nous récolterons du sang et des organes afin finaliser le phénotypage métabolique des souris et caractériser les altérations moléculaires induites.

Remplacement

Le métabolisme du cholestérol est un processus physiologique complexe, impliquant l’action combinée d’une multitude d’organes et de diverses voies métaboliques. Il est donc actuellement impossible d’étudier la physiopathologie du cholestérol d’une façon intégrale ex vivo ou in vitro et nous sommes malheureusement contraints d’utiliser les modèles animaux.

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en oeuvre. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.

Raffinement

Enfin, les procédures ont été réfléchies pour réduire au maximum le stress et les souffrances des souris soumises aux expérimentations. La cage sera enrichie par des frisottis ou une petite maison en carton

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser les mécanismes impliqués dans la régulation du métabolisme du cholestérol. Nous disposons d’un modèle de souris hypercholestérolémiques et prédisposées au développement rapide de la plaque d’athérosclérose lorsqu'elles sont nourries avec un régime hyperlipidique. Nous utiliserons des souris mâles adulte agés de 8 semaines au moment de l'initiation de l'étude. A cet age, l'état hormonal et le métabolisme des lipoprotéines sont matures et stabilisés et permettent de réaliser nos mesures en limitant l'hétérogénéité des données.

205 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules de cancer du sein triple-négatif, des traitements quotidiens cinq jours sur sept et des séances d'imagerie après injection d'un radio-traceur dans la veine de la queue, avant une mise à mort entre 30 et 100 jours pour prélever tumeurs et organes. Le porteur indique que le radio-traceur n'a jamais été testé chez la souris et attend une douleur modérée liée aux injections. Il présente le suivi par imagerie comme un moyen de réduire le nombre d'animaux par rapport aux mesures classiques.

Objectifs

Le cancer du sein (CS) est le cancer féminin le plus important en France et dans le monde en termes d'incidence et de décès. Le CS dit triple-négatif (CS TN) est très agressif et de mauvais pronostic. Il est important de trouver de nouveaux moyens de le soigner. Nous avons identifié un onco-métabolite qui stimule la prolifération des cellules de CS TN. Nous avons identifié des traitements qui bloquent la production de cet oncométabolite et le développement des CS TN. Nous avons développé un nouveau radio traceur qui est capté par les cellules de CS TN en culture qui produisent cet onco-métabolite. Les objectifs de ce projet sont d'étudier, par imagerie médicale, la capacité de ce radio traceur à détecter les CS TN chez l'animal et à suivre l'inhibition du développement des tumeurs suite aux traitements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont de valider, in vivo, le radio-traceur pour la détection non-invasive, par imagerie médicale, des tumeurs qui produisent cet onco-métabolite. De plus, les bénéfices seront de démontrer l'intérêt de ce radio-traceur pour le suivi de l’efficacité de deux traitements que nous avons identifiés pour inhiber les effets de l’onco-métabolite sur le développement des cancers mammaires triple-négatifs (CS TN). Les retombées seront de déposer de publier dans un article scientifique les résultats de ce projet et d’en faire bénéficier la communauté scientifique. A terme, ce projet permettra de proposer un radio-traceur pour la détection non-invasive des CS TN et le suivi des nouveaux traitements pour traiter les cancers du sein TN, qui sont de très mauvais pronostic et pour lesquels peu de thérapies efficaces sont disponibles.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront : l'injection en sous cutanée des cellules tumorales pour établir une tumeur : 1 injection/expérience (Exp 1 à Exp 3), avec une durée de 1 min/souris ; Traitement avec une molécule : 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 1 min/souris. Traitement avec deux molécules : 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 2 min/souris. Traitement avec trois molécules 1 fois par jour, 5 jours, avec une durée de 3 min/souris.

Impact sur les animaux

Les études in vitro et in vivo avec le traceur n’a pas montré d’effets indésirables. Le radio-traceur n’a jamais été étudié et injecté chez la souris. L’onco-métabolite, à la dose qui sera utilisée, a été testé in vivo sur plusieurs modèles de cancers mammaires TN (dont celui étudié dans ce projet) et aucun effet indésirable n'a été observé. Les deux thérapies qui seront testés, ont déjà été utilisés in vivo (rapporté dans la littérature) sans effet indésirable observé sur les animaux aux doses qui seront testées mais jamais en combinaison. Les différents traitements qui seront administrés aux souris causeront une douleur modérée due à la piqure de l’aiguille lors de l’injection. Les modalités d'imagerie mises en œuvre ne causent aucune souffrance aux animaux car la piqure d’une aiguille pour injection du radio-traceur par voie intraveineuse dans la veine caudale est réalisée sous anesthésie des animaux. L’induction des tumeurs dans les animaux peut affecter la santé des animaux. Aussi, nous serons vigilants à ce que l’animal ne souffre pas de douleur, de la faim ou de la soif, d'inconfort, de blessures ou d’immobilité. Le suivi quotidien du bien-être des animaux impliqués dans ce projet nous permettra de nous assurer que les animaux ne souffrent pas de ces différents maux. Dans le cas contraire, les animaux seraient immédiatement mis à mort sous anesthésie.

Devenir

Pour les procédures 1 et 2 : Toutes les souris seront mises à mort sous anesthésie à J30-J45, car les organes et la tumeur seront prélevés à la fin des acquissions d'imagerie pour analyser la biodistribution du radio-traceur. Pour la procédure 3 : Toutes les souris seront mises à mort sous anesthésie à J80-100, car nous ferons un suivi dans le temps de l'efficacité des traitements d'intérêts par imagerie médicale non invasive et les souris seront mises à mort sous anesthésie au temps J80-J100 qui permettra d'analyser la croissance tumorale et la survie des animaux.

Remplacement

L’exploration non invasive par imagerie médicale est une méthode permettant d’assurer un suivi longitudinal en limitant la souffrance animale. Ainsi, il sera possible d’étudier la distribution du radio-traceur et sa captation dans la tumeur dans les mêmes cohortes de souris, dans le temps, au cours du développement tumoral. De même, cette méthode permettra de détecter les tumeurs et de suivre l’efficacité des thérapies. Cette procédure permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux mis en jeu par comparaison aux procédures classiques de biodistribution nécessitant le sacrifice d’un groupe d’animaux par condition et par temps d’observation.

Réduction

Le choix du nombre de souris par groupe selon les expériences et la répétition des expériences se base sur des travaux réalisés précédemment avec l'onco-métabolite sur les mêmes modèles de lignées cellulaires implantés chez la souris et sur l'analyse statistique des données. De plus, le suivi longitudinal des animaux par imagerie permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux mis en œuvre par comparaison avec la procédure de biodistribution ex-vivo nécessitant le sacrifice d’un groupe de souris par temps d’observation et par condition expérimentale. La fiabilité des résultats obtenus est par ailleurs renforcée du fait que le suivi d’un même animal au cours du temps permet de réduire le biais statistique induit par la variabilité interindividuelle.

Raffinement

Les animaux utilisés au cours de cette expérience seront maintenus dans des conditions optimales (Hébergement en surpression, 5 animaux par cage IVC ventilée, sous un éclairage et une température (19-21°C) contrôlés) avec une surveillance régulière de leur bien-être et un enrichissement du milieu adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Ils seront manipulés dans des enceintes protégées. Les animaux auront un suivi clinique quotidien (observations, manipulation/palpation, état général) et pesés 2 fois par semaine afin d’intervenir rapidement si les animaux manifestent des signes de douleur (selon une grille de scoring). Une attention particulière sera apportée au maintien de la température corporelle des animaux anesthésiés qui seront mis sur un tapis chauffant. Si une souffrance est observée (selon une grille de scoring), un traitement pour éliminer la douleur sera mis en place sur prescription du vétérinaire désigné. Si des symptômes correspondant à des critères d’arrêt de l’expérience sont observés, voir ci dessous, l’animal sera mis à mort sous anesthésie. De même, les animaux seront mis à mort sous anesthésie si la tumeur atteint un volume supérieur à 2000 mm3, si elle est nécrosée ou présente une inflammation ou si des signes de souffrance apparaissent, voir ci-dessous. Les critères d’arrêt de l’expérimentation afin de minimiser la souffrance et/ou la détresse des animaux sont les suivants : Perte de poids rapide > 20 % du poids initial ou longue période de perte de poids, ulcération des tumeurs, comportement moribond, automutilation, diarrhée prolongée, paralysie, râle, écoulement nasaux, signes d'atteinte du système nerveux central, anorexie, saignement abondant par un orifice ou lésions interférant avec la prise de nourriture et d'eau.

Choix des espèces

La souris est le modèle utilisé majoritairement par la communauté scientifique internationale pour tester in vivo les effets de molécules anticancéreuses ou pro-tumorales et pour l’imagerie médicale et permet de comparer les résultats obtenus avec ceux d’autres laboratoires. Les modèles utilisés se reproduisent bien. De nombreux outils sont disponibles pour l’étude de cette espèce. Les souris sont achetées à l’âge de 6 semaines et greffées après la période d’acclimatation. Les souris sont adultes lorsqu'elles sont traitées car le cancer du sein se développe chez l'adulte.

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par chirurgie une sonde de température sous la peau, subissent des prélèvements sanguins, un isolement de 24 heures en calorimétrie et une exposition au froid à 4 °C pendant six heures qui abaisse leur température corporelle, pour mettre au point un test d'étude de la thermogenèse. Le projet vise à "compléter l'offre" d'analyse du métabolisme énergétique de l'établissement. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro pour étudier le métabolisme d'un organisme complet.

Objectifs

Les mammifères ont acquis la capacité de maintenir une température corporelle constante dans des environnements à température variable grâce à un processus physiologique adaptatif appelé la thermogenèse. Le tissu adipeux est considéré comme le principal site de thermogenèse et de production de chaleur, ce qui permet aux rongeurs de maintenir l'euthermie à des températures inférieures à la thermoneutralité. Les altérations de la thermogenèse sont actuellement considérées comme étant à la fois potentiellement responsables et capables de contrer l'obésité. Une compréhension et une évaluation adéquate de la thermogenèse sont donc primordiales pour les études métaboliques. En effet, des gènes impliqués dans la thermogenèse peuvent être facilement induits dans les adipocytes du tissu adipeux en réponse à une exposition au froid. Lorsqu'ils sont activés, les cellules adipeuses consomment une grande quantité de lipides circulants et de glucose. Dans ce contexte, notre projet est de mettre en place et de valider le test d’exposition au froid combiné à l’analyse de l’énergie par calorimétrie indirecte pour compléter notre offre d’étude du métabolisme énergétique chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif la mise en place et la validation d'un test d'exposition au froid pour analyser la thermogenèse et le métabolisme énergétique chez la souris. Cela nous permettra d'offrir un test qui permet de compléter l'analyse des effets métaboliques de certains gènes impliqués l'obésité.

Procédures

Implantation sous-cutanée de mini-sondes de température par chirurgie (durée 30 min par animal) -Les prélèvements sanguins par voie submandibulaire (moins de 5min par animal) -La calorimétrie indirecte : l’isolement des animaux pendant 24 heures. - Exposition au froid (+4°C) pendant 6h.

Impact sur les animaux

Notre protocole d’étude peut induire les contraintes suivantes : -les animaux subiront une implantation sous-cutanée de mini-sondes de température. Celles-ci restent sous la peau durant l’ensemble du projet, et ont une longueur de 15.5 mm, un diamètre de 6.5 mm et pèse 1.1 g. la chirurgie dure 30 min par animal. -Les prélèvements sanguins par voie submandibulaire peuvent induire du stress et douleur (moins de 5min) - La calorimétrie indirecte : l’isolement des animaux pendant 24 heures - Exposition au froid (+4°C) pendant 6h : chute de température corporelle.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem biochimiques.

Remplacement

Cette étude a pour but d’étudier la thermogenèse et le métabolisme chez la souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier le métabolisme énergétique à l’échelle d’un organisme complet.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable des résultats. Une approche statistique basée sur la variabilité inter-individu constaté dans les études précédentes en calorimétrie indirecte, et de la revue de la littérature pour la mesure de la température corporelle (sous exposition au froid) nous permet de fixer le nombre d’individu à 10 par groupe. De ce fait, nous prévoyons au total 20 souris (10 mâles et 10 femelles).

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales d'animalerie, en groupes, avec un enrichissement, nourriture et boisson à volonté avant les tests. -Implantation des mini-sondes : Les animaux recevront un antalgique par injection intra-péritonéale avant leur anesthésie. Ils auront un antalgique en post-opératoire pour couvrir les douleurs possibles lors de la cicatrisation. -Afin de diminuer le stress et la douleur liées aux prélèvements sanguins à la veine temporale superficielle, ces prélèvements se feront sous anesthésie par inhalation d’isoflurane. De plus un volume maximum de 200 μl et correspondant donc à moins de 20% du volume sanguin de l'animal sera prélevé et afin de compenser ce prélèvement, une solution de NaCl 0,9% correspondant au volume de sang prélevé sera injectée par voie intrapéritonéal. -Concernant les tests de calorimétrie indirecte, ceux-ci se déroulent dans des cages d’hébergement individuelles. La seule contrainte est donc l’isolement des animaux pendant 24 heures. A la fin de ce test, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec les mêmes dispositions d’avant le test (les mêmes souris dans la même cage, et les cages sont gardées dans le même état qu’avant le début du test, et ceci afin que les animaux retrouvent leur environnement) -Exposition au froid : les souris seront soumises à une température de +4 °c pendant 6h. Les souris s’adaptent bien au froid, leur température corporelle pouvant descendre de 37°C à 34°C. Afin d’éviter de trop grandes variations dans les mécanismes d’adaptation au froid, les animaux seront placés dans des cages individuelles comprenant de la litière. Néanmoins, tout animal dont la température corporelle chuterait en dessous des 34°C , montrant son incapacité à s’adapter au froid, sera sorti du test, et placé sur une plaque chauffante. Chaque semaine, les animaux seront pesés et évalués pour constater leur état général et s'assurer qu'aucune dégradation de celui-ci n'est constatée. Si ce cas se présentait, un protocole spécifique serait mis en place avec une surveillance quotidienne approfondie. En cas de perte de poids supérieure à 20% sur une semaine, prostration avec vocalisation, lésion du site d'implantation, hypothermie, les animaux seront mis à mort

Choix des espèces

La souris est l'animal de choix pour la création et l’étude de modèle avec des mutations genetique. De plus, la souris est un modèle animal adapté à l’étude du métabolisme energetique et la thermogenèse. Enfin, il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier des alterations de la thermogenèse d’un organisme complet. Nous allons étudier le metabolisme et la thermogenèse chez des souris adultes, en effet, nous souhaiterions mettre en place et valider ce test dans le cadre des études du métabolisme en âge adulte chez la souris.