Souris
Interactions douleur et prise excessive de sucre ou d’alcool chez la souris : analyses comportementales et moléculaires
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance de modéré à sévère. Elles sont isolées pour mesurer leur consommation de sucre ou d'alcool, subissent des prélèvements sanguins répétés et une chirurgie induisant une douleur neuropathique, le porteur indiquant renoncer à tout antalgique pour ne pas fausser ses mesures. Le projet étudie les liens entre douleur, prise excessive de sucre ou d'alcool et addiction. Le porteur affirme que ce travail comportemental et moléculaire n'est possible que sur "l'animal entier".
Objectifs
Dans les pays développés, la consommation alimentaire semble être motivée par le plaisir plus que par le besoin de se nourrir. Ce phénomène, qui consiste à consommer un aliment pour son goût agréable (appétissant), apparaît préoccupant puisqu’il peut devenir la cause de maladies comme l’obésité. Les adaptations comportementales et cérébrales associées à ces troubles de l’alimentation pourraient partager des similitudes avec celles mises en place dans l’addiction à l'alcool. Notre programme de recherche vise à étudier la relation entre les prises excessives de nourriture appétissante et la consommation d'alcool. En particulier, l’apparition de douleur chez des patients souffrant d’addiction à l’alcool a été décrite mais n’est pas bien comprise. Nous faisons l’hypothèse que les troubles de l’alimentation pourraient jouer un rôle dans le développement de douleur, et nous étudions les mécanismes sous-jacents. Les objectifs sont donc dans un premier volet de (1) mesurer les réponsesà la douleur dans nos modèles, et d'effectuer des mesures du bien-être ; (2) caractériser les changements d’expression de gènes et de protéines dans le cerveau. Dans un deuxième volet, nous souhaitons (3) étudier les effets d’une douleur neuropathique sur la consommation de sucre ou d’alcool.
Bénéfices attendus
En identifiant les mécanismes physiologiques, notre recherche permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes centraux impliqués dans les troubles alimentaires et dans l’addiction en général, et en particulier dans le cadre de douleur neuropathique.
Procédures
-Prise de sang à 3 reprises lors du protocole de binge saccharose en PE1 (semaines 1, 4 et 8); Prélèvement sanguin, au maximum tous les 15j, après le début des régimes, en PE2, PE3 et PE5; -Chirurgie, PE5, Modèle douleur neuropathique, 1 fois pour chaque animal, suivi sur 8 semaines maximum
Impact sur les animaux
Nous utilisons des modèles de consommation excessive qui nécessitent l’isolement des animaux pour une précision des mesures. Nous surveillons les animaux quotidiennement. La prise de sang à 3 reprises lors du protocole de binge saccharose peut induire une douleur et un risque d'infection voir de nécrose. Un modèle de douleur neuropathique sera utilisé dans le deuxième volet de l’étude, pour lequel une chirurgie est effectuée sous anesthésie générale. Dans ce modèle, les souris présentent des seuils nociceptifs abaissés, qui sont aussi des symptômes de neuropathie observés en clinique. Cependant nous ne pouvons pas utiliser de moyens pharmacologiques pour réduire la souffrance des animaux car cela risquerait d’interférer avec les mécanismes que nous étudions.
Devenir
PE1 à PE5: Les animaux sont tous mis a mort ( lots détaillés dans chaque PE) pour prélèvements de tissus et analyses moléculaires
Remplacement
Dans la mesure où nos travaux portent sur la caractérisation comportementale et moléculaire d’une consommation excessive d’aliment ou d’alcool, ou d’une douleur, il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques pour l’analyse comportementale et l’analyse moléculaire. L’effectif est plus important pour l’expérience de neuropathie, pour prévenir des aléas expérimentaux ainsi qu'une éventuelle variabilité. Les expériences seront menées sur les deux sexes.
Raffinement
La surveillance des animaux est journalière (observation visuelle, suivi de l’aspect général et de la posture) et une pesée au minimum 2x/semaine est réalisée lors du suivi des consommations (sucre ou alcool), permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris ont toujours le choix de consommation (sucre ou alcool) avec de l’eau. Les souris, habituées au dispositif expérimental avant le début des mesures, peuvent se soustraire à la stimulation nociceptive. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale. Le prélèvement sanguin est effectué sous analgésie locale. Un suivi spécifique à chaque procédure avec des points limites adaptés sera mis en place pour éviter toute souffrance éventuelle. Les procédures regroupent plusieurs tests comportementaux dont l'enchaînement est compatible avec le bien-être de l'animal, ce qui permet de réduire l’effectif. De plus, les animaux sont isolés dans des cages enrichies et en cages ouvertes ce qui permet les contacts olfactifs entre congénères et permet aux animaux de communiquer entre eux ce qui concourt à limiter l’impact du stress d’isolement.
Choix des espèces
Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des troubles alimentaires et l’addiction. Sur un plan évolutif, les rongeurs, appartiennent au clade des mammifères le plus proche de celui des Primates. Nous choisissons de travailler avec la souris car nous pourrons ensuite étudier le rôle de gènes précis dans les adaptations observées, en utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées Souris jeunes adultes (8 semaines en début de procédure). Le jeune adulte correspond à la période de vie de vulnérabilité accrue chez l’Homme vis-à-vis des troubles alimentaires et de la dépendance aux drogues.
Etude du remodelage des neurones à parvalbumine dans l’hippocampe de souris modèles de la maladie d’Alzheimer soumises à un enrichissement environnemental
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 570 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance de léger à modéré, 1 456 étant mises à mort pour prélèvement de tissus et 114 gardées vivantes pour d'autres projets. Modèles d'Alzheimer, elles subissent des chirurgies d'une à deux heures et demie avec injections et pose d'électrodes, des enregistrements cérébraux en cage isolée et des tests de mémoire spatiale et sociale. Le projet cherche à relier l'effet d'un environnement enrichi sur la mémoire au remodelage de certains neurones de l'hippocampe. Le porteur affirme qu'étudier des comportements complexes rend "indispensable" le modèle animal.
Objectifs
Dans le cerveau, certains neurones jouent un rôle clé dans le contrôle de l’activité des autres neurones et dans la formation et le maintien des souvenirs. Après un apprentissage, ces neurones subissent des modifications qui leur permettent d'assurer la stabilité des souvenirs nouvellement acquis. Or, ces neurones fonctionnent de façon anormale dans le cerveau de souris modèles de la maladie d’Alzheimer (MA) ainsi que celui de patients atteints par cette pathologie. Chez l'humain, les études épidémiologiques indiquent qu'une vie riche en expériences diverses, que ce soit sur le plan intellectuel, sportif ou social par exemple, permet de former une réserve cognitive qui permettrait de diminuer les risques ou de ralentir la progression des maladies neurodégénératives. Cette ressource repose sur le fait que le cerveau peut compenser différentes lésions ou affections cérébrales en utilisant des réseaux neuronaux préexistants, ou en activant de nouvelles connexions neuronales. En accord avec cette idée, les souris modèles de la maladie d'Alzheimer placées dans un environnement enrichi (EE) qui comporte des expériences sensorielles et sociales stimulantes (cages plus grandes, avec plus de congénères, et des objets changés régulièrement) ont des capacités d’apprentissage et de mémoire améliorés au moins pendant plusieurs mois. Ce projet vise à démontrer que les améliorations comportementales observées chez les souris Alzheimer sont directement liées aux modifications subies par les neurones impliqués dans la formation et le maintien des souvenirs suite à ces stimulations. Il cherchera également à évaluer si les changements subis par ces neurones suite au séjour dans l’EE s’accompagne d’un rétablissement de l’activité électrique dans la région cérébrale clef dans la formation des souvenirs, l’hippocampe.
Bénéfices attendus
Ce projet se place dans le contexte général de la compréhension des substrats neuronaux à l’amélioration comportementale et cognitive observée suite à des stimulations sensorielles et sociales dans la maladie d’Alzheimer (concept de réserve cognitive). Précisément, l’objectif de ce projet est de montrer le lien causal entre le remodelage d'une population de neurones et l’amélioration de la mémoire après le séjour dans un environnement enrichi (EE) chez les souris modèles de la maladie d’Alzheimer (MA). Dans un premier objectif, nos expériences nous permettront de déterminer si c’est l’activation de ces neurones qui sous-tend l’amélioration de la mémoire des souris, ou s’il s’agit de la modification de ces neurones, ou si les deux sont nécessaires. Le deuxième objectif permettra d’étudier si les changements subis par ces neurones suite à un séjour dans un EE s’accompagnent d’un rétablissement de l’activité électrique cérébrale. Le troisième et dernier objectif permettra d’évaluer si la stimulation de ces neurones, en dehors de toutes stimulations environnementales, et suffisante pour obtenir des bénéfices comportementaux et d’activité cérébrale chez les souris modèles de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale d’une durée variant de 1h à 2h30 en fonction des gestes réalisés : ils pourront recevoir des injections (entre 1h et 1h30 par animal), des poses d'électrodes (environ 1h par animal), ou la combinaison des deux gestes précédemment cités (entre 2h et 2h30 par animal). Une partie des individus sera soumise à trois enregistrements de l’activité cérébrale, espacés dans le temps, et qui dureront de 72h à 24h. Durant ces phases d’enregistrements, les animaux seront placés dans des cages individuelles. Enfin les souris sont soumises à des tests comportementaux afin d’évaluer leur mémoire spatiale (3x10 min par animal) et leur mémoire sociale (90min par animal).
Impact sur les animaux
La procédure chirurgicale peut induire une douleur modérée au stade post opératoire (environ 12h). De plus, durant les enregistrements de l’activité cérébrale, les souris seront placées individuellement dans des cages isolées les unes des autres ce qui peut induire un stress durant les premières heures (3 sessions d’une durée totale de 120h). Par ailleurs, toutes les manipulations liées aux tests comportementaux peuvent engendrer un stress léger. Enfin, dans le cadre de leur suivi à l’aide d’une grille de scoring par le personnel de l’animalerie, les animaux sont pesés deux fois par semaine, ce qui peut engendrer un léger stress dû à leur manipulation.
Devenir
1456 souris seront mises à mort pour réaliser des prélèvements de tissus et effectuer des observations anatomiques et histologiques nécessaires à la validation scientifique de ce projet. 114 souris seront maintenues en vie et pourront être réutilisées dans d’autres projets.
Remplacement
L’objectif du projet étant l’étude de comportements complexes et les activités cérébrales associées à la maladie d'Alzheimer, il est indispensable de travailler sur un modèle animal. Il s’agit de valider une stratégie thérapeutique dans un modèle préclinique.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de nos études antérieures et est réduit au minimum pour nous permettre de comparer statistiquement les groupes expérimentaux. Afin de limiter le nombre d'animaux, la mémoire sociale et la mémoire spatiale seront étudiés sur les mêmes individus.
Raffinement
Les souris sont hébergées par groupe de 2 à 5 individus dans des cages contenant du matériel de nidification ainsi qu'une buchette pour l'enrichissement. Après réception, un temps d'habituation d'une semaine est respecté avant le début des expériences. Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation de 10 minutes par souris. Les animaux sont suivis de manière quotidienne par du personnel formé au soin et des points limites ont été définis à partir d’une grille de scoring. En cas de blessure ou de souffrance, les animaux recevront un traitement analgésique adapté. Tous les signes de souffrance détectés lors de l’observation quotidienne tels qu’un isolement et une indifférence par rapport au milieu extérieur, une diminution du comportement exploratoire, une attitude prostrée avec dos voûté, une expression faciale modifiée, une altération du pelage, une perte de poids > 20% conduiront à la mise à mort de l’animal en accord avec le vétérinaire référent. Concernant les chirurgies, elles seront réalisées sous anesthesie générale dans des conditions aseptiques et accompagnées d'une analgésie.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle souris car il existe des souris modifiées génétiquement présentant des symptômes similaires à la maladie d’Alzheimer humaine. Elles seront utilisées à l’âge de 5-6 mois car à cet âge, les souris présentent un stade modéré́ de la maladie. En ce qui concerne les souris démonstratrices pour les tests de mémoire sociale, elles seront toutes des femelles non-transgéniques, âgées entre 3 et 9 mois. Cette tranche d'âge correspond à des souris adultes. En effet, il est préférable d'utiliser des souris démonstratrices ni juvéniles (moins de 8-10 semaines), ni âgées (plus de 9-10 mois), ce qui pourrait entrainer des comportements sociaux différents.
Etude de faisabilité : induction d’une réaction inflammatoire intestinale chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
8 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va de léger à sévère. Elles reçoivent trois injections dans l'abdomen destinées à déclencher une inflammation intestinale que le porteur reconnaît douloureuse, avant un prélèvement des intestins. Le projet se limite à tester la faisabilité de cette induction avant une étude plus large, et le porteur précise recourir à des souris "produites en excès" dans ses élevages. Il affirme que la réponse inflammatoire, jugée trop complexe, ne peut se modéliser hors d'un organisme vivant.
Objectifs
L’inflammation est une réponse normale du corps qui nait, s’amplifie et s’éteint. Elle est consécutive à une agression interne (comme un cancer) ou externe (comme une infection). Lorsque le corps n’arrive plus à maîtriser l’inflammation, celle-ci peut engendrer des maladies diverses comme le diabète, le cancer ou devenir chronique comme l’arthrite, la maladie de Crohn par exemple. Les mécanismes de la phase d’initiation de l’inflammation sont maintenant bien compris. En revanche, les mécanismes de la phase d’arrêt de l’inflammation le sont moins. Ces dernières années, des travaux ont permis de comprendre cette phase appelée résolution caractérisée par l’arrêt de la réponse inflammatoire, la réparation du tissu enflammé pour permettre finalement le retour à l’état initial du tissu appelé homéostasie. In vitro, nous avons trouvé une stratégie permettant d’augmenter le nombre de cellules impliquées dans la résolution de l’inflammation. Il est impossible de définir si nos observations in vitro sont pertinentes in vivo. C’est pourquoi, nous souhaitons mener une étude de faisabilité de l’induction d’une inflammation intestinale chez la souris par un protocole simple et rapide. Si les résultats sont concluants, une étude plus vaste sera menée.
Bénéfices attendus
Si les résultats sont convaincants et permettent en effet d’induire une inflammation intestinale, alors nous proposerons un projet visant à valider nos données obtenues in vitro pour améliorer la résolution de l’inflammation.
Procédures
Les animaux vont être soumis à 3 injections intrapéritonéales le lundi, mercredi et vendredi de 15 secondes connues pour ne pas être particulièrement douloureuses.
Impact sur les animaux
Les animaux vont être soumis à 3 injections intrapéritonéales de 15 secondes connues pour ne pas être particulièrement douloureuses mais la manipulation des animaux peut induire un stress. L’inflammation intestinale induite peut s’avérer douloureuse.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les intestins
Remplacement
Nos données obtenues in vitro montrent le rôle d’un récepteur aux signaux de danger dans la balance entre les cellules inflammatoires ou non inflammatoires. La réponse inflammatoire étant un phénomène complexe faisant intervenir beaucoup de cellules, de molécules et leurs interactions, il est impossible de la modéliser en dehors d’un organisme vivant.
Réduction
Dans un souci de réduction, notre demande d’expérimentation vise à évaluer la faisabilité de cette expérience avant de proposer une étude plus large. Afin d’avoir une réponse fiable quant à l’induction de l’inflammation, nous n’utiliserons que 8 souris. Quatre d’entre elles permettront de réaliser une analyse par cytométrie et les 4 autres feront l’objet d’une analyse par histochimie. De plus, cette expérience sera réalisée sur des souris de nos élevages produites en excès.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à raison de 10 animaux par cage dans un environnement adapté et enrichi. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Chaque animal sera examiné quotidiennement tout au long de l’expérimentation. L’inflammation intestinale cause des douleurs. En cas de signes de douleur ou de souffrance prolongée et/ou trop intense, les souris seront mises à mort. Afin de mieux les apprécier une grille de score sera utilisées. En cas de problèmes de mobilités induits par la douleur, nous ajouterons des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible.
Choix des espèces
Les animaux seront utilisés à l’âge adulte à partir de 8 semaines, c’est-à-dire possédant un système immunitaire mature. Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation de part l’utilisation de souris génétiquement modifiés. Ainsi, si cette étude pilote s’avère concluante, nous envisagerons un projet faisant intervenir des animaux transgéniques.
Etude de la réponse physiologique chez une souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt lors d’une altération pharmacologique de la fonction cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une mini-pompe implantée sous la peau du dos sous anesthésie, subissent des échographies cardiaques répétées et une induction pharmacologique d'hypertension qui peut entraîner une mortalité dans les jours suivants. Le projet étudie le rôle d'un gène dont l'inactivation altère la fonction cardiaque, dans un contexte d'hypertension, et teste un traitement. Le porteur affirme qu'aucune autre approche ne permet d'étudier ce gène dans un organisme vivant et que la souris est la "meilleure approche disponible".
Objectifs
Nous souhaitons étudier le rôle d'un gène d’intérêt dont l'inactivation entraîne une anomalie de la fonction cardiaque. Plus particulièrement, nous souhaitons étudier le rôle de ce gène dans le cadre d'une hypertension. Ce projet vise ainsi à comprendre si la suppression de ce gène pourrait modifier les réponses du système cardiaque lors d'une hypertension. Ces travaux sont une étape nécessaire dans le développement de traitements potentiels des troubles cardiaques observés chez les patients souffrant d'insuffisance cardiaque ou d'hypertension. Dans ce projet, nous prévoyons donc d'analyser des animaux génétiquement modifiés, porteurs d'une délétion totale du gène d’intérêt. Afin de déterminer l'impact de l’inactivation du gène d’intérêt sur la fonction cardiaque, dans un contexte d'hypertension nous utiliserons un modèle pharmacologique. De plus, nous testerons l’effet d’un traitement qui a pour but de réduire l’hypertension. Ainsi, nous tenterons de comprendre d’une part le rôle de la mutation dans la réaction à l'hypertension d'origine cardiaque et d’autre part l’effet du traitement sur cette hypertension.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de progresser dans la connaissance que nous avons sur le gène étudié, en recherche préclinique. Les données générées nous permettront de mettre en évidence des pistes thérapeutiques potentielles qui seront utilisées pour le développement de nouveaux médicaments dans le cadre des troubles cardiaques observés chez les patients souffrant d'insuffisance cardiaque ou d'hypertension.
Procédures
3 prélèvements sanguins qui durent quelques minutes. 4 injections intrapéritonéales ( uniquement pour les groupes avec traitement) qui durent environ moins d'1 minute. 3 évaluations cardiaques avec une anesthésie gazeuse de 45 minutes environ. 1 implantation sous-cutanée de mini-pompe avec une anesthésie gazeuse d'une durée de 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une implantation sous-cutanée au niveau du dos de mini-pompes sous anesthésie gazeuse. Cette implantation entrainera une douleur locale post-opératoire qui sera couverte par des antalgiques. Suite à cette implantation, les animaux subiront une anesthésie gazeuse pour effectuer des échographies cardiaques. Celle-ci dure environ 45 minutes et les animaux se réveillent spontanément. Une mortalité peut se présenter dans les jours suivant la mise en place de l'hypertension. Des points limites adaptés permettent d'anticiper ce risque pour éviter toute souffrance animale
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques.
Remplacement
Nous ne disposons pas d'une autre possibilité d'étudier la fonction de ce gène dans un organisme vivant. Cette étude in vivo est nécessaire pour permettre les analyses physiologiques qui nécessitent des interactions entre plusieurs organes. Dans le cadre d'atteintes de la fonction cardiaque et en particulier dans la mise en place d’une hypertension, le modèle souris constitue la meilleure approche disponible à ce jour pour cela.
Réduction
Chaque groupe expérimental sera constitué de 12 animaux, cet effectif a été calculé par étude de puissance et est suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables dans les protocoles d'analyse prévus (échographie cardiaque et électrocardiogramme). De plus d’après nos connaissances sur le modèle d’induction d’hypertension des groupes de 12 animaux sont nécessaires. Nous souhaitons donc employer un total de 144 souris pour ce protocole, correspondant à 12 groupes de 12 animaux. Le projet vise à définir les paramètres régissant la réponse au test pharmacologique, en comparant des animaux exprimant ou non le gène d'intérêt, dans des conditions physiologiques ou avec le protocole d'hypertension, traités ou non avec l’anticorps et chez les deux sexes (12 conditions au total).
Raffinement
Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal dominé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Les animaux seront maintenus en groupes, dans des conditions d'animalerie optimales. Ils disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi. Le cas échéant, des soins locaux seront appliqués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Le suivi post-implantatoire des pompes osmotiques délivrant le traitement pharmacologique déclenchant l'hypertension comprendra une surveillance de l'incision, du poids de l'animal, de son état général. Un tapis chauffant permettra aux animaux de maintenir leur température corporelle durant l'anesthésie. Les pompes osmotiques sont mises en place pour réduire la douleur et le stress sur le long terme en évitant des injections et des manipulations nombreuses et répétées Durant la pose des minipompes, ainsi que les échographies, les animaux seront anesthésiés et recevront une couverture analgésique appropriée.
Choix des espèces
La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement du modèle porteur de la modification génétique sur le gène d'intérêt, ce qui en fait un modèle de choix. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Enfin, dans le cadre d'atteintes de la fonction cardiaque, le modèle souris constitue la meilleure approche disponible à ce jour. Les animaux démarreront leur protocole en tant que jeune adulte, à partir de 7 semaines. A cet âge la fonction cardiaque est bien développée.
Régulation de la machinerie Polycomb dans le développement embryonnaire.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Le porteur indique qu'aucun geste douloureux n'est pratiqué sur les animaux et que la sévérité tient à la létalité embryonnaire de la mutation étudiée, les embryons étant prélevés au 15e jour de gestation après mise à mort des femelles gestantes. Le projet porte sur la machinerie Polycomb, qui régule l'identité des cellules, et son rôle dans le développement et diverses pathologies dont le cancer. Le porteur affirme que la variabilité des effets d'une cellule à l'autre rend l'étude difficile in vitro et que le rôle hématopoïétique de la protéine impose un modèle mammifère.
Objectifs
Les organismes complexes tels que les mammifères sont composés d’une très grande variété de cellules, chacune ayant des propriétés particulières, on parle d’identité des cellules. Etablir et maintenir ces identités cellulaires est un enjeu crucial en biologie. Un ensemble de protéines, regroupé sous le nom de « Polycomb », participe activement à ce processus, son rôle est de s’assurer que les gènes qui ne doivent pas être utilisés dans un type cellulaire donné ne le soit pas. Pour cela, les protéines du groupe Polycomb régulent la structure de la chromatine (c.a.d. le repliement de l’ADN) de façon à moduler l’accessibilité des gènes (dans le cas présent les rendre peu accessibles). Les altérations de l’activité des protéines du groupe Polycomb peuvent avoir des conséquences très délétères sur les organismes et sont fréquemment observées dans diverses pathologies dont le cancer. Pour mieux comprendre le mécanisme d’action de cette machinerie et sa régulation, nous étudierons des mutations ciblées d’une des protéines polycomb en analysant en particulier leur impact sur la capacité des cellules à conserver leur identité. L'objectif de ce projet est de déterminer comment une régulation anormale de la machinerie Polycomb peut impacter le développement, et de façon plus générale l'identité des cellules comme observé dans une variété de pathologies.
Bénéfices attendus
Les protéines du groupe Polycomb ont un rôle très important lors de la différentiation cellulaire et ensuite pour le maintien de l’identité cellulaire. Leur mutation ont souvent des conséquences majeures sur le développement embryonnaire. Il a, par ailleurs, été montré que des mutations de membre de la machinerie polycomb sont à l’origine de certaines maladies génétiques (par exemple weaver syndrome) tandis que des altérations de cette machinerie sont récurrentes dans les cancers. Le contrôle de l’activité de cette machinerie est donc un enjeu crucial. A court terme, cette étude vise à mieux comprendre le fonctionnement d’un de ces acteurs du groupe polycomb dans le développement embryonnaire. A plus long terme, cette étude pourrait éclairer sur la contribution des protéines polycomb dans un contexte pathologique et informer sur les conséquences que pourraient avoir la manipulation pharmacologique de ces protéines sur les patients (des composés inhibant l’activité d’un membre de la machinerie polycomb sont déjà approuvés pour l’usage en clinique).
Procédures
Il n'y aura pas de procédure externe créant des douleurs chez les souris. Toutefois, la mutation homozygote du gène d'intérêt entraine une létalité au stade embryonnaire des souris. Les embryons seront prélevés au 15ème jour de gestation, après mise à mort des femelles gestantes, pour des analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
La mutation complète de notre protéine d’intérêt, sur la base de la littérature, est létale vers le stade embryonnaire 18.5 (18,5 jours post accouplement). Nous avons généré des mutations partielles qui devraient donc avoir un phénotype équivalent ou moindre. Nous savons que nous ne récupérons pas de souris homozygote à la naissance, nous estimons donc la létalité de ces modèles entre le stade embryonnaire 18.5 et la naissance. Les souris hétérozygotes n’ont pas de phénotypes apparents.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Les mutations de notre protéine d’intérêt ont d’abord été générées dans une lignée cellulaire permettant d’avoir une première estimation de leur conséquence fonctionnelle. Nous avons sur cette base sélectionnée les mutations dont le phénotype est le plus informatif que nous souhaitons maintenant analyser dans un modèle murin. Les protéines du groupe Polycomb sont essentielles pour le maintien de l’identité des cellules toutefois les conséquences de leur altération sont très variables d’une cellule à une autre. Il est, de ce fait, difficile d'évaluer leur activité de façon compréhensive dans des modèles cellulaires. Par ailleurs, notre protéine d’intérêt ayant un rôle spécifique dans la régulation hématopoïétique, cette étude ne peut pas facilement être réalisée dans un organisme non-mammifère.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux à utiliser pour cette étude, deux mesures principales seront implémentées : 1) Dans un premier temps, les mutants de notre protéine d'intérêt sont générés dans une lignée cellulaire et nous essayons de caractériser les conséquences de ces mutations de façon la plus exhaustive dans ces modèles in vitro. 2) Par ailleurs, nous optimiserons nos expériences afin de réaliser plusieurs expériences en parallèle sur un même embryon mutant. Ainsi, bien que notre étude soit plus focalisée sur le développement hématopoïétique, nous récolterons également d'autres organes dans lesquels notre protéine d'intérêt est susceptible d'altérer le développement. Ne connaissant pas précisément la sévérite des phénotypes, mais estimant sur la base de la littérature que la létalité embryonnaire due aux mutations de notre protéine d’intérêt devrait avoir lieu autour de 18.5 dpc, nous étudierons le stade 15.5 en étudiant 14 embryons issus d’au moins deux portées (recommandation IMPReSS).
Raffinement
Aucun geste technique ne sera effectué sur les animaux. Seul le phénotype de la mutation de notre protéine d'intérêt peut entrainer un phénotype dommageable chez les embryons. Pour le réduire au maximum, nous analyserons les embryons mutants au temps le plus précoce possible (avant l’apparition du phénotype dommageable) permettant une évaluation robuste du phénotype. A noter que les lignées utilisées sont élevées à l’état hétérozygote, sans phénotype dommageable.
Choix des espèces
La souris est un mammifère très proche de l'Homme au niveau génétique mais aussi métabolique et immunitaire, c'est donc un excellent modèle d'étude des pathologies humaines comme le cancer et les maladies génétiques du développement. Par ailleurs, la connaissance du génome murin, sa forte homologie avec le génome humain et l’existence de divers modèles génétiquement modifiés murins rendent ce modèle puissant. Ainsi, ce modèle animal est le meilleur compromis entre l’étude d'un modèle animal mammifère et l’obtention de réponses pertinentes aux questions posées. Toutes les analyses se feront durant le dernier tiers du développement embryonnaire. La délétion complète de notre protéine d'intérêt étant létale autour du stade embryonnaire 18,5 et de nombreuses étapes de la différentiation hématopoïétique se faisant à ce stade.
Modélisation et caractérisation d’un sous-type de leucémie résistante à la chimiothérapie
- Recherche appliquée
- Cancers
128 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation de 90 secondes sans anesthésie, puis une injection de cellules souches humaines modifiées et des prélèvements sanguins mensuels à la joue, également sans anesthésie. Le porteur reconnaît qu'une prolifération incontrôlée des cellules peut causer perte de poids, diarrhées et souffrance, et prévoit une euthanasie douze semaines après l'injection. Il affirme que la culture in vitro ne reproduit pas le microenvironnement des patients, ce qui rend selon lui la souris "indispensable".
Objectifs
La leucémie aiguë lymphoblastique B est un cancer du sang affectant les lymphocytes B, un type de globule blanc de notre système immunitaire. Nous cherchons à améliorer la prise en charge de certaines leucémies dîtes de haut-risque, puisqu’elles présentent une très mauvaise réponse aux traitement actuels. Nous cherchons à comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans le développement de la cellule leucémique et d’identifier des vulnérabilités exploitables avec des molécules ciblées, dans l’optique de s’éloigner de la chimiothérapie. Afin de mieux comprendre les effets fonctionnels causés par ces altérations, nous voulons les rajouter à des cellules souches humaines. Pour cela, nous allons modifier génétquement ces cellules afin d’induire l’expression des altérations d’intérêt et injecter ces cellules à des souris pour évaluer les conséquences dans un modèle vivant. Nous espérons pouvoir reproduire les conséquences biologiques observées chez les patients et identifier les processus biologiques directement impliqués dans le développement leucémique.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans la transformation des cellules normales en cellules cancéreuses. Ceci devrait nous permettre de trouver un traitement ciblé plus efficace que la chimiothérapie actuelle, et à plus long terme, d’améliorer le devenir de ces patients.
Procédures
Les souris receveuses sont immunodéficientes, modifiées génétiquement afin de présenter un déficit de certaines cellules immunitaires ; ce qui les rend donc plus susceptibles aux infections. Les animaux seront ensuite soumis à une irradiation sans anesthésie de 90 secondes afin de réduire le nombre de cellules sanguines murines et permettre la greffe, survie et prolifération des cellules humaines injectées. Le lendemain, il y aura une injection unique de cellules souches humaines par voie intra-veineuse dans la veine de la queue sans anesthésie. Des prélèvements sanguins seront réalisés une fois par mois au niveau de la veine de la mâchoire, sans anesthésie Ceci permettra de suivre la prise de greffe des cellules injectées et anticiper toute prolifération massive. L’injection et le prélèvement sanguin sont des procédures rapides qui ne durent qu’entre 30s et 1 minute par souris.
Impact sur les animaux
Les procédures réalisées sont rapides et non invasives. Cependant, l’irradiation peut causer des diarrhées et l’injection en elle-même peut causer une douleur brève au niveau du site d’injection. Les cellules souches humaines modifiées peuvent éventuellement causer une prolifération massive des cellules et nous ne pouvons pas anticiper l’effet des altérations étudiées dans les cellules injectées, avec potentiellement une prolifération accélérée. Ceci peut causer une souffrance pour l’animal qui pourra se manifester par une modification du comportement, ou de l’apparence physique en cas de manque de toilettage, le plus souvent la perte de poids et des diarrhées précèderont ces évènements.
Devenir
Afin d’analyser le devenir des cellules humaines modifiées injectées, les animaux seront euthanasiés 12 semaines après leur injection pour permettre la collecte et l’analyse des différents organes tels que la moelle osseuse et la rate.
Remplacement
A ce jour, certains modèles de culture en milieu artificiel (in-vitro) permettent l’étude du développement de la leucémie mais leur pertinence reste partielle car la différenciation in vitro est très artificielle, et ne récapitule pas complétement la différenciation humaine normale. L’utilisation d’un modèle animal assure la présence du microenvironnement complexe récapitulant ce qui se passe chez les patients. Cela rend donc indispensable l’utilisation d’un modèle animal pour conduire des études fonctionnelles et précliniques.
Réduction
Pour ce projet, nous prévoyons 8 groupes d’animaux qui seront injectés avec des cellules différentes. Afin d’obtenir des différences statistiques significatives tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons réalisé une estimation du nombre d’animaux nécessaires et suffisants définie à l’aide d’une analyse statistique. Afin d’obtenir des différences significatives, chaque groupe comptera 4 animaux pour s’assurer d’une bonne reproductibilité ce qui représente au total 32 animaux par expérience qui pourra être répétée au maximum 4 fois. Pour des questions organisationnelles, afin de limiter la taille de l’expérience et de s’assurer de la robustesse des résultats obtenus, nous séparons en 3 répétitions, en anticipant une 4eme en cas de soucis techniques ne permettant pas d’observer de différences statistiquement significatives. L’analyse des résultats obtenus se fera au moyen de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Une surveillance quotidienne visuelle sera réalisée par l’animalier ou l’expérimentateur. Nous serons également attentifs en veillant à ce que tous les animaux soient maintenus autant que possible en groupe et que l’enrichissement du milieu soit adapté, notamment pour les animaux qui se retrouveraient isolés en cours d’expérience. Toutes les cages auront un enrichissement (papier kraft, tunnel, buchette de bois). Les animaux immunodéficents seront hébergés dans des cages ventilées et toutes les manipulations seront réalisées sous hotte afin de limiter tout risque d’infections. Une surveillance clinique hebdomadaire du poids, de l’apparence (pelage, sécrétions, présence de masse tumorale) et du comportement (interactions sociales, posture, mobilité, respiration) sera effectuée par l’expérimentateur dès l’injection des cellules humaines et jusqu’à la fin de la procédure (12 semaines après injection). En cas de détection de certains signes cliniques la surveillance clinique pourra être faite plus fréquemment. Une surveillance biologique mensuelle par prélèvement de sang sera également effectuée afin de détecter une prolifération anormale des cellules injectées. Le suivi des animaux se fera en suivant une grille de points limites définis, suffisamment précoces et prédictifs. Toute souris présentant des signes de souffrance pendant la durée de l’expérience (poil hérissé, prostration, perte de poids, tumeur palpable) sera euthanasiée sans attendre et analysée.
Choix des espèces
Le modèle souris utilisé dans ce projet présente deux avantages : (i) Les souris immunodéficientes sont décrites dans la littérature scientifique depuis de nombreuses années comme étant le meilleur modèle pour greffer les cellules sanguines humaines, et étudier le développement des lymphocytes dans un microenvironnement se rapprochant le plus de la physiologie humaine. (ii) Nous avons une bonne connaissance des signes de douleur et souffrance des souris et donc de leur prise en charge. Les souris seront injectées à partir de 7 semaines, lorsqu’elles auront atteint l’âge adulte, afin de garantir une prise de greffe optimale des cellules sanguines humaines.
Caractérisation de nouveaux agents pharmacologiques dans deux modèles murins de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de deux modèles transgéniques d'Alzheimer, elles subissent une biopsie de l'oreille puis une série de tests comportementaux de mémoire, dont un test d'évitement passif reposant sur une stimulation électrique des pattes. Le porteur teste des molécules hybrides dirigées contre deux cibles, et renvoie les bénéfices à un éventuel développement clinique. Sur le remplacement, il affirme que ces modèles murins sont le "seul recours" in vivo autre que l'humain présentant les symptômes de la maladie.
Objectifs
Les traitements disponibles aujourd’hui pour traiter la maladie d’Alzheimer (MA) sont essentiellement symptomatiques. La recherche pharmacologique explore donc activement d'autres pistes, la première d'entre elles étant de mettre au point des molécules actives à faible dose et sans effets secondaires pour les patients. Ce projet a donc pour but de créer et caractériser l’effet pharmacologique de molécules hybrides dirigées contre 2 cibles, afin d’avoir un impact majeur sur la toxicité, la neuroinflammation et le stress oxydatif présents dans la MA. Deux modèles transgéniques de la MA seront étudiés dans ce projet.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de découvrir des molécules neuroprotectrices très efficaces sur des modèles transgéniques,pour contrer les symptômes de la maladie d'Alzheimer, et espérer un développement pré-clinique et clinique de molécules hybrides actives en combinaison sur 2 cibles, pour modifier de façon durable le décours de la maladie.
Procédures
Les animaux transgéniques auront une biopsie à l'oreille au moment de l'identification. Les animaux seront traités par eau de boisson durant 2 mois. Suite à ce traitement les performances mnésiques des animaux seront testées, avec des tests comportementaux. La durée des tests est variable selon le type de test (de 3 à10 minutes) et pour les tests pour lesquels un apprentissage est nécessaire, les sessions sont répétées 3 fois à 20 minutes d'intervalle pendant 5 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux transgéniques auront une biopsie à l'oreille au moment de l'identification qui peut engendrer un léger stress. Les tests comportementaux peuvent engendrer un léger stress suite à la contention de l'animal et le test d'évitement passif permettant d'évaluer la mémoire à long terme repose sur la perception d'une stimulation électrique de très faible intensité au niveau des pattes de la souris.
Devenir
Après la série de tests comportementaux, les animaux seront euthanasiés et le matériel biologique sera récupéré pour procéder à des analyses port-mortem.
Remplacement
Afin de déterminer l’efficacité neuroprotectrice des différents composés hybrides, les tests doivent se faire « in vivo » en vue d’un éventuel développement clinique. De plus, l’utilisation de modèles murins transgéniques de la MA pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la MA
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux les doses administrées se baseront sur les doses efficaces observées sur un modèle aigu de la MA précédemment obtenus au laboratoire. Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe). Une veille bibliographique sera également prise en compte durant les 5 années du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de concentrer un maximum d’échantillons et éviter ainsi de relancer des expérimentations.
Raffinement
Nous procéderons à l’enrichissement minimal du milieu, car un enrichissement trop important interagit avec l’étude de la mémoire. Les animaux auront donc accès à des copeaux de carton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur.. Les procédures d’administration des composés par l' eau de boisson n'entraine aucun effet négatif. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu et l’animal serait retiré de l'étude
Choix des espèces
Nous choisissons de travailler avec la souris en raison des nombreuses simililtudes au niveau des processus physiologiques avec l’Homme. Par ailleurs, de nombreux modèles ont été développés afin de récapituler certains des changements pathologiques et cognitifs associés à la maladie d'ALzheimer. Notre étude comprend l’utilisation de deux modèles à des âges pour lesquels ils présentent des symptomes plus ou moins avancés. Une lignée transgénique développe progressivement la pathologie avec des altérations comportementales dès 9 mois et qui sont très marquées à 12 mois d'âge, c'est donc un très bon modèle expérimental pour refléter la progression de la MA. L'autre lignée commence à développer des plaques Aβ dès 2 mois avec des déficits cognitifs à l'âge de 4 mois. Ces souris sont utiles pour étudier la MA précoce. Les souris transgéniques seront testées dès l'âge de 2 mois afin de visualiser l’apparition progressive des symptômes et une fois bien installés, l’effet des composés seront testés en traitant les animaux pendant 2 mois après l’apparition des symptômes .
Identification de nouvelles molécules à visée anti-fibrotique dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles urogénitaux
Pendant six semaines, des souris reçoivent deux injections par semaine d'un inducteur de fibrose du foie ou du rein, ou d'un produit témoin, puis trois semaines d'injections ou des cycles de gavage quotidien du traitement testé, sont pesées deux fois par semaine et subissent une prise de sang sous anesthésie avant leur mise à mort. Le projet porte sur 986 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, modéré ou sévère, dont 30 gardées 24 mois pour étudier leur vieillissement et d'autres isolées 16 heures, trois ou quatre fois, pour recueillir leurs urines. Une lignée privée du gène col4a3 développe d'elle-même une fibrose rénale vers dix semaines, avec une perte auditive modérée dès six à huit semaines. À la fin de chaque procédure, toutes sont tuées pour prélever les reins ou le foie.
Objectifs
La fibrose est définie comme une cicatrisation anormale des tissus constatée après agression de ces derniers. Cette affection est irréversible et s'aggrave au cours du temps. Ce phénomène peut affecter la plupart des organes dont les poumons, les reins, le foie ou encore le coeur et représente un problème majeur de santé publique. En effet, 45% des décès dans les pays industrialisés seraient liés à la présence d’une composante fibrotique. Cependant, les mécanismes à l'origine de ce processus restent actuellement largement méconnus. De ce fait, un des enjeux majeurs de ces dernières années consiste à mieux appréhender les causes et les mécanismes de cette maladie afin de développer de nouveaux marqueurs diagnostiques, pronostiques et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les modèles cellulaires ne permettant pas de refléter de manière satisfaisante le processus de fibrose, le recours à l'animal reste une étape indispensable pour démontrer le potentiel anti-fibrotique d'un candidat médicament. Les objectifs de notre projet sont les suivants : - Identifier de nouvelles molécules présentant un potentiel anti-fibrotique dans des modèles murins de fibrose hépatique et rénale. Ces molécules ont été sélectionnées préalablement dans notre laboratoire à la suite de tests in vitro. Pour cela, nous utiliserons différents modèles murins couramment décrits dans la littérature scientifique permettant d'induire (ou développant spontanément) des lésions de fibrose hépatique ou rénale. De plus, la fréquence de la plupart des pathologies fibrotiques étant fortement augmentée après 50 ans, nous inclurons dans notre étude des souris âgées pour être plus représentatifs de la pathologie humaine. - Confirmer le rôle instrumental d’un gène, miR-21, dans la fibrose dans un modèle de souris déficientes pour ce gène. En effet, les résultats préliminaires obtenus in vitro nous ont permis de démontrer l'implication de ce gène dans la fibrose. Nous souhaitons donc confirmer nos résultats dans un modèle complexe.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer le potentiel anti-fibrotique de 5 molécules dont l’intérêt a été démontré in vitro au préalable en utilisant à la fois des souris jeunes et âgées. A terme, ce projet devrait permettre d’obtenir la preuve de concept de l’utilisation de ce type de molécules dans la prise en charge des patients atteints de fibrose, pour lesquels les options thérapeutiques restent à l’heure actuelle très limitées.
Procédures
Partie 1 : 30 souris hébergées pour étudier leur vieillissement subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (2min30) avant leur mise à mort. Durée totale = 24 mois Partie 2 : 360 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 2 injections par semaine pendant 3 semaines du traitement ou de son contrôle (30 sec/intervention). 180 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 1 gavage par jour (60 sec/intervention) pendant 1 cycle de 7 jours, répété 2 fois avec un intervalle de 2 semaines entre les 2. 180 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 1 gavage (60 sec/intervention). Elles seront également pesées 2 fois par semaine pendant 4, 6 ou 7 (en fonction du groupe) semaines (1 min/pesée) et subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (2min30) avant leur mise à mort. Durée totale = 7 semaines. Partie 3 : 360 souris recevront 1 injection de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 2 injections par semaine pendant 3 semaines du traitement ou de son contrôle (30 sec/intervention). 180 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 1 gavage par jour (60 sec/intervention) pendant 1 cycle de 7 jours, répété deux fois avec un intervalle de 2 semaines entre les 2. 180 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 1 gavage (60 sec/intervention). Elles seront également pesées 2 fois par semaine pendant 5, 7 ou 8 semaines (en fonction du groupe) (1 min/pesée) et subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (2min30) avant leur mise à mort. Durée totale = 8 semaines. Partie 4 Étape 1 : 36 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines (30 sec/intervention). Étape 2 : 72 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines (30 sec/intervention) puis seront isolées pendant 16h pour le recueil passif des urines (répété 3 fois pour 36 souris et 4 fois pour les 36 autres souris). Un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (2min30) sera réalisé sur 92 souris (72 souris du protocole + 20 souris contrôle) avant leur mise à mort. Durée totale = 9,5 semaines.
Impact sur les animaux
Notre projet implique l’induction de lésions de fibrose hépatique ou rénale chez la souris. De plus, les souris déficientes pour le gène col4a3 présentent à 6-8 semaines une perte auditive neurosensorielle modérée et développent à 10 semaines une glomérulosclérose associée une fibrose rénale.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes (reins et/ou foie) dans le but d’étudier la fibrose et la sénescence dans ces organes.
Remplacement
Des résultats préliminaires in vitro obtenus au sein de notre laboratoire nous ont permis de : - démontrer l’implication de certains gènes tel que miR-21 ou de processus cellulaires comme la sénescence dans la fibrose. - pouvoir sélectionner 5 candidats médicaments pour nos évaluations de potentiel anti-fibrotique. Cependant, les modèles cellulaires ne permettent pas de refléter de manière satisfaisante le développement des lésions de fibrose. En effet, le processus de fibrose étant un processus dynamique mettant en jeu de nombreux types cellulaires, son étude ne peut se concevoir que sur organisme entier et de ce fait nécessite de recourir à l’expérimentation animale.
Réduction
Nos études in vitro effectuées en amont au laboratoire nous ont permis de réduire significativement le nombre de molécules d’intérêt à tester et de ce fait, de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour notre recherche. En ce qui concerne le nombre d’animaux utilisés dans notre étude, en émettant l'hypothèse d'une fréquence de l'événement de 10% sans traitement et de 75% avec traitement, il est nécessaire d'inclure 7 souris par groupe. Du fait de la variabilité de réponse pouvant être observée lors du processus de fibrose, nous envisageons d’utiliser 9 souris par groupe expérimental. De plus, les modèles utilisés dans ce projet sont complémentaires et utilisent des procédures déjà mises au point et couramment décrites. Les différentes procédures mises en œuvre pour ce projet ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Pour la mise en œuvre de ce projet qui durera 5 ans, le nombre total d'animaux estimé est de 986 souris.
Raffinement
Le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques en expérimentation animale. Afin de limiter au minimum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage dans un environnement enrichi avec des cotons de nidification, et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés de 7 à 10 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés individuellement avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin de réduire leurs stress et angoisse. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé de manière à s’assurer qu’ils ne présentent pas de signes de souffrance nécessitant l’arrêt des procédures et leur mise à mort. La souffrance sera évaluée par l’observation de paramètres de poids, de comportement et d’apparences reportés dans une grille standard permettant d’établir un score à ne pas dépasser. Tout animal dépassant ce score sera exclu du protocole et mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle murin constitue un modèle de choix pour l’étude de la fibrose tissulaire de par notamment les nombreuses similitudes avec la pathologie observée chez l’homme. Le choix des lignées utilisées est dépendant des protocoles déjà existants et décrits dans la littérature. La fréquence de la plupart des pathologies fibrotiques étant fortement augmentée après 50 ans, nous inclurons dans notre étude des souris jeunes adultes et âgées pour être plus représentatifs de la pathologie humaine. Seul le modèle de fibrose rénale spontanée inclura de jeunes souris de 4 semaines en raison du développement précoce des lésions de la pathologie.
Impact des rayonnements ionisants à faible dose sur la carcinogénèse dans un modèle de souris transgénique développant des tumeurs du côlon
- Recherche appliquée
- Cancers
450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un produit activant une modification génétique déclenche des tumeurs intestinales, que le porteur reconnaît pouvoir provoquer des douleurs modérées à sévères, et une partie des souris est irradiée sous anesthésie pour reproduire l'exposition d'un scanner médical. Le projet cherche à savoir si de faibles doses de rayons X favorisent le cancer colorectal, sur un modèle transgénique inductible au tamoxifène. Le porteur affirme qu'un modèle animal aussi réaliste que possible est "nécessaire", tout en annonçant des organoïdes de côlon censés limiter à terme le nombre d'animaux.
Objectifs
Le cancer colorectal (cancer du côlon ou du rectum, CCR) est en France le troisième cancer le plus fréquent chez l'homme et le deuxième chez la femme, avec environ 45 000 cas diagnostiqués chaque année. Il représente la deuxième cause de décès par cancer en France, tous sexes confondus. 20 % des patients atteints de CCR ont des antécédents familiaux, mais seuls 5 à 10 % des cas sont purement dus à des facteurs génétiques. Les facteurs de risque du CCR comprennent des facteurs liés au mode de vie et à l'environnement, notamment l'exposition aux rayonnements ionisants. L'utilisation de l'imagerie diagnostique a connu une croissance spectaculaire au cours des dernières décennies. Chaque jour dans le monde, un demi-million de patients bénéficient d'un CT-scan. L’imagerie CT consiste à focaliser un faisceau de rayons X sur des parties spécifiques du corps et celle-ci représente 42 % de la dose collective totale pour la radiologie de diagnostic médical. De plus, de nombreux patients sont susceptibles d'être exposés à de multiples CT-scans, et une proportion significative de ceux-ci reçoivent des doses cumulées dépassant la limite communément admise des faibles doses, au-delà de laquelle l’augmentation du taux de cancer peut être observée épidémiologiquement. On ignore aujourd'hui si ces procédures d’imagerie potentialisent le risque de développement d'un cancer, chez des individus sains ou prédisposés Nous proposons ici d'aborder cette question en utilisant un modèle inductible murin de cancer du côlon. Afin de reproduire les conditions d'exposition d’un CT-scan, nous effectuerons des irradiations à l'aide d'un irradiateur adapté, qui peut délivrer de faibles doses de rayons X de faible énergie à de petits animaux et à des cellules. Nous observerons l’impact de ces irradiations sur l’induction de tumeurs dans les intestins et les côlons de souris. Nous générerons également des organoïdes intestinaux de souris afin d’étudier plus précisément les mécanismes moléculaires mis en œuvre.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de : • Mieux comprendre les interactions possibles entre l’exposition aux faibles doses de radiation et la carcinogenèse colorectale ; • Décrire les mécanismes moléculaires sous-jacents lors de la carcinogenèse dans ce modèle ; • Développer un modèle intégré décrivant les effets moléculaires, cellulaires et physiologiques des faibles doses dans le côlon. Ceci devrait fournir des informations importantes qui contribueront à l’évaluation des risques liés aux irradiations médicales diagnostiques.
Procédures
- Administration du produit activant la modification génétique par voie intrapéritonéale (n= 450) : 3 injections. - Irradiation avec un irradiateur pour petit animal sous anesthésie (n = 360) (30 sec - 5 min, 1 seule fois).
Impact sur les animaux
Les souris non traitées avec le produit activant la modification génétique n’ont aucun effet indésirable. Après administration du produit, des tumeurs intestinales se développent chez les souris portant la mutation génétique d’intérêt et ces tumeurs peuvent entraîner des douleurs modérées à sévères. L'irradiation à faible dose des animaux n'est pas susceptible d'entrainer des nuisances sur les animaux.
Devenir
Les prélèvements intestinaux seront effectués après euthanasie. Il est donc nécessaire d’euthanasier tous les animaux expérimentaux.
Remplacement
La carcinogénèse du côlon est un processus complexe qui fait appel à de nombreux mécanismes moléculaires pouvant agir seul ou en combinaison. Afin d’étudier les mécanismes liés à la carcinogénèse colorectale et les facteurs pouvant l’influencer (tels que l’exposition à des rayonnements ionisants), il est donc nécessaire d’utiliser des modèles expérimentaux aussi pertinents que possible. Dans cette étude, nous utiliserons un modèle murin transgénique qui récapitule de manière réaliste des étapes majeures du développement des tumeurs colo-rectales pour étudier les effets d’une irradiation faible dose de type diagnostique. De plus, cette étude inclura l’utilisation d’un modèle expérimental in vitro d’organoïdes de côlon, ce qui devrait permettre de limiter à plus long terme le recours à un nombre élevé d’animaux.
Réduction
Ce projet fait suite à une étude pilote dont l’objectif était de mettre en place un élevage interne de souris transgéniques et de déterminer les caractéristiques optimales pour l’administration du produit activant la modification génétique et le comptage de tumeurs. Une étude de puissance a été réalisée pour maintenir au plus bas le nombre d’animaux nécessaires pour l’obtention de résultats acceptables (n=16, mâles et femelles inclus)
Raffinement
Le développement de tumeurs est susceptible d’induire un stress et une douleur modérés ou sévères. Eau et alimentation seront disponibles sans limitation et les cages seront enrichies en objets favorisant le bien-être de l’animal. Des points-limites en lien avec les effets potentiels de tumeurs ont été définis. Lors de la surveillance quotidienne des animaux, une attention particulière y sera portée et pourra conduire à l’euthanasie anticipée des animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien caractérisé qui constitue le modèle de référence pour les études précliniques en oncologie. Nous utilisons un modèle transgénique de cancer du côlon inductible après administration de tamoxifène, déjà mis en place au sein de notre laboratoire. L’administration de tamoxifène sera réalisée entre 8 et 10 semaines après la naissance (jeunes adultes). L’administration de tamoxifène sera réalisée entre 8 et 10 semaines après la naissance (jeunes adultes), comme décrit précédemment (4),ce qui permet d’avoir les résultats des génotypages afin de constituer les groupes expérimentaux.
Etude de l’inhibition de l’ARN ribosomique dans un modèle murin immunocompétent de greffe d’adénocarcinome canalaire pancréatique (ACCP)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une greffe de cellules tumorales dans le pancréas sous anesthésie, ou une injection intraveineuse, puis des traitements répétés, et développent des tumeurs pancréatiques et des métastases pulmonaires pouvant causer perte de poids et difficultés respiratoires. Le porteur teste des inhibiteurs de l'ARN ribosomique, seuls ou combinés à la chimiothérapie, sur un cancer qu'il décrit comme très agressif et de mauvais pronostic. Il indique développer des modèles cellulaires en trois dimensions mais affirme qu'ils ne reproduisent pas la complexité de l'organe, ce qui justifie selon lui le recours à la souris.
Objectifs
Les carcinomes canalaire pancréatique sont classés comme des tumeurs très agressives par l'Organisation mondiale de la santé. Ils se caractérisent par une invasion étendue du pancréas et des organes distants, principalement en raison de mécanismes de résistance aux traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique de ces tumeurs repose généralement sur une chimiothérapie et/ou radiothérapie. Lorsque cela est possible, l'ablation partielle ou totale de la tumeur améliore la survie des patients. Cependant, malgré ces traitements lourds, la survie des patients est actuellement estimée à environ 6 à 12 mois. L'objectif de ce projet est d'étudier, dans un premier temps, l'effet de médicaments sur le développement de ces tumeurs en combinaison ou pas avec la chimiothérapie standard. Dans un deuxième temps, nous étudierons l'effet de ces inhibiteurs sur la dissémination métastatique des tumeurs.
Bénéfices attendus
A ce jour, les cancers du pancréas représentent des cancers très agressifs et réfractaires à tous types de traitement. Ainsi, la mise en évidence de nouveaux traitements ou de nouvelles combinaisons de traitements représenterait une avancée majeure dans la prise en charge thérapeutique de ces patients et un espoir thérapeutique fort pour d’autres types de tumeurs agressives et réfractaires. Notre étude s’attache à mieux comprendre, modéliser, et cibler la croissance tumorale et la dissémination métastatique afin de contrecarrer la résistance aux traitements et les mécanismes d’échappement.
Procédures
Des souris subiront une chirurgie lors de la greffe intra-pancréatique des cellules tumorales. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie adaptée et analgésie (1 fois, durée : 10min). D'autres souris auront une greffe cellulaires en intraveineux sous anesthésie (1 fois, durée 1min). Des animaux subiront des traitements par injections intrapéritonéales (durée : 20 sec) ou intraveineuses (durée : 1min) (nombre : 3 fois, espacés de 3 jours ou 5 jours).
Impact sur les animaux
La chirurgie pourrait entrainer une hémorragie chirurgicale ou une infection générale sont des complications exceptionnelles de la procédure (jamais rencontrées). Ces animaux développeront des tumeurs pancréatiques, qui peuvent entrainer la perte de poids. L'injection intraveineuse de cellules pourrait entrainer une irritation. Ce projet est bien caractérisé et des tumeurs métastatiques apparaissent rapidement dans les poumons (principalement), ceci pourrait entrainer des difficultés respiratoires. Des tumeurs métastatiques peuvent aussi être retrouvées dans d’autres organes tels que le foie, la rate et les ganglions. Lors des traitements : un stress peut être engendré par des contentions multiples, une irritation au point d'injection pourrait apparaitre.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses histologiques détaillant des effets thérapeutiques observés.
Remplacement
Notre laboratoire développe des modèles cellulaires en 3 dimensions permettant de remplacer une partie des études précliniques chez la souris en testant sur des cellules l’efficacité des drogues. Seules les drogues ayant montré un effet significatif sur l’inhibition de l’agressivité des cellules tumorales seront testées chez la souris. Ces systèmes cellulaires comportent des limites et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe ce qui explique le recours à des animaux pour étudier les échanges cellulaires et moléculaires qui prennent place dans la progression tumorale et la dissémination métastatique.
Réduction
Nous allons diviser les études en deux groupes : une étude de la progression de la tumeur qui durera 30 jours et une étude de la dissémination métastatique des cellules cancéreuses qui durera 15 jours. Un nombre croissant d’études révèlent la présence d’un dimorphisme sexuel pouvant conduire à une mauvaise interprétation des résultats. Des tests statistiques ont été utilisés afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires par groupe qui permettent à la fois de réduire le nombre total d’animaux nécessaires tout en préservant la significativité des résultats et leur robustesse. Cela nous permettra d’obtenir des conclusions pertinentes et d’éviter toutes répétitions expérimentales.
Raffinement
Les animaux seront hébergés ensemble dans un environnement confortable pour éviter qu'ils ne soient stressés. Les personnes en charge des animaux et de l'expérience surveilleront leur comportement tous les jours pour détecter toute douleur ou souffrance. Les expériences et les procédures seront effectuées de manière à minimiser le stress et à garantir le bien-être animal. Les souris seront suivies régulièrement pour détecter tout signe de souffrance, et si nécessaire, elles seront euthanasiées. Avant toute intervention chirurgicale, les souris recevront des anti-douleurs et seront surveillées de près pendant 48 heures après l'opération. Pendant l'anesthésie, les yeux des souris seront protégés pour éviter qu'ils ne se dessèchent, et les souris seront maintenues au chaud sur un tapis chauffant pour les garder à une température corporelle confortable.
Choix des espèces
Nous avons choisi d'utiliser des souris car la souris est génétiquement très proche de l'Homme. Les expériences sur les souris permettent d'avoir des analyses statistiques plus étendues comparées à des animaux de plus grande taille. Le modèle permettra de bien comprendre les mécanismes immunologiques émis par le microenvironnement tumoral pendant la progression tumorale et la dissémination métastatique et lors des réponses aux traitements. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines pour toutes les études. A ces âges, les animaux présentent des caractéristiques adultes et sont réceptifs à la prise des greffes. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines pour toutes les études. A ces âges, les animaux présentent des caractéristiques adultes et sont réceptifs à la prise des greffes.
Processus infectieux et réponse de l’hôte à Streptococcus pneumoniae
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 836 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va de léger à sévère. Elles reçoivent par voie nasale des doses de pneumocoque, les infections à haute dose provoquant prostration, poils hérissés et yeux fermés, avec une mise à mort dès une perte de poids supérieure à 20 % ou au point de prélèvement fixé à 48 heures. Le porteur décrit un suivi quotidien à bi-quotidien à l'aide d'une grille de douleur, et indique que les souris meurent parfois avant les points limites. Il affirme que l'étude des interactions entre cellules épithéliales et immunitaires exige un modèle "complet" impossible à reproduire in vitro, et retient la souris malgré un système immunitaire qu'il reconnaît éloigné de celui de l'humain.
Objectifs
Le pathogène opportuniste Streptococcus pneumoniae est la cause la plus commune de méningites bactériennes et les infections invasives peuvent conduire à des pneumonies et/ou des otites. Sa transmission est aggravée du fait que S. pneumoniae est présente comme colonisateur naturel des voies respiratoires chez un grand nombre d’individus. Les mécanismes qui permettent à la bactérie de persister, d’être invasive, et l’impact à long terme sur le système immunitaire ne sont pas bien étudiés. Nous nous intéressons à l’étude de l’impact de la bactérie S pneumoniae sur l’épithélium respiratoire et les cellules immunitaires. Les cellules épithéliales sont les premières à être colonisées par le pneumocoque et leur rôle dans la coordination de la réponse inflammatoire est peu étudié. Le modèle d’infection de la souris reconstitue un système complet de cellules épithéliales et inflammatoires. Aussi, nous nous intéressons aux cellules « natural killer » (NK) qui sont bien connues pour leur rôle anti-cancéreux mais dont le rôle au cours d'une infection ou d'une inflammation n'est pas suffisamment exploré. De plus, un modèle in vitro de ces cellules n’existe pas. Pour ces deux types cellulaires, épithéliales et NK, nous avons montré des reprogrammations géniques persistantes, indiquant qu’une mémoire de l’infection serait maintenue. Ce projet vise donc à comprendre comment une infection peut induire une reprogrammation génique de l’hôte et quel serait le rôle de celle-ci. Finalement, nous nous intéressons à mieux comprendre les différences entre l’interaction de l’hôte avec les souches colonisatrices ou invasives de S. pneumoniae, et nous étudions les différentes réponses immunitaires et les reprogrammations permanentes après une infection.
Bénéfices attendus
Le rôle des cellules épithéliales dans la coordination d’une réponse inflammatoire à une infection ou le maintien de l’homéostasie à une colonisation bactérienne est peu connu. Nos études in vitro démontrent des processus moléculaires importants dans le maintien de cet équilibre, mais des études in vivo sont nécessaires pour comprendre l’impact sur le système immunitaire. L’identification et la caractérisation des cellules Natural Killer (NK) qui sont reprogrammées après une infection, et qui ont acquis une meilleure capacité à répondre aux infections, est un domaine plutôt inconnu. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et l’identification des populations de cellules mémoires est important pour définir ce nouveau processus. En effet nous avons montré que ce processus à un effet protecteur lors d’une infection létale. Ce domaine de recherche est en pleine expansion et sera important non seulement pour une potentielle nouvelle prophylaxie, mais aussi pour une meilleure compréhension des mécanismes de l’immunité innée et des mécanismes d’actions de ces cellules effectrices puissantes. En effet, les cellules NK font l’objet de recherches intenses pour des traitements anti-cancéreux. Ainsi, les mécanismes de mémoire que nous révélons pourront aider à éclairer ce nouveau domaine de recherche.
Procédures
- Inoculation des bactéries par voie nasale aux souris ayant reçu un mélange analgésique/anesthésique en injection intrapéritonéale. - Injection par voie intraveineuse retro-orbital sur des souris anesthésiées par un mélange analgésique/anesthésique en injection intrapéritonéale.
Impact sur les animaux
Lors des infections sub-letales, les souris ne ressentent aucune douleur ou symptômes de souffrance. Leur comportement reste parfaitement normal. Cependant, lors des infections avec une dose élevée les souris infectées montrent des signes cliniques 2 jours après infection, tel que de la prostration, inactivité. Ces souris sont surveillées quotidiennement par une personne expérimentée et mises à mort si leur état devient trop critique. En général, les animaux sont mis à mort avant d’atteindre les point limites définis.
Devenir
Toutes les souris seront mises a mort pour prélèvements d’organes post-mortem.
Remplacement
Dans le cadre de cette étude il n’est pas possible de remplacer la souris par un autre modèle, car celui-ci est complet. Dans des systèmes in vitro nous ne pouvons étudier les interactions hôte/pathogène qu’avec un type cellulaire, mais pas une combinaison. Ainsi, l’étude du rôle des cellules épithéliales dans le recrutement des cellules inflammatoires ne peut être fait que dans un système in vivo. De plus, L'usage de la souris permet d'aborder l'étude de cellules dérivant de compartiments différents, alors que l'analyse chez l'homme se limite généralement aux cellules du sang. Pour les cellules Natural Killer (NK), il n'existe pas de lignées de cellules NK murines et nos recherches ne fonctionnent que si ces cellules proviennent directement de l'animal. Enfin, l’usage d’un modèle animal nous permet d'analyser les modifications des caractéristiques des cellules immunitaires lors de processus infectieux sur plusieurs semaines.
Réduction
Sans compromettre l’obtention de résultats exploitables et fiables, seulement les expériences considérées comme indispensables sont réalisées et toutes répétitions inutiles sont éliminées. Pour utiliser moins d’animaux en expérimentation, nous rédigeons nos protocoles à l’avance et les optimisons. Chaque manipulation expérimentale est planifiée dans le but d’envisager des problèmes éventuels, de décider des stratégies et de définir des critères d’interruption. Enfin, pour limiter le nombre d’animaux, un maximum de prélèvements est effectué sur le même animal (sang, lavages, organes) sur lequel nous mesurerons différents paramètres comme : recrutement et activation des cellules, charge bactérienne, production de cytokine et analyses histologiques. Des modèles mathématiques et bio-informatiques seront utilisées à posteriori pour complémenter et modéliser les résultats in vivo et minimiser le nombre d’animaux utilisés dans cette étude.
Raffinement
Après réception et pour permettre l’adaptation aux nouvelles installations, les animaux sont laissés sept jours dans l'animalerie avant le début des expérimentations. Pour prévenir les comportements agressifs entre souris et de limiter les sources potentielles de stress chaque cage sera enrichie avec des petits cylindres de coton. Pour la colonisation par S. pneumoniae, nous utiliserons l'imagerie intravitale par bioluminescence permettant de contrôler les infections sans besoin de mettre a mort les souris. Pour limiter au maximum la souffrance, les mesures de bioluminescence seront effectuées sous anesthésie gazeuse par Isoflurane. Selon les doses de bactéries utilisées les procédures génèreront des signes cliniques de souffrance, de douleur, de sévérité différente chez la souris. - Modéré pour l’inhalation d’une dose de bactérie basse des bacteries virulentes ou colonisantes (suffisante pour induire une colonisation). Les infections sublétals résulteront en une colonisation des voies respiratoire sans entrainer de symptômes. Dans le cadre des suivis de l'évolution des signes cliniques après l’infection, une surveillance journalière voire bi-journalière est pratiquée par une personne expérimentée qui est en mesure de juger selon la grille de douleur fournie par l'animalerie centrale les différents signes cliniques (prostration, inactivité, modification du rythme respiratoire). Cette surveillance est approfondie par une pesée quotidienne des animaux pour caractériser une perte de poids par un arrêt ou une limitation de la prise alimentaire causée par l’infection. Au-delà d’une perte de poids supérieure à 20% de leur poids initial ou des signes de souffrance sont détectés, les animaux seront mis à mort immédiatement. - Sévère pour l’inhalation d’une haute dose de bactérie virulentes. Les infections létales avec les bactéries invasives et virulentes causeront une infection systémique se traduisant en une perte de poids et des signes de souffrance (prostration, poils hérissés, yeux fermés) auxquels on ne peux rémedier sans mettre en cause l’expérience, mais toutes les souris survivent jusqu’au point de prélèvement à 48h. Après l’infection, les animaux sont surveillés quotidiennement et les souris seront euthanasiées dans le cas où la survie jusqu'à 48 ans n'est pas envisageable.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est loin de mimer celui de l'homme. Si bien sûr les primates non humains fournissent des informations plus aisément extrapolables à l'homme, la souris demeurent néanmoins le modèle le plus accessible, justifie ainsi son usage. De plus la possibilité de disposer de souris invalidées pour tel ou tel gène rend leur emploi particulièrement pertinent pour répondre aux questions que nous nous posons. Nous utilisons des souris adultes entre huit et onze semaines, afin d’étudier seulement le système immunitaire mature. En effet les cellules NK produites arrivent à maturation que vers l’âge moyen de huit semaines de l’animal. De plus, le fait d’avoir des souris du même âges nous permet de limiter la variation entre souris et entre expériences.
Maintien de la lignée de souris gain de fonction de TLR7 (TLR7Y264H) et rôle de la mutation TLR7Y264H dans le développement d’une auto-immunité
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, celles gardées pour l'élevage et les croisements restant en vie, les autres mises à mort pour prélever rate, moelle osseuse et reins. Porteuses d'une mutation reproduisant un lupus humain, elles peuvent développer perte de poids, insuffisance rénale, dermite avec plaies et douleurs articulaires, et subissent des prélèvements sanguins mensuels sous anesthésie à l'isoflurane, dont le porteur reconnaît le caractère aversif. La protéinurie est mesurée chaque semaine pour suivre les points limites. Sur le remplacement, le porteur affirme devoir recourir à un "modèle entier" et à un "organisme entier" pour étudier la production d'auto-anticorps, et juge la souris appropriée.
Objectifs
Ce projet repose sur l'étude d'une mutation décrite chez une patiente atteinte d'un lupus érythémateux systémique. Un modèle murin reproduisant cette mutation a été récemment créé sur fond C57BL/6J, et décrit dans la littérature. Cette souris présente une survie réduite, une autoimmunité avec une augmentation des lymphocytes B et une production d’auto-anticorps (notamment des anticorps anti-nucléaires). Nous souhaitons étudier en détail le phénotype des lymphocytes B à l’origine de la production des autoanticorps pathogènes. Ce projet n'a pas fait l’objet d'une évaluation par d'autres instances mais repose sur une question scientifique non résolue à ce jour et dont les réponses pourraient bénéficier aux patients.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de mieux comprendre comment cette mutation génétique peut conduire à une perte de contrôle de la production d’autoanticorps dans une maladie autoimmune sévère telle que le lupus. Les TLR sont des récepteurs de l’immunité qui ont été impliqués dans la maladie lupique dans la littérature, mais les mécanismes de leur implication sont encore mal connus. Ainsi ces résultats pourraient apporter de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients, à moyen/long terme.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins mensuels, sous anesthésie. Des prélèvements (rate, moelle osseuse, reins) seront effectués sur les animaux en fin de procédure après mise à mort. La protéinurie sera mesurée sur un prélèvement d'urine toutes les semaines, pour l'évaluation des points limites.
Impact sur les animaux
Les souris étudiées dans ce projet développent une maladie proche du lupus humain, qui peut causer une perte d'appétit et donc une perte de poids, une insuffissance rénale matérialisée par une augmentation de la protéinurie mesurable à l'aide de bandelettes urinaire. De plus, les animaux peuvent développer une adénopathie associée à une dermite, entrainant une dépilation et le développement de plaies. Le lupus peut également se matérialiser par des douleurs articulaires induisant des difficultés de déplacement et une mise à l'écart du/des individus, un dos voussé. Les prélèvements sanguins peuvent potentiellement générer une anémie (paleur des muqueuses), une respiration plus rapide ainsi qu'une plaie éventuelle au site de prélèvement. Les nuisances liées aux anesthésies répétées sont inhérentes à toute anesthésie (l'anesthésie est cependant ici de courte durée pour un prélèvement sanguin). L'utilisation de l'isoflurane pour l'anesthésie présente un aspect aversif pour la souris, cependant l'anesthésie génère un stress moins important que de réaliser le prélèvement sur un animal vigile.
Devenir
Les animaux ayant atteint les points limites définis seront mis à mort. Les animaux prévus pour expérimentation seront mis à mort pour pouvoir prélever les organes et analyser les cellules immunitaires. Les animaux gardés pour le maintien des lignées et les croisements seront gardés en vie.
Remplacement
La règle du remplacement n'est pas applicable ici : en effet, nous devons avoir recours à un modèle entier afin d'étudier les réponses immunes et la production d'autoanticorps qui mettent en jeu des coopérations cellulaires multiples dans les organes lymphoïdes tels que la rate et les ganglions.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés a été décidée. La pertinence des résultats sera évaluée à l'aide de tests statistiques multiparamétriques de type Anova nécessitant l'analyse de groupes de 8 souris minimum pour chaque question posée. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et d'optimiser l'utilisation des différentes portées, nous utiliserons les mâles et les femelles de chaque portée générée.
Raffinement
Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages à couvercle filtrants comportant des enrichissements (nids, tunnels), sur des portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés dans une animalerie à statut sanitaire propre permettant déviter une infection. Le phénotype des animaux sera examiné de façon hebdomadaire à l'aide d'une grille de score définissant des points limites, décrite pour chaque procédure, afin de soustraire les animaux à la souffrance. Après chaque prélèvement sanguin, les animaux seront également surveillés pendant 24h en utilisant des points limites spécifiques.
Choix des espèces
En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'autoimmunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Adulte, en âge de procréer pour maintenir l’élevage. Les animaux utilisés pour expérimentations auront un âge de 3 mois (âge moyen d’atteinte d’un système immunitaire mature chez les souris contrôles) et maximum de 8 mois (âge moyen pour lequel les points limites apparaissent).